Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
1
Introducere
Există organisme şi microorganisme vii care au dimensiuni atât de mici încât nu pot fi observate
decât la microscop (optic sau electronic). Între aceste microorganisme putem discuta despre alge, fungi,
bacterii, virusuri şi paraziţi. Relativ de curând au intrat în discuţie şi alte structuri numite prioni. Diferitele
microorganisme sunt studiate în cadrul disciplinei de microbiologie. Ca un domeniu înrudit cu
microbiologia poate fi considerată şi imunologia.
Se consideră că microorganismele sunt dintre cele mai vechi, numeroase şi diversificate forme de
viaţă. Pot fi identificate în mediul înconjurător, au rol în descompunerea materiei organice şi menţin
fertilitatea solulului. Majoritatea microorganismelor sunt utile global sau făcând parte din flora normală a
diferitelor gazde; o mai mică parte sunt implicate, în diferite grade, în patologie. În acest caz, bolile
infecţioase pot să afecteze o persoană, un grup de persoane sau o întreagă comunitate. Pe măsură ce
bolile infecţioase au fost identificate a apărut şi disciplina de epidemiologie, născută din necesitatea
studiului izbucnirilor epidemice. Datorită faptului că iniţial nu era cunoscută etiologia epidemiilor, acestea
au fost considerate drept fenomene ale naturii, invazii asupra poporului (de la cuvintele grecesti epi -pe,
peste, demos - popor). Există o serie de documente istorice care atestă existenţa epidemiologiei ca
ştiinţă privind patologia în masă, precum tratatele lui Hipocrate (460-377 înainte de Iisus Christos), cele
7 cărţi „Despre epidemii” şi „Despre aeri, apă şi locuri”.
Microbiologia a avansat continuu, de la nivelul unei ştiinţe relativ simple la un nivel care a
determinat progrese însemnate în diagnosticul, prevenirea şi tratamentul bolilor. În bună parte datorită
aplicaţiilor microbiologiei, speranţa de viaţă a crescut semnificativ. La începutul secolului, se înregistrau
frecvent decese datorită unor cauze infecţioase (difterie, oreion, pestă, poliomielită, rubeolă, rujeolă,
tifos exantematic, tuberculoză, sifilis, varicelă, variolă, etc).
În acest moment variola este eradicată.
Pentru poliomielită a fost stabilită ţinta eradicării, iniţial pentru anul 2000, ulterior pentru 2012.
Izbucnirea epidemică din 2010 ”a împins” această ţintă peste alţi ani (unica boală infecțioasă eradicată
rămâne variola).
Pentru alte maladii sunt propuse alte ţinte de prevenire şi control iar evoluţia gravă, letală, survine
numai în anumite situaţii (forme clinice avansate, atipice, neglijate).
Datorită cunoştinţelor în domeniul microbiologiei s-au îmbunătăţit condiţiile sanitare, s-au descoperit
şi aplicat noi metode de conservare a hranei etc. Dezvoltarea „tehnologiei ADN” (în special după anul
1973), bazată pe cunoştinţele acumulate pe parcursul ultimelor trei-patru decade de studiu şi practică
privind genetica microbiană, are o însemnătate deosebită. Există de un număr de ani posibilitatea
inserării de material genetic provenit de la oricare organism viu în bacterii selecţionate şi adaptate astfel
încât să poată realiza „sarcini” speciale, normale la celula donatoare, ajungându-se până la posibilitatea
ca tulpini deEscherichia coli modificate genetic să sintetizeze structuri de tipul anticorpilor. Studiul
bacteriologic a trecut de la un nivel morfologic, celular la unul biochimic, molecular.
2
Microbiologia ca ştiinţă este strict necesară pentru sănătate, pentru menţinerea sănătăţii şi
prevenirea îmbolnăvirilor. Cunoaşterea modului de transmitere a diferitelor microorganisme reduce
numărul cazurilor de toxoplasmoză, tuberculoză sau gripă. Cunoaşterea noţiunilor privind sterilizarea-
antisepsia-dezinfecţia poate permite (în cazul aplicării corecte în practică a acestor noţiuni) evitarea
infecţiilor de spital sau a altor infecţii produse în unităţi sanitare cu sau fără paturi. Cunoaşterea
imunologiei şi imunopatologiei permite înţelegerea legăturilor şi interrelaţiilor microorganism-
gazdă, precum şi importanţa procedeelor de imunizare şi supravegherea aplicării acestora. Măsurile
generale aplicate pentru evitarea apariției bolilor infecțioase sau a transmiterii ulterioare trebuie bazate
pe un nivel avansat de cunoștințe microbiologice.
Studiul microbiologiei nu este dificil în cazul în care se înţelege faptul că microbiologia este o
ştiinţă foarte logică (cele mai multe principii pot fi învăţate prin simpla înţelegere a acestora). Pe de
altă parte, pe măsură ce reuşeşti să îi descifrezi o parte dintre taine poţi realiza că este una dintre cele
mai fascinante ştiinţe.
Microorganismele au fost descoperite relativ târziu, în 1680, cu toate că primul instrument de mărire
asemănător cu dispozitivele actuale a fost realizat în 1590 de către Zacharias Janssen.
În 1665 Robert Hooke a observat pentru prima oară celulele, el a studiat o secţiune dintr-un dop de
plută şi a descoperit că structura plutei era formată din nişte „cutii” micuţe.
Antony van Leeuwenhoek (1632-1723), dorind să examineze ţesătura hainelor fine (deşi era la bază
un vânzător de mărunţişuri), se pare că a fost prima persoană care a văzut şi a descris diferite
microorganisme. Microscopul realizat de van Leeuwenhoek, instrument pe care l-a construit singur, a
constat dintr-o lentilă biconvexă într-un cadru metalic, cu o mărire de până la 270 de ori. Cu acest
microscop a examinat iniţial diferite ţesături, însă manifestând o curiozitate deosebită a dorit să studieze
ulterior apa din bălţi, tartrul dentar, materiile fecale provenite de la un pacient cu „dizenterie”, etc. A fost
mirat să observe în toate aceste substanţe, mici organisme sferice, altele în formă de „bastonaş”,
spirale, unele aflate în mişcare rapidă, pe care le-a numit „animalicule”. Desenele pe care le-a făcut
probează că a observat cu adevărat bacterii, protozoare şi alte microorganisme. Pornind de la condiţia sa
iniţială, pe parcursul a circa 4 decade, Antony van Leeuwenhoek a redactat 125 de scrisori traduse în
engleză şi predate Societăţii Regale din Londra. în plus, 27 dintre lucrările sale au fost publicate în
Memoriile Academiei Franceze de ştiinţe. Se pare că unul dintre microscoapele originale ale lui van
Leeuwenhoek se află în muzeul Universităţii din Utrecht.
În urma descoperirilor lui Leeuwenhoek s-a pus întrebarea „de unde au apărut aceste organisme?”.
Până la mijlocul secolului al nouăsprezecelea cea mai acceptată teorie a fost „teoria generaţiei
spontane”. Învăţaţii epocii credeau că bacteriile apăreau spontan din materie anorganică. În 1858 Rudolf
Virchof a introdus termenul de „biogeneză”. Această teorie susținea faptul că un organism viu poate să
apară numai din alt organism viu. Controversele între cele două teorii s-au păstrat până în 1861 când
Pasteur a infirmat ”teoria generaţiei spontane”. Geniul lui Pasteur a demonstrat că aerul contaminat cu
microorganisme poate cotamina o soluţie sterilă, în schimb aerul steril nu poate să determine apariția
unor bacterii.
Cu mult înainte de a se fi cunoscut faptul că microorganismele sunt cauza bolilor infecţioase au fost
imaginate o serie de metode de prevenire a bolilor. Spre exemplu, Edward Jenner (1796) a arătat că
variola ar putea fi prevenită prin vaccinare. Semmelweis a avut contribuţii importante privind prevenirea
răspândirii bolilor în maternităţi şi spitale utilizând substanţe chimice „dezinfectante”.
3
Regulile principale (unele valabile şi astăzi) precum şi metodele ştiinţei microbiologice inclusiv
principiile imunizării, utilizarea microbiologiei în medicina preventivă, prevenirea şi controlul bolilor
infecţioase se bazează pe activitatea a doi cercetători înzestraţi atât cu geniu cât şi cu tenacitate,
probabil având şi şansa de a fi trăit în „perioada marilor descoperiri”, Louis Pasteur (1822-1895) şi
Robert Koch (1843-1910). Pe bună dreptate, perioada 1857-1914 e considerată drept ”epoca de aur a
microbiologiei”.
Louis Pasteur a fost un chimist francez devenit faimos prin descoperirea polarimetriei. Tot el a
demonstrat că fermentaţia şi putrefacţia sunt cauzate de organisme vii şi a notat o asemănare între
aceste procese şi bolile infecţioase luând în discuţie degradarea vinurilor şi berii ca şi „boli” ale acestor
produse. Pasteur a fost cel care a realizat un experiment prin care a arătat că, atât cât era cunoscut pe
baza datelor disponibile, organismele vii au luat naştere numai din organisme vii, şi nu din materie
moartă. În 1861 a descoperit fenomenul de anaerobioză şi fermentarea butirică (produsă de Vibrion
butyrique, numit ulteriorClostridium butyricum). După elaborarea procedeului numit „pasteurizare”, a
expus în 1877 teoria pasteuriană cu privire la germeni desfiinţând (așa cum am mai menționat) „teoria
generaţiei spontanee”. Utilizând substanţe simple, de origine naturală şi gaze, vapori şi arcuri electrice
sub temperatură şi presiune crescută, microbiologii şi biochimiştii pot sintetiza o serie de compuşi
organici care au fost descoperiţi iniţial doar în celulele vii. După studiul fermentării vinului, Pasteur a
investigat o boală transmisibilă la viermii de mătase şi ca rezultat a formulat teoria legată de implicarea
germenilor în producerea unor boli. În ceea ce priveşte maladiile umane, a insistat ca bandajele să fie
curăţate şi instrumentele din spital să fie fierte.
Louis Pasteur a demonstrat în anul 1857, la aproape o jumătate de secol după lucrările redactate
despre vaccinare de către Edward Jenner, legătura dintre infecţii şi microorganismele susceptibile a fi
cultivate şi studiate. în diferite experimente ingenioase, Pasteur a protejat de antrax diferite ierbivore
prin vaccinarea cu un preparat extras din Bacillus anthracis. „Tratamentul profilactic” al rabiei a fost
dezvoltat prin injectarea de material uscat obţinut din măduva spinării de la animalele care au murit de
rabie. Joseph Meister, un băiat muşcat de un câine turbat, a fost primul om a cărui viaţă a fost salvată
prin această metodă fiind protejat de injecţiile făcute de Louis Pasteur. Tot Pasteur a descoperit
bacteriile anaerobe şi a studiat septicemia şi gangrena. Ca atare, a devenit posibilă punerea la punct a
tehnicilor de distrugere şi de control al diferiţilor germeni (stafilococi, streptococi, pneumococi etc). În
1880, Louis Pasteur a demonstrat că putem fi protejaţi contra bolilor infecţioase prin injectarea unor
germeni atenuaţi.
Primul medic care a observat transmiterea infecţiilor în instituții sanitare a fost Ignaz Semmelweis.
Femeile ce nășteau acasă sufereau mai puține infecții comparativ cu cele ce nășteau la spital. A impus
spălarea riguroasă şi ”dezinfectarea” cu clor a mâinilor personalului înainte de a aplica intra în sala de
naștere sau de a consulta o femeie însărcinată.
Chirurgul englez Joseph Lister (1827-1912) a aplicat descoperirile lui Pasteur în chirurgie chiar
înainte ca bacteriile care determină infecţiiile chirurgicale (nosocomiale) să fi fost descoperite. Lucrările
lui Lister reprezintă baza tehnicii chirurgicale aseptice din ziua de astăzi.
Ferdinand Cohn (1828-1898) a fost unul dintre cei mai renumiţi microbiologi germani. El a extins
cercetările lui Pasteur lucrând cu bacterii, alge şi fungi. Fiind foarte interesat de bacteriologie, a scris una
dintre primele cărţi referitoare la bacterii, realizând una dintre primele clasificări bacteriene în genuri şi
4
specii. Cohn a reprezentat un mare sprijin pentru Robert Koch, încurajându-l să îşi publice lucrările cu
privire la antrax.
Cu două secole înainte de apariţia bacteriologiei, Robert Boyle a sugerat că anumite boli sunt
provocate de organisme vii. Anatomistul Henle a sugerat că bolile infecţioase ar putea fi determinate
direct de către microorganisme.
Robert Koch i-a fost student lui Henle; a asigurat toate datele necesare pentru a demonstra „teoria
microbiană a bolii”. Dezvoltarea metodelor pentru izolarea bacteriilor în cultura pură a fost printre
cele mai importante descoperiri ale tehnicilor microbiologice şi a fost în mare parte opera lui Robert
Koch. O cultură pură de microorganisme se dezvoltă atunci când pornim de la un singur tip de
microorganism care se dezvoltă în eprubetele test sau în plăcile cu mediu de cultură (în colonii
izolate).în condiţii naturale, mai multe microorganisme din specii diferite pot coexista în acelaşi mediu.
Spre exemplu, în materiile fecale ale unui pacient cu febră tifoidă, Salmonella typhi se află „amestecată”
cu un număr extrem de mare de celule din alte specii bacteriene (aerobe şi anaerobe) sau chiar şi alte
forme de microorganisme. În cadrul diagnosticului medical microbiologic este importantă izolarea în
cultură pură a germenilor patogeni. În exemplul menţionat, pentru diagnostic este necesară folosirea
metodelor care permit izolarea S. typhi în cultură pură, singura care permite identificarea şi stabilirea
sensibilităţii / rezistenţei la antibiotice şi chimioterapice. în 1876 Koch a izolat în „cultură pură” bacteria
care determină antraxul. Pornind de la splina recoltată de la vite infectate şi procesată pentru a permite
obţinerea unui produs patologic; a fost capabil să infecteze şoareci de laborator utilizând această
cultură. Implicat în cercetarea etiologiei exacte a bolilor infecţioase, Robert Koch a rezumat ceea ce a
considerat că reprezintă datele esenţiale pentru a demonstra că un anume germen este cauza unei
infecţii. Aceste date sunt cuprinse în patru postulate, denumite Postulatele lui Koch, respectiv:
1. Microorganismele care determină boala trebuie să poată fi identificate în toate cazurile de boală,
în relaţie patogenică directă cu simptomele şi leziunile pe care le determină;
2. Microorganismul trebuie să poată fi izolat de la victimele bolii, în cultură pură, pentru studiul în
laborator;
3. Când cultura este inoculată la un animal susceptibil, trebuie să reproducă boala (sau, cum s-a
stabilit ulterior, să inducă apariţia anticorpilor specifici la noua gazdă);
4. Microorganismul trebuie să poată fi izolat din nou în cultura pură din infecţia produsă
experimental.
Utilizând aceste reguli precum şi diferitele tehnici microbiologice, Koch a descoperit bacilul
tuberculos (bacilul Koch), bacilul holeric, etc., precum şi modul de transmitere pentru numeroase alte
boli infecţioase (Babessia, Trypanosoma, Plasmodiumetc.). Descoperirile menţionate au reprezentat
debutul bacteriologiei, micologiei, virusologiei, parazitologiei şi imunologiei ca ştiinţe. în doar aproximativ
15 ani (după 1880) au fost descoperite şi izolate în cultură pură microorganisme implicate în multe
dintre bolile infecţioase importante. Aceste descoperiri au făcut posibilă stabilirea ca entităţi bine definite
a medicinei preventive şi respectiv a terapiei specifice (etiologice).
Ilia Mecinikov a evidenţiat modul natural de apărare a organismului faţă de agenţii infecţioşi prin
anumite celule care au proprietăţi fagocitare şi a scris în 1901 primul tratat de imunologie.
În şcoala germană apar o serie de nume celebre, cum ar fi Behring, care a studiat toxinele
bacteriene, imunitatea umorală şi seroterapia precum şi Paul Ehrlich (1854-1915). Cercetările lui Ehrlich
stau la baza chimioterapiei antimicrobiene. Prin utilizarea derivaţilor arsenicali în tratamentul sifilisului
5
ipotezele sale au fost confirmate. Mai mult decât atât, în anul 1878 Ehrlich realizează că există diferenţe
de afinitate tinctorială faţă de coloranţii pe bază de anilină. Această descoperire îl ajută să studieze
efectul diferitelor substanţe chimice, dar stă şi la baza apariţiei coloraţiilor în microbiologie.
Ehrlich arată că mycobacteriile au proprietatea de acido-rezistenţă iar doi ani mai târziu (1884),
cercetătorul danez Christian Gram pune bazele coloraţiei care îi poartă numele şi care are o
remarcabilă utilitate după aproape 125 ani de la această descoperire.
Deşi asistenţa medicală într-o anumită formă a existat încă de la debutul vieţii umane pe pământ,
începuturile nursing-ului profesional au fost realizate de către Florence Nightingale (1820-1910), care a
început munca sa cu mai bine de 140 de ani în urmă, în cursul războiului din Crimeea (1854-1856).
Descoperirile ulterioare, privind relaţia dintre microorganisme şi boală, au necesitat dezvoltarea unor
proceduri de nursing mai complexe şi mai rafinate decât cele utilizate de „îngerii din Crimeea”.
Descoperirea măsurilor profilactice precum administrarea de vaccin variolic (1796), de toxoizi şi
antitoxine (în difterie şi tetanos), a serurilor imune (von Behring, Fränkel şi Kitasato, 1890), a
vaccinurilor polio şi rujeolos (Enders, Weller şi Robins 1949; Salk 1954; Sabin şi alţii, 1954-1967),
precum şi utilizarea de gama globuline pentru prevenirea pojarului, rabiei, tusei convulsive etc., au făcut
necesară dezvoltarea de noi concepte şi educaţie în prepararea şi administrarea acestor substanţe.
Identificarea căilor de transmitere a infecţiilor a condus la dezvoltarea de metode eficace de
prevenire a răspândirii bolilor.în 1895, sir Ronald Ross (1857-1932), medic militar în India, a demonstrat
transmiterea agentului etiologic al malariei prin intermediul ţânţarilor. Parazitul a fost vizualizat în
eritrocitele umane în 1881 de către Laveran, chirurg al armatei franceze în Algeria. în 1900 a fost
demonstrată transmiterea virusului febrei galbene de către o specie particulară de ţânţari ( Aedes
aegypti), în Cuba.
Descoperirea unor teste de diagnostic în domeniul microbiologiei a necesitat o pregătire
microbiologică mai avansată a medicilor, asistentelor şi a altor profesionişti ai sănătăţii în metode pentru
colectarea produselor şi raportarea specifică de laborator, astfel încât terapia să demareze cât mai
precoce. Descoperirea de substanţe chimice specifice (de exemplu sulfonamidele, Domagk 1935) şi
substanţe antibiotice (de exemplu penicilina, streptomicina, tetraciclina şi cloramfenicolul) a contribuit la
îmbunătăţirea modului de abordare medicală a problematicii bolilor infecţioase. Primul medicament anti-
tuberculos este descoperit în anul 1944 (streptomicina - Scharty, Bugie, Waksman).
Procedurile chirurgicale moderne ar fi imposibile fără dezinfecţie şi sterilizare. Industria laptelui, a
conservelor, a hranei ambalate şi congelate sunt dependente de microbiologie. Sanitaţia sistemelor de
apă şi tratarea apelor poluate sunt posibile numai datorită cunoştinţelor acumulate prin microbiologie în
cursul ultimului secol. în multe moduri profesiunea medicală şi fiecare latură a ei este dependentă de
cunoaşterea, înţelegerea şi utilizarea informaţiilor din microbiologie.
La şcoala română de microbiologie înfiinţată de profesorii Victor Babeş (1854-1926) şi Ion
Cantacuzino (1863-1934) s-au pregătit multe generaţii de microbiologi, viitori cercetători şi profesori,
care au contribuit la dezvoltarea microbiologiei din ţara noastră.
Victor Babeş s-a născut la Viena în anul 1854, a studiat la Facultatea de medicină din Budapesta,
apoi în Viena unde a fost numit preparator la catedra de Anatomie condusă de profesorul Lauder.
Ulterior este recomandat pentru a deveni asistent la catedra de Anatomie patologică la Facultatea de
medicină din Budapesta. A fost în acelaşi timp anatomopatolog şi microbiolog. A fost atât elevul lui
Robert Koch, cât şi al lui Louis Pasteur. A fost numit docent şi profesor la Facultatea de medicină din
6
Budapesta la o vârstă foarte tânără (27 ani). Cu patru ani mai târziu, în anul 1885, publică împreună cu
A.V. Cornil primul tratat de bacteriologie medicală din lume (în 1891 apare a treia ediţie a tratatului). A
doua ediţie a acestui tratat se află în Biblioteca Institutului Naţional de Cercetare-Dezvoltare pentru
Microbiologie şi Imunologie „Cantacuzino”. Victor Babeş a demonstrat importanţa introducerii tehnicilor
microbiologice în anatomopatologie. Ar putea fi menţionat şi faptul că pe parcursul celor 10 ani de
activitate la Facultatea din Budapesta, a dat indicaţiile necesare pentru construirea unui nou Institut de
anatomie patologică iar în cadrul acestuia a unei secţii dedicate bacteriologiei. A evidenţiat proprietăţile
neutralizante ale serurilor imune, a descoperit corpusculii metacromatici ai bacilului difteric (Babeş-
Ernst), o nouă metodă de preparare a serului antidifteric etc. în 1886 a fost numit profesor de anatomie
patologică şi bacteriologie la Facultatea de Medicină din Bucureşti. Este fondatorul Institutului de
Bacteriologie pe baza căruia s-a dezvoltat actualul Institut „Victor Babeş”. În 1889 a preparat vaccin
antirabic,ţara noastră fiind a treia ţară din lume care a reuşit să prepare acest vaccin. A
condus institutul creat până aproape de sfârşitul zilelor sale, care a fost la puţin timp după pensionarea
sa.
Din păcate, în ciuda monumentalității sale, ”nu a fost posibil” să fie găsit un spațiu în care să-şi
poată continua cercetările şi după pensionare, lucru din păcate mult prea des întâlnit în istoria medicinei
noastre.
Cu privire la poziţia acestui mare cercetător precum şi la situaţii care par a fi foarte asemănătoare
peste ani, în ciuda trecerii timpului şi a speranţei că evoluţia societăţii noastre este într-o direcţie
pozitivă, vom prezenta în continuare un fragment din discursul profesorului Victor Babeş, ţinut la
Universitatea din Cluj în anul 1919. „Astăzi lumea civilizată aşteaptă deci lucruri mari din partea
noastră; nu îmbogăţirea oligarhiei politice în afaceri, certuri politice, persecuţiuni şi
denunţuri infame pentru interese egoiste şi înguste, ci păstrarea şi sporirea celor mai
valoroase achiziţiuni ale omenirii: sănătatea, prosperitatea, forţa, justiţia, instrucţiunea şi ştiinţa,
spre a asigura pacea şi progresul şi prin ele forţa şi fericirea poporului român, servind de exemplu
popoarelor din Orient.
Dar politica noastră de până acum n-a făcut decât să ne ducă în cea mai mare
desorganizare, desbinare şi dezastru economic, permiţând prin egoism şi nepăsare ca
ţărănimea să fie azi degenerată, analfabetă, lipsită şi îndatorată peste măsură; politicienii
noştri au reuşit să oprime toate valorile, înlocuindu-le prin clientela lor politică; au adus
funcţionarismul, birocratismul, nepotismul la culme; politicienii noştri în nepăsarea lor pentru
interesele ţării au lăsat armata la începutul războiului aproape nepregătită în clipele cele mai periculoase
prin care a trecut ţara şi din care nu ne-a scăpat decât vitejia fără pereche a soldatului român.
Trebue să ne întrebăm dacă nu acest politicianism este cauza tuturor relelor şi dacă nu este o
datorie patriotică să întrebuinţăm toate mijloacele necesare ca să-l nimicim şi să-l înlocuim cu o altă
putere care să ne garanteze regenerarea şi progresul.
În adevăr trebue să fim profund îngrijaţi şi să ne întrebăm înainte de toate cum vom putea să eşim
din acest dezastru şi cum vom putea face faţă creanţei mari pe care am contractat-o faţă de lumea
civilizată.
Publicul care, până deunăzi, a observat la guvernanţii noştri aceleaşi viţiuri politice, aceeaşi
nepăsare pentru interesele reale ale ţării, acelaşi nepotism, aceeaşi venalitate, acelaşi egoism care ne-a
7
condus la degenerare ca şi înainte războiului,aşteaptă cu nerăbdare o schimbare radicală a
moravurilor politice care să ne pună în poziţiunea de a îndeplini măreaţa noastră misiune.
Faţă de aceste adevăruri ar fi trebuit să ne aşteptăm ca România nouă să pună piciorul în prag şi să
rupă odată pentru totdeauna cu vechiul politicianism. Însă ce vedem spre profunda noastră descurajare;
că aceeaşi principii dezastruoase, egoiste, aceeaşi fraze goale domină şi politica de astăzi şi că mergem
orbi înainte spre un dezastru sigur. În loc ca întinderea şi bogăţia acestei ţări binecuvântate să ne
asigure un loc de frunte şi stare economică briliantă, ne găsim astăzi în deplin faliment, expuşi ruinei şi
foametei şi mai mult decât oricând sub dependenţa şi exploatarea nemiloasă a naţiunilor mari .”
Ion Cantacuzino a avut o personalitate cu totul deosebită, imposibil de cuprins într-o trecere atât de
sumară prin istoricul microbiologiei. A studiat la Paris Filozofia şi Literele, ştiinţele naturale şi Medicina.
Pregătirea în microbiologie a desăvârşit-o pe parcursul a 9 ani, în laboratorul lui Ilia Mecinikov, la Paris.
A cunoscut mai multe limbi străine, inclusiv latina şi greaca. A studiat la Paris şi a revenit în ţară pentru
satisfacerea stagiului militar (genişti, Jilava). A continuat studiile în Franţa (ştiinţe naturale 1886,
medicină 1887). Lucrează în Institutul Pasteur începând cu 1892, devine doctor în medicină în 1894 şi
este numit profesor suplinitor de Morfologie animală la Facultatea de Ştiinţe din Iaşi (1894). A fost numit
profesor la Facultatea de Medicină din Bucureşti în anul 1901 şi a grupat în jurul său un mare număr de
tineri medici, care au devenit la rândul lor îndrumători şi creatori de şcoală (Al. Slătineanu, C. Ionescu-
Mihăieşti, M. Ciucă, Al. Ciucă, D. Danielopolu, D. Combiescu, N. Gh. Lupu, I. Bălteanu, I. Nicolau, Lidia şi
I. Mesrobeanu şi mulţi alţii).
În perioada 1908-1910, profesorul Cantacuzino este numit Director General al Serviciului Sanitar,
face Legea de organizare a acestui serviciu, înfiinţează sanatoriile Bisericani, Bârnova, Nifon, Cărbuneşti,
Filaret precum şi primele laboratoare regionale de bacteriologie şi igienă (Craiova, Galaţi, Constanţa,
Iaşi, Sulina). Începe în 1912 prepararea vaccinului contra febrei tifoide şi a holerei asiatice, ulterior
începe prepararea serului antidifteric. Este numit în 1917 Director al Directoratului Sănătăţii Publice civile
şi militare, calitate în care coordonează combaterea epidemiilor de holeră, tifos exantematic, febră
recurentă. În 1920 începe prepararea serurilor antimeningococic şi anti gangrenos (în Laboratorul de
Medicină experimentală) iar în data de 4 iunie semnează în calitate de prim delegat, Tratatul de la
Trianon. Un an mai târziu se înfiinţează Institutul de Seruri şi Vaccinuri, în 1926 începe vaccinarea BCG
în România iar în 1928 înfiinţează „Archives Roumaines de Pathologie Expérimentale et de
Microbiologie”. Din păcate, în momentul de faţă „Romanian Archives of Microbiology and Immunology”
(numele actual al revistei, care a ajuns la volumul cu numărul 69) nu apare listată între publicaţiile
recunoscute oficial în ţara noastră, cu toate că începând cu anul 2005 a existat un reviriment, comitetul
editorial străduindu-se să refacă prestigiul revistei, ca o datorie morală faţă de înaintaşi.
În perioada 1931-1932 face parte din Guvernul prezidat de Nicolae Iorga, în calitate de ministru al
sănătăţii publice. Lucrează la elaborarea unei noi legi sanitare. Cu numai nouă zile înainte de a înceta din
viaţă prezidează Congresul de Tuberculoză şi propune înfiinţarea Ligii contra Tuberculozei.
Pe lângă şcoala pe care a format-o, una dintre cele mai mari realizări ale Profesorului Cantacuzino a
fost înfiinţarea în anul1921 a Institutului de Seruri şi Vaccinuri, numit astăzi INCDMI „Cantacuzino”
(Institutul Naţional de Cercetare-Dezvoltare pentru Microbiologie şi Imunologie), centru de cercetare
ştiinţifică fundamentală şi aplicativă, centru de învăţământ de specialitate, instituţie care a preparat şi
prepară seruri, vaccinuri şi alte produse biologice utile în diagnosticul bolilor transmisibile.
8
Alexandru Slătineanu (1873-1939) a organizat învăţământul universitar de microbiologie la Iaşi
(cercetări în domeniul febrei tifoide, tuberculozei, tifosului exantematic, etc.).
Constantin Ionescu-Mihăieşti (1883-1962) a abordat teme importante în domeniul virusologiei,
bacteriologiei, parazitologiei, imunologiei, hematologiei, anatomiei patologice şi epidemiologiei. A avut
contribuţii deosebite în studierea mycobacteriilor şi enterovirusurilor. A muncit intens pentru dezvoltarea
Institutului „Cantacuzino” a cărui director a fost începând cu anul 1934. A continuat activitatea ştinţifică
şi administrativă promovată de Ion Cantacuzino.
Mihai Ciucă (1883-1969) a dezvoltat o bogată activitate ştiinţifică în domeniul bacteriologiei şi
epidemiologiei, experimental, terapeutic şi clinic. A studiat împreună cu Jules Bordet fenomenul
lizogeniei (1921); a avut contribuţii deosebite în domeniul malariei fiind numit secretar al Comisiei de
Malarie de pe lângă Liga Naţiunilor. A fost profesor de microbiologie întâi la Iaşi şi din 1934 în Bucureşti
fiind al treilea profesor de bacteriologie din Bucureşti după Victor Babeş şi Ion Cantacuzino.
Alexandru Ciucă (1880-1872) a absolvit facultatea de medicină veterinară din Bucureşti. Activitatea
lui s-a îndreptat mai ales spre organizarea producţiei de seruri hiperimune pentru tratamentul
tetanosului, difteriei etc. A fost al treilea director al Institutului Cantacuzino.
Dumitru Combiescu (1887-1961) a cercetat capitole majore ale patologiei infecţioase (febra tifoidă,
febra recurentă, dizenteria, tetanosul, antraxul, gangrena gazoasă etc). A avut contribuţii deosebite în
domeniul rickettsiozelor şi leptospirozelor. În timpul primului război mondial a organizat măsuri de
prevenire a tifosului exantematic.
Matei Balş (1905-1989) a fost cea mai proeminentă personalitate a secolului XX, în România, în
domeniul bolilor infecţioase. A făcut un stagiu de microbiologie la Institutul Pasteur din Paris şi ulterior a
intrat între personalităţile cu formaţie „cantacuzinistă”, lucrând alături de Ion Cantacuzino, Mihai Ciucă,
I. Bălteanu. Deşi era un foarte bun clinician a devenit şi întemeietorul şcolii moderne de bacteriologie
clinică. Tehnicile şi metodele de diagnostic imaginate i-au adus numeroase brevete şi inovaţii care îi
poartă numele atât în ţară cât şi în străinătate.
Şcoala astfel întemeiată a avut o activitate cu rezultate excepţionale pentru ştiinţa românească,
pentru microbiologie şi pentru sănătatea publică.
După 1989, Institutul Cantacuzino a reintrat în Reţeaua Internaţională a Institutelor Pasteur şi a
Institutelor Asociate ceea ce a permis obţinerea unor rezultate, importante.
INCDMI „Cantacuzino” trebuie să continue tradiţia înaintaşilor şi să îşi menţină poziţia importantă în
cadrul instituţiilor care se ocupă de sănătatea publică la nivel naţional şi internaţional. Eforturile de la
nivel central din perioada 1997-2000 şi respectiv eforturile depuse în perioada 2005-2007 au reprezentat
un sprijin important în acest sens.
George Emil Palade (1912-2008)
Absolvent al facultăţii de medicină din Bucureşti, a desfășurat o prodigioasă activitate ştinţifică, în
Statele Unite. A fost unul dintre pionierii microscopiei electronice şi a fracționării celulelor (separarea
organitelor celulare). A fost iniţial cercetător şi ulterior profesor de biologie celulară al Institutului
Rockefeller din New York iar din 1973 al universităţii Yale din New Haven. Ultimul loc în care George
Emil Palade a fost profesor a fost facultatea din San Diego, California. A pus bazele unor noi
departamente pentru studiul celular.
Cercetările lui au cuprins descrierea rolului şi structurii mai multor organite (mitocondria în detaliu
cu structura membranei și a cristelor, a definit rolul reticulului endoplasmic, sistem tubular ce este
9
prezent in orice celula animală sau vegetală). Într-un articol publicat în 1955, Palade a prezentat o
fotografie de microscopie electronică ce reprezenta reticulul endoplasmic rugos şi a explicat legătura
între cele 2 structuri şi rolul lor în eliberarea produşilor de secreţie).
Cea mai importantă a fost descoperirea rolului corpusculilor citoplasmatici, denumiţi iniţial
”corpusculii lui Palade”. A precizat compoziția lor esențială (acizi ribonucleici) rezultând altfel denumirea
de „ribozomi”.
În 1974 realizările sale sunt încununate cu premiul Nobel pentru Medicină şi Fiziologie.
Datorită eforturilor depuse, incidenţa şi prevalenţa anumitor boli infecţioase a scăzut. Trebuie avută
însă în vedere emergenţa şi re-emergenţa diferitelor maladii.
Microbiologul, medicul clinician şi asistenta medicală trebuie să aplice cunoştinţele de microbiologie
în practica de zi cu zi. Deşi anumite tehnici pot fi învăţate din rutină, persoana cu adevărat profesionistă
înţelege faptele ştiinţifice precum şi principiile aflate la baza acestor tehnici. Profesionistul ştie de
asemenea în ce mod ar trebui adaptate aceste tehnici în cazul anumitor tipuri de pacienţi (ex. pentru cei
supuşi chirurgiei cardiace, pacienţilor care au suferit arsuri pe suprafeţe întinse), ce tehnici trebuie
utilizate în sălile de operaţie, de aşteptare şi în instituţiile unde sunt îngrijiţi copii mici sau foarte mici,
cum pot fi modificate acestea în condiţii de urgenţă (de exemplu în caz de război sau alte calamităţi
produse de om sau calamităţi naturale) şi cum trebuie făcută informarea pacienţilor, populaţiei, de
exemplu referitor la imunizări. Un membru antrenat alechipei medicale poate să diferenţieze adevărul
de interpretarea greşită şi / sau dezinformarea din aşa-zisa „literatură medicală” scrisă pentru publicul
larg şi poate recunoaşte erorile apărute în mass media, dacă are noţiunile necesare de microbiologie.
Persoanele care lucrează în domeniul sanitar dar şi orice altă persoană realmente interesată,
constată sau pot constata că în aproape orice activitate cotidiană există o aplicabilitate a cunoştinţelor
microbiologice.
