Distribuția micotoxinelor produse de Penicillium spp.

inoculate în gem de măr și

crème fraiche în timpul depozitării în condiții de refrigerare
Autori: Monica Olsena, Roland Lindqvist, Albina Bakeevab, Su-lin L. Leongb, Michael
Sulyok

Abstract
Estimările expunerii consumatorilor la micotoxine prin supravegherea micotoxinelor în
comerțul alimentelor sunt bine descrise, dar expunerea datorată alimentelor mucegăite în propriile case
nu este cunoscută și poate rezulta din eliminarea mucegaiului vizibil pe mâncare și mâncarea restului
alimentului. În acest studiu, s- a urmarit creșterea Penicillium expansum pe suprafața gemului de mere
și Penicillium verrucosum pe crème fraiche, precum și producția și distribuția de metaboliți de
ciuperci în proba (aproximativ 6 cm înălțime împărțită în trei straturi egale), utilizând o metodă
multianalitică, în timp (până la 28 zile) și la 4, 8 și 15 ° C.
Ratele de creștere pentru P. expansum au fost de 1,7, 2,7 și 4,3 mm zi-1 pentru păstrare la 4, 8
și 15 ° C, respectiv, timpul de întârziere aparent scăzut cu creșterea temperaturii de depozitare și au
fost 10,6, 7,9 și 2,6 zile la temperaturi corespunzătoare. Patulina și roquefortina C au fost identificate
și cuantificate, printre alți metaboliți fungici. Patulina a fost detectată în toate straturile de 2 cm ale
gemului de mere la 15 °C. Concentrațiile în cele două straturi superioare ale vasului au corespuns
expunerilor care depășesc valoarea de orientare bazată pe sănătate (HBGV) pentru o dimensiune
normală de servire. În consecință, îndepărtarea părții de mucegai este insuficientă pentru a evita
expunerea nesănătoasă. Spre deosebire de patulină, roquefortina C a fost de asemenea produsă la 4 °C.
Creșterea P. verrucosum pe crème fraiche a fost foarte restrictivă și nu a putut fi modelată. În
ciuda coloniei mici (8 ± 0,5 mm în diametru), ochratoxina A și citrinina au fost detectate după 21 de
zile la 15 °C în stratul superior de 2 cm (inclusiv colonia fungică) și la concentrații într-o porție
normală corespunzătoare unei expuneri deasupra HBGV stabilit de EFSA pentru ambele micotoxine.
Questiomycin A, un antibiotic, a fost de asemenea produs în crème fraiche, dar în contrast cu cele
două micotoxine, a fost detectat în toate straturile crème fraiche și a fost produs și la 4 și 8 ° C.
Ca o completare la un studiu anterior, se prezintă de asemenea producția și distribuția
principalilor metaboliți fungici ai gemului de mere și a crème fraiche pentru unele tulpini suplimentare
fungice ( P. crustosum , P. roqueforti și P. verrucosum pe gem de mere și P. expansum pe crème
fraiche). Un studiu pilot care investighează efectul mărimii inoculării asupra producției de toxine poate
avea implicații pentru cel mai bun inocul de utilizat în studiile experimentale.

Cuvinte cheie: patulina, Ochratoxina A, Citrinin, Roquefortine C, Expunere.

1. Introducere

Consumatorii sunt expuși la diferite niveluri de micotoxine în propriile lor diete din cauza
alimentelor mucegaite în timpul păstrării la domiciliu. O întrebare obișnuită din partea consumatorilor
către Food National Agency este dacă produsele alimentare care au devenit mucegăite după cumpărare
pot fi salvate prin îndepărtarea părții mucegăite sau dacă ar trebui să o elimine în întregime.
Astăzi, mulți consumatori sunt conștienți de necesitatea de a minimiza deșeurile alimentare,
din motive de sustenabilitate și din punct de vedere economic, și pot elimina porțiunea de mucegai
vizibil și să mănânce restul. Revizuirea literaturii a arătat că există un număr limitat de rapoarte
privind anchetele distribuția micotoxinelor în alimentele mucegaite; cele mai multe studii sunt vechi și
nu au acoperit gama sau concentrațiile de micotoxine pe care noi le știm astăzi (Olsen și Svanström,
2017). Akerstrand și Andersson (1979) a studiat creșterea mucegaiului și formarea de patulină în
gemurile de mere cu concentrații diferite de zahăr adăugat (scăzut și înalt, corespunzând la 25 sau 33
sau 100 g zahăr la 100 g gem) și cu sau fără conservant adăugat (benzoat de sodiu).
Gemurile a fost ținut la rece la temperatura de 15 °C și inoculat cu P. expansum. După 15 zile
patulina ajunsese la fundul borcanului, dar nu era observată nici o corelație între creșterea coloniilor și
producția de patulină. Creșterea mucegaiului a fost observată în 1 din 4 gemuri cu conținut ridicat de
zahăr, dar nu a fost detectată patulină.
Benzoatul de sodiu a redus creșterea mucegaiului dar a avut un efect stimulativ asupra
producției de patulină la un conținut scăzut de zahăr. Lindroth și colab. (1978), au dscoperit o inhibare
puternică, dar nu completă, a formării de patulină atunci când se adaugă 44 g zahăr la 100 g gem. Cele
mai ridicate niveluri de patulină au fost găsite în gemurile fără adaos de zahăr. Același grup de
cercetători a studiat, de asemenea, producția de aflatoxine în gemuri cu sau fără adaos de zahăr.
Aflatoxina a fost găsită numai în gemuri fără zahăr adăugat și care au fost depozitate la temperatura
camerei (Pensala și colab.,1978). Rezultate similare s-au obținut și de Ostry și colab. (2004) în gem de
caise. Cele mai înalte niveluri de aflatoxine au fost formate la temperatura camerei, dar concentrații de
până la 25 μg / kg de aflatoxine ar putea fi găsită și pe suprafața gemului depozitat la 6 ° C.
În acest studiu, s-a continuat, deci, să se studieze distribuția metaboliților fungici din specia
Penicillium psihotrofică și să se urmărească creșterea și producerea de micotoxine în timp în gem de
mere și cremă fraiche depozitate la temperaturi scăzute sau de refrigerare (4 până la 15 ° C).

