Evaluarea Toxicologică A Medicamentelor

5/26/2017
EVALUAREA
TOXICOLOGICĂ A
MEDICAMENTELOR
Evaluarea toxicologică a medicamentelor

 TOXICITATEA = efectul dăunător al unei
substanţe chimice sau al unui medicament
asupra unui organism viu.
 Întrebări la care trebuie să răspundă
studiile de toxicologie experimentală:
 Care sunt dozele maxime tolerate?
 Care sunt organele, ţesuturile, celulele sau
funcţiile fiziologice care sunt alterate de
medicament?
 Care este riscul ca medicamentul să inducă
alterări genetice sau carcinogeneză chimică?
1
5/26/2017
Clasificarea studiilor de toxicitate
 1) Studii de toxicitate convenţională:

 Toxicitate acută
 Toxicitate pe termen scurt după doze repetate
 Toxicitate subcronică
 Toxicitate cronică
 2) Studii de toxicitate specială:

 Mutagenitate
 Carcinogenitate
 Toxicitate asupra funcţiei reproductive
Studii de toxicitate convenţională: Obiective
 Evidenţierea importanţei efectelor unui

produs asupra animalelor de experienţă
expuse la diferite niveluri de doze, pe
perioade diferite de timp
 Constituirea unei baze de date
fundamentale pentru evaluarea toxicologică
2
5/26/2017
I. Studii de toxicitate acută

 TOXICITATEA ACUTĂ = efectele adverse produse pe
termen scurt, în urma administrării unei doze unice de
substanţă, sau a mai multor doze în interval de 24 ore
(OECD)
 Exprimată prin DOZA MEDIE LETALĂ = doza unică de
substanţă, determinată prin metode statistice, care
produce moartea a 50% din animalele de experienţă:
 Nu este o constantă biologică
 Precizia este afectată de un număr mare de factori, în
special de condiţiile experimentale
 A fost utilizată pentru compararea toxicităţii produşilor
chimici
 Şi-a pierdut valoarea pentru faza de toxicitate acută a
procesului de evaluare a siguranţei - nu se corelează
bine cu mecanismul de acţiune toxică
Studii de toxicitate acută: Obiective

 Definirea toxicităţii produsului
 Identificarea organelor ţintă
 Evaluarea potenţialului toxic ca şi relaţie
doză-răspuns
 Furnizarea de informaţii validate
clinicienilor (diagnosticul şi tratamentul
intoxicaţiilor acute)
Alţi parametri utilizaţi pentru evaluarea
toxicităţii acute:
 Semne farmaco-toxicologice
 Date patologice
3
5/26/2017
1. Toxicitatea acută pe cale orală

 Procedeele şi condiţiile experimentale sunt
standardizate (BPL)
 ANIMALE - alegere în funcţie de:
 Facilitateaşi condiţiile de creştere
 Rapiditatea dezvoltării
 Uşurinţa manipulării în timpul experimentelor
 Datele disponibile pentru specia respectivă
 rozătoare: şoareci, şobolani, cobai, iepuri
 Când valorile DL50 la şoarece şi şobolan =
semnificativ ≠  DL50 la non-rozătoare
 Europa: 2 specii de rozătoare
 SUA şi Japonia: 3 specii de animale, una de
nerozătoare
1. Toxicitatea acută pe cale orală: condiţii

experimentale
 ANIMALELE:
 De aceeaşi rasă şi origine - de la furnizori autorizaţi
 Sănătoase
 Aclimatizate într-o zonă de carantină a facilităţii timp
de 7-14 zile
 Variaţii ale greutăţii individuale max. 20% din
greutatea medie
 Examinare fizică înainte de iniţierea experimentului –
macroscopic, parametrii biochimici
 Condiţii standardizate (umiditate, temperatură, ciclu
zi/noapte)
4
5/26/2017
1. Toxicitatea acută pe cale orală: Metoda

clasică
 ANIMALE:10/lot (masculi + femele)
 Distribuite randomizat + posibilitate de identificare individuală
 Suprimarea hranei 16-24h pentru a sigura absorpţie GI optimă
şi apă ad libitum pentru a evita deshidratarea
 NIVELURI DE DOZE:
 3 niveluri de doze, încadrând DL50 presupusă
 Valoare limită: 2000 mg/kg (> se determină doza
maximă tolerată)
 PROCEDEE TEHNICE:
 Administrare în doză unică sau fracţionat în maxim 24
de ore, prin sondă intragastrică (gavaj)
1. Toxicitatea acută pe cale orală: condiţii