Povestiri Adevarate
1.1.1. Girolamo Fracastoro (1478-1553)
S-a născut într-o veche familie de medici. A fost coleg la Facultatea de Medicină cu Nicolaus
Copernicus (astronom şi medic). S-a ocupat atât de medicină cât şi de astronomie, matematică, poezie,
geografie, muzică etc.
Poate fi considerat un bun diagnostician; este primul medic care a făcut diferenţa între ciumă şi
tifosul exantematic (au existat 2 izbucniri epidemice de tifos, analizate de această minte luminată, în
1505 şi în 1528). Se poate spune că a descris corect din punct de vedere epidemiologic, în lumina
datelor cunoscute la acea vreme, ciuma, variola, febra tifoidă şi tifosul exantematic.
A scris mai multe lucrări în domeniul medical, care cuprind informaţii incredibil de corecte, dintre
care unele au fost confirmate ulterior aproape în totalitate.
Prima dintre aceste lucrări a fost scrisă în versuri şi se pare că a fost publicată la Veneţia [ Syphilis
sive morbus Gallicus(Sifilisul sau boala galică), 1530, trei volume; numele se datorează faptului că se
presupune că sifilisul ar fi fost răspândit în Italia de trupe franceze asediatoare]. În primele două
volume, Fracastoro descrie cu bune amănunte sifilisul; a descris şi luesul ca entitate în cadrul acestei
patologii, a discutat modalităţile de debut şi chiar diferenţele între cele trei stadii ale bolii. Apar
10
menţionate şi informaţii despre modalităţi de diagnostic şi „tratament” (vapori de mercur, mixturi din
sulf, mercur şi extracte vegetale etc). În această scriere sunt discutate chiar şi metode de prevenţie. În
al treilea volum, Girolamo Fracastoro prezintă date privind călătoriile lui Columb în Indiile de Vest (se
pare că boala era foarte răspândită printre băştinaşi) dar şi o poveste din mitologie, povestea păstorului
Syphil (numele sifilisului are, se pare, o vechime foarte mare) care a fost pedepsit de zeul Apollo, tocmai
prin această boală.
Lucrarea De contagione, contagionis morbis et eorum curratione („Despre contagiune, boli
contagioase şi tratamentul lor”), publicată tot la Veneţia, la vârsta de 68 de ani, include toate
cunoştinţele şi teoriile lui Fracastoro referitor la bolile contagioase ale acelor vremuri. În mod uimitor, cu
sute de ani înainte ca aceste aspecte să fie studiate şi parţial demonstrate ştiinţific de către Louis
Pasteur, într-o vreme când bolile erau considerate drept „pedeapsa zeilor”, teoria „miasmelor
morbigene” a lui Hipocrate este combătută iar Fracastoro emite ipoteza conform căreia bolile
contagioase sunt transmise prin intermediul unor „fiinţe invizibile” [ Seminaria morborum (seminţele
bolilor)]. După mai mult de 130 de ani, Antony van Leeuwenhoeck utilizează microscopul pentru a studia
câteva dintre microorganisme. În plus, Girolamo Fracastoro discută căile de intrare a „seminţelor bolii” în
organism: a. pe gură, b. prin respiraţie, c. prin răni, d. direct prin piele. Mai mult decât atât, clasifică
„contagiul” drept fiind de trei feluri: a. prin contact direct (ex. în tuberculoză, lepră, sifilis); b. prin
contact indirect, prin fomites (haine, aşternuturi, farfurii) şi c. la distanţă („seminţele morbigene” fiind
purtate la distanţă de către vânt, ploaie, apa râurilor etc., ca în cazul ciumei). Cu toate că a oferit
incredibil de multe explicaţii, cu toate că teoriile sale au fost în bună parte confirmate ulterior, la acea
vreme nu au fost acceptate iar teoria „miasmelor morbigene” a fost pentru încă mult timp considerată ca
fiind valabilă.
Cu toate acestea, se poate spune că Girolamo Fracastoro poate fi recunoscut în istoria medicinei ca
„părintele patologiei infecţioase”.
revenire sus
1.1.2. Robert Koch (1843-1910)
Alături de Louis Pasteur poate fi considerat “părintele bacteriologiei”. În 1905 meritele sale au fost
recunoscute, primind premiul Nobel, acordat pentru cercetările în domeniul tuberculozei.
S-a născut în 1843 în Clausthal. A studiat medicina la universitatea din Gottingen şi Hanovra iar în
1866 a absolvit facultatea şi a fost numit medic de circumscripţie. A practicat medicina în mai multe
localităţi germane. În 1868 s-a stabilit în Wolstein (astăzi această localitate se află în Polonia). În timpul
şederii la Wolstein a studiat Bacillus anthracis într-un laborator improvizat în propria locuinţa. Aici a creat
celebrele postulate.
Bacillus anthracis a fost descoperit de Pollender, Reyer şi Davaine dar Robert Koch a fost cel ce a
demonstrat că această bacterie e cauza îmbolnăvirilor cu antrax “cărbune” (nume dat datorită culorii
închise a leziunilor din această boală). Prin studiile amănunţite a descoperit fenomenul de sporulare şi a
fost primul cercetător care a folosit tehnica fotografiei în microbiologie, el fotografiind câmpurile
microscopice.
În 1880 a fost angajat în ministerul sănătăţii unde şi-a continuat cercetările avându-l colaborator
printre alţii pe Lofler. În 1891 s-a înfiinţat Institutul pentru Studierea şi Combaterea Bolilor Infecţioase
11
din Berlin, instituţie care la 30 de ani de la descoperirea bacilului tuberculozei a primit numele marelui
savant.
Infecţia cu Mycobacterium era o mare problemă în secolul 19. Unul din 7 oameni suferea de această
boală, multe dintre îmbolnăviri evoluând nefast, spre deces. În 1881 Robert Koch a izolat bacilul
cauzator şi a reuşit să îl cultive pe medii artificiale. În 1901 la congresul britanic despre tuberculoză,
savantul a dăruit organizatorilor 5 eprubete în care se aflau colonii provenite din cultivarea succesiva de
435 de ori a bacililor pe care îi identificase cu 20 de ani în urmă (în 1891 Heinrich Gunther, un muncitor
de 32 de ani, a fost internat şi după câteva zile a murit, se pare, datorită unei tuberculoze miliare; la
necropsie Robert Koch a prelevat material bioptic, a inoculat iniţial pe animale de laborator bacteriile
provenite din acest material, ulterior reuşind să le cultive şi în vitro; în 24 martie 1882, Robert Koch a
făcut publice descoperirile sale privind izolarea şi identificarea agentului patogen al tuberculozei).
Cercetările nu s-au oprit aici, Robert Koch continuând să aprofundeze studiul mycobacteriilor dar
abordând şi alte microorganisme. După succesul identificării bacilului tuberculos a urmat o perioada mai
puţin fastă, el încercând să folosească iniţial ”Alt-Tuberkulin” ulterior ”Neu-Tuberkulin” (un filtrat de
cultură bacteriană) ca şi tratament. Insuccesul i-a adus numeroase critici dar experimentul a avut şi o
parte bună, aceste încercări reprezentând momentul de pionierat pentru evidenţierea hipersensibilităţii
de tip IV, tuberculinică, iar tuberculina va fi ulterior utilizată în diagnostic și studii epidemiologice.
revenire sus
13
2.STRUCTURA CELULEI BACTERIENE
2. 1. Caracteristici
Bacteriile se pot clasifica după mai multe criterii, însă o variantă utilă de clasificare este clasificarea
în funcţie de structură şi aspectul peretelui bacterian, bacteriile putând fi:
- rigide, cu perete dens, imobile sau mobile; unele dintre aceste bacterii pot forma micelii (ex.
bacterii din genurileMycobacterium, Actinomyces, Streptomyces, Nocardia); dacă majoritatea bacteriilor
studiate sunt cultivabile pe medii artificiale există şi bacterii care pot fi denumite ca paraziţi strict
intracelulari (ex. genurile Rickettsia, Chlamydia);
- flexibile, cu perete celular subţire (ex. spirochetele, Treponema spp, Leptospira spp.);
- lipsite de perete celular (ex. bacteriile din genul Mycoplasma).
Celula bacteriană este o celulă procariotă şi are caracteristici structurale diferite în comparaţie cu
celula eucariotă
Forma
2. 2. 1. În funcţie de formă, bacteriile se pot grupa în mai multe categorii şi pot avea:
a). formă cocoidală, cu diametre egale sau inegale (coci), dispuse izolat sau grupat. Majoritarea
steptococilor şi stafilococii sunt sferici, enterococii sunt ovalari, pneumococii sunt lanceolaţi, gonococii şi
meningococii pot fi reniformi.
14
Dispunerea bacteriilor depinde de mediul de cultură în care se dezvoltă, de vârsta culturii
bacteriene, de alte aspecte fiziologice precum şi de modul în care are loc diviziunea în cursul procesului
de creştere şi multiplicare (planul de diviziune).
Modul de dispunere poate fi considerat, cu anumite rezerve, caracteristic pentru unele genuri de
bacterii, de ex.:
- stafilococii sunt coci sferici dispuşi în grămezi („ciorchine”);
- pneumococii sunt coci lanceolaţi dispuşi doi câte doi, eventual înconjuraţi de o capsulă comună (în
diplo);
- streptococii sunt coci dispuşi în lanţuri etc.;
b). formă de bastonaş (bacili, „rods”), drepţi cu capetele uşor rotunjite (enterobacterii), drepţi cu
capetele tăiate drept (Bacillus anthracis), fuziformi, cu ambele capete ascuţite (Fusobacterium
nucleatum), dispuşi uneori într-un mod caracteristic (de exemplu „în palisade”, ca şi scândurile dintr-un
gard - bacilii pseudodifterici);
c). aspect cocobacilar (exemplu H. influenzae, B. pertussis, B. abortus);
d). actinomicete, care în culturi tinere formează filamente lungi, ramificate (asemănător
mucegaiurilor); aceste filamente se fragmentează şi rezultă aspecte bacilare (ex. Actinomyces israelli);
e). forma spiralată (bacili curbi - V. cholerae, spirili şi spirochete - T. pallidum).
Unele bacterii, chiar şi atunci când rezultă prin multiplicarea unei singure celule „mamă” prezintă un
pleomorfism deosebit de accentuat (de exemplu Proteus spp.).
În culturi vechi sau sub influenţa unor factori fizici, chimici, biologici, sub tratament cu antibiotice
etc., pot apărea forme modificate: filamentoase, umflate, ramificate etc., care pot crea confuzii de
diagnostic pentru examinatorul fără experienţă sau care nu face o examinare ţinând cont de context.
Dacă are loc repicarea acestora pe mediu de cultură proaspăt iar examinarea ulterioară se face la timpul
potrivit (având în vedere durata optimă de multiplicare) vor rezulta forme „tipice” pentru specia
respectivă.
Dimensiunile
2. 2. 2. Dimensiunile variază în funcţie de gen, specie, condiţiile de mediu, vârsta şi stadiul de
dezvoltare al culturii. În general bacteriile au dimensiuni de ordinul micrometrilor, de exemplu, pentru
coci 0,5-2 µm, iar pentru bacili 0,3-2/0,5-10 µm. Dintre bacteriile vizibile la microscopul optic, Francisella
tularensis (discutată astăzi în legătură cu posibile atacuri teroriste) poate avea dimensiuni mici, de circa
0,3-0,6 µm / 0,2 µm. Rickettsiile, chlamydiile şi mycoplasmele nu sunt vizibile la microscopul optic
datorită dimensiunilor foarte mici. Flagelii pot atinge dimensiuni de până la 10µm. Formele filamentoase
rezultate după tratamentul cu antibiotice pot depăşi această dimensiune. Bacteriile din genul Proteus pot
prezenta „în mod natural” forme filamentoase, de dimensiuni mari.
Dacă în 1993 a fost pusă în evidenţă Epulopiscium fishelsoni (60-800 µm / 200-500 µm), cea mai mare
15
bacterie cunoscută astăzi este Thiomargarita namibiensis, o proteobacterie Gram negativă, potenţial
vizibilă cu ochiul liber (dimensiuni între 100–300 µm şi până la 750 µm). (1999)
Datorită dimensiunilor mici, bacteriile pot fi vizualizate numai cu ajutorul microscopului, fie clasic, cu
lumina transmisă direct, atunci când utilizând un ocular cu o mărire de 10× şi un obiectiv (de imersie)
cu o mărire de 90-100 X, se realizează o amplificare a dimensiunilor bacteriene de circa 900-1.000 X, fie
utilizând alte tipuri de microscoape. Spre exemplu, utilizarea preparatelor colorate prin metode în care
marcajul se face cu subtanţe fluorescente va creşte puterea de rezoluţie iar numărul de câmpuri
investigate poate fi mai redus în comparaţie cu investigarea unui preparat colorat clasic (a se vedea
capitolul referitor la genul Mycobacterium).
Iluminarea în câmp obscur permite examinarea preparatelor proaspete şi evidenţierea agentului
etiologic al sifilisului (T. pallidum), agentul etiologic al leptospirozei (Leptospira spp.), inclusiv mobilitatea
acestora.
Informaţii privind preparatele microscopice, executarea şi colorarea frotiurilor, tehnica examenului
microscopic în diagnosticul microbiologic sunt prezentate în anexa nr. 1.
2. 3. 1. 3. Mezozomii
18
Mezozomii sunt structuri care se formează prin invaginarea membranei citoplasmatice de care
rămân legaţi. Sunt prezenţi în special la bacteriile Gram-pozitive. Au structura chimică a membranei
citoplasmatice şi aceleaşi funcţii în permeabilitate şi respiraţie. Cu un capăt se pot fixa de materialul
nuclear, favorizând distribuirea în mod egal a genomului între cele două celule fiice. Au rol şi în formarea
septului transversal.
2. 3. 1. 4. Citoplasma
La microscopul optic, pe preparatele colorate uzual, observăm numai citoplasma bacteriană, intens
bazofilă. Detaliile structurale (nucleoplasmă, ribozomi, incluzii) se pot observa numai cu ajutorul
microscopului electronic. Are o structură mai simplă faţă de citoplasma eucariotelor. Este constituită
dintr-un sistem coloidal format din proteine, enzime, lipide, pigmenţi, hidraţi de carbon, săruri minerale
şi apă. Conţine în mod caracteristic 80% apă, menţine într-un sistem coloidal proteine, carbohidraţi,
lipide, săruri etc, conţine o mare cantitate de ARN (ex. ARNm, ARNt).
Particulele citoplasmatice studiate sunt: ribozomii, incluziile, vacuolele; în citoplasmă pot exista şi
elemente facultative, plasmidele (formate din ADN extracromozomial).
La celula tânără citoplasma este intens colorată, omogenă, conţine ARN în cantitate mare, este clară
în timp ce la celula „bătrână” citoplasma are aspect granular.
2. 3. 1. 5. Ribozomii: structură, rol
Ribozomii au formă aproximativ sferică, pot fi văzuţi la microscopul electronic. Mărimea lor (circa 10-
20 nm) depinde de concentraţia ionilor Mg2+ şi K+. Unii ribozomi sunt liberi în citoplasmă, în timp ce alţii
apar legaţi de faţa internă a membranei citoplasmatice. Din punct de vedere chimic conţin circa 65%
ARNr (ribozomal). Au constanta de sedimentare de 70 unităţi Swedberg dar sunt constituiţi din două
subunităţi de câte 30S şi respectiv 50S. În subunitatea mică intră o singură moleculă de ARNr, 16S şi 21
de tipuri de proteine ribozomale. În subunitatea mare intră mai multe tipuri de molecule de ARNr (ex.
ARNr 23S). Între cele două subunităţi se formează canalul prin care trec moleculele de ARNm (mesager)
în cursul sintezei proteice. Se apreciază că într-o bacterie cu dimensiuni medii, aflată în faza de creştere
activă, se sintetizează circa 500 ribozomi / minut, metabolismul bacterian fiind foarte intens.
Ribozomii au rol esenţial în procesul de biosinteză proteică. Au tendinţa de a se grupa în polisomi
(poliribozomi) cu eficienţă sporită în biosinteza proteică. În aceste condiţii, la un moment dat pe aceeaşi
moleculă de ARNm se află în scopul traducerii mesajului genetic mai mulţi ribozomi, care constituie un
ansamblu care poartă numele de polisom.
Biosinteza proteică
Biosinteza proteinelor are loc la nivelul ribozomilor.
Cu toate că secvenţa de aminoacizi din structurile proteice este „dictată” de secvenţa de baze
azotate din ADN, pentru că nu există afinitate şi posibilitate de cuplare între ADN şi aminoacizi este
necesar ca o altă structură să permită poziţionarea aminoacizilor în lanţul viitoarei proteine.
Iniţial are loc transcrierea informaţiei genetice pe ARNm (mesager), care va transporta această
informaţie de la genom la nivelul ribozomilor, sub forma unei copii complementare. Gena este segmentul
de ADN care deţine informaţia genetică pentru sinteza unei proteine. Segmentul de ADN care
controlează sinteza unui polipeptid poartă numele de cistron.
ARNm care deţine informaţia genetică pentu sinteza unei singure catene de polipeptid poartă
numele de ARNm monocistronic.
19
La bacterii, de obicei, o moleculă de ARNm trebuie să poarte informaţia necesară pentru sinteza mai
multor catene diferite şi în acest caz ARNm poartă numele de ARNm policistronic. Această situaţia
particulară este datorată dimensiunii mici a acestor procariote precum şi metabolismului intens care are
loc în cursul procesului de creştere şi multiplicare. Spre exemplu, la E. coli, pentru metabolizarea lactozei
sunt necesare potenţial 3 enzime diferite, iar mesajul genetic pentru sinteza acestora se află deţinut de o
singură moleculă de ARNm policistronic.
De regulă, numai o catenă de ADN este folosită drept matriţă pentru ARNm. Transcrierea mesajului
genetic este selectivă (se desfăşoară între promotor şi semnalul de terminare) şi este controlată de ARN
polimeraza ADN-dependentă.
Pentru traducerea mesajului genetic este necesară intervenţia la nivel ribozomal a moleculelor de
ARNt (de transfer). Acestea au o dublă specificitate (pentru fiecare dintre cei 20 de aminoacizi există
una sau mai multe molecule de ARNt; în acelaşi timp există enzime specifice fiecărui tip de aminoacid
care controlează legarea corectă a aminoacizilor activaţi pe ARNt corespunzător). La nivelul fiecărui ARNt
există trei nucleotide (anticodon) complementar codonului care corespunde aminoacidului.
ARNt nu are niciodată la anticodon succesiunea UUA, CUA sau ACU şi în aceste condiţii ne putem
explica motivul pentru care codonii UAA, UAG şi UGA sunt codoni stop.
Succesiunea specifică a nucleotidelor este transpusă într-o secvenţă specifică de aminoacizi care
intră în constituţia lanţului polipeptidic din proteina în curs de formare.
2. 3. 1. 6. Incluziile
Incluziile sunt formaţiuni care apar în citoplasmă la sfârşitul perioadei de creştere activă.
Dimensiunea şi forma incluziilor citoplasmatice pot varia în funcţie de condiţiile externe. Pot conţine
polimeri anorganici (de exemplu, corpusculii metacromatici ai genului Corynebacterium, la a căror
descoperire a avut un rol important Profesorul Victor Babeş), substanţe anorganice simple, polimeri
organici (rezervor energetic mai ales la germenii sporulaţi aerobi), lipide, cristale, granulaţii de sulf etc.
2. 3. 1. 7. Vacuolele
Vacuolele sunt formaţiuni sferice care conţin diferite substanţe în soluţie apoasă. Au o membrană
lipoproteică numită tonoplast. Au fost descrise în mai ales la bacteriile acvatice şi ar putea avea un rol în
plutirea acestora.
2. 3. 1. 8. Nucleul
Masa nucleară vine în contact direct cu citoplasma. Este localizată în partea centrală a celulei.
Conţine ADN, nu are nucleoli. Are afinitate pentru coloranţii bazici, dar pe preparatele colorate uzual este
mascat de bazofilia intensă a citoplasmei bogată în ARN.
Unicul cromozom bacterian este alcătuit dintr-o singură moleculă de ADN dublu catenar, cu aspectul
unui fir lung (1.000-2.000 µm), închis într-un inel şi replicat pe el însuşi, superspiralat. Mărimea
cromozomului poate să difere în funcţie de specia bacteriană (şi respectiv numărul de perechi de baze);
cea mai mică celulă bacteriană ar fi cea de Mycoplasma spp., la care dimensiunea este de 4.700 kpb, în
timp ce cromozomul de E. coli poate avea o dimensiune de circa 3 ori mai mare. Având în vedere că
dimensiunea bacteriilor este de circa 1-2 mm în cazul cocilor şi de câteva ori mai mare în cazul bacililor,
pentru ca materialul genetic să poată fi conţinut în acest spaţiu redus, acesta trebuie să fie compactat
într-un mod remarcabil şi astfel, rezultă nucleoidul bacterian care poate fi diferenţiat microscopic.
Nucleoidul este format din molecula de ADN asociată cu proteine şi o cantitate variabilă de ARN.
20
Relativ recent (1989) s-a descoperit că există şi bacterii care deţin cromozomi lineari (ex. Borrelia
burgdorferi). Toate speciile din genul Borrelia deţin şi plasmide lineare.
Replicarea cromozomului bacterian se face printr-un mecanism semiconservativ. Aşa cum am
menţionat, cromozomul este unic, însă în celula care se dezvoltă rapid există posibilitatea ca înainte ca
prima replicare să se fi încheiat să se iniţieze încă o replicare şi în acest caz celula bacteriană va putea fi
meroploidă (doar anumite regiuni cromozomiale sunt copiate de mai multe ori) sau chiar poliploidă (tot
cromozomul a fost copiat de mai multe ori). Dacă replicarea cromozomială nu este succedată de
diviunea celulei (aşa cum se întâmplă în mod obişnuit), putem remarca în celula bacteriană existenţa mai
multor cromozomi. Cromozomii suplimentari (în total 2 sau 4) nu aduc o informaţie genetică diferită
pentru că ei sunt copii ale cromozomului iniţial (identici cu acesta).
Nucleul deţine informaţia genetică necesară proceselor vitale de creştere şi multiplicare.
Codonul
Din punct de vedere funcţional, 3 nucleotide consecutive din structura moleculei de ADN formează
un codon. Codonii deţin informaţia genetică pentru a plasa într-o anumită secvenţă un anumit
aminoacid, în lanţul polipeptidic care va fi sintetizat la nivelul ribozomilor.
Cistronul
Cistronul reprezintă o subunitate funcţională a genei, capabilă să determine independent sinteza
unui lanţ polipeptidic.
Gena
Gena structurală reprezintă o porţiune a genomului, respectiv o anumită secvenţă de nucleotide
dispuse liniar. Genele structurale reprezintă circa 90% din ansamblul informaţiei genetice. Poartă înscrisă
în structura sa informaţia genetică necesară pentru sinteza unei proteine specifice, structurale sau
funcţionale (enzime).
2. 3. 2. Structuri facultative
Structurile facultative ale celulei bacteriene sunt reprezentate de capsulă, cili (flagelii), fimbrii (pili) şi
spori (forme de rezistenţă).
2. 3. 2. 1. Capsula: structură, rol, evidenţiere
Numeroase bacterii sintetizează polimeri organici (de obicei polizaharide) care formează în jurul
celulei o matrice fibroasă, numită glicocalix.
La unele bacterii glicocalixul aderă strâns de celula bacteriană şi reprezintă capsula. Există bacterii
care deţin o capsulă bine definită, cu structură polizaharidică ( S. pneumoniae, K. pneumoniae, unele
tulpini de E. coli etc) sau cu structură polipeptidică (Bacillus anthracis etc).
La alte bacterii, glicocalixul formează o reţea laxă de fibrile care se pierde parţial în mediu şi poate fi
separată de corpul bacterian prin centrifugare, capsula flexibilă, care nu este vizibilă la microscopul
optic.
Roluri:
- factor de virulenţă, împiedicând fagocitarea bacteriei şi favorizând invazivitatea;
- rezistenţă faţă de surfactanţi, anticorpi;
- permite aderarea unor bacterii (rol de adezină);
- barieră protectoare faţă de bacteriofagi, protozoare;
21
- conţine substanţe cu specificitate antigenică (de specie sau de tip) - antigenul K. Spre exemplu, în
cazul S. pneumoniaeexistă peste 90 tipuri antigenice capsulare în timp ce la E. coli sau la Klebsiella
pneumoniae există peste 80 tipuri antigenice capsulare.
Referitor la modalităţile de evidenţiere ale structurilor capsulare, este de menţionat că prin coloraţia
cu albastru de metilen sau tuş de China / India, în jurul bacteriei apare un halou necolorat. Există şi
coloraţii speciale pentru capsulă, de exemplu coloraţia Hiss. Structura antigenică a capsulei permite
identificarea bacteriilor, spre exemplu prin reacţia de umflare a capsulei (Neufeld) atunci când se
folosesc seruri polivalente sau monovalente anti-capsulare pentru identificarea pneumococilor.
2. 3. 2. 2. Flagelii: structură, rol, localizare
Cilii sau flagelii conferă mobilitate bacteriilor. Mobilitatea poate fi evidenţiată în preparatul proaspăt
(între lamă şi lamelă) sau pe anumite medii speciale (ex. MIU). Mobilitatea germenilor din
genul Proteus este observată pe orice mediu de cultură solid pe care acest microorganism foarte mobil
se dezvoltă (fenomenul de „invazie”).
Flagelii sunt formaţiuni fine, alungite, flexibile, cu origine la nivelul corpusculului bazal. Acesta este
alcătuit (de ex. la majoritatea bacteriilor Gram-negative) din patru discuri aranjate ca două perechi pe o
structură care trece prin mijlocul lor. Corpusculul bazal este plasat în perete şi membrana citoplasmatică.
Din punct de vedere chimic flagelul este de natură proteică (flagelina).
Roluri:
- în mobilitate (cu o viteză de circa 50 µm / secundă); cilul are o mişcare de rotaţie, asemănătoare
unei înşurubări în mediu şi ca atare corpul bacterian este împins în direcţia opusă; „motorul” rotaţiei e
reprezentat de corpusculul bazal iar energia este obţinută din ATP;
- antigenic (datorită structurii proteice - antigenul H, specific de tip);
- în clasificarea bacteriilor (prin număr şi distribuţie), bacteriile putând fi
- monotriche (cu un flagel dispus la o extremitate), de exemplu Vibrio cholerae, Pseudomonas
aeruginosa;
- lofotriche (cu un mănunchi de flageli dispus la o extremitate);
- peritriche (cu mai mulţi flageli dispuşi de-a lungul suprafeţei bacteriene), de exemplu E.
coli, Proteus mirabilis, Salmonella typhi.
2. 3. 2. 3. Fimbriile (pilii)
Sunt formaţiuni scurte, fine, nu au rol în mobilitate. De obicei pilii sunt mai subţiri decât cilii. Pot fi
foarte numeroase pe suprafaţa majorităţii bacteriilor; pot fi observate numai la microscopul electronic.
Există pili comuni, cu următoarele roluri:
- în aderenţa bacteriană (adezine);
- conţin receptori specifici pentru bacteriofagi;
- antigenic (la unele bacterii), ex. N. meningitidis şi N. gonorrhoeae.
Există pili „F” (sexuali), determinaţi genetic de factorul de fertilitate F (episom). Aceştia îndeplinesc
rolul canalului de conjugare.
2. 3. 2. 4. Sporii: structură, compoziţie chimică, rol, localizare
Fenomenul de sporogeneză este mai des întâlnit la Bacillaceae (genurile Clostridium şi Bacillus). Pe
sol, în condiţii de uscăciune, la adăpost de lumina solară directă, endosporii persistă zeci şi poate sute de
ani.
22
Materialul genetic este concentrat şi, împreună cu apa legată, lipide, Ca ++, Mg++, este înconjurat de
un strat protector (membrana sporală, cortexul sporal, învelişurile sporale). „Sâmburele” sporal
împreună cu membrana citoplasmatică formează protoplastul sporal.
Roluri:
- formă de rezistenţă şi conservare a speciei (în condiţii favorabile un spor se poate transforma într-
o bacterie / forma vegetativă; procesul de formare a sporului ar putea fi considerată una dintre cele mai
primitive forme de diferenţiere, dar nu este un proces de reproducere celulară aşa cum se întâmplă la
fungi sau paraziţi);
- rezistă la căldură, uscăciune, la anumite substanţe chimice şi antibiotice, raze UV etc.
Sporul poate fi localizat:
- central sau subterminal, mai mic decât celula (ex. la Bacillus anthracis);
- central sau subterminal, mai mare decât celula (ex. la Clostridium hystoliticum etc);
- terminal (ex. la Clostridium tetani, cu aspectul de „băţ de chibrit”).
Poate fi evidenţiat prin coloraţii speciale (de exemplu verde malachit) sau prin coloraţia Gram (locul
sporului rămâne necolorat).
Este sensibil la formol, propiolactonă etc. Este distrus prin autoclavare.
2. 4. Povestiri adevărate
2. 4. 1. Sporii bacterieni; Izbucnire epidemică de infecţii cu Clostridium novyi tipA în rândul
utilizatorilor de droguri administrate injectabil, în Scoţia
În Scoţia, în perioada aprilie-august a anului 2000, s-a raportat un număr fără precedent de
îmbolnăviri în rândul utilizatorilor de droguri pe cale injectabilă. Au fost identificate 60 de cazuri (23
confirmate şi 37 probabile), la subiecţi cu vârsta medie de 30 de ani, dintre care 31 erau de sex feminin
(51,66%). Toţi pacienţii erau consumatori de droguri administrate prin injecţie intramuscular şi
subcutanat (în acest caz a fost vorba despre un preparat compus din heroină şi acid citric). 20 (87%)
dintre cazurile confirmate au evoluat către deces. Din totalul pacienţilor, 15 au prezentat fasciită
necrozantă, 22 au dezvoltatedem la locul de injectare, iar 13 au prezentat pleurezie.
În 20 (54%) dintre cazurile probabile şi 14 (61%) dintre cele confirmate au existat legături familiale
sau sociale între subiecţi. Semnele clinice cel mai des înregistrate au fost: durere şi edem marcat la
nivelul locului de injectare; în câteva dintre cazuri, în afară de aceste semne, pacienţii au prezentat
insuficienţă multi-organică. O caracteristică a sindromului de afectare multi-organică a fost reprezentată
de reacţia leucemoidă, cu leucocitoză la valori foarte ridicate, cu deviere la stânga a formulei leucocitare
(numeroase leucocite tinere, nesegmentate).
Probe din heroina confiscată (pură şi în combinaţie cu acid citric), probe de sânge şi fragmente
tisulare (recoltate antemortem şi postmortem) au fost trimise către laboratoarele de referinţă din
Glasgow şi Londra, dar şi către laboratorul Centrului pentru prevenirea şi controlul bolilor (CDC, Atlanta,
SUA). Supoziţia iniţială (infirmată prin testele de laborator) a fost cea de contaminare a drogurilor
cu spori de Bacillus anthracis.
Testele efectuate pe probele recoltate au evidenţiat contaminarea masivă cu spori de Clostridium
novyi, tip A, a drogurilor injectabile recuperate (probabil datorită condiţiilor precare de obţinere, stocare
şi transport ale acestora). Autorităţile au emis ipoteza că o cantitate mult mai mare de droguri se poate
23
afla în circulaţie şi această situaţie ar putea fi considerată ca o adevărată „bombă biologică” pentru
populaţia consumatoare de droguri. Microorganismul cel mai frecvent izolat din probele recoltate de la
pacienţi (în condiţii de anaerobioză şi transportate corespunzător, la adăpost de oxigen) a
fost Clostridium novyi.Din probele recoltate s-au izolat, de asemenea, Clostridium
perfringens şi Clostridium saccharolyticum. În cazul în care autorităţile de sănătate publică nu s-ar fi
gândit, în cazul diagnosticului diferenţial, şi la o ipoteză în care germenii anaerobi să fie implicaţi,
izbucnirea epidemică ar fi putut să rămână fără diagnostic etiologic.
Pe lângă prezenţa sporilor, demonstrată prin tehnici de laborator, a fost utilizată testarea efectului
citopatic asupra culturilor monostrat de linii celulare Vero şi astfel s-a demonstrat prezenţa alfa-toxinei
produsă de C. novyi,tip A, în probele recoltate.
Alfa-toxina este eliberată la nivelul procesului infecţios (locul injectării drogului, unde prin realizarea
condiţiilor de anaerobioză, sporii trec în formă vegetativă se multiplică şi bacteriile sintetizează
exotoxina), în ţesutul subcutanat, conduce la instalarea unui răspuns inflamator local intens, cu edem
marcat. Alfa-toxina are o contribuţie patogenică şi în situaţiile cu evoluţie spre insuficienţă multi-
organică, asociat cu hipotensiune arterială, reacţie leucemoidă şi fasciită necrozantă. Condiţiile de
anaerobioză sunt atinse deoarece soluţia de heroină tamponată cu acid citric produce necroză tisulară la
locul injectării (în cazul în care soluţia ar fi fost injectată intravenos, sporii ar fi fost distruşi de către
mecanismele de apărare ale gazdei, la nivel sanguin).
În cazul în care ipoteza unei afectări datorită sporilor proveniţi de la bacterii anaerobe ar fi fost
emisă de la început şi dacă nu s-ar fi instituit (la o parte dintre cazuri) antibioterapia empirică cu
antibiotice / chimioterapice cu spectru larg anterior recoltării probelor, procentul de infecţii cu
etiologie confirmată ar fi putut să fie mai mare.
S-au emis mai multe comunicate de presă pentru a pune în temă populaţia şi pentru a alerta
comunitatea medicală şi pe eventualii consumatori de droguri.
2. 4. 2. Capsula bacteriană
Multe s-au scris despre Neisseria meningitidis, meningococul, răspunzător pentru izbucniri epidemice
de meningită, cu urmări îngrijorătoare (decese, sechele). Infecţiile meningococice rămân încă o
problemă de sănătate la nivel mondial iar înţelegerea mecanismelor prin care Neisseria
meningitidis eludează mecanismele de apărare ale gazdei este foarte importantă. Meningococul
determină boala prin invazivitate şi multiplicare, aderând la celulele umane şi invadându-le însă după
această etapă procesul rămâne, în mare parte, un mister.
Unul din atributele de patogenitate ale meningococului este reprezentat de capsula polizaharidică,
cu un rol clar demonstrat în supravieţuirea bacteriană în fluidele extracelulare. Studii recente au arătat
că aceeaşi structură contribuie şi la supravieţuirea intracelulară.
Sistemul complement este unul dintre factorii de apărare foarte importanţi în protecţia subiecţilor
faţă de infecţia cu N. meningitidis; totuşi acest microorganism s-a adaptat şi a dezvoltat mecanisme
proprii de protecţie anti-complement.
Structurile bacteriene de genul capsulei polizaharidice precum şi cele care „imită” structurile proprii
(self) ale gazdei sau leagă molecule proprii organismului salvează germenul de la liză celulară şi
fagocitoză. Se pare că Neisseria meningitidis îşi foloseşte eficient proprietăţile, atât extra- cât şi
intracelular.
24
Prin inocularea de tulpini capsulate şi necapsulate marcate izotopic în culturi celulare de celule
fagocitare şi nefagocitare umane s-a încercat monitorizarea invazivităţii şi multiplicării intracelulare.
Rezultatele au fost surprinzătoare deoarece capsula, care diminuează capacitatea de aderare la
membrana celulară şi de intrare a germenului în celulă, este esenţială pentru supravieţuirea intracelulară
a microorganismului. Un posibil mecanism prin care se produce această supravieţuire ar fi cel al
rezistenţei capsulare la peptidele cationice antimicrobiene (CAMPs – cationic antimicrobial peptides),
componente ale sistemului imun înnăscut.
