Aplicații ale nanoreactoarelor enzimatice în accidentele tromboembolice

Brezeanu R. A., Builescu-Antonescu A., Bujor A. M., Răcureanu D. C.

Abstract
Thromboembolic accidents are one of the most frequent causes of mortality and morbidity
worldwide. One of the challenges medicine is facing is an efficient treatment by reducing the
mortality rate and the sequelae this accidents often produce. The use of thrombolytic agents, like
streptokinase (SK), urokinase (UK) and tissue plasminogen activator (tPA), although efficient, is
limited by certain disadvantages. To overcome these limits, it was tested whether these
thrombolytic agents can be used without facing so many risks. One of the solutions was the use of
lipid vesicles, named liposomes, under different formulations, trying to obtain a targeted delivery
and a prolonged half-life. Among these liposomal formulations, besides conventional liposomes,
there were tested formulations such as enzymatic nanoreactors, like target-specific liposomes that
contain certain enzymes or enzyme substrates, improving their effectiveness.
Cuvinte cheie: lipozomi, nanoreactor enzimatic, activatori ai plasminogenului
1.Introducere
Tromboza reprezintă un proces de coagulare a sângelui, având loc intravascular sau
intracardiac, în timpul vieții, rezultatul acestui proces fiind un tromb alcătuit din elemente figurate
ale sângelui dispuse într-o rețea de fibrină cu o conformație particulară. Acesta poate provoca
accidente vasculare la locul formării sau se poate detașa de la acest nivel, devenind embol, având
consecințe la nivelul altor organe. Aceste accidente tromboembolice pot afecta semnificativ
calitatea vieții sau pot chiar duce la deces, principalele urgențe fiind reprezentate de infarctul
miocardic acut și accidentul vacular cerebral ischemic. Exceptând tratamentul chirurgical de tipul
intervențiilor de revascularizare prin by-pass sau în vederea îndepărtării trombului, o alternativă
terapeutică importantă este reprezentată de administrarea agenților trombolitici pentru a degrada
trombul. În cadrul terapiei trombolitice, substanțele utilizate pot fi streptokinaza (SK) - de origine
bacteriană, urokinaza (UK) - o serin-protează - și activatorul tisular al plasminogenului (tPA) [10].
Generic, aceste substanțe sunt numite activatori ai plasminogenului, având în vedere acțiunea lor,
aceea de a converti plasminogenul (PLG), inactiv din punct de vedere enzimatic, într-o protează
activă numită plasmină (PN), ce are rolul de a dizolva cheagul de fibrină și de a solubiliza produșii
de degradare ce vor fi apoi îndepărtați de către macrofage [1].
Liza trombului are loc în urma procesului de fibrinoliză. Fiziologic, acest proces implică
participarea anumitor enzime, substraturi, inhibitori, cofactori și receptori. Inițierea acestui proces
are loc prin eliberarea tPA și UK de la nivelul celulelor endoteliale, activând PLG ce va fi adsorbit
pe cheagul de fibrină. În urma activării PLG, are loc conversia acestuia în PN, aceasta degradând
polimerul de fibrină în fragmente mici ce vor fi îndepărtate de către sistemul monocito-macrofagic.
Fibrina are capacitatea de a-și regula propria degradare prin legarea PLG și tPA pe suprafața sa,
stimulând astfel generarea de PN printr-un proces de feedback pozitiv [1]. Activatorul tisular al
plasminogenului este secretat sub forma unei enzime active, și nu sub formă de zimogen, însă
versiunea sa “single chain tPA” (sctPA) are activitate redusă în circulație datorită unei constante
Km crescute pentru PLG, acest lucru având ca și consecință generarea unei cantități reduse de PN.
Acest lucru se schimbă atunci când tPA și PLG se leagă de fibrina din cheagul respectiv. Afinitatea
dintre tPA și PLG este redusă în absența fibrinei, dar crește semnificativ în prezența acesteia [12].
De asemenea, procesul de fibrinoliză este regulat de inhibitori ai activării plasminogenului, precum
inhibitorul activatorului plasminogenului-1 (PAI-1) și α2-antiplasmina [1].
În vederea reducerii riscurilor asociate terapiei trombolitice, precum cel de hemoragie,
imunogenitate și reacții alergice, au fost studiate diferite formulări veziculare de tipul lipozomilor și
nanoreactoarelor enzimatice. Lipozomii sunt vezicule formate dintr-un dublu strat lipidic, similar
celui de la nivelul membranelor biologice, prezentând în interior un mediu hidrofil. Nanoreactoarele
enzimatice sunt lipozomi ce conțin enzime încapsulate în mediul hidrofil din interior. De asemenea,
la nivelul bistratului lipidic pot fi incluse diverse proteine cu rol de canale, legare sau marcare, iar
enzimele din interiorul veziculei pot acționa asupra unor substraturi specifice ducând la formarea
unor produși de reacție, ambele fiind capabile de a difuza prin dublul strat lipidic vezicular. În cazul
tratamentului trombolitic, enzimele încastrate la nivelul nanoreactorului sunt reprezentate de
activatori ai plasminogenului (SK, UK, tPA), iar la nivelul stratului lipidic sunt încorporate diverse
substanțe cu rol de recunoaștere, precum plasminogenul.