experimentale
 OBSERVAREA ANIMALELOR:
 Imediat după administrare, frecvent în primele 4 ore, apoi cel
puţin o dată/zi
 Letalitatea (14 zile)
 Debutul, intensitatea şi durata efectelor toxice
 Semne clinice: modificări la nivelul pielii, blănii, membranelor
mucoase, sistemului circulator, SNC, comportamentului; In
special: tremurături, convulsii, salivaţie, diaree, letargie,
somn, comă
 Greutatea animalelor vii, consumul de apă şi alimente
 Analiza probelor de sânge (inclusiv hematologie), urină, fecale
 Examen macroscopic la autopsie
 Examen microscopic (ficat, rinichi, organe cu modificări
macroscopice)
5
5/26/2017
1. Toxicitatea acută pe cale orală:

calcularea DL50
 Metode clasice: Bliss, Litchfield şi

Wilcoxon
 Programe informatice
 Se exprimă în mg/kg greutate corporală,
precizându-se:
 specia
 rasa
 calea de administrare
Clasele de toxicitate în Uniunea

Europeană (2008)
Intervalul DL50 (mg/kg) Clasa de toxicitate
0 < DL50 < 5 Clasa 1

5 < DL50 < 50 Clasa 2
50 < DL50 < 300 Clasa 3
300 < DL50 < 2000 Clasa 4
6
5/26/2017

metode alternative
 Obiective:
 Reducerea numărului de animale
 Diminuarea suferinţei animalelor

metode alternative
 Metoda clasificării în funcţie de toxicitatea acută

(varianta actualizată - OECD 423)
 Permite încadrarea într-o clasă de toxicitate
 Substanţa → administrată oral, prin gavaj, unui lot de
animale, nivelul de doză fiind selecţionat plecând de
la doze bine definite
 Procedeu în etape, în fiecare etapă folosindu-se 3
animale de acelaşi sex
 Valoarea obţinută = referinţă pentru clasificarea
substanţei şi pentru exprimarea potenţialului său letal
7
5/26/2017
start
25 200 2000
3 animals 3 animals 3 animals Etapa 1
sex 1 sex 1 sex 1
2-3 0-1 2-3 0-1 2-3 0
25 200 2000
sex 2 sex 2 sex 2
2-3 0-1 2-3 0-1 2-3 0
ATC 3 ATC 2 ATC 1 ATC 0
25, 200, 2000: doza (mg/kg)

0, 1, 2, 3: numarul de animale moarte sau muribunde
ATC 0: neclasificate, letalitate > 2000 mg/kg
ATC 1: daunatoare, letalitate intre 200 si 2000 mg/kg
ATC 2: toxice, letalitate intre 25 si 200 mg/kg
ATC 3: foarte toxice, letalitate sub 25 mg/kg
start
25 200 2000
sex 1 sex 1 sex 1
2-3 0-1 2-3 0-1 2-3 0
25 200 2000
sex 2 sex 2 sex 2
2-3 0-1 2-3 0-1 2-3 0
25, 200, 2000: doza (mg/kg)

8
5/26/2017
start
25 200 2000
sex 1 sex 1 sex 1
2-3 0-1 2-3 0-1 2-3 0
25 200 2000
sex 2 sex 2 sex 2
2-3 0-1 2-3 0-1 2-3 0
25, 200, 2000: doza (mg/kg)

Ghidul OECD 420 – Procedura dozelor

fixe (2001)
 Unor loturi de animale (5) de un singur sex
li se administrează doze fixe de substanțe
de 5, 50, 300 și 2000mg/kg (în mod
exceptional 5000 mg/kg) (femele nulipare
8-12 săptămâni) – procedura continuă
până când:
 Se identifică doza care produce toxicitate
evidentă, dar nu mai mult de un deces
 Nu se observă deces la doza cea mai mare
 Se observă deces la doza cea mai mică
9
5/26/2017
Ghidul OECD 425 – Procedura

sus-jos (2008)
 Se pornește de la DL50 estimată sau de la 175
mg/kg
 Test secvențial ce utilizează max 5 animale
 Animalelor li se administrează dozele o dată, la
interval de min. 48 ore – primul animal – o
treaptă sub DL50 estimată; dacă animalul
supraviețuiește, următorului i se adminstrează o
doză crescută cu un factor de 3,2 față de doza
inițială
2. Toxicitatea acută pe cale cutanată