Degradarea intracelulară a bacteriilor internalizate poate fi legată de o multitudine de mecanisme,
printre care acţiunea pH-ului, stresul oxidativ sau acţiunea enzimelor litice şi a peptidelor antimicrobiene.
Teoretic prezenţa capsulei ar putea interfera, direct sau indirect, cu oricare din aceste mecanisme. În
particular s-a evidenţiat deja medierea rezistenţei pentru Klebsiella pneumoniae la CAMPs de către
capsula sa, polizaharidică.
În ceea ce priveşte capsula N. meningitidis, studii preliminare au arătat deja că tulpinile necapsulate
sunt mai susceptibile acţiunii defensinelor, protegrinelor şi polimixinei B, asemănătoare CAMPs.
Polimixina B, un peptid ciclic de origine microbiană, a fost folosită ca model al CAMPs datorită
proprietăţilor ei de permeabilizare a membranei externe a germenilor Gram-negativi. Experimental s-a
măsurat rata de supravieţuire a meningococilor timp de 45 de minute în diferite concentraţii de
polimixină B. Rezultatele au confirmat că absenţa capsulei scade viabilitatea microbiană în prezenţa
polimixinei B. Acest model pe culturi celulare susţine ipoteza conform căreia capsula N.
meningitidis reprezintă un mecanism major pentru supravieţuirea intracelulară a bacteriei din cursul
infecţiei.
2. 4. 3. Importanţa examenului microscopic
Examenul bacteriologic direct are o mare importanţă pentru diagnosticul de etapă, dar şi pentru cel
definitiv; poate schimba radical indicaţia de tratament precum şi prognosticul pentru respectivul pacient.
În cadrul examenului bacteriologic direct, examenul preparatului proaspăt între lamă şi lamelă a rămas
„ruda săracă”, fiind mai rar folosit (prea rar); informaţiile obţinute pot fi însă foarte utile. La un pacient
seropozitiv stadiul C3, cu diaree trenantă şi severă, examenul citobacteriologic a arătat prezenţa unor
formaţiuni rotund ovalare interpretate ca levuri, probabil candidozice. În ciuda tratamentului antifungic
pentru levuri diareea a rămas la fel de severă şi starea gravă. La o nouă examinare a materiilor fecale,
de data aceasta şi a preparatului proaspăt între lamă şi lamelă, colorat cu albastru de metil, s-au văzut
(datorită colorantului) aceleaşi formaţiuni rotunde dar cu capsulă, ridicându-se suspiciunea unei infecţii
cu criptococ, care ulterior s-au identificat după culturi şi repicări repetate pe medii specifice. Dar ce este
de subliniat este că schimbarea imediată a tratamentului a condus la remiterea simptomatologiei şi
îmbunătăţirea stării pacientului.
2. 5. Evaluarea cunoştinţelor
1. Alegeţi afirmaţia falsă:
a. Bacilii au formă rotundă şi se adună în grămezi
b. Haemophilus influenzae este un cocobacil
c. Dimensiunile bacteriene sunt de ordinul micrometrilor şi din acest motiv bacteriile se pot examina la
microscopul optic
25
d. Aspectul “in diplo” este caracteristic pneumococilor
e. Există bacterii cu dimensiuni foarte mici (ex.: Chlamydia spp. şi Mycoplasma spp.) care nu pot fi
vizualizate la microscopul optic
2. Despre componentele structurale ale celulei bacteriene este adevărată următoarea afirmaţie:
a. Peretele bacteriilor Gram-negative nu conţine mureină
b. Membrana celulară este o structură facultativă
c. Nucleul bacterian este învelit de membrană nucleară şi conţine numeroşi nucleoli
d. Capsula bacteriană reprezintă un factor de virulenţă şi favorizează invazivitatea
e. Bacteriile cu flageli sunt imobile
3. Peretele bacterian:
a. Este o componentă constantă a bacteriilor din toate genurile
b. Este degradat cu uşurinţă sub acţiunea lizozimului (muramidazei)
c. Are aceeaşi grosime atât la bacteriile Gram-negative, cât şi la cele Gram-pozitive
d. Nu este sediu de acţiune pentru nici un tip de antibiotic
e. Conţine antigene capsulare
4. Care dintre enunţuri este corect în ceea ce priveşte structurile facultative bacteriene:
a. Sporii bacterieni au rol în replicarea ADN-ului
b. Mobilitatea bacteriilor este dată de fimbrii
c. Sporul este o formă de rezistenţă bacteriană
d. Capsula este ubicuitară la toate genurile bacteriene
e. O bacterie nu poate avea mai mult de un singur flagel
5. Sporii bacterieni:
a. Nu se distrug prin autoclavare
b. Sunt forme de rezistenţă ale bacteriilor şi se pot transforma în forme vegetative
c. Nu se vizualizează microscopic
d. Pentru orice tip bacterian, sunt localizaţi în acelaşi loc şi anume central
e. Sunt caracteristici tuturor speciilor bacteriene
3. Fiziologia bacteriană
3. 1. Constituţia chimică a bacteriilor
3. 1. 1. Apa: procent, rol
Apa reprezintă peste 75-85% din greutatea umedă a bacteriei. Există apă liberă (mediu de
dispersie) şi apă legată fizico-chimic cu diferite structuri. Sporii au puţină apă, în special apă legată.
Bacteriile sunt fiinţe „acvatice” prin excelenţă. Vacuolele sunt formaţiuni sferice care conţin diferite
26
substanţe în soluţie apoasă. Au o membrană lipoproteică numită tonoplast. Au fost descrise în special
la bacteriile acvatice şi ar putea avea un rol în plutirea acestora.
Dintre rolurile îndeplinite am putea aminti faptul că apa reprezintă un mediu de dispersie, este
reactiv în reacţiile metabolice, reprezintă etapa finală a unor reacţii oxidative etc.
Prin deshidratare (desicare) este posibilă prezervarea culturilor bacteriene timp îndelungat. O
metodă des utilizată datorită eficienţei sale este liofilizarea (criodesicarea). Studiile ştiinţifice au arătat
că, în general, germenii Gram-negativi rezistă mai puţin timp liofilizării decât cei Gram-pozitivi, fenomen
care a fost pus pe seama stratului mai subţire de peptidoglican. (1)
3. 1. 2. Substanţele minerale
Substanţele minerale reprezintă 2-30% din greutatea uscată a bacteriei şi variază în funcţie de
specie, vârsta culturii, compoziţia chimică a mediului. Unele elemente intră în compoziţia diferitelor
structuri (exemplu sulful intră în structura aminoacizilor, fosforul în structura fosfolipidelor etc).
Dintre rolurile îndeplinite am putea aminti următoarele:
· favorizează schimburile cu mediul,
· participă la reglarea presiunii osmotice,
· pot stimula creşterea şi funcţia bacteriei (de exemplu fierul în cazul bacilului difteric, care
condiţionează şi producerea de toxine),
· activează unele sisteme enzimatice, contribuie la reglarea pH-ului şi a potenţialului de oxido-
reducere.
Aşa cum am menţionat anterior, la nivel ribozomal se găsesc Mg ++ şi K+.
3. 1. 3. Glucidele
În structura bacteriană se pot găsi glucide simple cu rol în metabolismul intermediar glucidic,
precum şi glucide complexe, de exemplu poliozide. Acestea din urmă au o serie de roluri, spre ex.
participă la realizarea structurii peretelui celular, fac parte din capsula unor bacterii etc.
Există teste biochimice în care se urmăreşte utilizarea sau imposibilitatea utilizării unui anumit zahar
de către o bacterie. Aceste teste sunt utile pentru identificarea bacteriei respective (în special în cazul
enterobacteriilor folosind mediile TSI, MIU, sistemele API etc). Testările biochimice sunt de mare utilitate
şi în studiul fungilor (auxanogramă, zimogramă).
3. 1. 4. Proteinele
Există proteine simple (cu rol în metabolismul intermediar protidic) şi proteine complexe, cum ar fi:
· mucoproteinele (ex. mucopolizaharidul de grup al S. pneumoniae, acidul hialuronic din
structuri de tip capsular),
· cromoproteinele (ex. catalaze, peroxidaze, citocromi),
· nucleoproteinele (ex. în acizii nucleici).
Este de remarcat prezenţa în structurile bacteriene a unui aminoacid special, acidul diaminopimelic,
precum şi a aminoacizilor în forma D (ceea ce reprezintă o adaptare biochimică a bacteriilor faţă de
acţiunea nocivă a enzimelor proteolitice).
3. 1. 5. Lipidele
Reprezintă mai puţin de 10% din greutatea uscată a bacteriilor şi variază cantitativ în funcţie de
specie, vârsta culturii (cresc în celulele „îmbătrânite”, reprezentând probabil un semn de
degenerescenţă) şi compoziţia mediului. La mycobacterii, sunt în cantitate mai mare (circa 20-40%), în
special la nivel parietal şi determină o serie de proprietăţi specifice, inclusiv afinitatea tinctorială. Lipidele
27
se pot găsi libere în vacuole, combinate sau făcând parte din diferite structuri ale celulei bacteriene
(perete, membrană, mezozomi).
Dintre lipidele bacteriene putem aminti:
· acizii graşi speciali (ex. acidul mycolic la mycobacterii),
· cerurile (acizi graşi plus alcooli monovalenţi superiori), care se găsesc în cantitate mare la
bacteriile acid-alcoolo-rezistente (ex. în peretele mycobacteriilor, nocardiilor etc). Dintre acestea, ceara D
pare a fi implicată în inducerea hipersensibilităţii întârziate (de tip IV).
· fosfolipidele, cum este lipoidul ubiquitar (difosfatidil glicerol) din Treponema
pallidum (agentul etiologic al sifilisului) sau lipidul A din structura lipopolizaharidului bacteriilor Gram-
negative, cu activitate toxică.
3. 1. 6. Pigmenţii
Pigmentogeneza este caracteristică bacteriilor cromogene şi este dependentă de condiţiile de
cultivare.
Producerea de pigmenţi poate reprezenta un criteriu de identificare (ex. în cazul tulpinilor
de Pseudomonas aeruginosa sau în cazul unor specii din genul Staphylococcus). Trebuie să reţinem încă
de la început faptul că în cazul stafilococilor, pigmentogeneza este doar un caracter orientativ şi nu vom
clasifica drept „patogenă” o tulpină de stafilococ în funcţie de „culoarea” coloniei. Stafilococii sunt
condiţionat patogeni. Testul orientativ privind patogenitatea este testul coagulazei care ar trebui
efectuat în mod obligatoriu pentru toate tulpinile izolate de la pacienţi.
După localizarea pigmentului, bacteriile pot fi:
· cromofore (pigmentul este legat în citoplasmă);
· paracromofore (pigmentul este prezent în perete sau în stratul mucos, de exemplu la S.
aureus sau laStaphylococcus epidermidis);
· cromopare (pigmentul este difuzibil în mediu, de exemplu la Pseudomonas aeruginosa).
În afară de faptul că datorită producerii de pigmenţi (albastru, galben-verde, maro etc. în
cazul Ps. aeruginosa sau auriu, citrin, alb în cazul tulpinilor de Staphylococcus) medicul de laborator se
poate orienta în alegerea testelor de identificare într-un anumit context clinic şi microbiologic.
Putem aminti și faptul că pigmenţii pot avea o serie de roluri, de ex.: rol de protecţie faţă de
radiaţiile UV (pigmenţi carotenoizi), rol antibiotic (exemplu piocianina elaborată de P. aeruginosa faţă
de B. anthracis) şi rol enzimatic.
3. 1. 7. Enzimele
În cazul bacteriilor se poate aprecia că metabolismul este foarte intens. Capacitatea de a elabora
anumite enzime este determinată genetic (există peste 2000 de determinanţi genetici diferiţi), precum şi
prin mecanisme de control care pot modifica bagajul enzimatic în funcţie de necesităţi.
După locul de acţiune, enzimele bacteriene se pot împărţi în:
· enzime extracelulare (exoenzime), de exemplu hidrolazele;
· enzime ectocelulare (în membrana citoplasmatică, reglând permeabilitatea selectivă), de
exemplu permeazele;
· enzime intracelulare.
În raport cu reacţia catalizată, enzimele pot fi: hidrolaze, transferaze, oxidoreductaze, liaze,
izomeraze etc.
28
După modul de apariţie, enzimele pot fi:
· constitutive (există totdeauna în celulă, indiferent de natura mediului);
· inductibile (sunt sintetizate de către bacterie numai ca răspuns la anumiţi compuşi apăruţi
în mediu).
Studierea comportamentului enzimatic este foarte utilă în taxonomie. Fiecare unitate taxonomică
bacteriană (gen, specie) are un spectru de activitate enzimatică propriu; studierea acestuia poate avea o
deosebită importanţă în identificarea bacteriilor.
3. 1. 8. Substanţe cu acţiune antibiotică:
· plasmidul „Col” codifică proprietatea unor bacterii de a elabora bacteriocine, cu efect asupra
altor bacterii receptive înrudite (de exemplu colicinele elaborate de E. coli);
· unele bacterii din genul Bacillus produc antibiotice polipeptidice (de exemplu, B.
licheniformis produce bacitracina, B. brevis sintetizează gramicidina, iar B. polymyxa sintetizează
polimixina; ultimele 2 specii fac parte, astăzi, din alte genuri, vezi capitolul nr. 48).
3. 1. 9. Vitaminele bacteriene
Dintre vitaminele produse de bacterii putem aminti: biotina, care poate fi secretată de exemplu
de E. coli, B. subtilis, B. anthracis etc; tiamina (B1), care poate fi sintetizată de E. coli, riboflavina
sintetizată de B. subtilis, vitaminele B2 şi B12 sintetizate de B. megaterium etc. sau vitaminele din
grupurile B şi K, care pot fi sintetizate sub influenţa florei bacteriene intestinale umane.
3. 1. 10. Factorii de creştere
Factorii de creştere sunt metaboliţii esenţiali pe care bacteria nu-i poate sintetiza pe baza
substanţelor care se găsesc în mediul extern. Factorii de creştere trebuie neapărat incluşi în mediul de
cultură în cazul în care dorim să izolăm microorganismul respectiv, numit „microorganism pretenţios”
(ex. factorii X şi V trebuie incluşi în mediul de izolare pentru Haemophilus influenzae).
Bacteriile patogene sunt heterotrofe. Adaptându-se la viaţa parazitară, devin dependente de o serie
de astfel de factori de creştere (unele sunt atât de dependente încât nu pot fi cultivate „in vitro”, de
exemplu bacilul leprei - Mycobacterium leprae).
3. 2. Metabolismul bacterian
3. 2. 1. Nutriţia bacteriană
Nutriţia bacteriană reprezintă suma proceselor metabolice care conduc la producerea de materiale
convertibile în energie şi în diferite componente celulare. Nutrienţii sunt substanţe ale căror soluţii pot
traversa membrana citoplasmatică pentru a fi antrenaţi în reacţiile metabolice care asigură creşterea şi
multiplicarea celulară.
În raport cu sursa de energie, bacteriile se împart în:
· bacterii care folosesc energie luminoasă şi trăiesc la lumină (photobacterii) şi
· bacterii care îşi procură energia prin procese de oxidoreducere catalizate enzimatic şi trăiesc
la întuneric (scotobacterii, chimiosintetizante).
În raport cu sursele folosite ca material de sinteză în ambele diviziuni se diferenţiază:
· bacterii autotrofe, capabile să-şi sintetizeze toţi compuşii organici din materie anorganică şi
· bacterii heterotrofe, dependente de prezenţa unor compuşi organici.
Nutriţia principalelor bacterii studiate
29
Majoritatea bacteriilor comensale, condiţionat patogene sau patogene importante pentru om, sunt
chimiosintetizante, heterotrofe. Se diferenţiază în funcţie de tipul respirator. Există şi
bacteriile paratrofe, a căror energie trebuie oferită de gazdă. Bacteriile paratrofe sunt parazite strict
intracelular (de exemplu microorganismele din genurile Rickettsia şi Chlamydia, care depind nutriţional
de o gazdă vie).
Creşterea microbiană necesită polimerizarea unor substanţe mai simple pentru a forma: proteine,
acizi nucleici, polizaharide şi lipide. Aceste substanţe se obţin fie din mediul de cultură, fie sunt
sintetizate de către celulele în creştere (sunt necesare diferite coenzime şi legături macroergice de tipul
celor din ATP). Substanţele necesare şi coenzimele implicate se pot obţine dintr-un număr relativ redus
de precursori metabolici.
Dacă o celulă bacteriană primeşte substanţele necesare, va sintetiza diferite macromolecule, iar
secvenţa aranjării componentelor în aceste macromolecule este determinată fie după un model ADN-
ADN (pentru acizii nucleici) sau ADN-ARN (pentru proteine), fie cu un determinism enzimatic pentru
carbohidraţi şi lipide.
După ce moleculele au fost sintetizate, ele se autoansamblează, formând structuri supramoleculare:
ribozomi, perete, flageli, pili etc. Rata sintezei macromoleculelor şi activitatea căilor metabolice sunt
foarte bine reglate (există o permanentă balanţă a biosintezei).
Microorganismele reprezintă un grup de celule vii care utilizează o mare diversitate de căi
metabolice; de exemplu, mai multe căi diferite pot fi utilizate pentru asimilarea unui singur compus
simplu, benzoatul, iar o singură cale metabolică pentru benzoat poate fi reglată de mai multe sisteme de
control. Principiul determinant pentru căile metabolice este acela al organizării unui număr relativ mic de
tipuri de reacţii biochimice, într-o ordine specifică. Multe dintre căile biosintetice se pot deduce având în
vedere structura chimică de la care se porneşte, produsul final şi eventual unul sau doi metaboliţi
intermediari. Principiul determinant al reglării metabolismului este acela că enzimele par a fi „chemate”
în joc numai când activitatea lor este necesară. Activitatea unei enzime poate fi modificată variind fie
cantitatea ei, fie cea a substratului pe care acţionează.
În unele cazuri activitatea enzimelor poate fi diminuată prin cuplarea unor efectori specifici
(metaboliţi care modulează activitatea enzimatică).
De multe ori, activitatea unei enzime care catalizează o etapă metabolică iniţială este (poate fi)
inhibată de produsul final al căii respective. O astfel de inhibiţie nu poate depinde de competiţia pentru
situsul de legare al enzimei la nivelul substratului. Inhibiţia depinde de faptul că enzimele reglatoare sunt
allosterice. Fiecare enzimă are atât un situs catalitic de legare cu substratul, cât şi unul sau mai multe
alte situsuri de legare cu mici molecule reglatoare (numite efectori). Legarea unui efector de situsul său
duce la o modificare conformaţională a enzimei, astfel încât afinitatea situsului catalitic scade (inhibiţie
allosterică) sau creşte (activare allosterică).
Când o bacterie peritriche se mişcă, flagelii se asociază şi se mişcă împreună, rezultând o deplasare
liniară. La diferite intervale de timp, bacteria îşi schimbă direcţia (flagelii „se dau peste cap”). Acest
comportament face posibilă chemotaxia: o celulă care se îndepărtează de sursa atractantului chimic îşi
schimbă sensul de mişcare mult mai frecvent în comparaţie cu una care se apropie de atractant şi ca o
însumare, bacteria se va deplasa înspre atractant. Spre exemplu, prezenţa unui zahar sau a unui
aminoacid este sesizată de receptori specifici localizaţi pe membrana celulară (de multe ori acelaşi
receptor participă şi la transportul membranar al acelei substanţe). Celula bacteriană este prea mică
30
pentru a fi capabilă să detecteze existenţa unui gradient chimic (în spaţiu), dar s-a demonstrat
experimental că detectează gradienţii în timp (de exemplu, concentraţia unei substanţe scade în timp ce
bacteria se îndepărtează de sursă şi creşte în timp ce aceasta se apropie de sursă).
Anumiţi compuşi acţionează ca respingători (R), iar alţii ca atractanţi (A). Un mecanism care ar
explica răspunsul celulei faţă de A/R ar implica metilarea şi respectiv demetilarea unei proteine specifice
din membrană, care depinde de GMPc. Atractanţii produc o inhibiţie tranzitorie a demetilării acestei
proteine. Respingătorii stimulează demetilarea.
Mecanismul prin care o modificare în comportamentul celular se produce ca răspuns la o modificare
de mediu poartă numele de transducţie senzorială. Aceasta pare să fie responsabilă de:
· chemotaxie;
· aerotaxie (deplasarea către concentraţia optimă de O 2);
· fototaxie (deplasarea bacteriei fototrofe către lumină);
· deplasarea spre acceptorul de electroni etc.
3. 2. 2. Respiraţia bacteriană
Respiraţia reprezintă suma reacţiilor biochimice aerobe sau anaerobe producătoare de
energie. Mecanismul de bază este reprezentat de oxido-reducerea biologică (pierderea ionilor de
hidrogen sau a electronilor) de către o substanţă chimică (donor) şi transportul lor pe molecula unei alte
substanţe numită acceptor (prima se oxidează, a doua se reduce: AH 2 + B <=> A + BH2). În funcţie de
natura acceptorului final, respiraţia poate fi: aerobă sau anaerobă.
Respiraţia aerobă (oxibiotică)
În respiraţia aerobă, acceptorul final de electroni este reprezentat de oxigen. Respiraţia aerobă
necesită existenţa membranei celulare. Electronii sunt pasaţi de la un reducător la un oxidant prin
membrană cu ajutorul unui set specific de transportori. Substratul reducător frecvent utilizat este
NADPH-ul.
Enzimele catenei respiratorii sunt:
- nicotinice (cu coenzima NAD şi NADP);
- flavinice (cu gruparea proteică FMN sau FAD);
- ferice (grupul prostetic conţine Fe sub formă de derivaţi ai protohemului, spre exemplu citocromi,
citocromoxidază, peroxidază etc).
NAD (nicotin adenin dinucleotid), NADP (nicotin adenin dinucleotid fosfat), FMN (flavin
mononucleotid); FAD (flavin adenin dinucleotid).
Pentru sinteza ATP-ului se utilizează fosforilarea oxidativă (la nivel de catalizator) cuplată cu partea
terminală a lanţului respirator.
Respiraţia anaerobă (anoxibiotică)
În respiraţia anaerobă acceptorul final de electroni este reprezentat de orice substanţă anorganică
diferită de oxigen sau de orice substanţă organică (fermentaţia); fosforilarea se face la nivelul
substratului.
Tipul fermentativ este reprezentat de ansamblul acizilor care rezultă prin fermentaţia zaharidelor şi
reprezintă un caracter fiziologic stabil, foarte important din punct de vedere taxonomic şi biochimic.
Etapele fermentaţiei sunt mai reduse, câştigul energetic fiind mai mic. De exemplu în cazul
genului Clostridium, prin fermentaţie acetică se obţine 1 mol ATP, iar prin fermentaţie butirică se obţin
31
0,5 moli ATP. Fermentaţia butirică a fost descoperită de Louis Pasteur în anul 1861 (produsă de Vibrion
butyrique, numit ulterior Clostridium butyricum). Rolul biologic al fermentaţiei este reprezentat de
producerea energiei şi nu de obţinerea unor produşi finali.
Sinteza ATP-ului
Sinteza ATP-ului se realizează prin cuplarea reacţiilor de oxidoreducere cu reacţiile de fosforilare.
În respiraţia aerobă se utilizează mai ales fosforilarea oxidativă (la nivel de catalizator) cuplată cu
partea terminală a lanţului respirator.
În respiraţia anaerobă fosforilarea se face la nivelul substratului, donatorii şi acceptorii fiind
metaboliţi anorganici (dar nu O2) sau organici (fermentaţia).
Energetica respiraţiei bacteriene
Prin fosforilarea oxidativă se pot obţine 38 moli ATP pentru 1 mol de glucoză.
Prin fosforilarea substratului se pot obţine circa 2 moli ATP pentru 1 mol de glucoză.
Energia este folosită apoi în procese metabolice de asimilaţie.
Tipul respirator
În raport cu utilizarea proceselor pentru obţinerea energiei şi de relaţia cu oxigenul din mediu,
bacteriile se pot grupa în 4 „tipuri respiratorii” principale (vezi și Tabelul nr. 1):
- strict aerob, atunci când bacteriile (spre exemplu Bordetella pertussis) se dezvoltă numai în
prezenţa unei presiuni crescute a O2, care este folosit ca acceptor final unic. Aceste bacterii posedă
catalază, peroxidază, citocromi (de exemplu catalaza desface H 2O2 toxic pentru celula bacteriană; vezi
Figura nr. 1) şi utilizează numai procese de respiraţie. Unele specii aerobe (exemplu Pseudomonas
aeruginosa) se pot dezvolta în medii lipsite de oxigen, dacă în mediu sunt prezenţi nitratul sau nitritul;
- strict anaerob, atunci când bacteriile (spre exemplu Clostridium tetani, Clostridium botulinum,
Fusobacterium, Veillonella, Peptostreptococcus etc) cresc numai în absenţa O2. Nu pot supravieţui în
prezenţa O2, care nefiind redus are o acţiune bactericidă. Nu au catalază, peroxidază (care acţionează
asupra ionilor de O2 sau asupra H2O2). Aceste bacterii folosesc pentru obţinerea energiei numai procese
de fermentaţie. Pentru cultivarea lor este necesară utilizarea unui mediu cu potenţial redox foarte
scăzut.
- aerob facultativ anaerob, atunci când bacteriile (E. coli, S. aureus, S. pyogenes etc) se dezvoltă
mai bine în mediile cu oxigen, prin procese de respiraţie, dar pot prezenta ambele tipuri respiratorii, în
funcţie de potenţialul redox. Majoritatea au catalază sau citocromoxidază, dar nu au peroxidaze
flavoproteice. În acest tip se încadrează majoritatea bacteriilor studiate.
- anaerob microaerofil, atunci când bacteriile (de exemplu Campylobacter) tolerează mici cantităţi
de O2.
3. 3. Căi metabolice
Metabolismul glucidic
Polizaharidele utilizabile de către bacterii nu pot pătrunde ca atare în celulă. Ele sunt degradate de 2
categorii de enzime extracelulare: exohidrolaze (care scindează unităţile monozaharidice din
extremităţile lanţurilor polizaharidice) şi endohidrolaze (care hidrolizează unităţile interne). Polizaharidele
32
existente în celulă ca materiale de rezervă au o degradare diferită, prin fosforoliză, rezultând hexozo-
monofosfaţi.
Principalele căi metabolice (de catabolism) sunt:
a). calea hexozo-difosfaţilor (Embden-Meyerhof-Parnas), prin care în final pentru 1 mol de glucoză
se obţin 1 mol de acid piruvic şi 2 moli ATP;
b). calea pentozo-monofosfaţilor;
c). calea Entner-Doudoroff (pentru bacterii din grupul Pseudomonas).
Metabolismul lipidic
Multe bacterii degradează trigliceridele prin lipaze exocelulare în glicerol şi acizi graşi liberi.
Activitatea lipazică poate fi cercetată pe medii care conţin glicerol-tributirat. Pentru degradarea lipidelor
unele bacterii, de exemplu Clostridium perfrigens, posedă enzime specifice (lecitinaza D, fosfolipaza C).
Prin degradarea fosfolipidelor din membrana hematiilor, fosfolipaza C conferă bacteriilor proprietatea de
hemoliză.
Acizii graşi sunt degradaţi preponderent prin procesul de beta-oxidare; acizii graşi reprezintă surse
de energie foarte utile (ex. 1 mol de acid palmitic generează 129 moli de ATP).
Bacteriile saprofite au proprietăţi lipolitice intense, participând la biodegradarea grăsimilor şi
uleiurilor (mai ales în mediul marin).
Metabolismul proteic
În lumea bacteriană mai răspândiţi sunt D-aminoacizii. Aceştia pot forma diferite polipeptide cu
activitate antibiotică (gramicidina, polimixina, bacitracina) sau de exemplu capsula bacilului anthraxului.
Participă de asemenea şi la formarea peretelui celular (de exemplu D-Ala).
Căile de degradare sunt reprezentate mai ales de:
a). transaminarea şi dezaminarea aminoacizilor (de exemplu, enterobacteriile au căi proprii de
catabolism, utile în identificare);
b). decarboxilarea aminoacizilor.
33
Această cale de biosinteză are o importanţă particulară în medicină, oferind şi baza acţiunii selective
a unor antibiotice (peniciline, cefalosporine, bacitracină, vancomicină, cicloserină etc). Spre deosebire de
celulele gazdei, microorganismele sunt izotone cu fluidele organismului. În interiorul lor presiunea
osmotică este foarte mare şi viabilitatea lor depinde de integritatea peretelui (peptidoglican) pe tot
parcursul ciclului celular. Orice compus care inhibă o etapă în biosinteza peptidoglicanului la o bacterie în
creştere va putea produce liza bacteriană (efect bactericid).
3. 4. 3. Sinteza LPZ
Sinteza este asemănătoare cu cea a peptidoglicanului; în ambele situaţii, o serie de subunităţi se
asamblează pe un lipid transportor la nivelul membranei şi apoi sunt transferate în „fabrica” polimerului
în creştere pentru realizarea peretelui celular. Toate componentele LPZ sunt sintetizate şi ansamblate la
nivelul membranei citoplasmatice.
3. 4. 4. Sinteza capsulei extracelulare
Capsula se sintetizează enzimatic din subunităţi activate. În sinteza capsulei extracelulare (poate
avea structură polizaharidică sau peptidică) nu sunt implicate lipide transportoare de provenienţă
membranară. Prezenţa capsulei este adesea determinată de condiţiile de mediu. De exemplu, dextranii
se pot sintetiza pornind de la sucroză şi acest lucru se va realiza doar dacă există sucroză în mediu.
3. 4. 5. Sinteza substanţelor de rezervă
Când nutrienţii sunt în exces, bacteria poate converti o parte din ei în granule de rezervă (vacuole),
de exemplu glicogen, polihidroxibutirat, volutină, care diferă de la o bacterie la alta.
3. 5. Cultivarea bacteriilor
3. 5. 1. Definiţii utile
Populaţia reprezintă o multitudine de indivizi ai unei specii care convieţuiesc într-un anumit biotop.
Clona este populaţia care rezultă dintr-o singură celulă prin înmulţire vegetativă (diviziune binară).
Tulpina reprezintă populaţia microbiană alcătuită din descendenţii unei singure izolări în cultură
pură.
Temperatura de dezvoltare
În funcţie de temperatura de dezvoltare, bacteriile pot fi:
- mezofile, cu temperatura optimă de 30-37ºC;
- psichrofile, cu temperatura optimă în jur de 20ºC (unele acceptând temperaturi apropiate de
0ºC; Listeria spp. poate supravieţui sau se poate chiar şi multiplica la temperatura din frigider). Ele sunt
adaptate la acest mediu prin numărul mare de acizi graşi nesaturaţi conţinuţi de membrana plasmatică.
Gradul de nesaturare al unui acid gras se corelează cu timpul de solidificare sau stadiul de tranziţie
termică (temperatura la care se topeşte sau se solidifică lipidul). Acizii graşi nesaturaţi rămân în fază
lichidă la temperaturi joase, dar sunt denaturaţi la temperaturi moderate. Fie că acizii graşi din
membrană se află în fază lichidă sau solidă, ei afectează fluiditatea membranei, care afectează în mod
direct capacitatea de a funcţiona.
- termofile, cu temperatura optimă de 50-60ºC (unele putând să se multiplice şi la temperaturi
apropiate de 95ºC, ca de ex.Thermus aquaticus). Bacteriile termofile sunt adaptate să reziste la
temperaturi de peste 60°C printr-o varietate de modalități. Acizii graşi din membrana bacteriilor termofile
sunt acizi grași saturaţi, permiţând membranelor să rămână stabile şi funcţionale la temperaturi ridicate.
34
- extrem termofile sau hipertermofile, cu temperatura optimă de 80°C sau mai mare şi o
temperatură de dezvoltare maximă de 115°C. (2) Nu sunt patogene.
Bacteriile studiate de microbiologia medicală sunt în marea lor majoritate mezofile.
3. 5. 2. Noţiuni de creştere şi multiplicare bacteriană
Creşterea oricărui organism are loc prin sinteza de noi molecule. Deoarece creşterea volumului
celular raportată la creşterea suprafeţei este mai mare, în cursul creşterii se ajunge la un punct critic.
Multiplicarea celulară este o consecinţă a creşterii. Se restabileşte raportul optim dintre volumul şi
suprafaţa celulei.
Multiplicarea majorităţii bacteriilor se face prin diviziune simplă (binară). Sporii nu reprezintă forme
de multiplicare (aşa cum se întâmplă în cazul fungilor sau paraziţilor).
3. 5. 3. Cultivarea bacteriilor
Pentru a identifica agentul etiologic al unei infecţii, trebuie ca din produsul recoltat de la pacient să
obţinem mai întâi respectivul microorganism în cultură pură, pentru ca ulterior să îi putem studia
diferitele caractere în vederea identificării.
Metodele de cultivare a bacteriilor urmăresc mai multe obiective:
· obţinerea unei populaţii microbiene suficiente cantitativ pentru investigaţiile propuse,
· prevenirea contaminării produsului cercetat cu un microorganism străin şi
· izolarea fiecărei tulpini microbiene urmărite în cazul unui produs plurimicrobian în culturi
monomicrobiene denumite „culturi pure”.
Nu există un mediu unic, valabil pentru cultivarea oricărei bacterii. Termenul „însămânţare”
defineşte operaţia de introducere a unei cantitaţi de germeni într-un mediu de cultură artificială, în timp
ce pentru culturile celulare, ouă embrionate şi mai ales animale de experienţă folosim termenul
„inoculare”.
Cultivarea se realizează prin însămânţarea bacteriilor pe medii de cultură. Mediile solide sau lichide
care asigură nutrienţii şi condiţiile fizico-chimice necesare creşterii şi multiplicării bacteriene se
numesc medii de cultură.
Totalitatea bacteriilor acumulate prin multiplicarea într-un mediu de cultură poartă numele
de cultură bacteriană.
Mediile de cultură
Microorganismele pot fi cultivate pe gazde vii şi pe medii artificiale.
Există anumite microorganisme (de exemplu virusuri, Rickettsii, Chlamydii) care nu pot fi cultivate
decât pe gazde vii, aşa cum se întâmplă în cazul virusurilor, respectiv: animale de laborator, ouă de
găină embrionate sau culturi de celule.
Majoritatea bacteriilor, fungii şi unele protozoare se pot cultiva şi pe medii artificiale.
Mediile de cultură artificiale trebuie să fie nutritive (să conţină factorii de creştere necesari), să fie
sterile, să aibă un anumit pH (de obicei între 7,2-7,6), să aibă o anumită presiune osmotică, să aibă
umiditatea favorabilă multiplicării germenilor etc.
Factorii de creştere reprezintă substanţe esenţiale pe care microorganismele nu sunt capabile să le
sintetizeze din nutrienţii de care pot să dispună. Ei sunt necesari în cantitaţi mici. Îndeplinesc anumite
roluri în biosinteză. Factorii de creştere pot fi grupați în:
1. Purine si pirimidine: necesare pentru sinteza acizilor nucleici (ADN şi ARN);
2. Aminoacizi: necesari pentru sinteza proteinelor;
35
3. Vitamine: necesare în calitate de coenzime şi grupări funcţionale pentru enzime.
Unele bacterii (de exemplu E. coli) nu necesită factori de creştere. Aceste bacterii pot sintetiza
purinele esenţiale, pirimidinele, aminoacizii şi vitaminele pornind de la o sursă de carbon.
Alte bacterii necesită purine, pirimidine, vitamine şi anumiţi aminoacizi pentru a creşte. Aceşti
compuşi trebuie adăugaţi în prealabil în mediile de cultură.