2. Materiale și metode

2.1. Sucuri fungice și suspensii de spori folosite pentru inocul

Următoarele specii fungice au fost folosite ca inoculum pe diferite produse alimentare:

Penicillium expansum (M17, pulbere de guma); P. roqueforti (M19, pulbere); P. crustosum (M55,
semințe de floarea-soarelui); P. nordicum (M40, brânză); P. verrucosum (OTA16 și OTA21, cereale).
Coduri de identificare pentru colecția internă de fungi la Agenția Națională pentru Alimente este
prezentată în paranteze împreună cu sursa originală de izolare.
Producția de toxină a fiecărei specii, în plus față de cea a studiului anterior (Olsen și colab.,
2017), a fost examinată prin creșterea pe plăci de agar de zahar de extract de drojdie (YES) la 25 °C
timp de 7 zile. S-au prelevat agar (n = 5) din fiecare colonie și au fost trimise la laborator la IFA-Tulln
din Austria (secțiunea 2.4).
Suspensiile de spori ale fiecărei specii pentru inocularea de produse alimentare au fost
preparate după cum urmează: o cultură pură a tulpinei a fost striată pe agenți de agar de extract de malț
(200 ml în baloane de 500 ml). După incubare la 25 ° C timp de 7 zile, sporii au fost recoltați în soluție
de peptonă 0,1% conținând 0,015% Tween 80 (822187, Merck, Darmstadt, Germania) folosind o
buclă plastică sterilă. Suspensia brută a fost filtrată prin țesătură sterilă în pungi sterile, după care
concentrația de spori a fost determinată microscopic utilizând o cameră Burker; absența fragmentelor
miceliene în suspensie a fost de asemenea confirmată microscopic.
Din suspensia inițială, o suspensie cu o concentrație de spori de 2500 spori în 5 μl a fost
preparată ca inocul pentru utilizare imediată în studiile privind inocularea produselor alimentare. O
altă suspensie de spori de 5000 spori per 5 μl a fost preparată pentru studierea efectului mărimii
inoculării. Această suspensie a fost diluată cu 1:10, 1: 100 și 1: 1000 în soluție de peptonă.

2.2. Produse alimentare

Următoarele produse alimentare au fost obținute de la un magazin local: 250 ml crème fraiche
(15% grăsime, amidon modificat de porumb, pectină și gumă de roșcată ca agent de îngroșare, n = 44);
și gem de mere de 375 grame (26% zahăr adăugat, pectină, acid citric, acid ascorbic, citrat de potasiu,
n = 23) din același lot. Crema și gemul de mere au fost de aceleași mărci ca cele utilizate în studiul
anterior (Olsen et al., 2017), iar valoarea aw a acestor produse a fost de 0,98 și respectiv 0,96.
Gemul de mere, 172 ± 5 g, a fost transferat în pahare de plastic sterile și acoperit cu folie
sterilă. Probele de crème fraiche au fost acoperite cu capace de plastic originale care au fost perforate
de trei ori cu un ac steril pentru a permite aerului în borcan.
Probele neinoculate din fiecare produs alimentar au servit ca martori și au fost păstrate
congelate (-18 ° C) pentru analizele chimice.
 2.3. Proiectare experimentală