2. Descrierea procesului
2.1. Streptokinaza
Primele vezicule lipidice utilizate în vederea transportului SK au fost lipozomii
convenționali (Fig. 1.A), constând într-un bistrat fosfolipidic stabilizat cu ajutorul colesterolului.
Studiile realizate pe animale au avut rezultate încurajatoare. Unul din aceste studii a fost condus pe
câini din rasa Mongrel utilizând lipozomi ce conțineau 1-palmitoil-2-oleoil-fosfatidilcolină,
demonstrând eficacitatea în tratamentul infarctului miocardic acut. Rezultatele au relevat un timp de
reperfuzie de aproximativ 32±28 min, comparativ cu un timp de 78 ± 43 minute în cazul SK libere
[13]. De asemenea, au mai fost folosiți lipozomi anionici ce conțineau SK, folosind fosfatidilcolină
(PC), fosfatidilglicerol (PG) și colesterol în vederea trombolizei din cazul unei ocluzii acute de venă
oculară, demonstrând un timp de reperfuzie de 32±12 minute [9]. În plus, a fost evaluată
eficacitatea lipozomilor ce conțin SK în cazul unui iepure, dovedind o eficacitate de 47,4 ±1,4%,
comparativ cu 36,3 ± 3,4% în cazul SK soluție, dar și o imunogenitate mai scăzută în cazul
lipozomilor [14].
O altă tehnologie, aceea de a conjuga lipozomii cu PEG (Fig. 1.B), demonstrează efecte
chiar mai eficiente față de lipozomii convenționali. Aceștia se pare că prezintă capacitatea de a se
ascunde de sistemul monocito-macrofagic, crescând astfel timpul de înjumătățire plasmatic al SK
[11]. În fine, cunoscându-se fapul că trombocitele joacă un rol important în procesul de formare a
trombului, a fost studiată posibilitatea orientării lipozomilor către trombocitele din interiorul
cheagului utilizând liganzi ce prezintă afinitate față de receptorii pentru integrine de la nivelul
acestora (Fig. 1.C). Receptorul αIIbβ3 de pe suprafața trombocitelor prezintă afinitate pentru
secvența tripeptidică RGD (arginină-glicină-aspartat). Într-un studiu realizat pentru a dovedi această
capacitate de legare la nivelul plachetelor s-a demonstrat cu succes afinitatea între lipozomi ce
exprimă pe suprafața lor peptidul RGD și receptorul αIIbβ3 de la nivelul plachetelor sanguine în
stare activată, relevând astfel o țintă alternativă pentru aceste vezicule lipidice [4]. Un alt studiu a
testat eficacitatea unor lipozomi compuși din dioleilfosfatidil-etanolamină și peptidul dipalmitil-
c(RGDfK) utilizând plachete sanguine izolate din sânge uman. Rezultatele au arătat atât o afinitate
crescută față de plachetele sanguine, cât și eliberarea conținutului printr-un mecanism de
autodistrugere. Rezultatele in vitro au arătat o eficacitate de liză a trombului de 50%, comparativ cu
30% SK soluție, după un interval de 30 minute de tratament. De asemenea, rezultatele in vivo au
fost evaluate la șobolanii Wistar, demonstrând o eficacitate de 28,27%, în contrast cu 17,18% SK
soluție [18].