Factorii de creştere nu sunt metabolizaţi direct ci sunt asimilaţi de către bacterii pentru a-și îndeplini
rolul în metabolism. Tulpinile mutante care necesită anumiţi factori de creştere ce nu sunt necesari
tulpinii din care au provenit sunt numiteauxotrofe. Spre exemplu, o tulpina de E. coli care necesită
triptofan pentru dezvortare se va numi auxotrof-triptofan şi va fi desemnată E. coli trp- (2).
Clasificarea mediilor de cultură artificiale
Aceste medii se pot clasifica după starea de agregare, după natura ingredientelor, după
complexitatea ingredientelor (de exemplu medii speciale), după scopul urmărit (de transport, de izolare,
de identificare etc.), după conţinutul în apă, etc. Există medii de cultură simple (agar, apă peptonată,
bulion simplu etc) şi medii de cultură mai complexe (agar-sânge, bulion glucozat, agar Muller-Hinton
etc). (vezi anexa nr. 2)
Medii speciale
Mediul electiv conţine ingredientele care convin cel mai bine dezvoltării unei anumite bacterii (de
exemplu mediul Lőffler, cu ser coagulat de bou, pentru bacilul difteric) (Figura nr. 5).
Prin conţinutul său în substanţe antimicrobiene, mediul selectiv inhibă dezvoltarea altor bacterii
decât cea a cărei izolare se urmăreşte. De exemplu, mediul cu telurit de potasiu pentru izolarea bacilului
difteric sau medii în care includem antibiotice (faţă de care bacteria care se doreşte a fi izolată este
rezistentă) (Figura nr. 6)
Mediul de îmbogăţire favorizează înmulţirea anumitor bacterii patogene, inhibând dezvoltarea
florei de asociaţie dintr-un produs patologic. Funcţionează concomitent ca mediu selectiv şi ca mediu
electiv (de exemplu, mediul hiperclorurat pentru stafilococ sau mediile de îmbogăţire utilizate pentru
izolarea Salmonella typhi).
Mediul diferenţial conţine un anumit substrat (de exemplu unele zaharuri) care poate fi sau nu
metabolizat, determinând modificarea culorii sau aspectului culturii. De exemplu, agarul cu albastru de
brom-timol lactozat (AABTL) care diferenţiază bacteriile lactoză-pozitive (cum este E. coli) de bacteriile
lactoză-negative (Shigella, Salmonella). Alte exemple: ADCL (agar dezoxicolat citrat lactoză), TSI (3
zaharuri şi fier), MIU (mobilitate indol uree). (Figurile nr. 7-10).
Colonia izolată
Pe medii solide, germenii însămânţaţi în suprafaţă produc colonii. Colonia este totalitatea bacteriilor
rezultate din multiplicarea unei singure celule bacteriene. O colonie este o clonă bacteriană.
Coloniile izolate se pot obţine de exemplu prin tehnica însămânţării prin dispersie (cu ansa
bacteriologică sau cu tamponul). După prelevarea cu ansa a unei porţiuni din produsul patologic, inoculul
este dispersat pe latura unui viitor poligon; se resterilizează ansa; se verifică temperatura, prin atingerea
mediului într-o zonă neînsămânţată, cât mai periferic; cu ansa sterilă se trasează a doua latură a
poligonului; se resterizează ansa şi se repetă procedeul descris până la realizarea a 4-5 laturi, fără a
atinge prima latură. În acest mod, pe ultimele „laturi” ale poligonului se vor putea observa după trecerea
timpului necesar multiplicării bacteriene, colonii izolate, bine individualizate. (Schema nr. 1)
36
Incubarea constă în menţinerea mediilor de cultură însămânţate, în condiţiile necesare pentru
dezvoltarea culturii. Majoritatea speciilor bacteriene se dezvoltă şi duc la apariţia unei culturi în circa 18-
24 de ore de incubare la temperatura optimă de dezvoltare (asigurată în termostat) pentru că timpul de
generaţie este de circa 30 minute. Mycobacterium tuberculosis are un timp de generaţie de 12-27 ore şi
în acest caz cultura devine pozitivă în 2-8 săptămâni. Pentru bacteriile strict anaerobe este necesară
incubarea în anaerobioză (ex. în medii la care s-au adăugat ingrediente cu activitate reducătoare sau în
anaerostat); dorim să subliniem că dacă transportul nu se face în condiţii de anaerobioză, nu vom mai
obţine nici un rezultat indiferent de mediile utilizate (Figura nr. 11).
Dinamica multiplicării bacteriilor în culturi
Culturile bacteriene sunt discontinue când se realizează în volum limitat de mediu, care nu este
reînnoit şi continueatunci când mediul de cultură este continuu reînnoit. O populaţie bacteriană poate fi
menţinută indefinit în faza de multiplicare exponenţială dacă se adaugă continuu mediu de cultură
proaspăt, cu omogenizare prin curent de aer steril şi evacuare a unei cantităţi corespunzătoare de
cultură (de exemplu în dispozitivul numit chemostat sau turbidostat).
Chemostatul utilizează un mediu de cultură în care unul dintre nutrienţi, aflat în concentraţie mai
redusă decât ceilalţi, funcţionează ca factor limitant al creşterii. Mediul de cultură proaspăt este admis în
vasul de cultură în ritmul în care este consumat factorul limitant, iar cultura este evacuată cu acelaşi
ritm. Cultura este menţinută astfel la o valoare constantă şi submaximală ratei de creştere, reglată prin
factorul limitant. Chemostatele sunt foarte utile pentru obţinerea de tulpini mutante pentru că după ce
rata de multiplicare a fost determinată şansa de selectare a acestor tulpini este mai mare (Figura nr.
12).
În laboratorul de microbiologie clinică, de regulă se utilizează culturile discontinue.
Timpul de generaţie
Populaţia care rezultă prin diviziunea unei bacterii creşte în progresie geometrică cu raţia 2. Timpul
necesar pentru dublarea populaţiei se numeşte timp de dublare sau timp de generaţie. Timpul de
generaţie în faza exponenţială şi în condiţii optime de cultivare este determinat genetic. De exemplu,
pentru E. coli este de circa 20 minute (ca şi pentru majoritatea bacteriilor studiate).
Pentru Mycobacterium tuberculosis timpul de generaţie poate avea o valoare între 12-27 ore.
Fazele dezvoltării unei culturi bacteriene
Teoretic, dinamica unei populaţii bacteriene ar trebui să evolueze exponenţial. Dinamica reală a
populaţiei bacteriene în cultură discontinuă are însă o evoluţie caracterizată printr-o curbă la care
distingem patru faze: faza de lag; faza de multiplicare logaritmică; faza staţionară şi faza de declin
(Figura nr. 13).
Faza de lag
Numărul bacteriilor însămânţate rămâne staţionar sau scade; germenii se adaptează la condiţiile
mediului. Bacteriile sunt foarte active metabolic, îşi consumă până la dispariţie incluziile, cresc mult în
dimensiuni, sintetizează enzime, proteine, acizi nucleici etc., dar nu se divid; sunt foarte sensibile la
antibiotice. Faza de lag durează aproximativ 2 ore. Această fază este aparent dependentă de o varietate
de factori incluzând dimensiunea inoculului, timpul necesar pentru a-şi reveni din şocul fizic datorat
transportului, timpul necesar pentru sinteza coenzimelor esenţiale sau a factorilor de diviziune şi timpul
necesar pentru sinteza a noi enzime ce sunt necesare pentru a metaboliza substratul prezent în mediu.
(2)
37
Faza de multiplicare logaritmică (exponenţială)
Celulele bacteriene prezintă caracteristicile tipice speciei (dimensiunile sunt însă ceva mai mari),
citoplasma este intens bazofilă şi omogenă, lipsită de incluzii. Bacteriile sunt foarte sensibile la
antibiotice. Această fază este adecvată pentru studierea bacteriilor sau pentru recoltarea lor în vederea
preparării de vaccinuri. Faza de multiplicare exponenţială durează aproximativ 2-3 ore.
Faza staţionară
Multiplicarea este realizată în progresie aritmetică, dar pentru că numărul bacteriilor care sunt
distruse este aproximativ egal cu numărul bacteriilor nou apărute rata de creştere devine nulă.
Germenii au morfologia caracteristică speciei; în această fază realizăm identificarea germenilor. Apar
incluziile caracteristice. La speciile sporogene începe formarea sporilor. Faza staţionară durează
aproximativ 2-3 zile.
Faza de declin
Substratul nutritiv sărăceşte, apar metaboliţi toxici, bacteriile sunt distruse progresiv, se produc şi
enzime autolitice, rezervele de hrană din incluzii (ex. acidul poli-β-hidroxi butiric sau glicogenul) se
consumă, pentru un timp sursa de energie rămâne doar ARN-ul celular. Unele bacterii pot persista 2-3
luni. În acest scop se pot activa mecanisme speciale de reglare şi se exprimă o serie de gene care duc la
sinteza unor proteine speciale care permit adaptarea pentru o durată limitată de timp. La speciile
sporogene, fenomenul de sporogeneză devine foarte intens.
Aspectul culturilor pe medii solide
Condiţiile de cultivare şi aspectul culturii sunt caractere cheie în identificarea bacteriilor. Aspectul
coloniilor variază între diferitele bacterii, fără a permite diferenţieri definitive de specie (dar au utilitate în
contextul studierii tuturor caracterelor bacteriene şi în contextul general al diagnosticului de laborator,
care la rândul său trebuie să aibă loc într-un context în care punem în balanţă şi alte elemente, clinice,
paraclinice; colaborarea între medicii de diferite specialităţi este esenţială). Se examinează:
· dimensiunea (coloniile pot fi mari, de peste 2 mm; medii, de circa 1-2 mm şi mici, sub 1
mm),
· conturul (circular, lobat, zimţat),
· relieful (plat, bombat, acuminat, papilat),
· suprafaţa (lucioasă, granulară, rugoasă),
· culoarea (pigmentate, nepigmentate),
· opacitatea (transparente, opace),
· consistenţa,
· aderenţa la mediu,
· prezenţa sau absenţa hemolizei (pe medii de tipul geloză-sânge). (Figura nr. 14)
Colonia S (smooth) are suprafaţă bombată şi netedă, margini circulare şi adesea aspect strălucitor.
Germenii păstrează structura antigenică şi nu aglutinează spontan cu soluţie salină fiziologică. Germenii
capsulaţi îşi păstrează capsula. Virulenţa este conservată. Majoritatea bacteriilor studiate formează
colonii de tip S (S. aureus, S. pyogenes, E. coli etc). (Figura nr. 15)
Colonia R (rough) este plată, suprafaţa ei prezintă rugozităţi, marginile sunt crenelate. Structura
antigenică nu este caracteristică. Nu păstrează capsula. Virulenţa nu este conservată (excepţii Bacillus
anthracis, Mycobacterium tuberculosis,Corynebacterium diphteriae). O bacterie care în mod caracteristic
duce la apariţia unei colonii de tip S (ex. o enterobacterie), în cazul în care testele de identificare prin
38
reacţii antigen-anticorp (ex. aglutinare pe lamă, folosind anticorpi cunoscuţi) nu se efectuează la timpul
potrivit ci mai târziu, prin „înbătrânire” va suferi anumite modificări, coloniile vor deveni de tip R iar
identificarea pe baza caracterelor antigenice nu va mai fi posibilă. (Figura nr. 16)
Colonia M (mucoid) este mare, strălucitoare, mucoasă. Este dată de exemplu de bacteriile care
prezintă capsule mari (exemplu Klebsiella pneumoniae). (Figura nr. 17) Coloniile de Streptococcus
pneumoniae pot fi şi de tip S şi de tip M.
În cazul bacteriilor foarte mobile (de ex. Proteus spp.) pe mediile obişnuite nu vom putea obţine
colonii izolate (a fost descris fenomenul de „invazie”). (Figura nr. 18) Cultura se întinde pe toată
suprafaţa plăcii în strat continuu sub forma unor valuri succesive. Fenomenul de „invazie” poate fi
inhibat prin incorporarea în mediu de acizi sau săruri biliare, tiosulfat de sodiu etc.
Aspectul culturilor pe medii lichide
Bacteriile şi fungii facultativ anaerobi se dezvoltă în toată masa de lichid, tulburându-l. Bacteriile
strict aerobe se dezvoltă preponderent la suprafaţa mediului. Ca un aspect particular, în apa
peptonată Vibrio cholerae se poate dezvolta şi formează un „văl” la suprafaţa mediului. În acest caz, pH-
ul mediului este 9-9,5.
Bacteriile care pe medii solide produc colonii de tip S, pe medii lichide tulbură omogen mediul
(majoritatea bacteriilor). (Figura nr. 19)
Variantele R realizează o tulburare mai puţin omogenă. Pot lăsa mediul limpede, formând flocoane
care se depun sau un strat (văl) la suprafaţa mediului (de exemplu bacilul difteric sau bacilul
tuberculos). (Figura nr. 20)
Alte informaţii privind mediile de cultură, diferitele tehnici de cultivare, examinarea culturilor
bacteriene şi diferitele tehnici de identificare fenotipice utile în diagnosticul microbiologic sunt prezentate
în anexa nr. 2.
3. 6. Povestiri adevărate
3.6.1. Penicilina, o mare descoperire ... născută dintr-o mică neglijenţă
Era prin anul 1928 când Alexander Fleming, investigând caracteristicile stafilococilor, a descoperit în
mod accidental penicilina printr-o „eroare de cultivare”. Fleming era deja cunoscut drept un cercetător
de excepţie prin activitatea deja desfăşurată, de ex. datorită descoperirii lizozimului (1922); pe de altă
parte, omul de ştiinţă demonstra un grad de neglijenţă în activitatea de laborator.
Întors din concediu în septembrie 1928, a găsit câteva dintre plăcile cultivate anterior, contaminate
cu un fung din genulPenicillium şi a decis să le arunce într-o soluţie de dezinfectat. Puţin mai târziu,
vrând să arate unui coleg câteva dintre rezultatele activităţii sale, a găsit câteva plăci care nu fuseseră
încă „dezinfectate” iar de această dată a observat o mică zonă, la contactul dintre cultura fungică şi
cultura bacteriană, zonă în care bacteriile nu s-au dezvoltat.
Pornind de la această observaţie, Fleming a obţinut un extract din cultura fungică, cu proprietăţi
bactericide. Pentru că fungul făcea parte din genul Penicillium a denumit acest extras penicilină.
A publicat rezultatele acestei descoperiri în anul 1929.
Au mai trecut aproape 16 ani, timp în care s-a reuşit izolarea şi stabilizarea acestui extract, şi în anul
1945 s-a înregistrat producerea antibioticului revoluţionar numit penicilină.
39
Pentru descoperirea sa, Fleming împreună cu biochimistul Ernst Chain şi farmacologul Howard
Florey au fost laureaţi cu Premiul Nobel pentru Fiziologie şi Medicină în anul 1945.
3.6.2. O fostă rickettsie rescrie vechile clasificări
În 2009, o echipă de cercetători i-a oferit Coxiellei burnetii mijloacele de a „evada” din mediul
intracelular. Până la această dată, agentul etiologic al febrei Q era unul dintre exemplele stereotipe de
bacterie strict parazită, imposibil de cultivat pe medii artificiale.
Nu a fost una dintre acele descoperiri rapide, neaşteptate, ci a încununat o muncă minuţioasă de
studiere a necesităților metabolice ale acestor bacterii. Cercetările au evoluat progresiv: într-o primă
etapă, a fost obţinut un mediu de cultură artificial, care reproducea condiţiile de pH acid din interiorul
vacuolelor asemănătoare lizozomilor, în care Coxiella spp. se multiplică în celulele gazdei. Pe acest
mediu, denumit ulterior Complex Coxiella Medium (CCM), Coxiella burnetii şi-a putut desfăşura
activitatea metabolică timp de aproximativ 24 de ore.
Într-o a doua etapă, cercetătorii au reuşit să dovedească faptul că bacteria este microaerofilă. Au
adaptat mediul în consecinţă şi l-au numit ACCM (Acidified Citrate Cysteine Medium).
Cultivarea Coxiella burnetii pe medii de cultură artificiale ar putea permite studierea factorilor de
patogenitate, studierea structurii genetice și poate și realizarea unui model de abordare pentru alţi
germeni strict intracelulari. (3-4)
3. 7. Evaluarea cunoştinţelor
La următoarele întrebări alegeți un singur răspuns corect:
1. Care dintre următoarele bacterii este cromopară?
A. Staphylococcus aureus
B. Staphylococcus epidermidis
C. Pseudomonas aeruginosa
D. Escherichia coli
E. Bacillus anthracis
2. Unul dintre următoarele este un microorganism strict aerob:
A. Clostridium tetani
B. Clostridium botulinum
C. Bordetella pertussis
D. Escherichia coli
E. Staphylococcus aureus
3. Penicilina se leagă la nivelul:
A. hidrolazelor
B. oxidoreductazelor
C. izomerazelor
D. permeazelor
E. transpeptidazelor
40
4. Se cultivă numai pe gazde vii:
A. Staphylococcus aureus
B. Chlamydia trachomatis
C. Streptococcus pyogenes
D. Streptococcus pneumoniae
E. Haemophilus influenzae
5. Pe ce mediu se produce modificarea culorii sau aspectului culturii datorită prezenţei unui
substrat?
A. Mediu electiv
B. Mediu selectiv
C. Mediu diferenţial
D. Mediu Lőffler
E. Mediu de îmbogăţire
45
b1. Autoclavarea este esenţială atât pentru laboratoarele de microbiologie cât şi pentru unităţile
sanitare în general, indiferent de sistemul public sau privat. Vaporii de apă realizează
· la 0,5 atmosfere o temperatură de 115ºC,
· la 1 atmosferă o temperatură de 121ºC şi respectiv
· 134ºC la 2 atmosfere.
Autoclavul are ca piesă principală un cazan cu pereţi metalici, care se închide etanş cu un capac
prevăzut cu un sistem special de închidere şi în interiorul căruia, vaporii de apă sunt comprimaţi la
presiunea necesară în vederea sterilizării (Schema nr. 2).
Există mai multe tipuri de autoclave:
- autoclave cu perete simplu
· verticale
· orizontale
- autoclave cu manta de aburi
· verticale
· orizontale.
În continuare, drept exemplu, vom discuta numai despre autoclavul cu perete simplu, vertical, la
care vaporii provin din apa aflată în cazanul de presiune şi ajung în camera de sterilizare de jos în sus
(Figura nr. 8). Presiunea din interiorul cazanului este înregistrată de un manometru. Pentru punerea în
funcţiune a autoclavului, în dotare există 2 robinete: unul superior (robinetul de aer şi vapori, care
permite legătura între cazan şi mediul exterior) şi unul inferior (robinetul care permite evacuarea apei
din cazan). Pentru a evita accidentele există o supapă de siguranţă care se deschide şi permite
evacuarea vaporilor atunci când, accidental, presiunea vaporilor depăşeşte limita de siguranţă. În
momentul de faţă pentru evitarea riscului de a veni în contact cu vapori de apă fierbinţi aflaţi sub
presiune, autoclavele sunt dotate cu un sistem care nu permite deschiderea capacului până când
presiunea din interior nu o egalizează pe cea din exterior. Cazanul de presiune este inclus într-un perete
exterior solid care la partea inferioară are un spaţiu în care se află sursa de căldură.
În partea inferioară a cazanului de presiune se află un suport pe care se aşează o placă de metal
perforată (Figura nr. 9). Pe suport se aşează materialele care trebuie sterilizate iar faptul că placa este
perforată permite trecerea vaporilor de apă produşi după încălzirea apei. În vederea sterilizării se
procedează astfel:
· verificăm nivelul apei din partea inferioară a cazanului, care trebuie să fie până la o
distanţă de 2-3 centimetri de suport; dacă nivelul a scăzut, se completează (recomandabil se va utiliza
apă distilată);
· aşezăm pe suport obiectele şi materialele de sterilizat, ambalate corespunzător;
· închidem etanş capacul, folosind sistemul special de etanşeizare cu care este dotat
autoclavul pe care îl avem la dispoziţie;
· conectăm sursa de căldură;
· deschidem robinetul pentru evacuarea aerului şi vaporilor (dacă rămâne aer în
cazanul cu presiune eficienţa sterilizării va scădea considerabil; vaporii de apă fiind mai uşori, vor încălzi
în special partea superioară a cazanului în timp ce aerul, care va atinge temperaturi inferioare, fiind mai
greu, va rămâne în partea inferioară a cazanului) ;
· închidem robinetul după evacuarea aerului şi apariţia unui jet continuu de vapori;
46
· presiunea din cazan începe să crească şi este urmărită cu ajutorul manometrului;
atunci când presiunea atinge valoarea dorită (de ex. 1 atmosferă), reglăm sursa de căldură în aşa fel
încât această presiune să fie menţinută pentru toată durata sterilizării (de ex. 30 minute) ;
· după trecerea celor 30 minute întrerupem sursa de căldură şi lăsăm autoclavul să
se răcească până când presiunea din interior ajunge la nivelul presiunii atmosferice;
· deschidem lent robinetul de vapori;
· deschidem sistemul de etanşeizare şi capacul autoclavului;
· lăsăm obiectele şi materialele să se răcească în autoclavul deschis;
· atunci când temperatura scade suficient de mult putem scoate materialele
sterilizate.
b2. Tindalizarea (sterilizarea fracţionată) este o metodă de sterilizare prin căldură umedă care
evită depăşirea unei temperaturi de 100ºC. Substanţele de sterilizat se menţin la 56-100ºC timp de 30-
60 minute, 3 până la 8 zile succesiv. Astfel, utilizând medii care permit germinarea, după prima încălzire
timp de 30-60 minute sunt distruse formele vegetative iar după răcire are loc germinarea sporilor. În
ziua următoare sunt distruse prin încălzire formele vegetative rezultate din germinarea sporilor iar după
răcire are loc germinarea sporilor care nu au germinat în prima zi etc. Din punct de vedere tehnic pot fi
utilizate autoclave la care se va menţine permanent deschis robinetul de vapori (şi astfel nu se va depăşi
în interior temperatura de 100ºC), băi de apă sau băi de nisip. Prin tindalizare se pot steriliza alimente,
unele medii de cultură etc.
b3-4. Pasteurizarea şi fierberea nu reprezintă metode de sterilizare, dar sunt utilizate în anumite
situaţii.
Pasteurizarea foloseşte căldura umedă şi are aplicaţii în conservarea pentru scurtă durată a unor
alimente (lapte, bere etc). Există o pasteurizare joasă (30 minute la 56-65ºC), o pasteurizare medie (15
minute la 65-75ºC) şi o pasteurizare înaltă (2-5 minute la 85-90ºC). Prin pasteurizare sunt distruse
bacteriile în formă vegetativă dar nu şi sporii.
Fierberea poate fi utilizată atunci când nu dispunem de alte metode eficiente de sterilizare, iar
mecanismul de acţiune este denaturarea proteinelor. Fierberea timp de 30 minute la 100 oC, distruge
bacteriile în formă vegetativă, fungii şi virusurile, dar nu şi sporii bacterieni. Timpul se înregistrează după
ce apa a început să fiarbă. Eficienţa acestei metode poate fi crescută prin adăugarea de carbonat de
sodiu 1-2%.
^inapoi sus
4. 2. 1. 2. Influenţa temperaturii scăzute asupra microorganismelor
Temperaturile joase (în jur de 0-4ºC) au în general un efect bacteriostatic. La temperaturi
scăzute, reacţiile biochimice încetinesc, multiplicarea poate fi stopată. Majoritatea produselor
biologice/patologice pot fi transportate (menţinând viabilitatea germenilor şi încetinind în acelaşi timp
multiplicarea acestora) la o temperatură de circa 4ºC. O serie de culturi pot fi de asemenea menţinute la
temperatura frigiderului pentru o durată limitată de timp în vederea prezervării şi posibilităţii de a repeta
anumite teste de identificare etc.
În funcţie de viteza cu care are loc răcirea, întâlnim situaţii diferite, cu următoarele posibile efecte
asupra structurilor celulare bacteriene.
a). Congelarea lentă, la temperaturi mai mici -21,3ºC are efecte bactericide prin formarea de cristale
de gheaţă şi prin hiperconcentrarea salină cu denaturarea proteinelor;
47
b). Congelarea bruscă la -70ºC are efecte de conservare a bacteriilor prin solidificarea în masă a
apei fără apariţia cristalelor de gheaţă;
c). Liofilizarea (criodesicarea) reprezintă congelarea bruscă concomitent cu desicaţia (deshidratarea
în vid). O suspensie microbiană în mediu protector, liofilizată, poate fi păstrată în fiole închise timp
îndelungat (de exemplu vaccinul BCG).
^inapoi sus
4. 2. 1. 3. Filtrarea
Microorganismele pot fi reţinute mecanic şi electrostatic în porii unui filtru. Trecerea unui lichid
printr-o substanţă prevăzută cu pori care va reţine microorganismele din lichidul respectiv poartă numele
de sterilizare prin filtrare.
De-a lungul timpului au fost utilizate o serie de filtre clasice (porţelan, sticlă poroasă, azbest
impregnat cu caolin, pământ de infuzori) (Figura nr. 10). Actualmente se folosesc din ce în ce mai
frecvent membrane filtrante din acetat de celuloză cu porozităţi între 8 şi 0,025 mm (Figura nr. 11). În
vederea filtrării sunt necesare o serie de piese precum: un recipient în care se introduce lichidul care
urmează a fi filtrat, un recipient în care se va colecta lichidul sterilizat, o pâlnie care se montează etanş
între cele 2 recipiente, o pompă de vid care va aspira lichidul din primul în al doilea recipient, prin
membrana filtrantă. Toate aceste piese sunt sterilizate prin autoclavare înainte de începerea filtrării.
Există şi alte variante tehnice. Cu o importanţă practică particulară ar fi de menţionat filtrele pentru
sterilizarea aerului din cabinetele de siguranţă biologică (clasa II şi clasa III), filtrele HEPA (High
Efficiency Particulate Air Filters) (Figura nr. 12).
Sterilizarea prin filtrare este utilizată pentru decontaminarea aerului, a unor medii de cultură (care
nu se pot steriliza prin autoclavare), a unor reactivi care sunt sensibili la temperaturile atinse în cazul
sterilizării prin căldură etc.
^inapoi sus
4. 2. 1. 4. Radiaţiile neionizante (UV) sau ionizante (X etc) au efecte bactericide prin ruperea
legăturilor de hidrogen, oxidarea legăturilor duble etc. Radiaţiile UV sunt utile în sterilizarea suprafeţelor
de lucru (pentru repartizarea mediilor de cultură, alte manevre aseptice etc) în cazul în care nu există
cabinete de siguranţă biologică cu flux laminar dar şi atunci când avem la dispoziţie astfel de cabinete de
siguranţă biologică şi dorim să sterilizăm incinta în care am prelucrat spre ex. produse în care
există Mycobacterium tuberculosis. Lămpile cu UV sunt numite lămpi germicide. Astfel de lămpi sunt
plasate de ex. şi în instituţiile sanitare în care sunt internaţi pacienţi cu tuberculoză (Figura nr. 13).
Radiaţiile ionizante se pot utiliza în sterilizări industriale (pentru alimente, medicamente, seringi de unică
întrebuinţare etc).
^inapoi sus
4. 2. 1. 5. Ultrasunetele au efecte bactericide prin acţiune mecanică, mişcare activă a conţinutului
celular, formare în mediul extern de bule mici de gaze dizolvate care se mişcă energic şi se izbesc de
membrană (fenomenul de cavitaţie) şi creşterea temperaturii la 50-80ºC. Sporii rezistă acestor efecte.
^inapoi sus
4. 2. 1. 6. Presiunea osmotică
Plasmoliza (pierderea apei, deshidratarea) în medii hipertone are efecte letale asupra unor bacterii.
În medii hipotone are loc acumularea de apă în celula bacteriană; aceasta devine turgescentă şi peretele
bacterian cedează.
48
4. 2. 2. Efectele antimicrobiene ale
factorilor chimici
Există o serie de substanţe chimice necesare creşterii şi multiplicării bacteriene. Alte substanţe
chimice (antibioticele şi chimioterapicele) au efect bactericid sau bacteriostatic selectiv.
Antisepticele şi dezinfectantele sunt substanţe cu acţiune antimicrobiană neselectivă,
alterândstructuri şi funcţii comune microorganismelor şi organismelor superioare.
Antisepticele pot fi utilizate pe tegumente şi mucoase.
Dezinfectantele pot fi utilizate numai pe suprafeţe şi structuri care nu sunt vii.
O parte dintre dezinfectante au efect sterilizant. Aşa cum am menţionat anterior, trebuie să existe o
etapă de pregătire a materialelor în vederea sterilizării. Materialele de laborator, instrumentarul,
materialele chirurgicale etc, trebuie curăţate perfect, de ex. prin spălare cu ajutorul unor detergenţi.
Dacă aceste materiale au fost contaminate cu sânge, înainte de spălare se vor dezinfecta.
Substanţele antiseptice şi dezinfectante se pot clasifica în funcţie de mecanismul de acţiune, după
cum urmează:
a). Substanţe care denaturează proteinele (au în general efect bactericid): acizii, bazele, alcoolii şi
derivaţii lor (de exemplu alcoolul etilic, CH3-CH2OH, de 70º, folosit pentru antiseptizarea tegumentelor).
b). Substanţe care oxidează grupările chimice libere ale enzimelor (de exemplu, SH):
hipermanganatul de potasiu, KMnO71‰, util în antiseptizarea mucoaselor, peroxidul de hidrogen, H 2O2,
soluţie 3% în apă, utilizat în antiseptizarea plăgilor, halogenii (Cl 2, I2, Br2) şi derivaţii lor (hipocloriţi,
cloramine, soluţii iodurate etc. Există și diferite clase de compuşi halogenaţi cu potență mai mare, cum
ar fi cei care au în componenţa lor radicalul benzil -C 6H5. Indiferent de substanța folosită este necesară
realizarea concentraţiei corespunzătoare.
c). Substanţe care blochează grupările chimice libere ale enzimelor (de exemplu, SH): metale
grele [sărurile de mercur, preparatele organomercuriale (cum ar fi spre exemplu merthiolatul de sodiu,
C9H9HgO2SNa ), sărurile de argint, compuşi de argint coloidal (exemplu colargol, protargol) cu efecte
bactericide], grupările alchil ale formaldehidei, glutaraldehidei (C 9H9HgO2SNa), oxidului de etilen (C2H4O)
etc.
d). Substanţe care lezează membranele celulare: fenolii [acidul fenic are utilizări limitate datorită
proprietăţilor caustice şi toxicităţii sale; este etalonul faţă de care se măsoară activitatea antimicrobiană
a antisepticelor şi dezinfectantelor (indicele fenolic), crezolii, hexaclorofenul, clorhexidina (cu efecte
toxice mai reduse) etc], detergenţii [anionici (săpunuri, perlan etc), cationici (săruri cuaternare de
amoniu, de exemplu bromocet), amfolitici (de exemplu acidul dodecilaminoacetic), neionici (de exemplu
propilenglicolul)].
e). Substanţe care alterează acizii nucleici: coloranţii bazici (violet de genţiană, albastru de metilen,
fucsină bazică etc), derivaţii de acridină, de exemplu rivanolul.
Dintre exemplele prezentate mai sus,alcoolul etilic de 70º, diferiţi derivaţi halogenaţi,
hipermanganatul de potasiu 1‰, peroxidul de hidrogen, rivanolul, sunt exemple de substanţe
antiseptice. Dorim să menţionăm şi să subliniem că atât în cazul antisepticelor cât şi în cazul
dezinfectantelor este important ca substanţa utilizată să aibă concentraţia corespunzătoare, să fie
aplicată pentru o durată de timp corespunzătoare, să se afle în termenul de garanţie. Aceeaşi
49
substanţă chimică (de ex. cloramina) poate intra în categoria antisepticelor sau în categoria
dezinfectantelor, în funcţie de concentraţie (concentraţia este mai mare în al doilea caz).
În continuare vom prezenta pe scurt câteva exemple de substanţe dezinfectante. Dorim să
menţionăm faptul că, până în prezent, nu există nici un dezinfectant ideal. Există numeroase substanţe
şi numeroşi producători de antiseptice şi dezinfectante.
Hipocloriţii:
soluţiile de hipoclorit se prepară periodic (se inactivează după mai mult de 24 ore),
concentraţia în clor activ este diferită în funcţie de scopul urmărit (ex. 2.500 ppm clor activ
pentru dezinfectarea pipetelor contaminate);
au efect dezinfectant asupra bacteriilor în formă vegetativă, sporilor bacterieni, fungilor (100 ppm
în o oră), virusurilor (200 ppm în 10 minute);
efectul este diminuat considerabil în prezenţa substanţelor organice (în special proteine), maselor
plastice, detergenţilor.
Derivaţii fenolici:
din cauza toxicităţii, potenţialului carcinogenetic şi corozivităţii, fenolii nu se folosesc ca atare, ci
sub forma derivaţilor fenolici;
soluţiile fenolice se prepară periodic (după cel mult 24 ore);
concentraţia poate fi diferită în funcţie de scopul urmărit (de obicei este de 2-5%);
au efect dezinfectant asupra bacteriilor în formă vegetativă, fungilor, unor virusuri (ex. HIV este
inactivat de soluţia 0,5%);
efectul este diminuat pe suprafeţele de cauciuc, lemn sau material plastic.
Glutaraldehida:
cel mai frecvent este utilizată concentraţia de 2%, la un pH alcalin;
are efect dezinfectant asupra bacteriilor în formă vegetativă (în cazul mycobacteriilor este
necesar un timp mai lung de expunere), fungilor, virusurilor;
datorită faptului că nu corodează metalele (aşa cum se întâmplă în cazul substanţelor prezentate
mai sus) se poate folosi şi la dezinfectarea suprafeţelor metalice;
nu poate fi folosită pentru suprafeţe, datorită vaporilor iritanţi şi timpului mare de expunere;
ideală pentru dezinfectarea echipamentelor contaminate ce pot fi imersate o perioada mai mare de
timp în containere menţinute închise.
Iodoforii:
sunt substanţe care complexează iodul pe care îl eliberează în soluţii apoase;
au efect dezinfectant asupra bacteriilor în formă vegetativă, unor spori bacterieni, fungilor, unor
virusuri (ex. virusuri cu înveliş lipidic);
sunt inactivaţi de substanţe organice (în special proteice), mase plastice, detergenţi;
pot fi utilizaţi pentru dezinfecţia suprafeţelor, dezinfecţia pipetelor contaminate.
Sterilizarea cu etilenoxid (CH2CH2O):
exercită activităţi bactericide prin alkilarea acizilor nucleici şi prin înlocuirea hidrogenului labil
printr-o grupare hidroxietil (-CH2CH2OH);
50
sporii de Bacillus subtilis nu sunt distruşi;
acest tip de sterilizare se utilizează pentru materiale care nu rezistă atunci când sunt supuse
acţiunii temperaturii sau radiaţiilor (ex. materiale din cauciuc, plastic, echipament electronic etc.);
· fiind o substanţă explozivă, etilenoxidul este utilizat în camere speciale în care se menţine o
presiune negativă, iar pentru a preveni o explozie dioxidul de carbon poate fi combinat cu această
substanţă în încăperi de oţel speciale; o altă variantă de protecție ar fi combinarea cu hidrocarburi
fluorinate.
indiferent de varianta folosită trebuie respectate toate recomandările producătorului;
există o serie de inconveniente în ceea ce priveşte acest tip de sterilizare (pot să apară efecte
carcinogenetice și afectarea sistemului nervos etc., dar e posibilă afectarea întregului organism);
sterilizarea este în principiu influenţată de: concentraţia etilenoxidului, temperatură, umiditatea
relativă şi timpul de expunere (spre ex. o dublare a concentraţiei va reduce la jumătate timpul necesar
pentru sterilizare).