 Obiective:
 Furnizarea de informaţii asupra efectelor adverse ce
rezultă în urma aplicării dermice a unei doze de
substanţă
 Compararea cu toxicitatea orală acută poate pune în
evidenţă o pătrundere relativă a compusului prin piele
 Diferenţe faţă de testul oral:
 Selecţionarea speciei
 Număr de animale /doză
 Pregătirea animalelor
 Condiţionarea şi administrarea substanţei
10
5/26/2017
2. Toxicitatea acută pe cale cutanată: condiţii

experimentale
 ANIMALE:
 Adulte, tinere, sănătoase
 Iepuri, şobolani, cobai
 Animalul este ras pe spate
 5 masculi + 5 femele (piele intactă)
 DOZE:
 Limita: 2000 mg/kg
 Aplicare pe aprox. 10% din suprafaţa corporală
 Expunere: 24 ore, animal imobilizat
 PERIOADA DE OBSERVAŢIE:
 Cel puţin 14 zile
 Iritarea cutanată: evaluată cu ajutorul unui scor (ex.
Draize)
II. Studii de toxicitate pe termen scurt

după doze repetate: Obiective
 Determinarea potenţialului substanţei de a produce
efecte adverse după doze repetate, administrate zilnic,
14 sau 28 de zile, suficient de mici pentru a permite
supravieţuirea
 Determinarea potenţialului de a produce efecte adverse
după o expunere mai îndelungată
 Determinarea relaţiei doză-răspuns pentru efectele
adverse, inclusiv a nivelului la care nu se observă efecte
(NOAEL)
 Identificarea organelor ţintă specifice
 Furnizarea de informaţii cu privire la diferenţele între
specii
 Determinarea criteriilor de alegere a unor evaluări
specifice în studiile de toxicitate subcronică
11
5/26/2017
Studii de toxicitate subcronică (90 zile):

Obiective
 Identificarea efectelor adverse care nu au fost detectate în
studiile anterioare
 Furnizarea de informaţii suplimentare asupra efectelor
adverse observate în studiile de durată mai scurtă
 Identificarea nivelului la care se observă efecte şi a NOAEL
 Furnizarea de informaţii importante pentru selecţionarea
dozelor şi a altor parametri în studiile pe termen lung
 Identificarea organelor ţintă sau a locurilor de acţiune în
funcţie de compusul testat
 Furnizarea unei scheme de testare cu criteriile necesare
 Oferirea de elemente pentru selectarea altor specii pentru alte
studii şi pentru extrapolarea la om
 Oferirea de informaţii utile asupra securităţii produsului pentru
agenţiile de înregistrare a medicamentelor
 Oferirea de informaţii cu privire la evaluarea riscului
Studii de toxicitate subcronică :

Concepţia studiului
 În general, exigenţele pentru studiile după doze
repetate sunt aproape identice cu cele după
studiile subcronice
 Diferenţe:
 Durata: 14 sau 28 de zile faţă de 90
 Selecţia dozelor este relativ independenţă de
scopul studiului
 Calea de administrare:
 Frecvent: în alimente, pe cale orală (intubaţie,
capsule), pe cale cutanată
 Rar: în apă, pe cale parenterală
12
5/26/2017

 Durata expunerii: depinde de durata preconizată a
administrării la om
Durata preconizată pentru Durata recomandată pentru

administrarea clinică studiul de toxicitate
Una sau mai multe doze, într-o zi 2 săptămâni
Doze repetate < 7 zile 4 săptămâni
Doze repetate până la 30 zile 3 luni
Doze repetate > 30 zile 6 luni

 Dozele utilizate: minim 3 nivele
 Grup de doze mari: să pună în evidenţă fenomene
toxice, dar letalitatea să fie < 10%
 Grup de doze medii: să nu producă mai mult de o
toxicitate uşoară
 Grup de doze mici: să nu producă toxicitate 
NOAEL
 Loturi martor:
 Martori negativi
 Martori pozitivi
 Animale – 2 specii:
 Rozătoare: şobolan, şoarece, hamster, cobai
 Nerozătoare: câine, mini-porc, primate
13
5/26/2017

Criterii de selectare a speciei:
 Exigenţele agenţiilor de înregistrare
 Produsul metabolizat similar ca la om
 Disponibilitatea unor referinţe anterioare
 Specia şi rasa cea mai sensibilă
 Capacitatea de răspuns a anumitor organe şi
ţesuturi la substanţe chimice
 Obţinerea uşoară
 Experienţa şi capacitatea laboratorului de a
utiliza specia

Evaluarea toxicităţii
 A) Evaluări pe animalul viu:
 1) Observaţii fizice:
 de 2 ori/zi pentru semne vizibile de toxicitate, mortalitate
 O dată/săptămână pentru modificarea funcţiilor vitale, a
comportamentului
 2) Greutatea corporală: 1 dată/săptămână
 3) Consumul de alimente: 1 dată/săptămână
 4) Examen oftalmologic: la început şi la sfârşit
 5) Patologie clinică: înainte, la 4 săptămâni, la
sfârşit
 Parametri: hematologici, enzimatici, biochimici
 Analiza de urină (nefrotoxici)
 B) Evaluare post-mortem
 1) Greutatea organelor
 2) Examen histopatologic
14
5/26/2017
III. Studii de toxicitate cronică