2.2. Urokinaza

Și în acest caz au fost studiați lipozomii convenționali (Fig. 1.A): fără sarcină electrică,
anionici și cationici. Dintre aceste variante, lipozomii cationici compuși din 1,2-distearoil-sn-
glicero-3-fosfocolină (DSPC), colesterol și stearilamină s-au dovedit a fi cei mai eficienți în
încapsularea urokinazei și în liza trombului, procentul de UK încapsulată în acest tip de lipozomi
fiind de până la 28% [15]. În ceea ce privește lipozomii cu sarcină electrică negativă, aceștia au
prezentat o stabilitate de până la 70% și un procent de UK încapsulată de 12%. De asemenea, testele
in vivo efectuate pe iepuri au relevat o epurare mai lentă a UK încapsulate în lipozomi față de cea
liberă, facilitând livrarea acesteia la nivelul trombului, însă s-a dovedit că UK se acumulează
excesiv la nivel renal [2]. Ca și în cazul SK, a fost urmărită îmbunătățirea acestor metode de livrare
a UK folosind lipozomi conjugați cu PEG (Fig. 1.B). Aceștia au fost formulați prin cuplarea
peptidului RGD de gruparea carboxil a lipidului 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamină, acesta
fiind conjugat cu PEG (DSPE-PEG3500-COOH). Aceștia au demonstrat stabilitate fizică și
dimensiune satisfăcătoare. La o doză de 60.000 unități/kg corp (60,000 U.kg-1) s-a evidențiat o liză
a trombului semnificativă la un exemplar de șobolan la nivelul arterei carotide, comparativ cu alte
formule, precum lipozomi convenționali și UK liberă [19]. Într-un alt studiu au fost utilizați
lipozomi conținând RGD ciclic (Fig. 1.C), demonstrând afinitatea acestora față de plachetele
sanguine activate, dar nu și față de cele inactive. De asemenea, testarea in vivo la nivelul vaselor
mezenterice la șoarece a relevat eficacitatea acestor lipozomi în scăderea dozei de UK folosită cu
până la 75% față de UK liberă cu obținerea acelorași rezultate [20].

2.3. Activatorul tisular al plasminogenului

Au fost conduse numeroase studii privind încapsularea acestui agent trombolitic și

numeroase variante de a realiza acest lucru. Pornind tot de la lipozomii convenționali (Fig. 1.A),
unul din primele studii realizate a dovedit faptul că încapsularea acestuia într-un mediu lipidic nu
afectează legarea tPA de fibrină. În schimb, s-a demonstrat faptul că lipidele încărcate negativ,
precum sulfoglicolipide și fosfatidilserina (PS), au arătat o scădere a valorii Km a tPA-ului față de
activarea PLG (sulfatide–20 ori, PS–6 ori), în timp ce lipidele neture, cum este fosfatidilcolina (PC),
au arătat o creștere a Km [17]. Un alt studiu a utilizat lipozomi constând în PC și PG, ambele din
ou, și colesterol, reușind să obțină o concentrație de până la 90% tPA (în funcție de pH și substanța
tampon folosită în timpul preparării) [5]. Mergând mai departe la formulări ce includ PEG în
compoziția lipozomului (Fig. 1.B), ca și în cazul celorlalți activatori ai plasminogenului, această
formulare a lipozomilor duce la creșterea timpului de înjumătățire plasmatic și la scăderea
îndepărtării acestora de către sistemul monocito-macrofagic. Într-un studiu din 2009 s-a demonstrat
o creștere semnificativă a timpului de înjumătățire a lipozomilor ce conțineau PC, Chol, Cholesterol
Sulphate (în raport molar 65:25:5) când s-a folosit PEG-DSPE 5 mol%. Eficiența acestora a fost
dovedită și în ceea ce privește prezervarea pe un termen de 45 zile la 4° C, procentul de tPA pierdut
din interiorul veziculei pe această perioadă fiind de 9%. De asemenea, timpul lor de înjumătățire a
crescut cu până la 16 ori față de lipozomii convenționali și până la 21 ori față de tPA liber, care nu a
mai fost detectabil în sânge după o oră de la administrare [8].