2.3.1. Distribuția micotoxinelor și a altor metaboliți secundari majori în gem de mere sau
în crème fraiche

Suspensiile de spori fungici au fost inoculate pe partea superioară centrală a fiecărui articol
alimentar prin plasarea a 5 μl (2500 spori) cu o micropipetă pe suprafață. Toate inoculările au fost
efectuate în două exemplare. Următoarele specii fungice au fost inoculate pe următoarele produse
alimentare: P. expansum (M17), P. nordicum (M40) și P. verrucosum (OTA21) pe crème fraiche; P.
roqueforti (M19), P. crustosum (M55) și P. verrucosum (OTA16) pe gem de mere.
Toate probele au fost incubate la 15 ° C timp de 14 zile. Diametrul coloniei a fost măsurat și
toate probele au fost plasate într-un congelator (-18 ° C) înainte de prelucrare ulterioară. Probele
congelate au fost împărțite în subeșantioane prin tăierea paralelă cu suprafața superioară la 2 cm și 4
cm de partea superioară, obținându-se trei subeșantioane numite straturi A, B și C. Suprafața A
superioară a inclus partea superioară a coloniei fungice.
Fiecare sub-mostră individuală a fost cântărită. În final, subeșantioanele au fost dezghețate
aprox. 30 min înainte de omogenizare cu un amestecător pentru 1-2 minute. Aproximativ 5 g din
fiecare subsuprafețe omogenizate au fost cântărite într-un tub de 50 ml-Falcon și depozitate la -18 ° C
până la analizele chimice (vezi secțiunea 2.4 Analiza micotoxinelor și a altor metaboliți fungici).
Producția de metaboliți secundari a fost exprimată ca și în studiul anterior (Olsen et al., 2017)
ca concentrație în straturile A, B și C (μg metabolit / kg).

2.3.2. Creșterea mucegaiurilor, producția și distribuția micotoxinelor în gem de mere și

în crème fraiche în funcție de temperatură și timp

Gemul de mere: P. expansum (M17) a fost inoculat pe partea centrală superioară a 36 de probe
prin plasarea a 5 μl (2500 de spori) cu o micropipetă pe suprafață. Două probe au fost incubate la
fiecare temperatură, 4, 8 și 15 °C.
S-au extras triplicate de probe în patru timpi de stocare diferite: la 15 °C, probele au fost
prelevate la 3, 7, 10 și 14 zile după inoculare; la 8 și 4 °C, au fost prelevate probe la 3, 7, 14 și 21 zile.
Diametrul coloniei a fost măsurat și probele au fost plasate într-un congelator (-18 ° C) înainte de
divizarea, omogenizarea și analizele descrise mai sus (secțiunea 2.3.1).
Crema fraiche: P. verrucosum (OTA16) a fost inoculată pe partea centrală superioară a 36 de
probe prin plasarea a 5 μl (2500 spori) cu o micropipetă pe suprafață. Două probe au fost incubate la
fiecare temperatură, 4, 8 și 15 ° C. Eșantioane trilitice au fost prelevate la patru timpi diferiți: la 3, 14,
21 și 28 de zile după inoculare. Diametrul coloniei a fost măsurat și probele au fost plasate într-un
congelator (-18 ° C) înainte de divizare, omogenizare și analiză ca mai sus (Secțiunea 2.3.1).

2.3.3. Efectul mărimii inoculării asupra creșterii și producției de metaboliți fungici

Patru probe de gem de mere au fost inoculate cu 5, 50, 500 și 5000 de spori de P. expansum
(M17). Probele au fost incubate la 15 ° C timp de 14 zile. Diametrul coloniei a fost măsurat după 3, 5,
7, 10, 12 și 14 zile. După 14 zile, întreaga probă (170 ± 10 g) a fost omogenizată ca mai sus și s-a
cântărit un subsample (aproximativ 5 g) într-un tub de 50 ml-Falcon și depozitat la -18 ° C până la
analiza chimică.