 Durata: > 3 luni, pentru rozătoare min. 10% din
durata de viaţă (6 sau 12 luni)
 Obiective:
 Identificarea toxicităţii după administrări repetate la
specia selectată
 Contribuie la selectarea nivelului de doze pentru alte
studii pe aceeaşi specie (toxicologia reproducerii,
carcinogenitate)
 Identificarea a cel puţin 2 răspunsuri extreme:
 1) efecte toxice (1 sau > răspunsuri toxice)
 2) absenţa efectului
III. Studii de toxicitate cronică:

 Animale- mai multe specii:
 Rozătoare: şobolan, hamster – minim 20 animale de
fiecare sex pentru fiecare nivel de doză (nerozătoare
– min. 4 animale/sex/lot)
 Nerozătoare: câine beagle, primate
 Durata:
 În funcţie de durata tratamentului la om
 Administrare zilnică: ritmul de administrare prevăzut
la om
 Doze: minim 3 niveluri de doze + grup control
(martor)
15
5/26/2017
III. Studii de toxicitate cronică:

 Cea utilizată iniţial la om
 Căi mai utilizate: orală, parenterală, perfuzie
 Măsurători şi observaţii:
 A) Observaţii clinice
 1) Starea generală şi comportamentul
 2) Consumul de alimente
 3) Examen specializat: oftalmologic, cardiovascular
 B) Patologie clinică
 C) Evaluarea absorbţiei substanţei
 D) Examinare histopatologică
Studii de toxicitate specială

I. Studii de mutageneză
 Mutageneza = inducerea de leziuni ale

ADN şi de alterări genetice 
 Modificări ale uneia sau câtorva perechi de
baze din ADN = Mutaţii genice
 Modificări majore în structura cromozomilor =
Aberaţii cromozomiale
 Modificări ale numărului de cromozomi =
Aneuploidie şi poliploidie
16
5/26/2017

 A) Teste care evidenţiază mutaţii genice
 1) Teste microbiene in vitro: utilizează variante
biologice cu caracter specific sau producerea de
mutaţii letale recesive
 Mutaţii:
 În sens direct: tip sălbatec → tip mutant; puse în evidenţă
prin rezistenţa la un agent toxic, care traduce modificarea
unei enzime
 În sens indirect: tip mutant → tip de origine; fol. suşe
auxotrofe (necesită factor de creştere)  prototrofe (capabile
să crească pe un mediu fără factor de creştere)
Testul Ames: măsoară reversia mutantelor histidin-
dependente de Salmonella typhimurium
Teste pe tulpini de Escherichia coli (WP2): necesită triptofan

 2) Teste pe celule de mamifere:
 limfom de şoarece
 limfoblaşti umani
 celule de plămân sau ovar de hamster chinezesc:

locusul HPRT (codifică enzima hipoxantin-
fosforiboziltransferaza → fosforilarea guaninei);
celulele mutante au activitate enzimatică redusă
sau absentă  în mediu de 6-tioguanină nu
sintetizează o nucleotidă letală → colonia se
dezvoltă
17
5/26/2017

 3) Teste microbiene in vivo
 4) Teste pe insecte: Drosoplila melanogaster
 Bine caracterizată din punct de vedere genetic
 Metabolizează substanţele toxice asemănător cu mamiferele
 Timpul de producere a unei generaţii: 12-14 zile
Ex. Testul letalităţii recesive sex-linkate: specific mutaţiilor în
celulele germinale, optim pentru studiul efectelor genetice
transmisibile; mutaţiile recesive sunt letale dacă nu sunt
mascate de o alelă dominantă pe cromozomul omolog
corespunzător; dacă mutaţia se găseşte pe segmentul impar
al cromozomului X, nu are corespondent pe alela
cromozomului Y → masculii cu această mutaţie mor înainte de
maturitate, femelele heterozigote (purtătoare) transmit
caracterul recesiv letal generaţiei următoare, acesta
manifestându-se la jumătate din masculi

 5)Teste de mutaţie genică la şoarece
Ex. Testul spot la şoarece: şoarecii gestanţi ai
căror embrioni sunt heterozigoţi la nivelul
locusului specific pentru culoarea blănii –
expuşi la substanţa test la momentul migrării
celulelor precursoare ale melanocitelor  se
examinează petele mozaic pe blana noilor-
născuţi → indică formarea celulelor mutante
18
5/26/2017