Fig. 1 Diferite tipuri de lipozomi. A. Convențional; B.Conjugat cu PEG; C. Target-specific

 În cele din urmă, s-a ajuns la formularea ce constă în lipozomi ce conțin PLG ancorat pe
suprafața lor (Fig. 2). Studiile in vitro au demonstrat că aceste formulări ale lipozomilor au o
afinitate crescută față de fibrină în prezența PLG liber în concentrație de până la 100 de ori mai
mare decât cea a lipozomilor [6]. În plus, un alt studiu a dovedit faptul că acest tip de lipozomi a
prezentat o acumulare crescută atât la nivelul unui cheag de fibrină cât și la nivelul unui cheag roșu,
comparativ cu PLG liber [3]. Într-un alt studiu au fost utilizați lipozomi ce conțineau atât enzima cât
și substratul, și anume PLG ca substrat și tPA având rol enzimatic, existând riscul interacțiunii
precoce între acestea și scăderea eficacității. Însă, s-a demonstrat că nu au existat interacțiuni între
cele două în timpul preparării lipozomilor, iar activarea PLG a avut loc doar în prezența
fragmentelor de fibrină. Acest lucru a fost posibil prin liofilizarea lipozomilor într-un sistem tampon
(Hepes) la un pH de 7,5 și în prezența lactozei, rezultând lipozomi cu activitate enzimatică maximă
a tPA și PLG, iar PLG și-a prezervat capacitatea de a se lega de rețeaua de fibrină [7]. O altă
inovație în ceea ce privește ultilizarea lipozomilor este reprezentată de sinteza microbulelor
ecogenice. Utilizarea acestora, chiar și fără agenți fibrinolitici, împreună cu ultrasunetele (US), s-a
dovedit eficace în eroziunea mecanică a trombului, favorizând expunerea fibrinei pentru activatorii
plasminogenului [10]. Studiile au demonstrat că lipozomii ecogenici cu tPA au calitatăți ecogenice,
afinitate pentru fibrină și sunt capabili de solubilizarea cheagului in vitro. Astfel, utilizarea
lipozomilor ecogenici cu tPA împreună cu US a dus la o reducere substanțială a cheagului de 89%,
în timp ce, în cazul tPA-ului liber cu US procentul a fost de 71%, în cazul lipozomilor ecogenici cu
tPA fară US, procentul de reducere a fost de 48%, iar pentru tPA liber, fară US, reducerea a fost de
31% [16].

Fig. 2 Lipozom cu bistrat concentric, marcat cu plasminogen, ce conține activatorul tisular al

plasminogenului în spațiul hidrofil.