2.4. Analize de micotoxine și alți metaboliți fungici

Toate probele au fost extrase utilizând 4 ml de solvent de extracție pe gram de probă. Pentru
conectorii de agar, solventul de extracție a fost găsit cel mai bun compromis (acetonitril / apă / acid
acetic 79 + 20 + 1, v + v + v) de Sulyok și colab. (2006); cu toate acestea, fracțiunea de acetonitril a
fost mărită la 84% (v / v) pentru ca probele de alimente să țină cont de conținutul lor de apă, deoarece
solventul de extracție a fost optimizat pentru boabe uscate (conținut de apă <14% conținut de apă în
dopuri de agar YES (82% apă)]. Probele au fost extrase timp de 90 de minute utilizând un agitator
rotativ GFL 3017 (GFL, Burgwedel, Germania). Extractele au fost transferate în flacoane din sticlă
utilizând pipete Pasteur și diluții cu același volum de solvent diluant (acetonitril / apă / acid acetic 20 +
79 + 1, v + v + v) au fost diluate cu alicote de 500 µl. După amestecarea adecvată, 5 µl din extractul
diluat au fost injectați în sistemul LC-MS / MS fără o pre-tratare suplimentară. Pentru fiecare tip de
eșantion, trei replici neinoculate au fost împărțite și apoi analizate pentru a determina recuperările
aparente.
Detecția și cuantificarea au fost efectuate așa cum s-a descris de către Malachova și colab.
(2014). Pe scurt, s-a utilizat un sistem QTrap5500 LC MS / MS (Applied Biosystems, Foster City,
CA) echipat cu o sursă de ionizare cu electrospray TurboIonSpray (ESI) și 1290 Series UHPLC
System (Agilent Technologies, Waldbronn, Germania). Separarea cromatografică s-a efectuat la 25 °
C pe o coloană Gemini® C18, dimensiune 150 x 4,6 mm, dimensiune a particulelor de 5 µm, echipată
cu un cartuș de protecție C18, cu 4 x 3 mm id (toate de la Phenomenex, Torrance, CA, SUA ). ESI-MS
/ MS s-a efectuat în modul de monitorizare a reacției multiple (sMRM), atât în polarități pozitive, cât
și în polarități negative în două runde cromatografice separate. Fereastra de detecție sMRM a fiecărui
analit a fost setată la timpul de retenție respectiv ± 27 s și respectiv ± 42 s în modul pozitiv și,
respectiv, negativ. Timpul de scanare țintă a fost setat la 1 s. Confirmarea identificării pozitive a
analitului se obține prin obținerea a două sMRM pe analiză (cu excepția moniliforminului și a acidului
3-nitropropionic, fiecare prezentând doar un fragment de ioni), care produce 4,0 puncte de identificare
în conformitate cu Decizia 2002/657 / CE a Comisiei . Cuantificarea sa bazat pe calibrarea liniară, 1 /
x cântărită, utilizând diluții seriale ale unei soluții stoc externe multicomponente. Concentrațiile au
fost corectate pentru recuperări aparente. Exactitatea metodei a fost verificată anterior prin participarea
la studii comparative interlaboratoare (De Girolamo et al., 2017; Malachova et al., 2014), inclusiv o
schemă obișnuită organizată de BIPEA (Gennevilliers, Franța). Limitele de detecție și limitele de
cuantificare au fost determinate în urma ghidului EURACHEM (Magnusson și Örnemark, 2014).

2.5. Modelarea creșterii mucegaiului

Creșterea observată a coloniilor de mucegai pe suprafața superioară a alimentelor a fost

exprimată ca un diametru mediu al coloniei de-a lungul a două axe perpendiculare. Diametrele medii
ale coloniilor în timp, t (zile), au fost montate pe un model bafazic Baranyi (Eq. (1)), descris în Marin
și colab. (2008 IJFM). Rata de creștere (μ) și timpul de întârziere aparent (λ, aproximând timpul până
la creșterea vizibilă) au fost estimate folosind funcția nls în software-ul statistic și de programare R (R
Core Team, 2016).

2.6. Evaluarea expunerii

Pentru a evalua riscul unor concentrații diferite de micotoxine în gemurile de mere și crema
fraiche s-au utilizat următoarele date privind consumul.
Datele privind marimea porțiunilor de gem de mere au fost colectate de la studiul național
suedez Riksmaten (NFA, 2012). Dimensiunea medie a porțiunii a fost de 39 g, 51 g median, 50 g
percentil, 34 g și 85 g percentil 85 (n = 240). Nu au existat mărimi de porție pentru crème fraiche
disponibile în ancheta națională, în schimb sa folosit media a 10 rețete alese aleatoriu, inclusiv crème
fraiche, iar mărimea porției mediane a crème fraiche a fost de 50 ± 12 g. Greutatea corporală pentru o
persoană adultă a fost stabilită la 70 kg.

3. Rezultate si discutii

Capacitatea izolatoarelor fungice de a produce metaboliți secundari, inclusiv micotoxine, a

fost confirmată prin creșterea în primul rând a izolatelor pe plăci de agar YES, metodă utilizată în mod
obișnuit pentru controlul producerii de micotoxine a tulpinilor fungice. Rezultatele sunt incluse în
studiul anterior (Olsen et al., 2017). În acest studiu am adăugat câteva alte tulpini cu capacitatea de
producere a ochratoxinei A, unul P. nordicum (M40) și două P. verrucosum (OTA16 și OTA21), care
au fost verificate utilizând aceleași metode ca și în studiul anterior. Formele metabolitului secundar al
acestor tulpini fungice suplimentare sunt prezentate în Tabelul 1.

3.1. Distribuția micotoxinelor și a altor metaboliți secundari majori în gem de mere sau
în crème fraiche