 B) Teste care evidenţiază efecte asupra
cromozomilor
 1) Teste pe insecte: Drosophila melanogaster
 2) Studii citogenetice pe celule de mamifere
Teste in vitro
 a)Analiza metafazelor: celule de limfom de şoarece,
ovar de hamster chinezesc, limfocite umane
 Testare paralel cu 2 martori pozitivi
 Incubare → oprirea diviziunii celulare cu colchicină →
evaluarea anomaliilor ce apar la nivelul cromatidelor sau
cromozomilor
Imaginea unei metafaze
19
5/26/2017

 b) Testul micronucleilor
 Micronucleii = formaţiuni citoplasmatice rotunde,
asemănătoare ca formă, structură şi proprietăţi
tinctoriale cu nucleul
 Se formează în timpul tranziţiei metafază/anafază şi
pot lua naştere din:
 Fragmente cromozomiale acentrice, care în anafază nu se
mai pot deplasa spre nucleii în formare
 Cromozomi întregi, care nu mai sunt incluşi în nucleii fii
datorită retardării anafazice produse prin lezionarea
aparatului mitotic

 b) Testul micronucleilor
 Analiza ex vivo/in vitro a limfocitelor în prezenţa
cytoclasinei B (inhibitor al actinei), permite
diferenţierea între celulele mononucleate care
nu se divid şi celulele binucleate, care şi-au
terminat diviziunea nucleară în timpul cultivării in
vitro 
 Frecvenţa celulelor mononucleate cu MN→ indicaţii
asupra nivelului de bază al mutaţiilor acumulate in
vivo
 Frecvenţa celulelor binucleate cu MN → măsură a
leziunilor acumulate înainte de cultivare + mutaţiile
exprimate în timpul primei mitoze in vitro
20
5/26/2017
 Combinarea testului
micronucleilor cu
hibridizarea in situ cu
fluorescenţă
(fluorescence in situ
hibridization FISH) cu o
sondă ce marchează
regiunea (peri)-
centromerică a
cromozomilor, permite
discriminarea între
micronucleii ce conţin un
cromozom întreg
(micronucleu centromer-
pozitiv) şi un fragment de
cromozom acentric
(micronucleu centromer-
negativ)
21
5/26/2017
Caracteristicile testului micronucleilor:

 Biomarker al efectului relevant pentru evaluarea riscului
cancerigen
 Punct final: identificarea mutaţiilor cromozomiale şi ale
genomului
 Exprimarea micronucleilor necesită diviziune celulară
 Micronucleii pot conţine fie un cromozom întreg, fie un
fragment acentric
 Discriminare între celulele mononucleate şi cele
binucleate în testul cyto-B:
 Celulele mononucleate → leziuni acumulate înainte de cultivarea
celulelor
 Celulele binucleate → leziuni acumulate înaintea cultivării
celulelor + leziuni exprimate în timpul cultivării
22
5/26/2017

 Testul cometă
 Măsoară leziunile ADN în celule individuale, incluse
în agaroză, lizate şi supuse electroforezei la tensiuni
joase, când are loc migrarea ADN-ului lezat
 ADN-ul este colorat şi apoi vizualizat cu un microscop
cu epifluorescenţă
 Fragmentele de ADN apar sub forma unei cozi difuze
în urma nucleului
 Sisteme informatice pentru cuantificarea ADN-ului
lezat reprezentat sub imaginea cometei (momentul
cozii, profilul cozii)
 Tipuri de celule: linii celulare, hepatocite în cultură,
limfocite T umane
23
5/26/2017

 Teste in vivo: Testul

micronucleilor pe
măduvă hematogenă
de şoarece

 3) Testul letalităţii dominante la rozătoare: descrie
moartea embrionilor ca urmare a leziunilor genetice la
nivelul celulelor germinale ale părinţilor
 Se observă viabilitatea implantaţiilor uterine: implantaţiile ce mor
timpuriu sunt recunoscute deoarece formează un “decidium” =
creştere a ţesutului uterin matern ca urmare a implantării oului;
creşterea sa este autonomă, indiferent de soarta oului, până în
ziua 11 de sarcină:
 Creştere normală → ţesutul normal depăşeşte decidium
 Letalitate timpurie → decidium (necrozat la partea superioară)
persistă pe perioada sarcinei şi este eliminat la naştere o dată cu
conţinutul uterin
24
5/26/2017

 3) Testul letalităţii dominante la rozătoare:
 Masculii la maturitate sexuală şi fertili se tratează cu
substanţa de testat (doză unică sau doze multiple), se
împerechează cu 3 femele virgine (8-10 săptămâni)
timp de 1 săptămână
 Femelele sunt schimbate săptămânal timp de 8
săptămâni, pentru a acoperi toate stadiile ciclului
spermatogenetic
 După 17 săptămâni, femelele sunt sacrificate şi
disecate
 Se urmăresc: numărul de corpi galbeni, prezenţa
decidium, fetuşii vii