4. 2. 3. Produsele biocide
Directiva 98/8/CE defineşte produsele biocide după cum urmează: „Substanţe active şi
preparatele conţinând una sau mai multe substanţe active, condiţionate într-o formă în care sunt
furnizate utilizatorului, având scopul să distrugă, să împiedice, să facă inofensivă şi să prevină acţiunea,
sau să exercite un alt efect de control asupra oricărui organism dăunător, prin mijloace chimice sau
biologice” (vezi directiva CE).
Din categoria produselor biocide sunt excluse produsele de curăţenie, detergenţii sub formă de
pulbere sau lichidă şi alte produse similare, ce nu sunt destinate a avea efect biocid.
Produsele biocide includ:
produsele utilizate pentru dezinfecţia suprafeţelor mari inerte, a aerului, a echipamentului
medical, a mobilierului, sau pentru dezinfecţia şi curăţarea acestora;
produsele pentru dezinfecţia / sterilizarea instrumentarului, endoscoapelor, ş.a., prin imersie;
produsele dezinfectante / antiseptice pentru tegumente, săpunurile dezinfectante, săpunurile
antiseptice, săpunurile antibacteriene / antimicrobiene, gelurile de curăţare antibacteriene /
antimicrobiene, soluţiile de curăţare antibacteriene / antimicrobiene (după cum sunt denumite de
producător);
produsele dezinfectante/antiseptice pentru mucoase, ex. pentru igiena orală, ş.a.;
şerveţele umede dezinfectante,
detergenţii şi produsele de curăţare care au activitate biocidă dovedită (distrug sau inhibă
multiplicarea bacteriilor, fungilor sau a altor microorganisme).
În această categorie ar putea intra şi substanţele sintetizate de Bacillus thuringiensis din
genul Bacillus, cu efect biopesticid.
4. 3. Povestiri adevărate
4. 3. 1. Epidemia de holeră din Peru - Legendă urbană
În 1991, în Peru, a izbucnit o epidemie de holeră. Boala nu este foarte frecventă pe continentul
american, motiv pentru care iniţial a fost dificilă stabilirea cauzelor.
Situaţia a apărut oarecum în paralel cu o dezbatere publică ce avea loc în SUA cu privire la raportul
risc / beneficii adus declorinarea apei. Dintre „istoriile adevărate” aceasta ca şi istoria epidemiei de
difterie în fostele state sovietice arată cât de mult poate fi influenţată sănătatea publică de către
dezbateri, de către mass-media etc (de multe ori în mod negativ).
Este cunoscut faptul că prin clorinarea apei, pe lângă efectul de distrugere a unor microorganisme
ar putea să apară şi fenomene nedorite, datorită apariţiei unor produşi de tipul trihalometanului. În USA
se discută foarte mult despre efectul cancerigen al acestei substanţe.
Diverşi oficiali americani, având se pare relaţii în industria chimică, şi care doreau ca metoda
clorinării să rămână cea mai importantă metodă de antiseptizare a apei, au folosit multă vreme exemplul
acestei epidemii pentru a demonstra ce se poate petrece dacă clorinarea apei va fi stopată. Pornind de
la date reale (epidemia de holeră) dezbaterile au ajuns să prezinte o situaţie foarte diferită (numeric)
ajungându-se să se discute de 1,3 milioane de cazuri de holeră soldate cu peste 11.000 de decese. În
aceste dezbateri s-a afirmat că pentru a preveni apariţia unui număr foarte mic de cancere (ipotetice) s-
a precipitat apariţia unui număr extrem de mare de cazuri de holeră şi respectiv a unui enorm număr de
decese datorate infecţiei cu Vibrio cholerae.
A fost criticată şi aşa-zisa „Teorie a precauţiei”, principial corectă, bazată pe următoarele idei
generice: a. stabileşte un ţel în cadrul unui proces decizional deschis, care să se adreseze tuturor celor
implicaţi; b. analizează toate modalităţile de a realiza ceea ce îţi propui şi alege varianta care va conduce
la cele mai puţine efecte nedorite; c. dacă nu eşti sigur de calea pe care vrei să o urmezi, asigură-te că o
alegi pe aceea care creează cele mai mici probleme mediului, sănătăţii publice, comunităţii în general; d.
54
monitorizează rezultatele şi asigură-te că iei măsuri rapide de remediere, în cazul în care ar apărea o
problemă şi e. consultă-te în permanenţă cu cei asupra cărora vor avea un efect măsurile pe care le-ai
stabilit.
Totuşi, nu aplicarea greşită a teoriei a fost cea care a provocat epidemia de holeră.
În final, reprezentanţi oficiali din Peru au afirmat că au decis să aplice clorinarea intermitent şi nu
continuu din motive economice (preţ prea mare pentru clorinarea continuă) şi nu au fost influenţaţi de
„teoria precauţiei”; nu au luat în calcul riscul apariţiei cancerului.
Investigaţia epidemiologică realizată împreună cu colegii de la CDC a demonstrat că epidemia de
holeră a avut o cauzalitate multiplă, factorii cei mai importanţi fiind reprezentaţi de: a. clorinarea
intermitentă a apei; b. diferite branşamente ilegale sau amatoristic făcute la linia de aprovizionare cu
apă a oraşului; c. conectarea instalaţiilor ilegale de irigaţie la liniile de aprovizionare cu apă potabilă; d.
perioade lungi în care apa a avut o presiune scăzută sau nu a existat presiune deloc, situaţii în care
colonizarea şi multiplicarea bacteriană este favorizată; e. depozitarea apei potabile în butoaie, în condiţii
neigienice sau „la limită” şi f. lipsa unor canalizări construite corespunzător, care au permis refularea
apei din zonele poluate în reţeaua de apă potabilă etc.
Cu toate că la baza acestei epidemii au stat mai mulţi factori, cel mai important dintre aceştia a fost
lipsa clorinării (antiseptizării) corespunzătoare a apei potabile.
Datele reale cu privire la această epidemie sunt prezentate succint la punctul 44. 8. 2.
4. 3. 2. Epidemia de holeră din Dhaka - bacteriofagii
Holera se transmite cel mai frecvent prin consumul de apă contaminată cu tulpini de Vibrio cholerae,
în special în zonele cu educaţie sanitară precară. Datele epidemiologice şi de mediu obţinute în urma
unei izbucnirii epidemice („outbreak”) de holeră în Bangladesh, au sugerat rolul bacteriofagului litic
specific pentru V. cholerae, care ar putea limita gradul de severitate al epidemiei prin efectul de
distrugere a bacteriilor prezente în sursele de apă contaminată, sau chiar şi în cazul unor persoane
infectate.
Au fost emise două ipoteze privind rolul potenţial al bacteriofagilor specifici: a. în cadrul relaţiei
bacterie-bacteriofag, bacteriofagii lizează un număr mare de bacterii, ulterior densitatea bacteriofagilor
scade şi la un moment dat bacteriile se pot multiplica exponenţial şi densitatea bacteriană atinge nivelul
la care pot determina o izbucnire epidemică (severitatea izbucnirii epidemice va fi cu atât mai mare cu
cât densitatea bacteriofagilor rămaşi în sursele de apă contaminate este mai mică); b. dacă izbucnirea
epidemică este datorată multiplicării bacteriene, necorelat cu diminuarea densităţii fagice, introducerea
bacteriofagilor în sursele de apă ar putea reduce amploarea izbucnirii epidemice şi ar putea duce chiar şi
la declinul acesteia.
În ambele situaţii amploarea efectului bacteriofagilor depinde de balanţa care se stabileşte între rata
de multiplicare a vibrionilor şi de rata de distrugere a fagilor.
În timpul izbucnirii epidemice din Dhaka, Bangladesh, au fost cuantificate: a. incidenţa infecţiilor, b.
densităţile tulpinilor deV. cholerae implicate (serotipul O1, rezistent la streptomicină) şi c. concentraţiile
bacteriofagilor litici specifici pentru această tulpină (JSF4), atât în scaunul pacienţilor spitalizaţi cât şi în
rezervoarele de apă potabilă.
Studiul a fost posibil pentru că implica o singură tulpină, a cărei densitate a putut fi uşor
monitorizată prin susceptibilitatea/rezistenţa la streptomicină.
55
Pe baza observaţiilor în dinamică, studiul a sugerat că infecţiile sunt cauzate de consumul de apă
dintr-un rezervor comun, în care bacteria şi fagul se reproduc şi interacţionează independent de
populaţia umană. Iniţial, schimbările temporare climaterice au creat condiţiile unei descreşteri a
concentraţiei fagice, cu o multiplicare exponenţială a vibrionilor în sursele de apă. Populaţia a început să
se infecteze consumând apa respectivă, s-a creat un cerc vicios de multiplicare bacteriană în rezervor
prin recontaminarea rezervorului datorită igienei precare şi astfel epidemia s-a amplificat. După un timp
producţia de fagi a început să crească, datorită concentraţiei mari de vibrioni din rezervor şi în
persoanele infectate. Amplificarea densităţii fagice a dus la un declin al densităţii bacteriene şi respectiv
la scăderea numărului de persoane infectate, până la dispariţia cazurilor.
Studiul (a fost realizat şi un model matematic foarte interesant) a sugerat şi posibilitatea ca fagul să
se dezvolte iniţial în gazdele infectate cu V. cholerae, şi abia apoi să ajungă în rezervor (datorită lipsei de
igienă). Această amplificare (numerică şi funcţională) a bacteriofagilor ar putea reprezenta o importantă
componentă în prevenirea / controlul epidemiilor de holeră.
5. Genetica bacteriană
5. 1. Suportul eredităţii
Genetica bacteriană studiază ereditatea şi variabilitatea la bacterii.
Suportul material al eredităţii este reprezentat de ADN (acidul dezoxiribonucleic). Molecula de ADN
conţine codificată informaţia ereditară, care se exprimă prin sinteza unor proteine şi se transmite prin
replicare şi diviziune la descendenţi. Gena reprezintă unitatea funcţională a eredităţii iar noţiunea de
genă este cunoscută încă din anul 1909.
Dacă nu au loc modificări genetice, toţi descendenţii unei bacterii vor fi identici cu bacteria „mamă”
şi identici între ei. O celulă bacteriană inoculată pe un mediu de cultură (având la dispoziţie nutrienţii
necesari) va produce prin multiplicare în condiţii prielnice (de pH, temperatură, umiditate etc.) o colonie
bacteriană, o clonă.
Materialul genetic al unei celule bacteriene poate fi modificat fie prin incorporarea unui fragment de
material genetic exogen (prin procesul de recombinare genetică), fie prin apariția spontană sau indusă a
unei mutaţii care poate consta în adăugarea, pierderea, substituirea sau inversarea ordinii unor baze în
secvenţa ADN-ului.
Structura acidului dezoxiribonucleic
ADN-ul este un macropolimer de dezoxirbonucleotide.
Unitatea structurală este formată dintr-o bază azotată purinică (adenina, A; guanina, G) sau
pirimidinică (timina, T; citozina, C), o pentoză (dezoxiriboza) şi acid fosforic.
Legături fosfodiester unesc carbonul 5 al unei molecule de dezoxiriboză cu carbonul 3 al moleculei
adiacente, formând o catenă lungă polinucleotidică. Prin analiza compoziţiei în baze azotate a ADNului
(provenit din surse diferite) s-a demonstrat că există o anumită compoziţie care diferă la diversele specii.
Compoziţia de nucleotide a ADN-ului este surprinzător de variabilă. Suma procentuală a citozinei şi
guaninei variază la bacterii de la 22% până la 74%, în timp ce la organismele eucariote intervalul este
ceva mai restrâns (28 - 58%). La om variază între 39-40% în funcţie de tipul de ţesut (timus 39%; ficat
56
39,4%). Acest fapt se explică prin evoluţia în decursul a mai multor mii de ani a procariotelor comparativ
cu a eucariotelor în general şi a omului în particular.
Comparaţiile conţinutului de C+G ale diferitelor organisme și microorganisme au fost folosite drept
fundament în vederea stabilirii relaţionării/legăturii genetice. Timina fiind susceptibilă la alterări
fotochimice (lumină UV), bacteriile cu un conţinut bogat de C+G este posibil să fi evoluat în medii
supuse unei lumini solare foarte puternice sau unor temperaturi înalte, iar cele cu conţinut redus de C+G
s-ar fi dezvoltat în locuri mai protejate.
Așadar, compoziţia în baze azotate, numită şi procentul de C+G, este diferită în funcţie de specie,
dar se păstrează constantă în cadrul unei anumite specii.
Procentul de C+G se calculează după formula: (C+G)/ (C+G+A+T). De exemplu acest raport diferă
la diferitele specii bacteriene, sper exemplu este 26,8% la Clostridium perfringens, 40%
la Streptococcus pneumoniae, 40,5% la Proteus vulgaris,51,7% la Escherichia coli, 53% la Proteus
morgani şi67% la Pseudomonas aeruginosa. Aşa cum a fost precizat de către diverși autori, compoziţia
de baze azotate este un index taxonomic. (1)
La celulele procariote ADN-ul este inelar, împachetat în nucleoidul din citoplasmă. La bacteria
intestinală E. coli cele 4,7 milioane de perechi de baze alcătuiesc o macromoleculă de 1,4 milimetri
lungime, dar numai 2 nanometri lăţime. Aceasta conţine 4.400 de gene deja secvenţiate. În ciuda
lungimii sale, de peste o mie de ori diametrul celular, ADN-ul este extrem de bine înfăşurat în nucleoid,
în aproximativ jumătate din diametrul celular.
ADN-ul apare ca o macromoleculă formată din două catene polinucleotidice antiparalele şi
complementare răsucite în dublu helix. Cele două catene sunt unite prin punţi de hidrogen formate între
bazele azotate opuse (A=T şi G≡C). Modelul structural al ADN-ului a fost propus de către Watson şi
Crick în anul 1953. Complementaritatea bazelor azotate este cea mai importantă proprietate a acizilor
nucleici şi condiţionează toate proprietăţile ADN-ului, mai ales cea de autoreplicare şi cea de transfer al
informaţiei genetice.
Rolul genetic al ADN-ului a fost dovedit prin experienţe succesive, iniţial prin cercetările lui W.
Griffith (1928) privind fenomenul de transformare bacteriană, ulterior prin experienţe care au confirmat
rezultatele obţinute de Griffith, dar abia în 1944 Avery, MacLeod şi Mc Carthy demonstrează faptul că
ADN-ul este substratul chimic al eredităţii şi reprezintă materialul genetic al oricărei celule (funcţie
îndeplinită așa cum știm astăzi de ARN, la ribovirusuri).
La temperatura camerei ADN-ul este o structură stabilă în condiţii fiziologice normale, datorită
legăturilor intercatenare (2 între A şi T şi 3 între C şi G). Dacă temperatura depăşeşte 65ºC, stabilitatea
punţilor de hidrogen începe să cedeze, dublul helix începe să se desfacă şi rezultă două catene
complementare (proces numit denaturare termică). Denaturarea devine completă la temperaturi care
depăşesc valoarea de 90ºC.
Renaturarea („reannealing”) reprezintă refacerea structurii bicatenare a ADN-ului, iar prin acest
proces se poate stabili relaţia filogenetică între două specii (în funcţie de procentul de renaturare). De
exemplu dacă se utilizează ADN denaturat provenit de la E. coli şi ADN denaturat provenit de
la Salmonella spp., fiecare marcat cu acelaşi izotop (ex. C 14), fracţiunea de ADN marcată şi evaluată prin
diferite tehnici va fi fracţiunea din ADN care este complementară pentru cele două specii (aceste
experienţe au stat la baza brevetării tehnicilor de hibridare moleculară). Renaturarea este un proces mai
lent decât denaturarea.
57
Denaturarea şi renaturarea acizilor nucleici sunt procese fizice importante, folosite fie în tehnologia
ADN-ului recombinant, fie în studierea relaţiilor filogenetice între diferite specii. Cu cât speciile sunt mai
înrudite, cu atât secvenţele de baze azotate au un mai mare grad de similitudine (lanţurile lor
monocatenare renaturează mai rapid).
5. 3. Amplificarea genetică
conceptul amplificării cantităţii de acizi nucleici a fost introdus în 1983 de către Mullis, dar anul
1955, odată cu descoperirea ADN polimerazei I, a reprezentat un moment crucial. Folosind ADN-
polimeraza şi două secvenţe scurte de ADN (oligonucleotide, primeri), s-a pus la punct un test repetitiv
59
de sintetizare a ADN-ului care a fost numit „Reacţia de polimerizare în lanţ” (Polymerase Chain Reaction,
PCR).
ADN-polimeraza este capabilă să conducă la sinteza unui al doilea lanţ de ADN, întotdeauna orientat
5’-3’, folosind ca substrat patru nucleotide trifosfat, un lanţ de ADN ca „matrice” (model) şi un fragment
scurt de ADN complementar utilizat drept „primer” (amorsă). Pentru un lanţ polinucleotidic, vom utiliza
de fapt doi primeri, care sunt complementari pentru două secvenţe specifice şi diferite ale ADN-ului
ţintă.
Iniţierea sintezei de ADN va putea avea loc numai după ce ADN-ul dublu catenar este denaturat
(termic). Urmează o etapă de răcire, permiţând astfel ataşarea primerilor (care sunt furnizaţi în exces)
de fragmentele de ADN complementar. Sinteza de ADN mediată de ADN-polimerază va produce două
molecule dublu catenare. Dacă procesul se repetă, vor rezulta patru molecule de ADN. ADN-ul se
multiplică exponenţial (dublându-se de fiecare dată) ori de câte ori se repetă reacţia. Teoretic, PCR
poate amplifica un fragment scurt de ADN pornind de la o singură moleculă la 1.000 de copii, dacă
procesul se repetă de 10 ori şi la circa un milion de copii, dacă procesul se repetă de 20 de ori. Acest
proces poate avea loc automat într-un aparat numit termociclor; aparatul repetă ciclul constând în
denaturarea prin căldură (la 94-96ºC), ataşarea primerilor (la 40-60ºC) şi sinteza ADN-ului (la 65-75ºC),
folosind ADN-polimeraza termostabilă (Taq-polimeraza) izolată de la o bacterie, care trăieşte în izvoarele
termale din Yellowstone National Park, Thermus aquaticus.
Aplicaţiile tehnicii de amplificare genetică
PCR a început să fie aplicată în numeroase domenii ale cercetării medicale fundamentale.
Succesul depinde de puritatea sursei de ADN, precum şi de metoda de extragere şi de recuperare a
ADN-ului. Datorită sensibilităţii extrem de mari a procesului, contaminarea datorată manipulării
produselor de amplificare PCR obţinute anterior în acelaşi laborator poate reprezenta o problemă
deosebit de serioasă. Contaminarea se poate realiza fie între probe, în timpul desfăşurării protocolului de
lucru, fie datorită diferitelor manipulări. Prima variantă este mai uşor de evitat, astfel încât sursa majoră
de contaminare în laboratorul de biologie moleculară rămâne eventuala contaminare a reactivilor.
Verificarea acestei posibile erori este obligatorie pentru orice reacţie PCR, printr-o reacţie de control
(control negativ) la care nu se adaugă ADN. Această problemă a contaminării nu este superpozabilă cu
cea a rezultatelor fals-pozitive. O contaminare între probe este mult mai dificil de identificat. Principalele
măsuri de precauţie ar fi reprezentate de: utilizarea unor camere de lucru separate pentru manipularea
produselor care conţin ADN şi respectiv pentru prepararea celorlalţi reactivi, folosirea micropipetelor
(două seturi de micropipete, pentru produse cu şi fără ADN), utilizarea conurilor cu filtru, lucrul într-o
nişă special amenajată şi dotată cu hotă cu flux laminar de aer.
Recent s-a demonstrat faptul că lumina ultravioletă are capacitatea de a inactiva ADN-ul dublu
catenar contaminant.
Alte modalităţi de a elimina (diminua) riscurile contaminării sunt reprezentate de: includerea unei
nucleotide modificate în PCR (înlocuirea deoxiuridinei-P cu deoxitimidină-3P) şi respectiv folosirea
enzimelor de restricţie pentru îndepărtarea ADN-ului contaminat din RT-PCR (transcriere inversă).
Utilizarea PCR în diagnosticul bolilor infecţioase
PCR poate fi utilă în diagnosticul bolilor virale, bacteriene, fungice sau parazitare.
În infecţia cu HIV, PCR şi-a dovedit utilitatea atât în diagnostic (secvenţele HIV-1 sunt detectabile în
100% din cazuri atunci când virusul este cultivabil şi în 64% din cazuri în situaţia unor culturi negative),
60
cât şi în stabilirea prognosticului. În cazul infecţiilor cu citomegalovirus (CMV), PCR poate detecta ADN
viral în sânge cu 7-10 zile mai devreme decât sunt identificate antigenemia sau viremia. În mod
asemănător, PCR este utilă în identificarea altor agenţi etiologici (în contextul general epidemiologic,
clinic şi paraclinic) precum virusurile hepatitei B şi C, virusurilor papilloma, herpes virusurilor sau a unor
enterovirusuri.
Diagnosticul infecţiilor bacteriene poate beneficia de asemenea de tehnicile moleculare prin
amplificare genică. Actualmente sunt puse la punct protocoalele de lucru utile identificării agenţilor
etiologici ai tusei convulsive (Bordetella pertussis), legionellozei (Legionella pneumophila), pneumoniei
atipice (Mycoplasma pneumoniae), tuberculozei (Mycobacterium tuberculosis), proceselor inflamatorii
pelviene (Chlamydia trachomatis), gonoreei (Neisseria gonorrhoeae), sifilisului (Treponema pallidum),
meningitei (Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis), gastritelor şi ulcerului (Helicobacter pylori),
febrei tifoide (Salmonella typhi), dizenteriei bacteriene (Shigella dysenteriae), septicemiei cu E.
coli (enterotoxigen), bolii Lyme (Borrelia burgdorferi), leprei (Mycobacterium leprae) etc. Dacă în cazul
majorităţii bolilor enumerate există alternative bacteriologice sau imunologice clasice decisive, atunci
când sunt implicate microorganismele aparţinând genului mycobacterium (Mycobacterium tuberculosis,
Mycobacterium leprae) se ridică anumite probleme. În tuberculoză, agentul etiologic se izolează relativ
dificil din produsele patologice, se multiplică lent, coloniile vizibile apărând pe mediile de cultură după 2-
8 săptămâni, iar testele necesare identificării fenotipice clasice necesită 2-6 săptămâni suplimentare şi
nu au relevanţă în 100% din cazuri. Pe de altă parte, Mycobacterium leprae nu se multiplică pe nici un tip
de mediu de cultură. Cu alte cuvinte, aplicarea unor metode sensibile şi specifice este foarte necesară.
Sunt puse la punct protocoalele de lucru PCR utile în scopul diagnosticării infecţiilor grave produse
de Candida albicans, pneumoniei la pacienţi imunodeprimaţi (Pneumocystis carinii), meningitei
cu Cryptococcus neoformans sau al unor infecţii cuCoccidioides immitis (ex. la persoane infectate cu
HIV), pentru a enumera câteva din aplicaţiile biologiei moleculare în domeniul afecţiunilor produse de
fungi.
În domeniul parazitologiei, exemplele cele mai bine cunoscute sunt legate de diagnosticul dizenteriei
amoebiene (Entamoeba histolytica), altor diarei de origine parazitară (de exemplu, cele produse
de Giardia lamblia), malariei (Plasmodium falciparum) sau diagnosticul toxoplasmozei (Toxoplasma
gondii).
Actualmente s-au pus la punct şi alte metode de amplificare genetică utile în diagnosticul sau în
identificarea agenţilor etiologici ai maladiilor transmisibile. În mod suplimentar dorim să menţionăm
faptul că dacă iniţial tehnicile de bază ale biologiei moleculare (hibridizarea moleculară, utilizarea
sondelor nucleotidice marcate radioactiv sau neradioactiv, amplificarea genică) erau utilizate individual,
majoritatea protocoalelor de lucru actuale cuprind combinaţii de tehnici, din ce în ce mai complexe şi mai
subtile. Pe de o parte, există şi o întregă serie de variante tehnice ale reacţiei de amplificare genică, de
ex. Invers-PCR (pentru amplificarea unei regiuni la care nu este cunoscută secvenţa, dar zonele
învecinate au secvenţe cunoscute); LCR (ligase chain reaction) în care este necesar să cunoaştem
integral secvenţa ADN-ului ţintă; RT-PCR (PCR înainte de care are loc o revers-transcriere, pornind de
ex. de la ARNm şi obţinând ADNc); Nested PCR (în care are loc o amplificare dublă a acidului nucleic
folosind 2 perechi de primeri diferiţi) etc. Pe de altă parte, tehnica PCR este utilizată din ce în ce mai
frecvent ca o completare esenţială a unei alte tehnici (de exemplu RFLP, restriction fragment length
61
polymorphism; SSCP-PCR; DRE-PCR, double repetitive element PCR; DRV-PCR, direct variable repeat-
PCR; UP-PCR, single universal primer-PCR; spoligotyping etc).
5. 5. Mecanismele de variabilitate
bacteriană
Bacteriile sunt microorganisme haploide (cu excepţiile prezentate anterior), au un singur cromozom
iar pentru remanierea prin recombinare a genomului este necesară transferarea de material genetic de
la o tulpină („donoare”) la tulpina receptor („acceptoare”). În mod clasic poate avea loc un transfer „pe
orizontală” între tulpini care fie fac parte din aceeaşi specie fie fac parte din specii foarte înrudite, chiar
dacă genotipic sunt diferite. Relativ recent a fost demonstrată posibilitatea unor schimburi genetice între
64
tulpini din specii diferite (ex. în ecosistemul intestinal). Variabilitatea bacteriană presupune modificarea
la un moment dat a comportamentului celulei bacteriene sau a descendenţilor ei şi pot exista în principiu
două variante:
- variabilitatea fenotipică şi
- variabilitatea genotipică;
Variaţiile fenotipice reprezintă modificări morfologice sau fiziologice de tip adaptativ, care nu se
transmit ereditar. Genomul nu este afectat.
Variaţiile genotipice reprezintă modificări definitive ale materialului genetic (cromozomial sau
extracromozomial) care se transmit descendenţilor.
Mecanismele variaţiei genotipice sunt reprezentate de:
- mutaţie;
- transfer genetic urmat de recombinare genetică.
Mutaţia
Mutaţia reprezintă o modificare accidentală în secvenţa nucleotidică a unei gene, ducând la
modificări ale mesajului genetic.
Mutaţiile pot apărea la nivelul materialului genetic prin:
- substituţii;
- inversii;
- inserţii;
- deleţii.
Mutaţia spontană
Mutaţiile care apar în condiţii de mediu obişnuite şi fără intervenţia unui factor decelabil se numesc
mutaţii spontane.
Mutaţia indusă
Mutaţiile care se produc sub acţiunea unor factori fizici (de exemplu raze UV, radiaţii ionizante etc.)
sau chimici (de exemplu agenţii alchilanţi), care acţionează ca agenţi mutageni, se numesc mutaţii
induse.
Rata mutaţiilor induse este semnificativ mai mare decât rata mutaţiilor spontane.
Mutaţia punctiformă are ca substrat alterarea unui singur nucleotid, respectiv a unui singur codon.
Mutaţiile extinse reprezintă alterări care depăşesc limitele unui codon, putând afecta secvenţe mai
mari ale uneia sau mai multor gene (mutaţie poligenică).
Mutaţiile regresive (retromutaţii) afectează celule mutante, determinând revenirea acestora la tipul
iniţial, restabilind secvenţa nucleotidică originară.
Mutaţiile supresoare permit exprimarea funcţiei anterioare a genei, deşi o modificare a secvenţei
bazelor nucleotidice persistă.
Principalele mecanisme de transfer al materialului genetic de la o bacterie donor la o bacterie
receptor sunt:
- transformarea;
- transferul mediat de bacteriofagi (transducţia);
- conjugarea.
Transformarea
65
Transformarea este un transfer genetic realizat atunci când bacteria acceptă ADN liber provenit de
la o bacterie donor sau din alte surse. Bacteria receptor trebuie să fie „competentă” în a accepta ADN-ul
de la bacteria donor.
Prima transformare a fost descrisă în 1928 de către Griffith, în experimente referitoare la virulenţa
pneumococilor faţă de şoarecele alb.
Transformarea poate avea loc doar atunci când bacteriile intră în faza staţionară a ciclului celular.
Pătruns în celula receptoare, un fragment de ADN exogen poate înlocui (prin recombinare genetică) o
secvenţă nucleotidică omologă, bacteria receptoare dobândind un caracter genetic nou (de exemplu
sinteza unei structuri capsulare/capsidice).
Unele bacterii sunt „competente” în mod natural. În cazul bacteriilor care nu sunt „natural
competente”, pentru a putea realiza fenomenul de transformare este necesară tratarea chimică a
acestora, de ex. cu ioni de calciu.
Transferul genetic mediat de bacteriofagi se poate realiza prin:
- transducţie;
- conversie lizogenică.
Transducţia reprezintă transferul unui fragment genetic (cromozomial sau extracromozomial) de la
o bacterie la alta prin intermediul unui bacteriofag (de obicei un fag temperat). Fagul se numeşte
transductor. Bacteria receptoare se numeşte transductant.
Transducţia specializată (restrictivă) este caracteristică fagilor transductori care au proprietatea de a
transfera numai un număr restrâns de gene bacteriene situate în imediata apropiere a situsului de legare
a profagului în cromozomul bacterian.
Transducţia generalizată (nerestrictivă) presupune că teoretic, oricare din genele cromozomului
bacterian, indiferent de poziţia lor în genom, pot fi încorporate în mod accidental în particula virală
matură pentru a forma un fag transductor, care le poate transmite unor bacterii receptoare. Transducţia
generalizată poate fi realizată de un mare număr de fagi neintegraţi în cromozomul bacterian atunci
când aceştia intră în ciclul litic.
Conversia lizogenică reprezintă apariţia unui caracter nou la bacteriile care găzduiesc un profag,
de exemplu producerea toxinei difterice este realizată numai de către C. diphtheriae purtător al fagului
temperat (profagul β care deţine gena tox) iar producerea toxinei scarlatinoase este posibilă numai în
cazul în care Streptococcus pyogenes de grup A este lizogenizat. Există şi fagi care sunt integraţi în
regiuni care codifică un anumit produs din genomul bacterian (ex. fagul P4 de la E. coli se integrează
într-o genă care codifică leucina).
Conjugarea bacteriană reprezintă un proces de transfer de material genetic (cromozomial sau
extracromozomial) realizat prin intermediul unei legături intercelulare directe. Este condiţionată de
prezenţa factorului F în celula donoare.
Receptorii specifici
Pentru realizarea legăturii intercelulare este necesară existenţa unor „receptori” de suprafaţă atât la
celula donoare, cât şi la celula receptoare. Aceştia vor permite „recunoaşterea reciprocă”.
Fiziologia conjugării bacteriene
După un număr de alipiri întâmplătoare, bacteriile F+ formează cu bacteriile F- „perechi de
recombinare” şi între celulele alăturate se formează un canal de conjugare. Prin canalul de conjugare se
realizează transferul unidirecţional al materialului genetic. Fragmentul transferat poate fi apoi integrat
66
parţial sau total în genomul celulei receptoare, ducând la apariţia unor proprietăţi noi ale acesteia,
manifeste sau nu.
5. 6. Povestire adevărată
„Folosirea cunoştinţelor din domeniul geneticii, în munca de detectiv”
Îmbinarea examinării foarte detaliate a secvenţelor genomice microbiene cu o cunoaştere
aprofundată a evoluţiei bacteriilor poate fi utilă atât în obţinerea unor diagnostice de mare precizie, cât
şi în aplicarea unor teste de diagnostic relevante în medicina legală.
Spre exemplu, dorim să amintim situaţia creată în 2001 în urma atentatelor teroriste din SUA, când
o serie de instituţii, dar şi persoane particulare, au primit plicuri având un praf alb sau maroniu, care în
unele cazuri (au existat şi „alarme false”) s-a dovedit a conţine spori de Bacillus anthracis. Câteva
elemente concrete cu privire la situaţia din acea perioadă vor fi prezentate în capitolul dedicat
genului Bacillus.
După cartografierea genomului de B. anthracis s-au evidenţiat ca fiind posibile circa 3.500 de mutaţii
nucleotidice unice. În funcţie de acestea se ştie actualmente, că tulpinile cunoscute pot fi împărţite în 8
grupe, fiecare grup fiind la rândul său divizat în mai multe subgrupe. Toate aceste grupe studiate sunt
foarte stabile privind o posibilă variaţie genetică (nu există „cross-link”-uri între grupe), ceea ce face
ca Bacillus anthracis să reprezinte un „candidat ideal” pentru studii de biologie moleculară folosite în
scopul punerii la punct a unor teste, care să identifice cu mare fineţe o anumită tulpină, inclusiv
„originea” acesteia.
Prin metode ale biologiei moleculare s-a demonstrat de exemplu că tulpina de B. anthracis folosită
în atacurile teroriste făcea parte din grupul Ames. Această încadrare a putut să fie stabilită prin
evidenţierea a 6 mutaţii specifice grupului Ames (4 la nivel cromozomial, una la nivelul plasmidului pX01
şi una la nivelul plasmidului pX02).
Aşadar, iată cum, pentru o bacterie stabilă din punctul de vedere al unei posibile variaţii genetice, se
poate realiza o adevărată „muncă de detectiv” şi prin metode specifice de laborator se poate stabili
originea şi apartenenţa sa, pornind de la caracteristicile genetice.
6. Antibiotice şi Chimioterapice
6. 1. Definiţie
Antibioticele şi chimioterapicele antimicrobiene reprezintă un grup de substanţe medicamentoase
capabile să distrugă sau să inhibe multiplicarea unor microorganisme implicate etiologic în bolile
infecţioase. Au o acţiune selectivă asupra celulelor microorganismelor, exercitând acţiuni minime asupra
celulelor organismului gazdă. Aceste substanţe pot fi:
- antibacteriene,
67
- antivirale,
- antifungice,
- antiparazitare.
În mod clasic, în această grupă de medicamente au fost incluse şi antineoplazicele (ex.
dactinomycina, doxorubicina, bleomycina). Există și antibiotice folosite ca:
· inhibitori enzimatici (ex. Lipstatin, sintetizat de Streptomyces toxytricini),
· imunosupresori (ex. Ciclosporina, sintetizată de Tolypocladium inflatum),
· hipocolesterolemiante (ex. Lovastatin, sintetizat de Aspergillus terreus),
· insecticide,
· ierbicide etc (1).
68
În perioada 1979-1982 sunt descoperite fluorochinolonele (norfloxacina, enoxacina, ofloxacina,
pefloxacina, ciprofloxacina etc) iar în 1982 sunt produşi monobactamii, cu activitate pe germenii
Gram-negativi (ex. aztreonam).
La începutul secolului 21 se utilizau la nivel mondial peste 250 de molecule de antibiotice şi
chimioterapice antiinfecţioase diferite. Având în vedere utilizarea mai puţin raţională a acestor
medicamente, Organizaţia Mondială a Sănătăţii elaborează periodic o listă a medicamentelor esenţiale,
inclusiv antibiotice şi chimioterapice. În această listă apar medicamente betalactamice (penicilină,
amoxicilină, cloxacilină, piperacilină etc), medicamente antituberculoase şi antileproase (clofazimină,
dapsonă, ethambutol, izoniazidă, pirazinamidă, rifampicină etc), alte medicamente antiinfecţioase
(cloramfenicol, co-trimoxazol, doxiciclină, eritromicină, gentamicină, metronidazol, spectinomicină,
sulfadiazină etc), medicamente „complementare” (ciprofloxacină, clindamicină, acid nalidixic etc) dar nu
apar pe lista principală nici cefalosporinele şi nici chinolonele ceea ce demonstrează cel puţin indirect
recomandarea de reducere a utilizării în exces a medicamentelor antimicrobiene, aceasă noţiune având o
legătură directă cu subiectul prezentului capitol. În acelaşi sens, este recomandată citirea unui document
relativ recent („How to improve the use of medicines by consumers ”, OMS, 2007), adresat atât
specialiştilor în sănătate cât şi celor care utilizează diferitele medicamente, inclusiv antibiotice şi
chimioterapice. Interesul pentru acest subiect este dovedit şi de faptul că editarea acelui manual a fost
făcută cu asistenţă financiară de la Comunitatea Europeană.