3. Discuții și comentarii
Utilizarea activatorilor plasminogenului este bine cunoscută drept tratament în cazul
accidentelor tromboembolice, însă, prezintă anumite dezavantaje care le limitează semnificativ
eficacitatea. Există numeroase tipuri de activatori ai plasminogenului utilizați (streprokinază,
urokinază, activator tisular al plasminogenului), precum și diverse tipuri de preparate lipozomale
(lipozomi convenționali, legați cu PEG, marcați cu liganzi specifici), fiecare prezentând avantaje
caracteristice. Dacă în cazul tratamentului cu SK liberă există riscul unui răspuns imun datorat
originii sale bacteriene, folosirea unor lipozomi PEG crește timpul de injumătățire și scade
imunogenitatea SK, iar prin marcarea lor cu un peptid specific (RGD), crește afinitatea pentru
plăcuțele activate. În cazul UK, deși nu prezintă imunogenitate, aceasta nu are selectivitate doar
pentru PLG încorporat la nivelul trombului, ci și pentru cel circulant, crescând astfel riscul
hemoragiilor, formulările lipozomale reducând acest risc prin creșterea specificității. În ceea ce
privește tPA, acesta prezintă o afinitate de 100 ori mai mare pentru PLG de la nivelul cheagului
decât față de cel circulant, dar este limitat de asemenea de un timp de injumătățire foarte scurt. Prin
încapsularea sa într-un lipozom PEG, s-a observat creșterea timpului de înjumătățire față de tPA
liber, creșterea afinității pentru cheag și acumularea semnificativă la nivelul acestuia. În lucrarea de
față, au fost prezentate și alte tipuri de marcare a lipozomilor pentru a crește selectivitatea pentru
anumite molecule țintă, dar și alte modalități prin care eficacitatea lipozomilor clasici poate fi
crescută, de exemplu prin utilizarea ultrasunetelor. Rămâne o chestiune legată de viitor și de
cercetătorii zilei de mâine, dacă aceste tehnologii vor evolua sau vor fi abandonate în favoarea altor
modalități de tratament și țintire cât mai specifică.
4. Rezumat
Accidentele tromboembolice reprezintă una din cele mai frecvente cauze de mortalitate și
morbiditate la nivel global. Una dintre provocările medicinei este tratamentul eficient al acestora și
reducerea ratei mortalității și sechelelor pe care le determină de cele mai multe ori. Utilizarea
agenților trombolitici, precum streptokinaza (SK), urokinaza (UK) și activatorul tisular al
plasminogenului (tPA), reprezintă o metodă care, deși eficientă, este limitată de câteva dezavantaje.
Timpul foarte scurt de înjumătățire, reacțiile alergice, imunogenitatea și riscul crescut de hemoragie
reprezintă câteva dintre dezavantaje. În vederea depășirii acestor limite, s-a încercat utilizarea
acestor agenți trombolitici cu scăderea reacțiilor adverse pe care le pot determina. Una dintre
soluțiile investigate a fost utilizarea unor vezicule lipidice, numite lipozomi, sub diferite formulări,
pentru a livra țintit agentul terapeutic și pentru a crește timpul de înjumătățire plasmatic. Printre
aceste variații ale lipozomilor se numără, pe lângă cei convenționali, cei utilizați sub forma
nanoreactoarelor enzimatice, prin asocierea lipozomilor cu diferite enzime sau substraturi
enzimatice, cu scopul de a le îmbunătăți eficacitatea.
Bibliografie
[1] Cesarman-Maus G., Hajjar K. A., Molecular mechanisms of fibrinolysis, British Journal of
Haematology, 2005, 129(3), 307-321;
[2] Erdoğan S., Özer A. Y., Bilgili H., Erratum to “In vivo behaviour of vesicular urokinase”[Int.
J. Pharm. 295 (2005) 1–6], International Journal of Pharmaceutics, 2005, 299(1-2), 178;
[3] Feitsma H., Kluft C., Heeremans J. L. M., Prevost R., Crommelin D. J. A., Clot