 C) Teste ce evidenţiază repararea şi
recombinarea ADN-ului
 1)Sinteza neprogramată a ADN-ului
 măsurare indirectă a lezării primare a ADN-ului, pe
baza reparării prin excizie
 cultură celulară de hepatocite de şobolan +
timidină tritiată
 repararea ADN-ului : definită prin cantitatea de
timidină radioactivă încorporată per unitatea de
greutate de ADN, în raport cu valorile determinate
la martori
 măsurarea încorporării timidinei tritiate - prin
autoradiografie
25
5/26/2017

 2)Schimbul între cromatidele surori
 măsoară schimbul reciproc de ADN între două
cromatide surori ale unui cromozom în timpul
duplicaţiei
 Celulele sunt marcate cu 5-BRDU (5-bromo-
dezoxi-uridină); după două cicluri de replicare,
sunt colorate şi se analizează şi compară
frecvenţa schimburilor per celulă şi per cromozom
 Tipuri de celule: limfom de şoarece, ovar de
hamster chinezesc, limfocite umane
26
5/26/2017

 3)SOS Chromotest:
 se bazează pe inducerea sistemului SOS - rol
important în răspunsul bacteriei E.coli la agenţi
genotoxici = indicator precoce al lezării ADN-ului
 Gene implicate: gena lexA (codifică un represor
pentru toate genele sistemului) şi gena recA
(codifică o proteină capabilă să scindeze
represorul printr-un semnal activator SOS)
27
5/26/2017
recA recA*
represor scindat
semnal SOS
leziune ADN
P O
 galactozidaza
substanta genotoxica

I. Studii de mutageneză: Baterii de teste
 Nivelul unu
 1) un test de mutaţie genică la Salmonella/ microzomi
(Ames + activare)
 2) un test de mutaţie genică pe celule de mamifere
 3) un test care evidenţiază rupturi cromozomiale pe
celule de mamifere (testul micronucleilor)
 Toate testele = negative  absenţa potenţialului
mutagen la mamifere
 Două teste pozitive  produs considerat
mutagen la mamifere
28
5/26/2017

I. Studii de mutageneză: Baterii de teste
 Nivelul doi:
 pozitiv un singur test din nivelul 1
 testul mutaţiei letale la Drosophilla
 Nivelul trei: evaluarea aprofundată a

compuşilor care ridică semne de întrebare:
 Testul locusului specific (test de mutaţie genică la
şoarece) pentru produşii care posedă potenţial
mutagen pe celule germinale de mamifere
 Testul letalităţii dominante pentru produşii cu efecte
cromozomiale

II. Studii de carcinogenitate
C A R C I N O G E N G E N O T O X IC
S
U
P
R
A lez a r ea A D N M
V O
I A
E r ep a ra r e
T R
U T
I E
rep lic a re a A D N A
R
E C
A E
rep a ra re
C L
E U
L M u ta tie L
U E
L I
E silen tio a s a
I
A ctiv a rea In a ctiv a rea p ro tein e lo r

p ro tein elo r o n co g e n e su p reso a re d e tu m o ri
T R A N SF O R M A R E A N E O P L A ZIC A A C E L U L E I
exp a n s iu n e clo n a la
TUM OARE
29
5/26/2017

II. Studii de carcinogenitate – PE TERMEN LUNG
 După trecerea în revistă a datelor cunoscute; structură, rezultatele
testelor de mutageneză la termen scurt, de toxicitate cronică
 Animale:
 Şobolani şi şoareci (talie mică, durată de viaţă scurtă)
 Hamsteri
 Câinişi primate (limitat)
 Alegerea în funcţie de:
 Sensibilitatea cunoscută la substanţe cu structuri similare
 Incidenţa redusă a tumorilor spontane
 Viteză şi căi de metabolizare similare cu omul
 50 animale de fiecare sex/grup de doze

 Durata:
 Şobolani: 24 → 30 luni
 Şoareci: 18 → 24 luni
 Cea utilizată la om
 Doze:
 2-3 niveluri de doze + lot martor
30
5/26/2017

 Observaţii:
 1) Greutatea corporală şi consumul de hrană
 2) Observaţii generale - zilnic, în special: localizarea,
mărimea şi creşterea oricărei mase tisulare
neobişnuite
 3) Teste de laborator: examen hematologic
 4) Examene postmortem:
 Autopsie
 Examen macroscopic
 Examen microscopic
 5) Descoperirea tumorilor:
 Număr şi tip (benign/malign)
 Numărul animalelor cu tumori
 Numărul de tumori la fiecare animal