6. 3. Clasificarea antibioticelor şi
chimioterapicelor
Clasificarea se poate face după:
a) originea lor;
b). efectul bacteriostatic sau bactericid;
c). mecanismul de acţiune;
d). spectrul de acţiune şi
e). structura chimică (Tabelul nr. 1).
6. 3. 1. În funcţie de originea lor, agenţii antimicrobieni pot fi clasificaţi în următoarele categorii:
a). Substanţe cu origine biologică elaborate de anumite microorganisme (antibioticele), de exemplu
penicilina G; bacteriocinele (piocine, colicine etc) au origine biologică, dar nu pot fi utilizate în
tratamentul infecţiilor umane;
b). Produşi de semisinteză realizaţi pornind de la un nucleu elaborat de un microorganism, nucleu
care suferă apoi prelucrări chimice (de exemplu meticilina);
c). Produşi de sinteză chimică integrală (chimioterapice antiinfecţioase), de exemplu acidul nalidixic
sau sulfamidele (sulfonamidele).
Deoarece în momentul actual o mare parte a medicamentelor antimicrobiene sunt produse prin
metode chimice, diferenţierea netă dintre antibiotice şi chimioterapice este mai rar întâlnită în limbajul
medical curent, cel mai frecvent toate aceste medicamente fiind numite „antibiotice” (totuşi trebuie să
cunoaştem că există această diferenţă).
6. 3. 2. în funcţie de efectul lor, medicamentele antimicrobiene pot fi bacteriostatice şi bactericide.
69
Un antibiotic este bacteriostatic dacă efectul său se limitează la oprirea multiplicării bacteriene (ex.
tetraciclinele, cloramfenicolul, eritromicina, clindamicina, sulfonamidele etc).
Un antibiotic este bactericid dacă acţiunea sa duce la distrugerea bacteriilor (ex. penicilinele,
cefalosporinele, polimixinele, aminoglicozidele, rifampicina, vancomicina, streptograminele etc).
Trebuie cunoscute situaţiile patologice în care se poate administra un antibiotic bacteriostatic,
precum şi situaţiile în care este absolut necesară administrarea unui antibiotic cu efect bactericid (spre
exemplu la persoanele care prezintă imunodepresie).
72
- alte peniciline şi inhibitori de beta-lactamaze (de exemplu acid clavulanic + amoxicilină / ticarcilină,
sulbactam + ampicilină, tazobactam + piperacilină);
b). Cefalosporinele
- din generaţia I (de exemplu cefalotina, cefaloridina);
- din generaţia a II-a (de exemplu cefamandola, cefoxitina, cefuroxima);
- din generaţia a III-a (de exemplu cefotaxima, ceftriaxona);
- din generaţia a IV-a (de exemplu cefepima, cefpiroma).
Cefalosporinele se mai pot clasifica şi în:
- cefalosporine de uz oral (cefacitril, cefapirin, cefazedon, ceftezol etc);
- cefalosporine de uz parenteral (cefalotina, cefaloridina, cefazolina, cefamandola etc);
- cefalosporine care prezintă o mai bună stabilitate în prezenţa beta-lactamazelor (cefuroxima,
cefoxitima, cefotetanul, cefixima etc);
- cefalosporine cu activitate faţă de Pseudomonas aeruginosa (ceftazidima, cefpiroma,
cefepima, cefoperazona, cefsulodimul etc).
c). Alte antibiotice beta-lactaminice
- monobactamii (de exemplu aztreonamul);
- penemii (de exemplu ritipenemul);
-carbapenemii (de exemplu imipenenul, meropenemul, imipenemul + cilastatina; cilastatina este un
inhibitor al dehidro-peptidazei);
- oxacefemii (ex. latamoxef);
- carbacefemii (ex. loracarbef).
d). Inhibitori de beta-lactamaze (ex. acidul clavulanic, sulbactamul, tazobactamul).
2. Glicopeptidele (teicoplanina şi vancomicina);
Vancomicina este utilizată în tratamentul infecţiilor cu S. aureus meticilino-rezistent. Se
administrează intravenos deoarece nu se absoarbe în tractul gastrointestinal. Printre reacţiile adverse
amintim reacţiile anafilactice, febră, eozinofilie, neutropenie, pierderea auzului.
3. Aminoglicozidele
- streptomicina (care este de fapt un oligozaharid);
- kanamicina, gentamicina, amikacina, spectinomicina, tobramicina, netilmicina etc.;
4. ciclinele (ex. tetraciclina, oxitetraciclina, minociclina, doxiciclina etc);
5. Ansamicinele (ex. rifampicina, rifabutina);
6. Macrolidele (ex. eritromicina, claritromicina, azitromicina, telitromicina); 7. Polipeptidele ciclice
(polimixina B, colistinul);
8. Antibioticele care nu se încadrează în nici una din grupele de mai sus
- cloramfenicolul;
- lincosamidele (lincomicina şi clindamicina);
- acidul fusidic (cu o structură asemănătoare steroizilor);
- streptograminele (pristinamicin, quinupristin, dalfopristin);
- oxazolidinonele (linezolid);
- mupirocinul; ultimele 4 grupe de medicamente au fost descoperite în special ca răspuns la apariţia
tulpinilor de stafilococ rezistente la meticilină etc.
Chimioterapicele
73
1. Sulfamidele (sulfonamidele) (ex. sulfadiazina, sulfafurazolul);
2. Co-trimoxazolul (asociere trimetoprin + sulfametoxazol)
3. Dapsona (diaminodifenilsulfona);
4. Ethambutolul;
5. Hidrazida acidului izonicotinic (HIN, izoniazida);
6. Chinolonele (ex. acidul nalidixic, ofloxacina, ciprofloxacina, norfloxacina, levofloxacina,
moxifloxacina, gatifloxacina, gemifloxacina etc);
7. Nitrofuranii (ex. furazolidonul, nitrofurantoina);
8. Nitroimidazolii (ex. metronidazolul, tinidazolul, ornidazolul) etc.
6. 4. Lantibioticele
Denumirea de „lantibiotice” a fost introdusă relativ recent, fiind vorba de un grup special de
substanţe antimicrobiene cu o serie de proprietăţi datorită cărora au fost clasificate între antibiotice şi
bacteriocine. Lantibioticele sunt sintetizate de bacterii Gram-pozitive (ex. din
genurile Staphylococcus, Streptococcus, Bacillus, Streptomyces) şi prezintă un spectru de activitate
specific faţă de anumite bacterii Gram-pozitive. Din punct de vedere al structurii chimice lantibioticele
sunt polipeptide policiclice.
Masa moleculară a acestor substanţe se situează între 1.825 daltoni (mersacidina) şi 3.488 daltoni
(Pep5). Pe baza structurii lor diferite, s-au descris două tipuri de lantibiotice: A şi B.
Tipul A: sunt lantibiotice produse de stafilococi, lactococi şi bacili Gram-pozitivi, de ex. nisina,
subtilina, epidermina, gallidermina şi Pep5.
Lantibioticele îşi au originea în proteine precursoare inactive (pre-lantibiotice) sintetizate la nivel
ribozomal, convertite enzimatic în polipeptide active din punct de vedere biologic. În privinţa
mecanismului de acţiune se ştie de ex. că nisina şi Pep5 au activitate bactericidă depolarizând
membrana citoplasmatică a celulei bacteriene, formând pori şi inducând autoliza acesteia. Datorită
faptului că există o specificitate a lantibioticelor faţă de anumite bacterii se consideră că există şi alte
mecanisme implicate.
Genele responsabile de sinteza lantibioticelor pot fi localizate cromozomial sau plasmidic. De ex. în
cazul nisinei, genele sunt localizate pe cromozonul celulei bacteriene (15) de Lactococcus lactis, iar
informaţia genetică pentru biosinteza epiderminei este localizată pe plasmidul pTu 32.
Utilizarea lantibioticelor în industria alimentară şi în practica medicală
Dintre lantibioticele cunoscute, nisina are cea mai largă aplicabilitate practică. Nisina inhibă tulpinile
din genurileStreptococcus, Staphylococcus, Bacillus, Clostridium, Listeria la o concentraţie ≥ 30 ml / ml,
activitatea inhibitorie fiind maximă la pH < 5,5. Nisina inhibă sporularea bacteriilor din
genurile Clostridium şi Bacillus; nu are efect asupra bacteriilor Gram-negative sau asupra fungilor. Nisina
este folosită pe scară largă în industria alimentară drept „conservant natural” pentru vegetale, fructe,
brânzeturi proaspete şi procesate, carne, peşte, cacao, băuturi alcoolice (vinuri). Nu prezintă
dezavantajele nitraţilor şi nitriţilor (produc nitrozamină cu acţiune carcinogenă). În practica medicală
este utilizată în unguente cosmetice. Este folosită şi ca agent terapeutic în medicina veterinară (în
tratamentul local al infecţiilor bacteriene).
74
Epidermina, produsă de Staphylococcus epidermidis, are acţiune antimicrobiană faţă de germeni
care pot acţiona patogen la nivel tegumentar: Propioniibacterium acnes, Streptococcus
spp., Staphylococcus spp. Astfel, epidermina şi gallidermina (sintetizată de Staphylococcus gallinarum)
constituie alternative terapeutice pentru derivatele de vitamina A şi eritromicină, de ex. în cazurile de
acnee juvenilă, eczemă, foliculite etc.
Dintre lantibioticele de tip B putem exemplifica lanthiopeptina, care are acţiune antivirală faţă de
virusul Herpes simplex.
6. 5. Rezistenţa microbiană la
antibiotice
Utilizarea cu succes a oricărui agent terapeutic poate fi compromisă de dezvoltarea rezistenţei.
Rezistența poate să apară atât pentru antibioticele utilizate în tratamentul infecțiilor bacteriene cât şi
pentru antifungice, antivirale, antiparazitare sau pentru medicamentele utilizate în tratamentul unor boli
cronice.
Trei condiţii trebuiesc îndeplinite ca un anumit antibiotic să inhibe bacteria susceptibilă:
antibioticul trebuie să poată să ajungă la ţintă într-o concentraţie suficientă;
antibioticul nu trebuie să fie inactivat înainte să se lege de ţintă;
trebuie să existe în celula bacteriană o ţintă vitală susceptibilă la acţiunea antibioticului.
Cititorul este rugat să consulte și http://ecdc.europa.eu/en/eaad/pages/video.aspx.
Rezistenţa microbiană la antibiotice reprezintă capacitatea unor microorganisme de a supravieţui şi
de a se multiplica în prezenţa antibioticului.
Fenomenul de rezistenţă la antibiotice a fost descris relativ rapid după introducerea acestora
(ex. Streptococcus pyogenesrezistent la sulfonamide, Staphylococcus aureus rezistent la penicilină
sau Mycobacterium tuberculosis rezistent la streptomicină) în practica medicală.
Pe măsură ce au fost descoperite mecanismele prin care medicamentele antiinfecţioase afectează
multiplicarea sau distrug diferitele tipuri de bacterii (ex. mecanismul de acţiune al beta-lactaminelor) au
fost descoperite şi mecanismele prin care bacteriile pot rezista faţă de acţiunea medicamentului
antibacterian (ex. producerea de enzime numite beta-lactamaze / penicilinaze, cefalosporinaze etc).
Rezistenţa poate fi naturală sau dobândită.
6. 5. 1. Rezistenţa naturală (intrinsecă) reprezintă rezistenţa tuturor membrilor unei specii
bacteriene faţă de un antibiotic şi este determinată genetic, de exemplu rezistenţa bacilului tuberculozei
(Mycobacterium tuberculosis) la penicilina G.
6. 5. 2. Rezistenţa dobândită este acea rezistenţă necaracteristică unei specii bacteriene, dar
achiziţionată de anumite subpopulaţii din acea specie în circumstanţe date; de exemplu, antibioticul
acţionează ca un presor selectiv (pacientul are o infecţie în care majoritatea populaţiei bacteriene este
sensibilă la agentul antimicrobian, dar există tulpini care prezintă rezistenţă; în aceste condiţii, tulpinile
sensibile vor fi inhibate sau distruse în timp ce tulpinile rezistente vor fi „selectate”; această situaţie nu
poate fi detectată decât utilizând tehnicile de testare a sensibilităţii bacteriilor la antibiotice şi
chimioterapice, de ex. antibiograma difuzimetrică standardizată).
Rezistenţa dobândită poate fi cromozomială sau extracromozomială.
75
Mecanisme biochimice implicate în rezistenţa la antibiotice
- producerea de către bacterie a unei enzime care inactivează antibioticul, de exemplu penicilinaza
stafilococului auriu (codificată plasmidic) care inactivează nucleul beta-lactamic al penicilinelor sau
diferitele tipuri de beta-lactamaze produse de bacteriile Gram-negative (ex. de enterobacterii);
- scăderea permeabilităţii peretelui sau membranei citoplasmatice pentru antibiotic (de exemplu
formele L);
- elaborarea în exces de către bacterie a unor enzime complementare, care limitează sau anulează
acţiunea antibacteriană a antibioticului, exercitată la nivelul enzimei respective;
- alterarea ţintei intracelulare (ex. modificarea proteinelor ribozomale);
- amplificarea sintezei de acid paraaminobenzoic, anulându-se astfel prin „diluare” acţiunea
inhibitorie a sulfamidelor etc. (Tabelul nr. 2)
6. 5. 2. 1. Rezistenţa cromozomială se poate dezvolta ca rezultat al unei mutaţii spontane, la
întâmplare, la nivelul unui locus ce controlează sensibilitatea faţă de un anumit produs antimicrobian
(deleţie, substituţie sau adiţie de bază). Prezenţa substanţei active antimicrobiene serveşte ca un
mecanism selector, suprimând organismele sensibile şi favorizând dezvoltarea unei populaţii provenite
din organismele mutante, rezistente la antibiotic. Mutaţia spontană apare cu o frecvenţă variind între 10 -
12
-10-7. Mutaţiile cromozomiale sunt definitive, afectează numai un anumit antibiotic sau o familie de
antibiotice şi se transmit vertical la toţi descendenţii suşei bacteriene devenite rezistentă. Pot fi
clasificate în:
· mutaţii într-un singur pas (single large step mutations) – o singură mutaţie duce la creşterea
CMI pentru un anumit antibiotic. Pot duce la eşuarea tratamentului atunci când acesta este instituit cu
un singur antibiotic.
· mutaţii în mai mulţi paşi (multistep mutations) – mutaţii secvenţiale care duc la creşterea
gradată a CMI.
6. 5. 2. 2. Rezistenţa extracromozomială este mult mai frecventă decât cea cromozomială,
reprezentând circa 90% din cazurile de rezistenţă. În acest caz, transmiterea materialului genetic pentru
rezistenţă se poate face transversal (orizontal), la toţi membrii populaţiei bacteriene existente la un
anumit moment dat, prin plasmide, material plasmidic sau transpozoni.
Transferul materialului genetic se poate realiza prin:
- transducţie;
- transformare;
- conjugare;
- transpoziţie.
Transducţia apare prin intervenţia unor bacteriofagi care pot transporta ADN bacterian încorporat în
capsida sau genomul propriu. Dacă acest material genetic include gene pentru rezistenţa la un antibiotic
(factor R sau RTF), o celulă bacteriană infectată ulterior poate deveni rezistentă la antibioticul respectiv
şi este capabilă să transmită descendenţilor această rezistenţă fără a veni în contact cu antibioticul
respectiv.
Transformarea reprezintă un mod de transfer al informaţiei genetice care implică încorporarea de
ADN liber din mediu (rezultat de exemplu în urma lizei unor bacterii care-l conţin) într-o altă bacterie.
Conjugarea reprezintă pasajul genelor de la o celulă la alta prin contact direct realizat prin
intermediul unui pil sexual (pil F). Acest mecanism este considerat foarte important în răspândirea
76
rezistenţei la antibiotice. ADN-ul astfel transferat poate codifica simultan pentru germenul receptor
rezistenţa faţă de mai multe antibiotice.
Transpoziţia este un transfer al unor secvenţe scurte de ADN (transpozoni, elemente transpozabile)
în interiorul unei celule bacteriene între două plasmide sau între o plasmidă şi o porţiune a cromozomului
bacterian.
6. 5. 3. Tipuri de rezistenţă
6. 5. 3. 1. Rezistenţa faţă de un agent antimicrobian poate fi:
- monovalentă (monorezistenţa), atunci când germenii rezistă la un singur antibiotic;
- plurivalentă (rezistenţa multiplă, la mai multe antibiotice);
6. 5. 3. 2. Din alt punct de vedere, rezistenţa se poate manifesta:
- direct (leagă o anumită bacterie de un singur anumit antibiotic);
- încrucişat (rezistenţa unei bacterii faţă de mai mulţi agenţi antimicrobieni cu structură şi/sau
mecanism de acţiune asemănător); de ex. rezistenţa la o sulfonamidă sau la o tetraciclină conferă
rezistenţă la toate sulfonamidele sau la toate tetraciclinele în timp ce stafilococii rezistenţi la meticilină
(MRSA) sunt rezistenţi la toate medicamentele beta-lactamice;
6. 5. 3. 3. După ritmul de instalare, rezistenţa poate fi:
- cu ritm rapid de instalare (monostadială), „tip streptomicină”;
- de ritm intermediar, „tip eritromicină”;
- cu ritm lent de instalare (pluristadială), „tip penicilină”;
- cu ritm foarte lent de instalare, „tip vancomicină”.
6. 5. 4. Modificări ale spectrului antimicrobian iniţial
Implicaţiile clinice, terapeutice, epidemiologice şi materiale ale fenomenului de rezistenţă bacteriană
la antibiotice şi chimioterapice sunt extrem de mari. Selectarea tulpinilor rezistente prin antibioticoterapia
excesivă, de multe ori abuzivă, exercitată în spitale, alte unităţi sanitare sau în ambulator (inclusiv prin
fenomenul numit „automedicaţie”), duce la variate aspecte negative: infecţii cu germeni rezistenţi,
apariţia şi transmiterea germenilor de spital, devalorizarea şi pierderea unor medicamente antibacteriene
etc. O problemă deosebită este şi utilizarea medicamentelor antibiotice şi chimioterapice în domeniul
veterinar. Se estimează că anual se consumă circa 100.000 tone de antibiotice şi chimioterapice, o bună
parte în ferme de animale, piscicole etc (Levy 2002). Acest exces de utilizare produce şi un fenomen de
„poluare” a mediului cu substanţe de acest tip, prin excreţia acestora de către animalele „tratate”.
Atunci când vorbim de utilizarea raţională a antibioticelor şi chimioterapicelor ar trebui să avem în
vedere: utilizarea acestora în beneficiul pacientului; evaluarea clinică riguroasă însoţită de teste de
laborator sugestive sau care să confirme infecţia şi respectiv sensibilitatea la medicamente a tulpinilor
izolate; instituirea tratamentului în cel mai scurt timp posibil în cazul pacienţilor cu infecţii severe,
ameninţătoare de viaţă; tratamentul trebuie să fie „ţintit”, să fie îndreptat strict către bacteria care a
produs respectiva infecţie, să se utilizeze calea de administrare cea mai potrivită, doza corespunzătoare,
intervalul între doze, durata optimă a tratamentului iar pacientului să i se explice toate elementele care
vor permite ca acesta să fie compliant şi să respecte indicaţiile medicale.
Este strict necesară supravegherea fenomenului de rezistenţă la antibiotice şi chimioterapice,
testarea sensibilităţii germenilor, notificarea şi evaluarea statistică, publicarea periodică a datelor şi
punerea lor la dispoziţia sistemului sanitar. Cu toate acestea, datele menţionate mai sus nu sunt
77
disponibile la nivel naţional. În România, profesioniştii din sistemul sanitar se bazează fie pe
experienţa proprie, fie pe datele statistice din literatura internaţională.
Se vorbeşte tot mai des în zilele noastre despre „superbugs”, şi anume, bacterii rezistente la foarte
multe antibiotice. Printre acestea amintim Acinetobacter baumannii, Burkholderia cepacia,
Campylobacter jejuni, Clostridium difficile, Enterobacter spp., Escherichia coli, Haemophilus influenzae,
Klebsiella pneumoniae, M. tuberculosis, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa,
Salmonella spp., Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae etc. Termenul de „superbug” se
refer la microbi care duc la o mortalitate şi morbiditate ridicată datorită mutaţiilor multiple și respectiv
rezistenței la antibiotice și chimioterapice rezultate. Variantele terapeutice devin limitate iar spitalizarea
este de durată mare şi poate duce la costuri deosebit de mari. (3)
NDM (New Delhi metallo-beta-lactamase gene; blaNDM-1) este o genă nou descoperită.
Bacteriile care dețin gena devin ”impermeabile” pentru o serie de antibiotice și inactivează
carbapenemazele. Gena se găseşte la nivelul unei plasmide și din această cauză poate fi ușor transmisă.
A fost prima dată identificată în India; a fost ulterior recunoscută în Pakistan, Bangladesh, UK, SUA,
Canada, Australia, Belgia etc (4-7).
6. 5. 5. Date privind controlul extinderii rezistenţei la antibiotice
Utilizarea oricărui antibiotic în mod potențial duce la rezistenţă. De-a lungul anilor s-au realizat și
aplicat diferite strategii de către CDC, Organizația Mondială a Sănătății și mai de curând de către ECDC,
pentru prevenirea şi controlul rezistenţei la antibiotice, spre exemplu:
· controlul strict al folosirii acestor medicamente după o prescriere corectă (ex. nu pentru un
guturai sau altă infecție insensibilă la antibiotice anti-bacteriene)
· achiziţionarea antibioticelor și chimioterapicelor doar în baza prescripției medicale
· controlul strict al medicamentelor utilizate la animale şi în agricultură (multe dintre
moleculele de antibiotice și chimioterapice folosite în terapie la om se găsesc sub alte denumiri
comerciale şi în tratamentul animalelor)
· prevenirea bolilor infecţioase etc.
Rezistenţa la antibiotice datorată răspândirii utilizării acestora de către om şi pentru animale a
devenit o problemă tot mai mare în ultimele decenii. În 2001 ”European Union Ministers of Health” a
adoptat Recomandările legate de folosirea prudentă a antibioticelor în medicina umană. Prima
recomandare a fost ca statele membre să întocmească şi să întărească un sistem de supraveghere
pentru folosirea antibioticelor şi prevenirea rezistenţei la acestea. Din 1999, Sistemul European de
Supraveghere Antimicrobiană (European Antimicrobial Surveillance System – EARSS) oferă date legate
de prevalenţa şi răspândirea majorităţii bolilor cauzate de bacterii rezistente la unul sau mai multe
antibiotice. În raportul anual din 2007 EARSS afirmă că „datele pe care EARSS le-a adunat de-a lungul
anilor aduc un mesaj neplăcut dar important: rezistenţa la antibiotice devine o problemă tot mai mare de
sănătatea publica an după an şi doar un efort cumulat poate schimba această situaţie”. (8)
Copiii sunt cei care primesc cele mai multe antibiotice în UE mai ales pentru infecţii ale tractului
respirator superior. Există date care arată că în acest caz apare și rezistenţa la antibiotice și
chimioterapice. Tulpinile rezistente sunt răspândite printre copiii care sunt duşi la creşă sau la altă formă
de educație preșcolară. La nivelul UE deşi au existat câteva iniţiative, s-a făcut mult prea puţin în ceea
ce priveşte această grupă de vârstă. Ar fi totuși de menționat înfiinţarea Reţelei de Prescriere şi
78
Rezistenţa la Antibiotice a Copiilor din UE (The Antibiotic Resistance and Prescribing in European
Children network – ARPEC) care are următoarele scopuri:
· să folosească metodologia şi datele oferite de celelalte sisteme de supraveghere pentru a
dezvolta un sistem de supraveghere a rezistenței la antibiotice, pentru copiii din UE
· să determine diferenţele legate de alegerea antibioticului, doza şi indicaţiile care apar între
diferite comunităţi şi spitale
· să pună la punct recomandări privind dozele de antibiotice și chimioterapice administrate
zilnic copiilor
· să colecteze date
· să initieze referinţe legate de rata prescrierii şi rezistenţei în colaborare cu Societatea
Europeană pentru Bolile Infecţioase Pediatrice (European Society for Paediatric Infectious Diseases –
ESPID)
· să trimită rezultatele obținute în cadrul fiecărui proiect către toate ţările membre. (9)
CDC a dezvoltat la rândul său un plan de acţiune cu privire la rezistenţa la antibiotice care cuprinde
patru mari puncte:
· Supraveghere,
· Prevenire şi Control,
· Cercetare şi
· Producţie. (10)
81
multidisciplinare cu participarea managerilor unităţilor sanitare, pentru limitarea problemelor legate de
numeroasele erori comise în antibioticoterapie (Arnold 2004).
Principalele cauze ale situaţiei actuale sunt un număr imens de prescrieri abuzive şi folosirea
iraţională a unor antibiotice; se estimează că 60% din antibioticele şi chimioterapicele produse anual se
risipesc inutil. Principalele „rezultate” sunt: apariţia de specii sau de tulpini („mutante”) bacteriene cu
rezistenţă la antibiotice, înmulţirea reacţiilor adverse la antibiotice şi chimioterapice precum şi
modificarea tablourilor clinice „clasice“ ale patologiei infecţioase.
Cel puţin teoretic soluţia ar fi descoperirea de noi antibiotice (însă din ce în ce mai multe companii
farmaceutice transferă interesul pentru descoperirea de medicamente antivirale şi antifungice şi au
tendinţa de a renunţa la cercetarea fundamentală în vederea producerii de medicamente antibacteriene,
Shlaes 2003) dar mult mai logic, mai corect şi mai la îndemână estefolosirea raţională a
medicamentelor antimicrobiene deja existente şi evitarea erorilor făcute în practica antibioticoterapiei.
Dar, care sunt cele mai frecvente erori în folosirea antibioticelor?
În primul rând este incorect să începem un tratatament antibiotic fără să fi examinat clinic
(complet) pacientul şi fără să utilizăm informaţiile pe care le putem obţine printr-o anamneză riguroasă.
Este incorect să indicăm folosirea acestor medicamente în stări febrile în care există doar „bănuiala unei
infecţii”. Este incorect să decidem antibioticoterapia „la întâmplare” sau „pe încercate” (cu o eventuală
eroare suplimentară reprezentată de schimbarea succesivă a antibioticului în „raţionamentul” că „poate
de data aceasta va merge” fără să încercăm să ne fundamentăm decizia pe criterii raţionale (cel puţin pe
criterii de probabilitate). „Raţionamente” simpliste de tipul febră = infecţie = antibiotice şi chimioterapice
(deseori întâlnite în practică, din păcate) nu pot conduce decât la eşec, la modificarea evoluţiei bolii şi la
împiedicarea stabilirii ulterioare a diagnosticului („mascare” clinică şi bacteriologică) şi tratamentului
corect. Cu privire la criteriile de probabilitate este adevărat că în România nu există ghiduri şi
recomandări privind utilizarea corectă a antibioticelor, bazate pe studii actuale, realizate
peeşantioane reprezentative statistic pentru România şi în aceste condiţii „referinţa” este
reprezentată de studiile făcute în SUA sau în Europa de Vest şi de manualul domnului profesor Mircea
Angelescu (1998).
În al doilea rând este incorect să utilizăm antibiotice fără a solicita, fără a obţine şi fără a
interpreta corect datele de laborator. Indiferent de specialitate (medicală, chirurgicală) şi indiferent de
supra-specialitate este necesară cunoaşterea şi utilizarea corectă a unor noţiuni elementare de
bacteriologie. Este absolut incorect să începem antibioticoterapia înainte de recoltarea produsului
patologic. În funcţie de contextul clinic şi de gravitatea patologiei în cazul căreia presupunem drept
etiologie o infecţie bacteriană este recomandabil să solicităm şi efectuarea unor examene paraclinice de
bază (leucogramă, VSH, radiografie, sumar de urină etc). Nu trebuie să uităm că atunci când
suspicionăm o infecţie bacteriană, indiferent de specialitate (aceste analize pot fi efectuate chiar şi
personal; ca alternativă trebuie să stabilim o foarte bună colaborare între clinică şi laborator)
avem la îndemână posibilitatea şi necesitatea efectuării de preparate între lamă şi lamelă (native) şi
frotiuri (colorate Gram, cu albastru de metilen, Giemsa etc.) din produsul obţinut prin recoltare de la
pacientul cu o presupusă infecţie bacteriană. Realizarea şi examinarea frotiurilor poate dura chiar şi
numai 5 minute, permiţând în scurt timp obţinerea unui rezultat orientativ, uneori foarte important. Nu
ar trebui să indicăm tratamentul cu antibiotice fără a ţine seama de sensibilitatea la antibiotice a
germenului. În cazul unor infecţii grave se poate începe antibioticoterapia, după „criterii de
82
probabilitate”. Însă, în cazul în care produsul patologic a fost recoltat anterior, a fost transmis către
laborator, a fost prelucrat iar agentul etiologic a fost identificat şi s-a stabilit care este sensibilitatea la
antibiotice şi chimioterapice iar evoluţia clinică şi paraclinică nu este favorabilă, demonstrând că
antibioticul ales nu a fost cel mai potrivit, pentru că avem rezultate de laborator vom putea „schimba”
tratamentul, de această dată pe criterii ştiinţifice evitând schimbări repetate şi „la întâmplare” sau chiar
inducerea unui prognostic rezervat pacientului supus tratamentului din clinica în care ne desfăşurăm
activitatea). Trebuie să nu greşim şi să luăm în considerare drept agenţi etiologici diferiţi germeni
saprofiţi sau condiţionat patogeni, cultivaţi din focare sau cavităţi septice deschise, sau izolaţi din
produse contaminate în cursul recoltării.
O altă eroare ar fi ignorarea posibilităţii ca germenul izolat să fie doar unul dintre cei 2 sau mai mulţi
germeni implicaţi.
Încă din anul doi de studiu se obţin primele date cu privire la toate aspectele descrise mai sus
precum şi cu privire la testarea sensibilităţii la antibiotice (de ex. antibiograma), metodă care nu trebuie
interpretată mecanic, nu trebuie nici subestimată şi nici supraevaluată (mai ales atunci când este
efectuată difuzimetric şi / sau nu este standardizată).
Aşa cum am mai subliniat în cadrul acestui capitol, nu trebuie niciodată să absolutizăm datele
clinice, datele paraclinice, datele de laborator, luate fiecare în parte şi „scoase” din contextul general. Nu
există o prioritate pentru clinică sau o prioritate pentru laborator; datele trebuie interpretate, integrate şi
utilizate în contextul clinic, paraclinic şi de laborator general. Aceasta reprezintă, după opinia
noastră, un aspect esențial al medicinii pe care dorim să o practicăm la cel mai înalt nivel, în favoarea
pacienţilor pe care trebuie să îi tratăm.
În al treilea rând este incorect să prescriem fără justificare antibiotice şi chimioterapice, spre ex. în
stări febrile neinfecţioase (maladii cu mecanism prin hipersensibilitate, maladii ale ţesutului colagen,
neoplazii etc), în boli infecţioase cu agenţi patogeni care nu sunt sensibili la antibiotice (ex. este absurd
să utilizăm penicilină sau orice alt antibiotic antibacterian în „tratamentul” gripei). Este de subliniat că
este incorect să indicăm antibioterapia (şi să aşteptăm ca indicaţia noastră să aibă efect curativ) în cazul
unor supuraţii colectate neglijând şi / sau temporizând incizia şi drenajul (antibioticul nu difuzează în
focarul purulent; în plus, va fi inactivat la acest nivel).
În al patrulea rând, atunci când este necesară antibioterapia, este incorect să alegem eronat un
antibiotic sau o asociere de antibiotice (în cazul în care această asociere este strict necesară), prin
necunoaşterea sau nerespectarea spectrului antimicrobian, prin nefolosirea antibioticului de elecţie (ex.
folosirea augmentinului sau cloramfenicolului sau tetraciclinei în angina streptococică la pacientul care
nu prezintă hipersensibilizare la penicilină), prin utilizarea de antibiotice nedifuzibile în focar (infecţia
urinară nu se poate trata cu cloramfenicol deoarece cloramfenicolul se elimină prin bilă sau prin urină
sub formă de metabolit inactiv). În plus nu trebuie să uităm faptul că lucrăm cu bolnavi şi nu cu boli şi în
acest sens pentru un anume pacient pot exista anumite contraindicaţii specifice (ex. hipersensibilizare
faţă de antibioticul pe care dorim să îl utilizăm, cu posibilitatea apariţiei unui şoc anafilactic).
Este incorect să indicăm asocierea antibioticelor antagoniste din punct de vedere al mecanismului
(ex. penicilină G + tetraciclină) sau să indicăm asocierea de antibiotice cu acelaşi spectru (eroare poate
fi dramatică în cazul asocierii a două aminoglicozide sau a două antibiotice cu spectru larg). Primul
exemplu a fost ales pentru a atrage atenţia privind eroarea de a asocia antibiotice care pot da reacţii
adverse serioase (ex. afectarea până la determinarea apariţiei surdităţii prin afectarea nervului acustico-
83
vestibular), reacţie de notorietate în cazul aminoglicozidelor (streptomicină, kanamicină, gentamicină,
amikacină etc.).
În al cincilea rând, este incorect să indicăm „din start” antibiotice şi chimioterapice într-un aşa-zis
scop profilactic. Spre ex. în cazul în care pacientul prezintă un panariţiu la degetul inelar singura
atitudine corectă este de realiza incizia, drenajul, antiseptizarea şi pansarea locală, vindecarea urmând a
se produce; nu este necesar ci este chiar contraindicat să recomandăm administrarea de antibiotice şi
chimioterapice. Încă din primii ani de studenţie se poate reţine faptul că, în principiu, utilizarea
antibioticelor în scop profilactic trebuie privită cu rezerve serioase. Pe de altă parte, trebuie cunoscute
situaţiile în care antibioticoprofilaxia este utilă şi recomandabilă (de ex. înainte şi după efectuarea unei
extrageri dentare, manevră sângerândă, la un pacient care are stenoză mitrală).
În al şaselea rând, este incorect să nu studiem şi să nu acumulăm cunoştinţele necesare de
microbiologie, farmacologie, fiziopatologie, semiologie medicală, medicină internă, chirurgie etc. care
contribuie la evitarea erorilor în conducerea tratamentului sau / şi greşelilor în tehnica de administrare;
cunoştinţele acumulate ne permit să avem în vedere posibilele reacţii adverse şi să evităm situaţii care
pot deveni dramatice.
Circulaţia substanţelor antimicrobiene în organism din momentul resorbţiei şi până în momentul
eliminării (farmacocinetica substanţelor antimicrobiene) trebuie cunoscută atât pentru evaluarea
efectului terapeutic cât şi pentru prevenirea acumulării şi apariţiei fenomenelor toxice (de ex. vom indica
substanţe antimicrobiene la pacienţi cu insuficienţă renală numai în condiţiile monitorizării valorii
creatinei şi creatininei sanguine, a ureei sanguine, a ratei de filtrare glomerulare, a ionogramei şi a
sedimentului urinar).