Accumulation Characteristics of Plasminogen-bearing Liposomes in a Flow-system,
Thrombosis and Haemostasis, 79(01), 1998, 144-149;
[4] Gupta An., Huang G., Lestini B., Sagnella S., Kottke-Marchant K., Marchant R., RGD-
modified liposomes targeted to activated platelets as a potential vascular drug delivery
system, Thrombosis and Haemostasis, 2005, 93(01), 106-114;
[5] Heeremans J., Gerrttsen H., Meusen S., Mijnheer F., Gangaram Panday R., Prevost R., The
Preparation of Tissue-Type Plasminogen Activator (t-PA) Containing Liposomes:
Entrapment Efficiency and Ultracentrifugation Damage, Journal of Drug Targeting. 1995,
3(4), 301-310;
[6] Heeremans J., Los P., Prevost R., Crommelin D., Kluft C., Fibrin Binding of Plasminogen
Coated Liposomes In Vitro, Thrombosis and Haemostasis, 1996, 75(01), 134-139;
[7] Heeremans J., Mijnheer F., Gerritsen H., Prevost R., Kluft C., Crommelin D., Long-term
stability of liposomes containing both tissue-type plasminogen activator and glu-
plasminogen, International Journal of Pharmaceutics, 1996, 129(1-2), 191-202;
[8] Kim J., Kim J., Park J., Byun Y., Kim C., The use of PEGylated liposomes to prolong
circulation lifetimes of tissue plasminogen activator, Biomaterials, 2009, 30(29), 5751-5756;
 [9] Khoobehi B., Peyman G., Accelerated thrombolysis and reperfusion in a primate model of
branch vein occlusion by liposomal encapsulation of streptokinase, Invest Ophthalmol Vis
Sci. 1997, 38(4), 4879-79;
[10] Koudelka S., Mikulik R., Mašek J., Raška M., Turánek Knotigová P., Miller A., Liposomal
nanocarriers for plasminogen activators, Journal of Controlled Release, 2016, 227, 45-57;
[11] Kumar L., Verma S., Vaidya B., Liposomes for the delivery of streptokinase, Therapeutic
Delivery, 2017, 8(10), 855-866;
[12] Longstaff C., Williams S., Thelwell C., Fibrin Binding and the Regulation of Plasminogen
Activators during Thrombolytic Therapy, Cardiovascular & Hematological Agents in
Medicinal Chemistry., 2008, 6(3), 212-223;
[13] Nguyen P., O'Rear E., Johnson A., Patterson E., Whitsett T., Bhakta R., Accelerated
thrombolysis and reperfusion in a canine model of myocardial infarction by liposomal
encapsulation of streptokinase, Circulation Research, 1990, 66(3), 875-878;
[14] Perkins W., Vaughan D., Plavin S., Daley W., Rauch J., Lee L., Streptokinase Entrapment in
Interdigitation-Fusion Liposomes Improves Thrombolysis in an Experimental Rabbit Model,
Thrombosis and Haemostasis, 1997, 77(06), 1174-1178;
[15] Schmelter R., Shaw S., Born G., Landolt R., Hetzel K., A preliminary study of the
association of urokinase with liposomes, Can. J. Pharm. Sci., 1981, 16, 37-39;
[16] Shaw G., Meunier J., Huang S., Lindsell C., McPherson D., Holland C., Ultrasound-
enhanced thrombolysis with tPA-loaded echogenic liposomes, Thrombosis Research, 2009,
124(3), 306-310;
[17] Soeda S., Kakiki M., Shimeno H., Nagamatsu A., Some properties of tissue-type
plasminogen activator reconstituted onto phospholipid and/or glycolipid vesicles,
Biochemical and Biophysical Research Communications, 1987, 146(1), 94-100;
[18] Vaidya B., Nayak M., Dash D., Agrawal G., Vyas S., Development and characterization of
highly selective target-sensitive liposomes for the delivery of streptokinase: in vitro/in vivo
studies, Drug Delivery., 2016, 23(3), 801-807;
[19] Wang X., Li S., Zhang X., Hou X., Preparation of thrombus-targeted urokinase liposomes
and its thrombolytic effect in model rats, Acta Pharm. Sin., 2003, 38, 231-235;
[20] Zhang N., Li C., Zhou D., Ding C., Jin Y., Tian Q., Cyclic RGD functionalized liposomes
encapsulating urokinase for thrombolysis, Acta Biomaterialia, 2018, 70, 227-236.