II. Studii de carcinogenitate – PE TERMEN SCURT
 1. Teste de mutageneză/carcinogeneză
 Aberaţii cromozomiale
 Testul micronucleilor
 Schimbul între cromatidele surori
 Sinteza neprogramată a ADN-ului
 2. Teste de detectare a promotorilor
 3. Teste de carcinogenitate localizată-ex:
 Testul tumorilor pulmonare la şoareci de tip A
 Testul neoplasmului mamar la şobolan
 Testul injectării subcutanate
31
5/26/2017

III. Studii de toxicitate asupra reproducerii
 Toxicologia reproducerii: studiază cauzele,
mecanismele, efectele şi prevenirea tulburărilor induse
de agenţii chimici pe parcursul întregului ciclu al
reproducerii
 Toxicitatea reproducerii = efectele dăunătoare induse
de compuşii chimici asupra descendenţei şi/sau
alterarea funcţiilor de reproducere la cele două sexe
 Toxicologia dezvoltării: studiază efectele observate în
cursul perioadei embrionare sau fetale şi cele observate
sau induse în perioada post-natală. Se manifestă prin:
 Malformaţii structurale
 Retardarea creşterii
 Incapacitate funcţională
 Moartea organismului

 Embrio- şi fetotoxicitatea: se referă la orice
efect toxic asupra produsului de concepţie ce
rezultă în urma unei expuneri înainte de naştere
şi care include anomalii structurale şi
funcţionale, sau manifestările după naştere ale
acestor efecte
 Teratogenitatea = o manifestare a toxicităţii
dezvoltării ce reprezintă un caz particular de
embrio-feto-toxicitate, care constă în inducerea
sau creşterea frecvenţei anomaliilor structurale
la descendenţi
32
5/26/2017

 Manifestarea toxicităţii reproducerii
depinde de mai mulţi factori:
 Stadiulde dezvoltare
 Genotip: indivizii pot reacţiona diferit la
aceeaşi substanţă, dependent de
caracteristicile biochimice şi morfologice
determinate de factori genetici
 Doză
Maturarea functionala
Histogeneza
Organogeneza
Sistemul nervos central
Inima
Urechea
Ochii
Membrele
Palatul
Organele genitale
saptamani
1 2 3 4 5 6 7 8 12-16 20-38
Implantare Perioada embrionara Perioada fetala

Moarte Anomalii morfologice Defecte fiziologice si
prenatala majore functionale
33
5/26/2017

 I. Studii de fertilitate la femele

 II. Studii de toxicitate a dezvoltării
 Embriotoxicitate
 Fetotoxicitate
 Teratogenitate
 III. Studii de toxicitate perinatală şi post-

natală

Studii de teratogenitate
 Animale: 2 specii, din care una de nerozătoare:
 şobolan, iepure, şoarece, hamster, porc, primate
 Numărul depinde de specie
 Adulte, tinere, gravide primipare
 Doze: minim 3 niveluri + martor pozitiv şi martor
negativ
 Administrare - perioada organogenezei:
 Ziua 6 → 15: şobolan, şoarece
 Ziua 6 → 18: iepure
34
5/26/2017

Studii de teratogenitate
 Observaţii:
 Femele gravide:
 Semne de toxicitate (zilnic)
 Autopsie:
 Număr corpi galbeni
 Număr implantări
 Număr resorbţii
 Fetuşi - extraşi chirurgical cu o zi înainte de naştere:
 Număr fetuşi vii
 Număr fetuşi morţi
 Greutatea şi dimensiunea fetuşilor vii
 Anomaliile fiecărui fetus
SCREENING ACTIVITATE NULA

PRIMA aprox. 200 animale
SINTEZA INSUFICIENTA
(sobolani, soareci)
DA RESPINGERE
Studiu pe 2 cai
(p.o., i.p)
ACCEPTABIL TOXICITATE
INACCEPTABILA
A DOUA RESPINGERE
SINTEZA VERIFICAREA ACTIVITATII
DA NU
VERIFICAREA TOXICITATII
LA CAINE TOXICITATE
- doza unica INACCEPTABILA
ORGANIZAREA - observare comportament
RESPINGERE
TESTELOR ACCEPTABIL
TOXICOLOGICE TESTE PRELIMINARE