Există anumite caracteristici farmacocinetice pentru fiecare substanţă antimicrobiană. Datele
farmacocinetice condiţionează „biodisponibilitatea” medicamentului în cazul concret al bolnavului tratat.
Aceste proprietăţi caracteristice privesc absorbţia de la locul de administrare, difuziunea în organism
(ţesuturi şi fluide), metabolizarea substanţei în organism, eliminarea (căi şi forme de eliminare) etc.
După mecanismul patogenic reacţiile adverse la antibiotice şi chimioterapice ar putea fi reprezentate
de: a. efecte toxice directe, la locul administrării (fenomene iritative, flebite etc.), sau la distanţă
(hepatice, renale, hemopoietice etc.); b. reacţii de hipersensibilizare (erupţii, şoc anafilactic etc.) şi c.
efecte secundare (dismicrobisme de ex. prin utilizarea antibioticelor cu spectru larg, inducerea de
suprainfecţii, reacţii autoimune etc.).
În al şaptelea rând, este incorect ca atunci când avem un dubiu cu privire la decizia pe care
urmează să o luăm să nu ne consultăm cu alţi colegi, pentru a alege întotdeauna cea mai bună variantă
posibilă. Considerăm că tăria este atunci când ne recunoaştem limitele şi nu atunci când încercăm să
demonstrăm că acestea nu ar exista.
6. 8. Povestiri adevărate
6. 8. 1. Gentamicina administrată în aerosoli
Datorită conjuncturii actuale internaţionale, s-a concluzionat că probabilitatea unui atac terorist cu
arme biologice este din ce în ce mai mare. Având în vedere că prevenirea poate fi o mai bună formă de
apărare, specialiştii occidentali au hotărât să pună la punct un program naţional de protecţie anti-
bioterorism. În Statele Unite, acest program poartă numele de „BioShield”.
84
Iniţial au fost identificate structurile microbiene sau tulpinile care ar putea fi utilizate în cazul unui
atac biologic, cele mai importante fiind: toxina botulinică, Bacillus anthracis, virusurile febrei
hemoragice, Yersinia pestis, Francisella tularensis şi virusul variolic.
În afară de identificarea problemelor potenţiale a fost necesară găsirea soluţiilor de prevenire /
control / combatere.
În cadrul acestui capitol vom discuta numai subiectul legat de un antibiotic cunoscut, dar condiţionat
într-o formă specială, prezentând astfel o serie de avantaje. Gentamicina şi respectiv mecanismul de
acţiune al acesteia sunt elucidate. Condiţionarea în aşa fel încât administrarea să poate fi făcută pe
care inhalatorie prezintă o serie de avantaje, spre exemplu: a. eliberare mai rapidă; b.
biodisponibilitate mai bună; c. remanenţă mai bună; d. posibilitate de dozare mai bună; e. capacitatea
de a ajunge mai uşor şi mai direct la nivelul organelor afectate. Atât în cazul tularemiei cât şi în cazul
pestei, formele pulmonare sunt cele mai grave, cu cea mai mare mortalitate şi cu cea mai mare
contagiozitate, cu alte cuvinte tratamentul acestor forme de boală reprezintă o prioritate.
Având în vedere toate aceste menţiuni, gentamicina administrată pe cale inhalatorie trebuie avută în
vedere atât pentru tratament cât şi pentru profilaxia post-expunere în cazul unui atac bioterorist.
Aceste studii sunt foarte recente iar informaţiile au devenit disponibile în ultima parte a anului 2007.
6. 8. 2. „A da sau a nu da” aceasta este intrebarea!
Când administrăm antibiotic? Mai ales că, spre exemplu, administrarea unui antibiotic adecvat la
pacienţii cu sepsis diminuă mortalitatea într-un procent semnificativ cu cât se face mai precoce (de
ordinul orelor). Aşadar, administrarea de urgenţă a unui antibiotic depinde de capacitatea de a
recunoaşte bolnavul „critic”. „Legarea” ulterioară de etiologia infecţioasă a stării critice nu face decât să
confirme decizia. Dacă va fi incriminată, ulterior, o altă etiologie a stării critice (IMA, pancreatita acută,
HDS cu şoc etc) oprirea antibioticului nu afectează în sens negativ evoluţia, aşa cum ar fi fost afectată
de întârzierea administrării acestuia. La vârstnici, infecţia urinară poate fi frecvent o cauză de sepsis. La
un pacient vârstnic, febril, cu hipotensiune, cu imagine EKG nespecifică pentru un IMA (posibil in primele
ore), aşteptăm chiar şi 4 ore fără să administrăm antibiotic, până la elucidarea modificărilor EKG, dar
dacă sursa hipotensiunii era un sepsis cu punct de plecare renal, sau altul, atunci mortalitatea poate
creşte de la simplu la dublu (17%-30%).
La pacientul care nu e critic, se pot monitoriza semnele clinice şi se poate aştepta cu administrarea
antibioticului până la determinarea posibilei etiologii infecţioase.
Dar pe de altă parte nu trebuie să uităm că nimeni nu ne opreşte, indiferent de decizia care va fi
luată, să recoltăm sânge pentru hemoculturi, urină pentru uroculturi sau alte produse, care pot fi trimise
către laborator înainte de începerea tratamentului antibiotic.
6. 8. 3. S-a întâmplat nu demult în România ...
Vă aducem la cunoştinţă cazul pacientei în vârstă de 21 de ani, care s-a prezentat la medic pentru
o plagă tăiată la nivelul falangei distale a policelui mâinii stângi. Pacienta se tăiase în marginea unei
conserve pe care o desfăcuse de curând. Plaga era în aparenţă profundă şi secţionase coronar pulpa
degetului pătrunzând şi în patul unghial. Sângerarea abundentă şi îndelungată a plăgii, dar şi durerea
pulsatilă la nivelul policelui, apărută după aproximativ o oră, au fost motivele prezentării la medic.
Pacienta a menţionat faptul că acasă a aplicat apă oxigenată pe plagă (a procedat corect, fiindcă apa
oxigenată, prin efectul de spumare, antrenează cheagurile de sânge şi resturile anorganice de la nivelul
leziunii, dar realizează şi o uşoară hemostază, oxigenând totodată plaga şi prevenind astfel dezvoltarea
85
germenilor anaerobi). De asemenea, a aplicat local un antibiotic sub formă de pulbere (ceea ce nu este
la fel de corect).
La spital, din cauza durerii intense care a cuprins între timp întreaga mână până la articulaţia
pumnului, medicul a evitat aplicarea unui prişnit alcoolizat, realizând hemostaza plăgii şi efectuând în
continuare toaletarea marginilor şi interiorului acesteia, aplicând şi apă oxigenată. Leziunea s-a dovedit a
fi minoră şi în mod cert nu necesita suturare. Totuşi, medicul curant cunoştea faptul că pacienta este
studentă la facultatea de medicină şi studiind în diferite spitale, lua aproape zilnic contact cu bolnavii, cu
echipamentul medical, dar şi cu celelalte cadre medicale. În mediul spitalicesc, atât pacienţii cât şi
membrii personalului sanitar se pot infecta dacă există soluţii de continuitate şi dacă nu se respectă
măsurile de prevenire şi control. În acest context, medicul i-a propus pacientei iniţierea unei
antibioterapii cu oxacilină (menţionând că stafilococul alb şi auriu „răspund bine”), timp de cinci zile,
pentru a preveni apariţia unei infecţii piogene a degetului. Un motiv de îngrijorare îl constituia durerea
chinuitoare, pulsatilă la nivelul mâinii (apare de obicei ca un fenomen însoţitor pentru un panariţiu
subcutanat pulpar, însă abia după 24 - 48 de ore; în cazul de faţă durerea s-a instalat la o oră de la
lezarea zonei).
Deşi iniţial reticentă la ideea de a lua antibiotice în scop profilactic, pacienta a acceptat, convinsă de
către medic că riscul apariţiei unei infecţii era mare.
A doua zi, sfătuindu-se cu un medic din universitate, pacienta a „cântărit” mai bine acest risc,
ajungând la concluzia că antibioterapia pe care o urma nu era nici pe departe necesară. Medicul de la
spital a tratat leziunea ca pe o plagă chirurgicală pentru care antibioterapia ar fi putut să fie instituită în
scop profilactic (înainte de realizarea contaminării plăgii) sau metafilactic (în contextul unei inoculări
bacteriene prezumtive). O altă eroare, de această dată a pacientei, a fost aplicarea locală de pulbere
antimicrobiană imediat după lezarea zonei. Evident că riscul apariţiei unei infecţii exista, la fel ca şi în
„povestea drobului de sare”. Pacienta a decis să urmeze antibioterapia timp de trei zile în loc de cele
cinci recomandate; evoluţia a fost favorabilă, iar plaga s-a cicatrizat fără complicaţii. Suntem convinşi că
acest lucru a fost posibil nu datorită antibioticelor administrate, ci datorită faptului că leziunea a fost
minoră, precum şi datorită capacităţii de răspuns a organismului. Pacienta a decis ca pe viitor, în situaţii
similare, să analizeze mai atent beneficiile şi riscurile administrării de antibiotice, acest caz constituind un
elocvent contra-exemplu.
În concluzie, chiar dacă fenomenul apariţiei rezistenţei la antibiotice este bine cunoscut şi înţeles,
iată că în România anului 2007 încă se mai prescriu antibiotice pentru orice „zgaibă”!
6. 8. 4. Antibiotice folosite ca biostimulante
Nu doar fiinţele umane sunt supuse uzului iraţional al antibioticelor, ci şi animalele de fermă.
Situaţiile de necesitate, în care acestea chiar sunt bolnave, reprezintă numai o mică parte din totalul
situaţiilor în care le sunt administrate antibiotice. În majoritatea cazurilor, medicamentele antimicrobiene
sunt introduse în doze mici în hrana sau apa lor pentru efectul biostimulant.
Încă din anii ’40, antibioticele au început să fie folosite în fermele din toată lumea pentru
capacitatea de a determina o creştere mai rapidă în greutate a animalelor. O altă consecinţă este că
acestea devin adevărate rezervoare de germeni rezistenţi, care pot fi apoi transferaţi omului. Producţia
de carne creşte spre beneficiul câtorva producători, dar creşte concomitent şi ponderea bacteriilor
rezistente la antibiotice, în dauna sănătăţii unei lumi întregi.
86
În UE, de la 1 ianuarie 2006 a intrat în vigoare o directivă a Comisiei Europene, care interzice
folosirea antibioticelor în scop biostimulant. Lista antibioticelor utilizate în alt scop decât cel terapeutic s-
a micşorat treptat, de la an la an, pentru ca în 2006 responsabilii europeni, pe deplin convinşi de
concluziile cercetătorilor în domeniul microbiologiei, să le interzică complet.
Fenomenul rezistenţei microbiene la antibiotice are o istorie aproape la fel de lungă ca și cea a
antibioticelor. În discursul rostit cu ocazia primirii Premiului Nobel, Alexander Fleming avertiza în
legătură cu uşurinţa cu care pot fi produse microorganisme rezistente la invenţia sa - penicilina. Nu este
nevoie de altceva decât ca acestea să fie expuse la doze mai mici decât doza bactericidă. Aceasta se
întâmpla în 1945. Foarte curând temerile sale s-au adeverit, începând să apară primele tulpini rezistente.
În 2009 s-a dovedit clar transmiterea de la animal la om a unui germen redutabil - stafilococul auriu
rezistent la meticilină (MRSA).
Aşadar, în condiţiile eforturilor pentru prevenirea apariției și răspândirii germenilor rezistenţi,
sistarea abuzului de antibiotice în ferme ar trebui să se găsească în lista de priorităţi. (11)
6. 8. 5. Antibiotice fără rețetă?
Tot în 2009 câţiva cercetători s-au adunat şi au avut ca scop verificarea numărului de site-uri care
oferă antibiotice fără reţetă. Cu ajutorul motoarelor de căutare Google şi Yahoo au găsit 138 de astfel de
site-uri. Dintre acestea, 36,2% vindeau antibiotice fără reţetă iar 63,8% ofereau o reţetă online.
Penicilinele erau disponibile pe 94,2% din aceste site-uri, macrolidele pe 96,4%, fluoroquinolonele pe
61,6% iar cefalosporinele pe 56,5%. 98,6% exportau spre SUA.
Rezultatele descrise în acest studiu sugerează că există o sursă mare de antibiotice în SUA care nu
este afectată de iniţiativele legate de schimbarea prescrierii antibioticelor şi care poate contribui la
extinderea rezistenţei la antibiotice și chimioterapice.
Comunitatea medicală împreună cu instituţiile de sănătate publică şi companiile farmaceutice trebuie
să-şi extindă eforturile pentru a controla rezistenţa la antibiotice. În timpul anamnezei medicul poate
oferi informaţii legate de antibiotice, rezistenţa la antibiotice şi posibilele interacţiuni între antibiotice.
Pacienţii au nevoie să fie educaţi în acest sens! (12)
6. 8. 6. Și care să fie soluția?
În SUA şi UK se estimează că un foarte mare procent din infecţiile nosocomiale cu S. aureus este
produs de tulpini meticilino-rezistente (MRSA) şi o bună parte sunt MDR. O mai mică parte din aceste
tulpini (şi totuşi numărul este în creştere) prezintă nivele joase de rezistenţă la vancomicină. S-au
descoperit noi antibiotice care pot fi utilizate în tratamentul MRSA şi chiar şi a tulpinilor rezistente la
vancomicina (ex. daptomicina) dar nu o să treacă mult timp până se va dezvolta rezistenţa şi la ele. Este
o soluţie inventarea continuă de noi antibiotice?
Unele tulpini de E. coli (una din cauzele comune de ITU) sunt rezistente la antibiotice din şase clase
diferite incluzând cele mai nou recomandate, fluoroquinolonele. Mai mult decât atât, în sudul Asiei şi în
China, 60-70% E. coli sunt rezistente la fluoroquinolone. (13)
Aşa că rămâne întrebarea - ce este de făcut?
Sau mai bine zis, ce va face cititorul după ce va citi aceste rânduri?
Care este atitudinea pe care o va adopta medicul curant, studentul viitor medic sau omul care
doreşte pur şi simplu să se informeze?
87
Am avea o propunere: în cazul în care nu va reuși să învețe sau să aplice noțiunile învățate
”secundum arte”, măcar să nu participe la ”implementarea” în practică a celor mai frecvente erori în
utilizarea antibioticelor și chimioterapicelor.
6. 9. Evaluarea cunoştinţelor
Alegeți răspunsul corect
1. Neutralizează acţiunea unei clase de antibiotice:
A. nucleul betalactam
B. nucleul carbapenem
C. betalactaminele
D. betalactamazele
E. inhibitorii de betalactamaze
2. Au/Are efect bactericid:
A. cefalosporinele
B. tetraciclinele
C. sulfonamidele
D. cloramfenicolul
E. eritromicina
3. Inhibă sinteza peretelui celular:
A. macrolidele
B. tetraciclinele
C. cloramfenicolul
D. sulfonamidele
E. penicilinele
4. În cazul rezistenţei extracromozomiale, transmiterea materialului genetic NU se poate realiza prin:
A. transducţie
B. transformare
C. mutaţie spontană
D. conjugare
E. transpoziţie
5. NU se obişnuieşte administrarea de antibiotice bactericide la pacienţii cu:
A. cancer
B. SIDA
C. politraumatisme
D. proteze valvulare
E. gripă
88
7. Testarea sensibilităţii la antibiotice şi
chimioterapice
Testarea sensibilităţii la medicamentele antimicrobiene se realizează (din punct de vedere didactic)
în ultima etapă a diagnosticului de laborator microbiologic, pentru majoritatea microorganismelor
implicate etiologic. Testarea este necesară datorită apariţiei şi extinderii rezistenţei microorganismelor la
antibiotice şi chimioterapice. Rezistenţa poate fi naturală sau dobândită. Rezistenţa naturală este
determinată genetic. Rezistenţa dobândită este „achiziţionată” de anumite subpopulaţii dintr-o anumită
specie microbiană, în circumstanţe date, ex. prin „presiunea de selecţie” exercitată de antibiotic.
Noţiuni privind evaluarea sensibilităţii la agenţi antimicrobieni
În general, o tulpină poate fi considerată sensibilă atunci când germenii sunt în mod eficient afectaţi
de către antibiotic, iar efectul terapeutic poate fi obţinut cu doze şi pe căi de administrare „obişnuite”.
Tulpina va fi considerată moderat sensibilă dacă germenii sunt afectaţi într-o măsură mai mică, iar
efectul terapeutic nu poate fi obţinut decât în condiţii speciale (ex. prescrierea unor doze mai mari decât
cele „obişnuite”, calculate de exemplu pe kilogram/corp; utilizarea unor căi de administrare speciale –
injectare intravenoasă, intrarahidiană etc) (Figura nr. 1, Figura nr.2). În mod absolut se consideră că o
tulpină este rezistentă dacă rezultatul testării sensibilităţii in vitro este negativ. Totuşi, trebuie să avem în
vedere că între rezultatele „in vitro” şi efectul „in vivo” pot exista diferenţe.
89
o antibiograma difuzimetrică standardizată
o antibiogramele difuzimetrice rapide
· Tehnicile cantitative
o metoda diluţiilor în mediu lichid
o metoda diluţiilor în agar
o metoda microdiluţiilor în agar
o metoda „punctelor de ruptură”
o testul „E”
o metode şi sisteme comerciale, automatizate, de testare etc.
7. 1. 1. 1. Antibiograma difuzimetrică comună
Din punct de vedere tehnic însămânţăm germenul de testat pe mediul solid (ex. agar Mueller-
Hinton) turnat în plăci Petri. Însămânţarea se poate realiza de exemplu prin „inundarea” plăcii urmată de
aspirarea, aseptic, a excesului de inocul sau cu ajutorul unui tampon (există şi alte variante tehnice).
După circa 20 minute (timp în care placa Petri se lasă cu capacul întredeschis în vecinătatea becului de
gaz, aprins) se aplică microcomprimatele în care sunt încorporate antibiotice în concentraţie
standardizată. Aplicarea microcomprimatelor se poate face cu ajutorul unei pense, în condiţii aseptice,
sau cu ajutorul unui aplicator „automat” (la minim 30 mm distanţă între ele şi minim 15 mm de
marginea plăcii; vom utiliza 5 antibiotice diferite pentru o placă Petri cu diametrul de 9 cm).
Microcomprimatele trebuie să vină în contact perfect cu mediul, motiv pentru care, cu ajutorul unei
pense le presăm uşor (după caz). După încă 15-20 minute, incubăm plăcile peste noapte în termostat, la
28 sau 35-37°C, în funcţie de temperatura optimă de multiplicare a microorganismului testat.
Antibioticul eliberat din microcomprimat difuzează în mediu, realizând zone de inhibiţie în care
coloniile microbiene nu se dezvoltă (Figura nr. 3).
Cu cât zona de inhibiţie este mai largă, cu atât germenul va fi considerat mai sensibil. Dacă în
interiorul zonei de inhibiţie (chiar dacă diametrul înregistrat este foarte mare) se dezvoltă colonii,
„mutanţi rezistenţi”, germenul va fi considerat rezistent (Figura nr. 4).
Această metodă, cu toate că este folosită pe scară largă în laboratoare, permite de fapt numai
eliminarea antibioticelor complet inactive şi eventual selecţionarea antibioticelor foarte active, pentru că
tehnica nu este standardizată.
7. 1. 1. 2. Antibiograma difuzimetrică comparativă (Stokes, Balş)
Se efectuează pentru microorganismul de testat în paralel cu un microorganism de referinţă, din
aceeaşi specie (sau o specie asemănătoare). Spre exemplu, pentru cocii Gram-pozitivi putem alege
pentru comparaţie o tulpină de Staphylococcus spp. Tulpina de referinţă are o sensibilitate cunoscută la
diferitele antibiotice pe care le utilizăm.
Prin această metodă se înlătură o parte din factorii de eroare ai metodei precedente, spre ex.
calitatea mediului, calitatea discurilor de antibiotice, care vor fi identice pentru microorganismul de
referinţă şi pentru microorganismul testat. Rezultatele se exprimă cu termenii: „sensibil”, „intermediar”,
„rezistent”, în funcţie de diametrul zonelor de inhibiţie a multiplicării celor doi germeni, faţă de acelaşi
antibiotic (jumătăţile de cerc se examinează comparativ). În cazul în care cunoaştem CMI (concentraţia
minimă inhibitorie) a microorganismului de referinţă, putem face aprecieri cu privire la CMI pentru
microorganismul testat.
90
Din punct de vedere tehnic, pe o placă de forma unui pătrat („împărţită” în 3 zone egale marcând
pe partea externă a plăcii liniile de demarcaţie) se inoculează în treimea medie microorganismul de
referinţă iar în treimile exterioare 2 microorganisme diferite, pentru care dorim să realizăm testarea.
Inoculul trebuie să fie astfel realizat încât să conducă la apariţia după incubare a unor colonii foarte
apropiate, dar care să nu fie confluente. Plasăm microcomprimatele cu antibiotice pe liniile de
demarcaţie dintre culturi. Incubăm peste noapte la 35-37°C urmând ca în ziua următoare să citim şi să
interpretăm rezultatele. (Figura nr. 5)
7. 1. 1. 3. Antibiograma difuzimetrică standardizată (Kirby-Bauer, NCCLS)
Din punct de vedere tehnic se realizează asemănător cu prima metodă prezentată, dar este
standardizată, fiind singura metodă difuzimetrică recunoscută pe plan internaţional, care permite
obţinerea unor rezultate reproductibile şi corelabile între laboratoare diferite (Film nr. 1).
Elementele necesare standardizării sunt:
· mediul (în majoritatea cazurilor agar Mueller-Hinton, pentru că are o valoare nutritivă
corespunzătoare şi nu conţine substanţe cu acţiune inhibitoare)
o există elemente minerale care trebuie adăugate în cazul testării anumitor microorganisme (ex.
Mg şi Ca2+, pentru tulpini de Pseudomonas aeruginosa, atunci când este testată sensibilitatea la
2+
aminoglicozide);
o se va verifica pH-ul mediului (de obicei cuprins între 7,2 şi 7,4);
o există suplimente nutritive care trebuie adăugate în cazul testării unor microorganisme
pretenţioase;
o grosimea mediului trebuie să fie de 4 mm (25 ml de mediu/placă de 9 cm);
· inoculul, care se obţine de preferat din 5 colonii izolate (cultură pură) şi trebuie să aibă o
turbiditate corespunzătoare standardului turbidimetric 0,5 McFarland (circa 10 8 unităţi formatoare de
colonii/ml) în majoritatea cazurilor;
· timpul de incubare (în majoritatea cazurilor 16-18 ore la 35-37°C, nu mai mult de 2-3 plăci
suprapuse), atmosfera de incubare, umiditatea atmosferei de incubare;
· concentraţia substanţelor antimicrobiene din microcomprimate şi dimensiunea
microcomprimatelor (6 mm diametru);
· alegerea substanţelor antimicrobiene pentru care se face testarea;
· păstrarea plăcilor cu mediu până în momentul utilizării (maxim 7 zile, în pungi de polietilenă,
la +4°C);
· utilizarea tulpinilor de referinţă pentru controlul de calitate;
· interpretarea rezultatelor (se măsoară diametrul zonei de inhibiţie şi se compară rezultatele
cu cele din tabelele puse la dispoziţie de producători şi/sau centrele de referinţă).
Metodele difuzimetrice au dezavantajul că nu permit aprecierea concentraţiilor eficace ale
antibioticului la nivelul focarului infecţios.
92
Metoda este folosită în laboratoarele moderne de microbiologie şi este utilizată pentru a defini
sensibilitatea şi rezistenţa la antibiotice. Depinzând de metoda de testare rezultatele sunt exprimate sub
forma unei concentraţii (mg/l sau µg/ml) sau sub forma unui diametru (mm). (1)
Metoda este practicată de multe dintre laboratoarele din Europa de Vest, mai ales dacă volumul de
muncă este mare sau foarte mare. Prin această metodă se pot testa mai multe microorganisme, în
acelaşi timp. Antibioticele sunt incorporate în mediul de cultură, la o anumită concentraţie „limită”, în
funcţie de cunoştinţele şi datele acumulate în ceea ce priveşte activitatea „in vivo” a respectivelor
medicamente. Plăcile sunt inoculate simultan cu mai multe tulpini bacteriene, în „spot”, folosind un
inoculator construit special, sunt incubate în condiţii corespunzătoare pentru 16-18 ore. În cazul în care
tulpina sau tulpinile din diferitele specii bacteriene nu se dezvoltă la această concentraţie „limită” de
antibiotic (considerată ca fiind eficace „in vivo”), bacteria izolată este considerată sensibilă. În cazul în
care bacteria se dezvoltă (apare cultură bacteriană), bacteria izolată este considerată rezistentă.
Această concentraţie limită (breakpoint) trebuie setată în funcţie de următoarele date: distribuţia
CMI, evaluarea raportului PK/PD (farmacocinetic/farmacodinamic) şi rezultatele obţinute în clinică în
tratamentul pacienţilor. PD reprezintă studiul efectelor medicamentului de-a lungul timpului şi este în
strânsă legătură cu PK care reprezintă modificările concentraţiilor medicamentului în timp.
”Punctele de ruptură” trebuie stabilite înainte ca un antibiotic să fie folosit în clinică şi trebuie să fie
revăzute când apar cazuri de rezistenţă la antibiotice. Totuşi setarea de ”puncte de ruptură” nu este
perfectă. Metoda este utilă şi în realizarea unor studii epidemiologice în ceea ce priveşte modificarea
rezistenţei la antibiotice în anumite zone geografice. (1-2)
7. 1. 1. 7. Testul E; Determinarea CMI prin „E test”
„E test” reprezintă o metodă de testare in vitro a sensibilităţii la antibiotice pentru diferite
microorganisme, inclusiv pentru bacteriile pretenţioase şi germenii anaerobi. „E test” se aseamănă
metodei diluţiei în agar combinând principiile metodei difuzimetrice cu cele de diluţie. „E test” este uşor
de utilizat şi spre deosebire de metoda difuzimetrică permite determinarea valorii CMI. (3)
Din punct de vedere tehnic sunt necesare: o placă Petri cu agar Mueller-Hinton, inoculul
standardizat şi langhetele din plastic pe care au fost fixate antibiotice în gradient, de ex. la un capăt
256 mg/ml ajungând la celălalt capăt la 0,016 mg/ml (câte o langhetă pentru fiecare antibiotic, câte 15
diluţii marcate pe fiecare langhetă). Însămânţăm microorganismul care urmează a fi testat în condiţii
standardizate şi depunem radiar langhetele cu antibiotice (Figura nr. 11 - Aplicarea benzii “E-test” pe
suprafaţa mediului de cultură; Film nr. 2).
Principiu:
Asemănător metodei difuzimetrice, „E test” necesită un inocul bacterian ajustat ca turbiditate
(standardizat), ce urmează a fi depus pe mediul de cultură potrivit microorganismului studiat (ex. mediul
Mueller-Hinton, geloză-sânge etc), în plăci Petri. Benzile „E test” conţin un gradient de agent
antimicrobian şi se aplică după însămânţare. În funcţie de antibiotic, gradientul „acoperă” un şir continuu
de concentraţii între 0,002-32 mg/ml; 0,016-256 mg/ml sau 0,064-1024 mg/ml. După incubare (timp de
16-18 ore la 35-37°C) se formează o zonă eliptică de inhibiţie. Valoarea CMI se citeşte acolo unde
creşterea bacteriană intersectează banda „E test” (Figura nr. 12 ).
Materiale şi reactivi necesari:
· plăci Petri cu agar Mueller-Hinton (păstrate la 2-8ºC până în momentul utilizării);
93
· bulion Mueller-Hinton (cu 20-25 mg Ca2+ şi 10-12,5 mg Mg2+/litru; se repartizează câte 5 ml
în tuburi sterile cu capac; se păstrează la 2-8ºC);
· medii de cultură pentru menţinerea în stare viabilă a tulpinilor bacteriene necesare efectuării
controlului de calitate ;
· tulpini martor;
· inocul bacterian;
· soluţie salină sterilă (0,85% NaCl) sau bulion Mueller-Hinton, pentru ajustarea inoculului
bacterian;
· benzi „E test” (a. cu agenţi antimicrobieni cu nucleu β lactam, b. cu alţi agenţi
antimicrobieni); se păstrează în congelator la -20ºC până în momentul utilizării (Figurile nr. 13-14. Modul
de prezentare a benzilor “E-test”); au o durată de utilizare de 1-2 ani (pentru prima grupă) şi respectiv
de 2-3 ani
· tampoane sterile;
· standard de turbiditate McFarland de 0,5 şi 1,0;
· pipete Pasteur sterile;
· foarfece;
· plăci Petri sterile cu diametrul de 90 mm şi respectiv de 150 mm;
· incubator cu atmosferă obişnuită reglat la 34-35ºC; incubarea în atmosferă îmbogăţită cu
CO2 este necesară în cazul testării anumitor microorganisme;
· sursă de lumină;
· aplicator „E test”şi bandă adezivă (opţional).
Tehnica de lucru (Film nr. 2):
A. Benzile „E test”
· scoatem plăcile cu mediul de cultură şi benzile „E test”din congelator, le lăsăm la
temperatura camerei pentru echilibrare termică timp de 20 minute sau până când nu mai observăm nici
o urmă de umezeală
· înainte de a deschide folia care include benzile, inspectăm pentru a observa dacă există
perforări; dacă folia respectivă nu este intactă, atunci benzile din interiorul ei nu se mai pot folosi; dacă
nu sunt probleme, pentru a deschide o folie mai întâi tăiem cu o foarfecă de-a lungul liniei întrerupte
apoi între compartimentele ce conţin benzile
· scoatem benzile din folie cu ajutorul unei pensete şi le punem în plăci Petri sterile; apoi le
putem aplica pe mediul de cultură care conţine inoculul microbian de testat
· păstrăm restul benzilor în tuburi în care introducem o substanţă desicantă pentru a le proteja
faţă de umezeală; este necesară protecţia şi faţă de căldură şi expunerea directă la lumină (punem
tuburile în congelator, la -20°C)
B. Inoculul bacterian:
· cu ajutorul ansei sau a unei pipete, transferăm mai multe colonii dintr-o cultură bacteriană
de 18-24 de ore într-un tub cu soluţie salină sterilă sau bulion; omogenizăm (există şi varianta să
transferăm mai multe colonii în bulion, să incubăm timp de 2-8 ore până când obţinem densitatea dorită)
· ajustăm (vizual) densitatea folosind soluţie salină sterilă 0,85% sau bulion, la un standard de
turbiditate echivalent cu 0.5 McFarland; alternativ, suspensia se poate ajusta la standardul dorit cu
94
ajutorul unui nefelometru (aprecierea vizuală a turbidităţii inoculului nu garantează numărul corect al
unităţilor formatoare de colonii).
C. Inocularea plăcilor:
· introducem tamponul steril în tubul care conţine suspensia bacteriană de testat, rotim de
câteva ori, apoi eliminăm excesul de lichid prin presarea tamponului de pereţii interiori ai tubului;
· depunem inoculul pe suprafaţa plăcii cu mediul de cultură având grijă să acoperim complet
suprafaţa mediului (ex. inoculăm pe 3 direcţii diferite, rotind placa cu câte o treime);
· lăsăm placa timp de circa 10 minute, ca să se usuce, înainte de a aplica benzile „E test”.
D. Aplicarea benzilor „E test”:
· luăm cu grijă o bandă fără să atingem sau zgâriem partea pe care este depus agentul
antimicrobian; dacă folosim pensa sterilă, apucăm cu grijă de capătul benzii notat cu E (benzile trebuie
să fie complet separate una de cealaltă înainte de a le aplica pe suprafaţa mediului de cultură inoculat cu
tulpina de testat); dacă se foloseşte aplicatorul „E test”, banda adezivă trebuie să fie în poziţia corectă
(la fiecare capăt al aplicatorului);
· aplicăm banda „E test” pe suprafaţa mediului de cultură, cu capătul ce conţine concentraţia
cea mai mare aproape de marginea plăcii;
· dacă lucrăm cu plăci cu diametrul de 90 mm, aplicăm una sau două benzi; dacă lucrăm cu
plăci cu diametrul de 150 mm, putem aplica şase benzi „E test” (benzile se pun la distanţe egale, radial,
pornind din centrul plăcii; marginea capătului benzii notată cu E trebuie să atingă marginea plăcii);
· banda trebuie să fie în contact cu suprafaţa agarului; eliminăm eventualele bule de aer de
sub bandă cu ajutorul unei pense începând de la marginea bulei şi mutând-o în sus pe gradient până la
capătul notat cu E (prezenţa bulelor mici nu va afecta rezultatul testării);
· banda aplicată pe suprafaţa agarului nu se mută în altă poziţie (luând contact cu mediul de
cultură, agentul antimicrobian de pe partea posterioară se eliberează imediat); dacă banda a fost
aplicată cu partea posterioară în sus atunci se apucă cu grijă, se întoarce şi se pune corect pe suprafaţa
mediului; dacă banda a atins suprafaţa mesei de lucru sau un alt obiect, se poate folosi în continuare
atât timp cât nu a luat contact cu o substanţă lichidă.
E. Incubarea:
· timpul şi temperatura de incubare depind de variantele de microorganism-agent
antimicrobian ce urmează a fi testate;
· incubarea în atmosferă de CO2 modifică pH-ul mediului de cultură şi poate afecta activitatea
agenţilor antimicrobieni; se foloseşte numai în cazul în care microorganismele supuse testării necesită
pentru multiplicare CO2 (Haemophilus spp.,Neisseria gonorrhoeae, Streptococcus pneumoniae etc).
Interpretarea rezultatelor:
· putem citi rezultatul în cazul în care creşterea bacteriană este confluentă sau aproape
confluentă (Figura nr. 15 - Interpretare rezultate E-test pentru E. coli);
· ţinem placa lângă o sursă de lumină (atunci când mediul este Mueller-Hinton); citim valoarea
CMI în punctul în care creşterea bacteriană intersectează banda „E test”; dacă am utilizat agar Mueller-
Hinton suplimentat cu 5% sânge de oaie, sau geloză-chocolate Mueller-Hinton sau alt mediu opac, vom
utiliza pentru citirea rezultatului o sursă de lumină reflectantă şi o lupă;
· pe geloză-sânge citim zona de inhibiţie a creşterii bacteriene nu zona de inhibiţie a hemolizei;
95
în cazul în care nu apare nicio zonă de inhibiţie, raportăm valoarea CMI ca fiind mai mare decât cea
mai mare concentraţie a agentului antimicrobian de pe banda „E test” (Figura nr. 16 Interpretare
rezultate E-test pentru stafilococ); dacă zona de inhibiţie nu intersectează banda (zona de inhibiţie se
află sub banda „E test”), valoarea CMI se raportează ca fiind mai mică decât concentraţia cea mai
scăzută a agentului antimicrobian de pe banda „E test”;
· în cazul unei valori CMI situată între două marcaje ale gradientului benzii, rezultatul pe care îl
notăm va fi valoarea cea mai mare;
· raportăm rezultatul obţinut pentru tulpina studiată după ce verificăm rezultatul obţinut
pentru tulpina de referinţă (control de calitate);
· rezultatele CMI se interpretează conform criteriilor stabilite de NCCLS (National Committee
for Clinical Laboratory Standards) (Figura nr. 17 - Tabel NCCLS pentru enterobacterii).
7. 1. 1. 8. Alte tehnici de testare clasice
· Testarea sensibilităţii la antibiotice a bacteriilor anaerobe
o metodele sunt utile în special din punct de vedere al supravegherii epidemiologice, dar sunt
rezervate pentru laboratoarele de referinţă
o se pot utiliza tehnici de diluţie în mediu lichid sau solid, tehnici de microdiluţii în mediu lichid,
teste pentru producerea de β-lactamază etc.