- MUTAGENEZA (Ames)
S1 (-)
- TERATOGENEZA (iepure) S1 (+)
DMT RESPINGERE
DMT/5 S1 (-)
- DL50 (p.o., i.p.) S1 (+)
sobolan, soarece
(3 M + 3F/doza) RESPINGERE
DA
STUDIU FARMACODINAMIC TOXICITATE LA TERMEN
APROFUNDAT SCURT (SUBCRONICA)
35
5/26/2017
TOXICITATE 15 ZILE
Sobolan: 10M + 10F/doza
p.o. gavaj (7zile/7)
ACCEPTABIL
Caine> 2M + 2F/doza
Biochimie(B)
Hematologie(He) TOLERANTA MICA
Histologie (Hi) LA OM
(FAZA 1)
1 doza/zi RESPINGERE
BUNA
ACCEPTABIL
TOXICITATE 4 SAPTAMANI
sobolan: 10M +10F/doza
Caine: 2M + 2F/doza TOLERANTA
B, He, Hi LA OM
FARMACOCINETICA (P) MICA
(FAZA 1)
Doze repetate
pana la 7 zile RESPINGERE
Farmacocinetica
TOXICITATE 3 LUNI
BUNA
sobolan: 10M + 10F/doza
satelit pentru alte examinari ACCEPTABIL
(reversibilitate)
caine: 2M + 2F/doza
satelit reversibilitate TESTARE
LA OM
B, He, Hi FAZA 2 S1 (-)
P (complet) TOLERANTA
EFICACITATE
METABOLISM RESPINGERE
test dublu orb
< 1 luna
FAVORABIL
FAVORABIL
TOXICITATE PE
TERMEN LUNG
TOXICITATE CRONICA
calea din terapie
- sobolan 6 luni
15M + 15 F/doza
-caine sau maimuta
(in functie de metabolism)
1 an
4M + 4F/lot
6M + 6F - sacrificare
partiala 6 luni
TERATOGENEZA FAVORABIL
2 specii
MUTAGENEZA
teste complementare
TESTARE LA OM
(FAZA 3)
dublu orb
nr. mare voluntari
barbati + femei
36

Evaluarea Toxicologică A Medicamentelor - 2017

Încărcat de

Informații document

Titlu original

Drepturi de autor

Formate disponibile

Partajați acest document

Partajați sau inserați document

Opțiuni de partajare

Vi se pare util acest document?

Este necorespunzător acest conținut?

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Evaluarea Toxicologică A Medicamentelor - 2017

Încărcat de

Drepturi de autor:

Formate disponibile

5/26/2017

Clasificarea studiilor de toxicitate

 1) Studii de toxicitate convenţională:

 2) Studii de toxicitate specială:

Studii de toxicitate convenţională: Obiective

 Evidenţierea importanţei efectelor unui

I. Studii de toxicitate acută

Studii de toxicitate acută: Obiective

1. Toxicitatea acută pe cale orală

1. Toxicitatea acută pe cale orală: condiţii

1. Toxicitatea acută pe cale orală: Metoda

1. Toxicitatea acută pe cale orală: condiţii

1. Toxicitatea acută pe cale orală:

 Metode clasice: Bliss, Litchfield şi

Clasele de toxicitate în Uniunea

Intervalul DL50 (mg/kg) Clasa de toxicitate

0 < DL50 < 5 Clasa 1

1. Toxicitatea acută pe cale orală:

1. Toxicitatea acută pe cale orală:

 Metoda clasificării în funcţie de toxicitatea acută

2-3 0-1 2-3 0-1 2-3 0

2-3 0-1 2-3 0-1 2-3 0

ATC 3 ATC 2 ATC 1 ATC 0

25, 200, 2000: doza (mg/kg)

2-3 0-1 2-3 0-1 2-3 0

2-3 0-1 2-3 0-1 2-3 0

ATC 3 ATC 2 ATC 1 ATC 0

25, 200, 2000: doza (mg/kg)

2-3 0-1 2-3 0-1 2-3 0

2-3 0-1 2-3 0-1 2-3 0

ATC 3 ATC 2 ATC 1 ATC 0

25, 200, 2000: doza (mg/kg)

Ghidul OECD 420 – Procedura dozelor

Ghidul OECD 425 – Procedura

2. Toxicitatea acută pe cale cutanată

2. Toxicitatea acută pe cale cutanată: condiţii

II. Studii de toxicitate pe termen scurt

Studii de toxicitate subcronică (90 zile):

Studii de toxicitate subcronică :

Studii de toxicitate subcronică :

Durata preconizată pentru Durata recomandată pentru

Studii de toxicitate subcronică :

Studii de toxicitate subcronică :

Studii de toxicitate subcronică :

III. Studii de toxicitate cronică

III. Studii de toxicitate cronică:

III. Studii de toxicitate cronică:

Studii de toxicitate specială

 Mutageneza = inducerea de leziuni ale

Studii de toxicitate specială

Studii de toxicitate specială

 celule de plămân sau ovar de hamster chinezesc:

Studii de toxicitate specială

Studii de toxicitate specială

Studii de toxicitate specială

Imaginea unei metafaze

Studii de toxicitate specială

Studii de toxicitate specială

Caracteristicile testului micronucleilor:

Studii de toxicitate specială

Studii de toxicitate specială

 Teste in vivo: Testul