· Testarea sensibilităţii mycobacteriilor
o se efectuează respectând prevederile Programului Naţional de Control al Tuberculozei (care
indică situaţiile în care vor fi efectuate aceste testări)
o se pot utiliza metoda concentraţiilor absolute, metoda proporţiilor, metoda rapoartelor de
rezistenţă, metode radiometrice etc (Figura nr. 18).
· Testarea sensibilităţii altor bacterii
o există şi alte bacterii pentru care trebuie respectate condiţii particulare
o spre exemplu pentru testarea sensibilităţii stafilococilor la oxacilină/meticilină se recomandă ca
mediul să conţină 4% NaCl, pentru testarea sensibilităţii la antibiotice a streptococilor se recomandă ca
mediul să conţină 5% sânge defibrinat de berbec etc. (4)
· Testarea sensibilităţii fungilor (antifungigrama)
o ţine cont de temperatura şi durata de incubare, care diferă faţă de cele pentru bacterii, mediul
utilizat fiind mediul Sabouraud
o se pot utiliza tehnici de diluţie în mediu lichid sau solid (Figura nr. 19).
· Testarea producerii de β-lactamaze
o este utilă atunci când se verifică sensibilitatea la antibiotice a microorganismelor care pot
produce β-lactamază (ex.Haemophilus spp., Staphylococcus aureus etc)
o se pot utiliza teste iodometrice, teste acidimetrice, teste cu cefalosporine cromogene etc; există
şi metode puse la punct pentru testarea sintezei de β-lactamaze cu spectru extins (ESBL) (Figura nr.
20).
· Există şi sisteme automate (ex. ATB şi rapid ATB) sau sisteme semiautomate (ex. ATB
Expression sau miniAPI), pentru testarea sensibilităţii la antibiotice şi chimioterapice, utilizând criteriile
de interpretare NCCLS (Figura nr. 21).
7. 1. 1. 9. Tehnici de biologie moleculară utilizate în testarea sensibilităţii la antibiotice
şi chimioterapice
96
Au fost imaginate o serie de metode semi-automatizate sau automatizate pentru a optimiza
obţinerea unor rezultate corecte şi în timp cât mai scurt, cu privire la sensibilitatea/rezistenţa
microorganismelor la antibiotice şi chimioterapice. Metodele care au la bază tehnicile de biologie
moleculară pot fi foarte utile (chiar dacă costurile sunt mai ridicate). De ex. se cunoaşte că agentul
etiologic al tuberculozei se multiplică lent pe medii de cultură şi în aceste condiţii rezultatele vor fi
obţinute în circa 2 săptămâni prin metodele clasice. Se pot utiliza diferite tehnici şi în final hibridizarea
moleculară pentru a studia diferite mutaţii care pot să dea informaţii cu privire la sensibilitatea/rezistenţa
tulpinilor studiate. Spre ex. INNO-LIPA Rif. TB (LIPA= Line Probe Assay), se realizează cu ajutorul unei
truse comerciale puse la punct în USA. Metoda permite concomitent identificarea M. tuberculosis precum
şi testarea sensibilităţii la rifampicină, după o amplificare genetică a unui material (ADN) provenit fie din
culturi mycobacteriene, fie chiar din produse clinice (Figura nr. 22).
Principiul INNO-LIPA este hibridizarea ADN-ului rezultat dintr-o amplificare prin PCR (Polymerase
Chain Reaction) cu sonde nucleotidice specifice, imobilizate sub forma unor linii (benzi) paralele, pe fâşii
de nitroceluloză. Sondele nucleotidice (S1-S5) sunt biotinilate (cuplate cu biotină). După hibridizare se
adaugă streptavidină conjugată cu fosfatază alcalină, acest conjugat ataşându-se de produşii de
hibridizare rezultaţi anterior. Incubarea în prezenţa unui reactiv cromogen conduce, în cazul existenţei
hibridizării, la apariţia unor benzi colorate, vizibile. În cazul testării rezistenţei la rifampicină, se
urmăreşte apariţia unei/unor mutaţii la nivelul genei care codifică pentru subunitatea β a ARN
polimerazei (gena rpoB). (5-6)
Identificarea apartenenţei tulpinii testate la specia M. tuberculosis, este certificată cu ajutorul unei
oligonucleotide specifice, situată în poziţia a 3-a, după linia care marchează fiecare fâşie-test şi respectiv
linia care permite verificarea calităţii conjugatului (conjugate control).
Produsul unei tulpini sensibile la rifampicină deţine fragmente amplificate, care hibridizează cu
sondele specifice S1, S2, S3, S4 şi respectiv S5. Absenţa uneia sau a mai multor benzi demonstrează că
tulpina este rezistentă la rifampicină (Figura nr. 23).
Pentru tulpinile rezistente la rifampicină, trusa comercială INNO-LIPA permite suplimentar aprecierea
locusului mutaţiei. De exemplu, o tulpină poate prezenta o mutaţie în regiunea R5 (serină-leucină) în
timp ce altă tulpină prezintă o mutaţie în regiunea R4a (histidină), aceste mutaţii apărute la nivelul genei
rpoB fiind dintre cele mai frecvente şi pot fi identificate prin această metodă.
7. 2. Povestiri adevărate
7.2.1. Rezistenţa la antibiotice a tulpinilor de S. aureus în România, comparativ cu EU
În statele Uniunii Europene, serviciile de sănătate publică şi-au îndreptat atenţia în ultimii ani către
stafilococul auriu meticilino-rezistent (MRSA), incidenţa acestei specii microbiene fiind într-o permanentă
creştere atât în infecţiile nosocomiale, cât şi în cele comunitare. Alături de alţi agenţi patogeni care stau
la baza declanşării de infecţii nosocomiale ( Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Enterobacter
spp., Klebsiella spp., Aspergillus spp. etc.), MRSA este agentul etiologic izolat în aproximativ 5% din
totalul acestor infecţii.
În vederea monitorizării în timp şi spaţiu a susceptibilităţii, dar şi a rezistenţei la antibiotice a
diferitelor specii bacteriene cu potenţial patogen crescut, s-a pus la punct EARSS (European
Antimicrobial Resistance Surveillance System) – un program de supraveghere a sensibilităţii la
antibioticele folosite în practica medicală curentă a tulpinilor izolate de Streptococcus
pneumoniae, Staphylococcus aureus, E. coli, Enterococcus faecalis / faecium, K. pneumoniae şi P.
aeruginosa). Supravegherea tulpinilor de S. aureus şi implicit a MRSA este realizată începând cu anul
1999.
În anul 2006, 31 de state din Europa au raportat către EARSS efectuarea testării sensibilităţii la
antibiotice pentru un număr de 29.552 de tulpini de S. aureus izolate. Dintre acestea, 7.037 (23,81%)
au fost identificate ca fiind MRSA. Dintre cele 31 de state, 15 au raportat o incidenţă a infecţiilor cu
MRSA mai mare de 25%. În ţări precum Croaţia, Grecia, Islanda, Malta, Turcia, MRSA s-a izolat cu
precădere în unităţile de terapie intensivă (peste 60% din totalul tulpinilor de MRSA).
Din raportul pe 2006 al EARSS reiese faptul că în statele din Europa Centrală, rata infecţiilor
nosocomiale şi comunitare cu MRSA se situează între 7-22%, comparativ cu partea de nord a
continentului, unde rata este sub 4%. Marea Britanie a raportat între 1.500 şi 4.000 de tulpini de MRSA
pe an, Franţa între 1.700 şi 3.900 de tulpini pe an, Suedia între 1.300 şi 2.000 de tulpini pe an,
Germania între 800 şi 1.300 de tulpini pe an, Slovenia între 150 şi 365 de tulpini pe an, iar Bulgaria a
raportat între 100 şi 170 de tulpini pe an.
În comparaţie cu aceste stateRomânia a raportat în perioada 2002-2006 un număr foarte scăzut de
tulpini, variind între 78 şi 92 de tulpini pe an (circa jumătate din numărul de tulpini raportate de Slovenia
şi de circa 16 ori mai puţine decât Suedia); în acest context, datele raportate la ECDC nu au valori
statistic semnificative.
98
În anul 2005 s-a efectuat în ţara noastră, la Institutul de Boli Infecţioase „Matei Balş”, un studiu al
cărui obiectiv principal a fost stabilirea spectrului de sensibilitate la antibiotice pentru un număr de 589
de tulpini de S. aureus izolate. Peste jumătate din tulpini au fost izolate de la nivel faringian, dar s-au
izolat tulpini şi din leziuni cutanate, prin hemocultură etc. Testarea sensibilităţii la antibiotice a fost
efectuată prin E-test, evidenţiindu-se 92 (15,61%) tulpini de MRSA. Acest nivel redus al meticilino-
rezistenţei poate fi corelat, printre altele, cu numărul mare de tulpini izolate din exsudat faringian, la
care nivelul de meticilino-rezistenţă este mai mic de 10%. Studiul a relevat faptul că macrolidele,
ciclinele şi cotrimoxazolul constituie în prezent alternative terapeutice compromise, rămânând active
(pentru tulpinile identificate în institut) în antibioterapie clindamicina, rifampicina şi aminoglicozidele.
Procentul de tulpini de S. aureus penicilino-rezistente raportat a fost de 26% (şi nu de 100% cum ar
putea părea că este sugerat atunci când, în relaţie cu o tulpină de S. aureus, penicilina este „uitată”
complet).
Tulpinile de MRSA constituie o problemă de sănătate publică pe tot cuprinsul Europei. Totuşi, faptul
că în unele ţări (cum ar fi Cipru sau Turcia) incidenţa infecţiilor cu MRSA este în scădere, reprezintă o
speranţă în încercarea de a controla rata infecţiilor nosocomiale şi respectiv a celor comunitare în care
sunt implicate tulpinile de MRSA.
7.2.2. Este începutul sfârşitului erei antibioticelor?
Conform unor studii recente s-a descoperit o nouă genă numită New Delhi metallo beta lactamază
sau NDM 1. Această genă se găseşte la nivelul plasmidelor şi astfel poate fi copiată cu uşurinţă şi
transmisă altor tipuri de bacterii. Pentru prima dată bacteria care purta gena NDM a fost izolată de la un
pacient suedez de origine indiană care a avut infecţie urinară în timp ce vizita New Delhi. Studiile arată
că între 1 şi 4% dintre bacteriile Gram negative din sudul Asiei poartă gena NDM.
NDM a fost identificată cu precădere la E.coli şi Klebsiella pneumoniae, tulpinile devenind înalt
rezistente la toate antibioticele cu excepţia tigecycline şi colistin. Dar există cazuri în care nici aceste
antibiotice nu sunt eficiente. În prezent nu există alte antibiotice pentru a distruge bacteriile purtătoare
ale acestei gene. Pot apărea infecţii obişnuite precum infecţiile tractului urinar cauzate de
microorganisme rezistente la antibiotice. O încercare pentru tratarea acestor infecţii ar putea fi
administrarea unor ”cocktail-uri” de antibiotice în sparanţa că acestea vor avea un efect sau se pot folosi
doze foarte mari dar există pericolul de intoxicaţie sau a altor reacții adverse.
Din cauza turismului medical în general mai ales pentru proceduri precum chirurgia estetică această
nouă superbacterie se poate răspândi în întreaga lume. În urma unui studiu s-a constat că NDM1 a fost
identificată mai ales în Bangladesh, India şi Pakistan şi a ajuns în Marea Britanie prin intermediul unor
pacienţi care s-au întors din aceste ţări după tratament.
Rezistenţa la antibiotice trebuie considerată o problemă globală, mondială. (7)
99
începe stabilirea relaţiilor operaţionale între fiinţa umană şi populaţia microbiană din mediul înconjurător,
fie prin colonizare saprofitică, fie prin agresiune ce devine evidentă. Imediat după naştere,
microorganismele se stabilesc treptat pe tegumente şi pe majoritatea mucoaselor. Este vorba în principal
de microorganismele care vor alcătui microflora normală a organismului.
Aceasta joacă un rol important în protejarea gazdei faţă de o invazie microbiană ulterioară,
acţionând prin următoarele mecanisme:
- competiţia faţă de aceiaşi nutrienţi (interferenţă);
- competiţia pentru aceiaşi receptori de pe celulele gazdei (tropism);
- producţia de bacteriocine (colicine, piocine);
- producerea de acizi graşi volatili sau alţi metaboliţi;
- stimularea continuă a sistemului imun pentru a menţine un nivel scăzut (dar constant) al exprimării
moleculelor din clasa a II a de histocompatibilitate (DR) pe macrofage şi alte celule prezentatoare de
antigen;
- stimularea producerii unor factori imuni de protecţie încrucişată, ca de exemplu aşa-numiţii
anticorpi naturali.
Cu alte cuvinte, trebuie avute în vedere toate aceste aspecte atunci când se utilizează antibiotice cu
spectru larg, care vor scădea numărul microorganismelor la nivel intestinal şi vor permite multiplicarea
fungilor şi a microorganismelor rezistente la aceste antibiotice. Ca urmare, la oprirea terapiei pot apărea
fenomene de „rebound”, manifestate prin repopularea tractului digestiv în avantajul enterobacteriilor
faţă de germenii anaerobi.
100
La nivelul cavităţii bucale flora conţine diferiţi coci şi bacili Gram-pozitivi şi Gram-negativi, aerobi şi
anaerobi (de exemplu stafilococi, streptococi precum S. salivarius, S. sanguis, S. mutans, lactobacili,
spirochete, neisserii saprofite, sau anaerobiiVeillonella spp., Actinomyces spp., Fusobacterium spp.,
Bacteroides spp., Prevotella spp., Porphyromonas spp.), de origine aeriană sau alimentară. Există o
adevărată microbiologie orală, cu diferenţe în funcţie de localizare. Spre exemplu, pentru o celulă de la
nivelul dosului limbii există aproximativ 100-150 bacterii, într-un ml de salivă sunt circa 100.000.000
bacterii, iar la nivelul plăcii dentare, circa 100.000.000.000 bacterii (aproximativ 35 de specii bacteriene
diferite, cele dominante fiindStreptococcus sanguis şi Streptococcus mutans). Placa dentară, cariile şi
boala parodontală sunt cauzate de bacteriile ce constituie flora normală bucală.
e). La nivelul tractului respirator
Mucoasa nazală este întotdeauna bogat colonizată, fiind supusă unor numeroase contaminări prin
contacte şi traumatisme locale. În mod normal se pot găsi Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus
aureus (la aproximativ 20% din populaţie), streptococi, corynebacterii, pneumococi etc.
Flora de la nivelul faringelui se aseamănă în compoziţie cu flora cavităţii bucale. Astfel se pot găsi
streptococi, neisserii saprofite, bacili Gram-negativi- Lactobacillus spp, Bacteroides spp.
Tractul respirator inferior este steril, fapt datorat și clearance-ului mucociliar.
f). La nivelul tractului digestiv
La acest nivel există o diferenţă evidentă în funcţie de segmentele acestuia, exprimate mai ales prin
chimismul local. Luând ca exemplu colonul copilului mare şi al adultului, la acest nivel se găsesc o serie
de bacili Gram-negativi (enterobacterii), precum şi foarte numeroşi germeni anaerobi ( Bacteroides spp.,
enterococi) etc, în total existând aproximativ 10 11 bacterii la 1 g de materii fecale. Se va detalia mai jos
(8.2) despre compoziţia şi funcţiile florei normale digestive.
g). La nivel urogenital
Urina este în mod normal sterilă, iar în timpul micţiunii bacteriile de pe tractul urinar inferior sunt cel
mai frecvent îndepărtate. Totuşi, în uretra anterioară poate exista o floră care este cel mai frecvent
alcătuită din fungi, staflococi, corinebacterii şi enterobacterii.
Flora vaginală este dominată de lactobacili (flora Döderlein) asociaţi în proporţii diferite cu
mycoplasme nepatogene, stafilococi, streptococi, enterococi, clostridii, Candida spp., Bacteroides
spp. etc. Predominanţa lactobacililor menţine local un pH acid nefavorabil multiplicării altor germeni (în
special patogeni). Mucusul cervical are în plus o acţiune bactericidă prin lizozim. La femeile fără
activitate sexuală predomină lactobacilii, pe când la restul compoziţia florei este mixtă.
104
S-a descoperit faptul că Pseudomonas aeruginosa, ce aparţine florei normale la 3% din oameni,
deţine receptori pentru IFN-γ, mesager al sistemului imun, util în reglarea răspunsului imun, inclusiv în
cazul activării răspunsului imun anti-infecţios. Această citokină este „recunoscută” drept o structură
negativă şi, drept consecinţă, bacteria îşi activează genele de patogenitate. În aceste
condiţii, Pseudomonas aeruginosa reuşeşte să eludeze răspunsului imun, se multiplică, selectează factori
de rezistenţă la antibiotice, secretă toxine, sau poate penetra peretele intestinal ( P. aeruginosa a fost
izolată în sepsis, iar unica sursă posibilă era reprezentată de flora intestinală). În urma unor intervenţii
chirurgicale majore a fost raportată o frecvenţă crescută a sepsisului cu implicarea Pseudomonas
aeruginosa.
Ipoteza foarte interesantă şi relativ recentă, care decurge din diversele studii realizate de cercetători
din universităţile americane este că bacteriile nu „simt” nevoia şi nici nu „intenţionează” să descopere o
oportunitate de atac, dar, atunci când se simt ameninţate, dezvoltă un plan de reacţie.
8. 3. 1. 4. Bacteriile au „propriul sistem imunitar”
La întrebarea privind modul de răspuns al bacteriilor faţă de informaţia genetică externă sistemului
în care se dezvoltă în mod obişnuit, cercetătorii au lansat o serie de ipoteze. Se pare că bacteriile au
capacitatea de a recunoaşte ADN-ul străin. În materialul nuclear bacteriile deţin proteina H-NS care are
funcţia unui receptor pentru moleculele de adenină şi timină din structura ADN-ului existent în mediul
exterior. Această proteină previne activarea lui şi blochează exprimarea informaţiilor ce ar putea dăuna
bacteriei. Se pare că microorganismele pot folosi ADN din surse externe pentru a exprima caractere de
patogenitate. Cercetătorii sugerează un fapt foarte interesant: bacterii cunoscute în prezent drept
patogene, în trecut au fost nepatogene (Shigella spp., Vibrio cholerae, Yersinia pestis etc., ar fi devenit
patogeneprin cooptarea de ADN-ului din mediul extern).
Aceste studii oferă şi o nouă viziune asupra evoluţiei bacteriilor dar şi asupra utilizării capacităţii
unor bacterii (modificate genetic) de a produce proteine recombinate. La bacteriile lipsite de H-NS, care
nu inactivează structurile genetice umane, producţia de proteine este mai eficientă.
8. 3. 1. 5. Diferenţierea bacteriilor comensale de cele patogene
Mecanisme ale gazdei
Organismul gazdă deţine sistemul PRR (pattern recognition receptor), care include familia TLR (toll-
like receptors) de receptori extracelulari şi NOD/CARD (nucleotide binding oligomerization domain /
caspase recruitment domain isoforms), familie de receptori intracelulari. (Figura nr. 3)
Celule implicate în procesul de diferenţiere sunt:
- enterocitele de suprafaţă;
- celulele M din foliculii limfoizi şi
- celulele intestinale dendritice.
Enterocitele deţin receptori PRR, iar la contactul cu bacteriile patogene eliberează IgA, chemokine,
citokine şi peptide antibacteriene. Celulele M transportă antigenele luminale către celulele prezentatoare
de antigen (celule dendritice, macrofage etc.) care le prezintă în continuare limfocitelor T naive. Celulele
intestinale dendritice deţin receptori PRR. Ele îşi trimit dendritele către suprafaţă, recunosc antigenele, le
cooptează şi le transportă către ganglionul limfatic. Aici prezintă antigenele limfocitelor T naive. În
ganglion este declanşat răspunsul imun care poate fi efector, prin intermediul limfocitelor T helper (Th1,
Th2), sau reglator, prin limfocitele T cu rol în reglarea răspunsului imun.
105
La contactul dintre bacteria comensală şi receptori nu apare răspuns inflamator sau chiar poate să
apară un efect de protecţie, prin inhibiţia reacţiilor inflamatorii care ar putea fi declanşate de bacteriile
patogene.
Molecule precum TOLLIP (Toll interacting protein), SIGIRR (single Ig IL-1 R-related molecule) şi
NOD2 determină toleranţa faţă de flora normală gastro-intestinală, prin inhibarea TLR sau prin blocarea
cascadei inflamatorii. Limfocitele T reglatoare şi celulele intestinale dendritice deprimă la rândul lor
reacţia inflamatorie.
Mecanisme ale florei
Toleranţa faţă de flora normală nu este determinată doar de structurile gazdei. Bacteriile comensale
deţin mecanisme efectoare care le permit supravieţuirea în sistemul intestinal. Astfel, ele pot prezenta
pe suprafaţă molecule asemănătoare cu cele ale gazdei (ex. Bacteroides spp.) sau pot secreta molecule
care mediază eludarea mecanismelor de apărare ale gazdei. Recent s-a demonstrat că secreţia se
realizează prin sisteme de secreţie de tip III (injectarea unor molecule în celulele eucariote, prin
intermediul unui flagel) şi de tip IV (transportul ADN-ului sau a unor proteine în celulele eucariote,
asemănător mecanismului de conjugare), mecanisme până acum descrise doar la bacteriile patogene.
(Figura nr. 4)
Flora normală limitează semnalele inflamatorii declanşate de bacteriile patogene prin următorul
mecanism (Figura nr. 5):
- NF-kB (transcription factor nuclear factor) este un factor prin care bacteriile patogene transmit
semnale inflamatorii la nivelul celulelor epiteliale intestinale. Acest factor determină transcripţia genelor
p55-p65, cu producţia de chemokine şi citokine.
- flora microbiană intestinală activează PPAR (peroxisome proliferator-activated receptor) care
exportă p65 în citoplasma enterocitului. Astfel transcripţia este blocată, de asemenea şi cascada
inflamatorie.
Spre exemplu, flora intestinală normală scade răspunsul inflamator faţă de Salmonella typhimurium.
8. 3. 2. Flora microbiană normală inhibă dezvoltarea bacteriilor patogene prin „efectul
de barieră” sau fenomenul de competiţie
Într-un organism gazdă sănătos, flora normală realizează un „strat protector” de-a lungul sistemului
intestinal. Bacteriile comensale ocupă situsurile de ataşare ale mucoasei şi consumă factorii nutriţionali
produşi de enterocite. La rândul lor, celulele intestinale secretă produşi anti-bacterieni, chemokine,
citokine şi IgA. (Figura nr. 6)
În anumite condiţii, spre exemplu atunci când:
- există o cantitate mai mare de tulpini din specii bacteriene patogene;
- este urmat un tratament îndelungat cu antibiotice (mai ales dacă au spectru larg);
- există factori care deprimă mecanismele de apărare ale gazdei (ex. o stare de imunosupresie, o
modificare a tranzitului prin peristaltism scăzut etc.);
- se exercită acţiunea unor factori externi (ex. radiaţii, arsuri, substanţe chimice etc.) flora
microbiană este afectată, iar bacteriile patogene pot invada mucoasa intestinală.
8. 3. 3. Flora normală intestinală „determină” greutatea fiecărui individ
Într-un studiu realizat în anul 2006 pe şoareci „germ-free”, hrăniţi cu alimente bogate în
polizaharide, s-a observat că animalele colonizate doar cu Methanobrevibacter smithii şi cu Bacteroides
106
thetaiotaomicron au prezentat o depunere semnificativ mai mare de grăsime în comparaţie cu animalele
din alte grupuri de control. S-a demonstrat că:
- Bacteroides thetaiotaomicron intervine în dezvoltarea vascularizaţiei intestinale; induce formarea
reţelelor capilare şi stimulează absorbţia şi procesarea carbohidraţilor; în timp ce
- Methanobrevibacter smithii deţine funcţia unui reglator caloric în intestinul distal şi prin sinergie
cu B. thetaiotaomicronstimulează digestia zaharurilor şi creşte absorbţia caloriilor.
Mai recent, s-au descoperit numeroase mecanisme prin care flora microbiană normală intervine în
reglarea greutăţii corporale şi a depunerilor adipoase. (Figura nr. 7)
Primul dintre acestea ar fi influenţarea metabolizării nutrienţilor şi a reglării energetice. S-a
demonstrat faptul că bacteriile metabolizează polizaharide nondigerabile transformându-le în produşi
digerabili, astfel crescând extracţia energetică.
O altă ipoteză stabileşte o legătură între flora normală intestinală şi homeostazia metabolică. O dieta
bogată în lipide modulează populaţiile bacteriene dominante la nivel intestinal: cresc bacteriile Gram
negative şi scad bifidobacteriile, eubacteriile şi Bacteroides spp. Această
modificare determină creşterea nivelului plasmatic al lipopolizaharidelor (LPZ) care induce un răspuns
inflamator cronic de mică intensitate la nivelul ficatului, al ţesutului adipos şi al hipotalamusului. Apare o
creştere în greutate şi o acumulare excesivă a lipidelor la nivel hepatic. În timp, creşte riscul apariţiei
rezistenţei la insulină şi al dezvoltării diabetului zaharat de tip 2. (Figura nr. 8)
Un al treilea mecanism este acela prin care flora normală induce reglarea unor gene ale gazdei.
Acestea sunt implicate în modularea depozitelor şi a consumului energetic.
Aceste descoperiri ar putea să aibă o mare importanţă atât în tratamentul obezităţii cât şi în
tratamentul celor subnutriţi. Ar putea explica de ce oameni care consumă aceeaşi cantitate de hrană,
prezintă modalităţi diferite de depunere a grăsimilor.
Totuşi ar rămâne un semn de întrebare: diferenţele observate în flora normală a pacienţilor obezi
este cauza sau consecinţa obezităţii?
8. 3. 4. Fermentarea şi absorbţia polizaharidelor în colonul proximal
Corpul uman nu deţine enzimele necesare fermentării polizaharidelor. Flora normală îndeplineşte
această funcţie. Prin fermentare zaharolitică, bacteriile produc acizi graşi cu lanţ scurt de carbon şi gaz.
Microorganismele florei normale stimulează şi controlează dezvoltarea celulelor intestinale (epiteliale
şi ale ţesutului limfoid), prin furnizarea factorilor nutriţionali necesari. Bacteriile previn lezarea mucoasei,
aceasta constituind o posibilă funcţie anti-cancerigenă.
Acizii graşi cu lanţ scurt de carbon, produşi de floră, au ca efect scăderea pH-ului în lumenul
intestinal. Astfel este redus numărul bacteriilor patogene, deoarece acestea au o rezistenţă scăzută la pH
acid.
Prin fermentarea zaharolitică, flora are o importantă funcţie energetică, creşte reabsorbţia apei,
precum şi absorbţia unor nutrienţi (Ca, Mg, Fe).
8. 3. 5. Alte funcţii
8. 3. 5. 1. Fermentarea proteolitică în colonul distal - importanţa dietei reduse în
proteine
Prin fermentarea proteolitică flora normală intestinală produce o serie de toxine şi substanţe cu
posibil rol în carcinogeneză. Cantitatea acestor substanţe este în relaţie directă cu cantitatea de proteine
ingerate.
107
8. 3. 5. 2. Conversia acizilor biliari în cocarcinogeni
Bacterii precum Streptococcus faecalis, Veilonella spp. metabolizează prin deconjugare sau hidroliză
acizii biliari dezoxicolic şi litocolic, cu producţie de cocarcinogeni. Lactobacillus bifidus blochează acidul
colic intracelular şi astfel împiedică formarea de cocarcinogeni.
8. 3. 5. 2. Biosinteza vitaminei K
Flora normală produce 50% din necesarul zilnic de vitamină K. Bacteroides fragilis şi Escherichia
coli participă la sinteza vitaminei K2.
8. 3. 5. 3. Absorbţia vitaminei B12
A fost dovedit rolul florei intestinale normale în absorbţia de vitamină B12.
8. 3. 6. Flora microbiană normală - partenerul silenţios în manifestarea bolii
Boala inflamatorie intestinală (boala Crohn şi colita ulcerativă) reprezintă un exemplu care trebuie
luat în discuţie şi aflat în relaţie cu flora intestinală normală. (Figura nr. 9)
Boala inflamatorie intestinală include:
- boala Crohn, în care procesele inflamatorii apar în principal la nivel intestinal, dar şi la nivelul altor
organe. Cel mai frecvent sunt afectate segmentele terminale ale intestinului subţire; în cazul afectării
colonice pot apărea fistule şi abcese în regiunea anală.
- colita ulcerativă include răspunsul inflamator la nivelul mucoasei ce căptuşeşte interiorul rectului
(proctita) sau la nivelul întregului colon (colită ulcerativă).
În momentul actual, nu a fost stabilită cu exactitate cauza apariţiei acestei entităţi patologice.
Totuşi, s-a observat că există anumiţi factori declanşatori, prezenţi la persoanele afectate:
- o predispoziţie genetică;
- lipsa alăptării la sân în perioada de sugar şi nou-născut;
- „igiena excesivă”în copilărie, cu o insuficientă dezvoltare a răspunsului imun;
- excese în consumul de grăsimi animale şi carbohidraţi;
- tratament cu antibiotice utilizat frecvent.
Se pare că unul dintre elementele de luat în consideraţie ar fi pierderea toleranţei faţă de flora
normală intestinală, cu apariţia unui răspuns imun aberant, cu stări de hipersensibilitate şi reacţii
autoimune. Apare o permeabilitate intestinală crescută. Compoziţia florei normale este modificată (de
ex. specii din genul Clostridium apar în proporţie mai mare faţă de normal), dar nu s-a putut demonstra
dacă aceasta determină boala sau dacă este doar un efect al inflamaţiei intestinale.
Se pare că există şi o serie de alte boli în care este implicată flora normală, spre ex. neoplazii
(digestive sau în afara sistemului digestiv), infecţii produse în alte sisteme după modificarea habitatului
(ex. Escherichia coli în momentul în care ajunge la nivelul tractul urinar), obezitate, stări de
hipersensibilitate, autism, depresie etc.
8. 3. 7. Farmabioticele
Reprezintă orice formă de „exploatare farmaceutică” a florei normale (probiotice, prebiotice,
sinbiotice).
Probioticele sunt suplimente alimentare care conţin microorganisme vii (bacterii, fungi) cu efecte
benefice asupra corpului uman; bacteriile folosite sunt în general cele producătoare de acid lactic (scad
pH şi împiedică dezvoltarea bacteriilor patogene). (Figura nr. 7) Genurile utilizate
sunt Lactobacillus şi Bacteroides.
108
Prebioticele reprezintă ingrediente alimentare non-digerabile care afectează în mod pozitiv gazda,
stimulând în mod selectiv creşterea şi/sau activitatea unei sau a unui număr limitat de bacterii din colon;
majoritatea sunt carbohidraţi iar bacteriile stimulate sunt Bifidobacteria sau bacteriile producătoare de
acid lactic.
Sinbioticele sunt produse care conţin atât probiotice, cât şi prebiotice.
Există dovezi ce susţin rolul terapeutic al probioticelor în boala inflamatorie intestinală, infecţii,
cancer, artrită.
8. 4. Relaţii microorganism-gazdă
Cu o parte din microorganismele întâlnite organismul stabileşte relaţii de simbioză, convieţuirea fiind
folositoare pentru ambii parteneri (de exemplu sinteza de vitamine la care participă unii coliformi
intestinali).
Foarte multe din microorganismele care alcătuiesc microflora normală se află în relaţii de
comensualism cu organismul, germenii depinzând nutriţional de gazdă, căreia nu îi creează prejudicii.
Această convieţuire exprimă însă un echilibru instabil, care poate fi uşor tulburat. Diferiţi factori (ai
gazdei, din mediul extern sau biologici intrinseci ai germenilor) pot modifica aceste relaţii, astfel încât
unele microorganisme din flora normală pot manifesta aspecte patogene - este vorba de
microorganismele condiţionat patogene.
Relaţia de parazitism tipic apare însă doar atunci când microorganismele se dezvoltă în detrimentul
gazdei, cu manifestări clinice mai mult sau mai puţin evidente.
Astfel, în cazuri extreme unele bacterii sunt obligatoriu parazite, nu se pot dezvolta decât în
organismul gazdei (de exempluMycobacterium leprae, Treponema pallidum, Chlamydia
pneumoniae etc). Alte bacterii sunt facultativ parazite, putând trăi şi libere în natură, dar o dată
pătrunse în organism stabilesc cu acesta relaţii de parazitism (de exemplu Clostridium tetani, Clostridiile
gangrenei gazoase, Salmonella typhi etc).
8. 5. Povestire adevărată
Rolul şi importanţa florei microbiene normale a organismului, sunt mai mult decât bine stabilite.
Rolul infecţionistului este, ca pe durata tratamentelor cu antibiotice pentru diverse afecţiuni, să afecteze
cât mai puţin această floră. O primă idee este utilizarea de antibiotice cu spectru cât mai „ţintit” (îngust),
cu efect asupra patogenului respectiv. Pe de altă parte „piatra de încercare” a medicilor, credem, o
reprezintă evitarea tratamentelor antibiotice inutile. Câţi dintre medici nu recomandă scheme după
scheme de medicamente anti-stafilococice doar pentru că la exsudatul faringian se izolează un stafilococ,
fie el chiar şi „auriu”? Mai toţi. Încercăm „sterilizarea” de acel stafilococ, doar dacă pacientul urmează să
primească un transplant (ex. medular sau hepatic) sau dacă va primi un tratament intens
imunosupresor, altfel nici nu trebuie căutat! Iar pe de altă parte, rămâne o întrebare pe care o punem
tuturor generaţiilor de studenţi cu care lucrăm: în câte dintre cazurile de infecţii stafilococice întâlnite şi
raportate în foile de observaţie pe care le vor vedea este menţionat şi testul coagulazei? Însă, revenind
la subiectul acestui capitol, nu trebuie să uităm niciodată că utilizarea medicamentelor antibiotice şi
chimioterapice, în special a celor cu spectru larg, afectează uneori decisiv flora microbiană normală a
cărei utilitate este în momentul de faţă binecunoscută.
109
8. 6. Ştiaţi că ...
....Gregor Reid, director al Centrului Canadian petru Cercetarea şi Dezvoltarea Probioticelor a
afirmat: “Lactobacilul este doar o bacterie. Să spui că un produs conţine lactobacil este ca şi cum ai
spune că îl aduci pe George Cloney la o petrecere. Poate fi actorul sau poate fi doar un tip de 85 de ani
din Atlanta pe care întâmplător îl cheamă George Cloney. În cazul probioticelor există diferenţe
importante între tulpini”?
....atunci când doriţi să achizionaţi produse ce conţin probiotice ar trebui să le căutaţi pe acelea pe a
căror etichetă este specificată tulpina conţinută şi care oferă cititorilor acces liber la studiile ştiinţifice de
suport? O sursă bună pentru informarea asupra efectelor variatelor tulpini probiotice
este www.PubMed.gov.
....puteţi să vă faceţi singuri iaurt cu probiotice? Aveţi nevoie de 1l lapte steril-orice tip, chiar şi de
soia, un iaurt-sursa de probiotice şi de un recipient în care doriţi să faceţi iaurtul. Cuptorul se încalzeşte
timp de 15 minute la 180 grade, se lasă să se mai răceasca timp de 10 minute. Se aşează în cuptor
recipientul şi compoziţia pentru iaurt. Se închide uşa de la cuptor şi se lasă 12 ore, peste noapte. Dacă
dimineaţă observaţi că nu a ajuns la consistenţa dorită mai lăsaţi-l în cuptor timp de 12-24 ore.
9. Patogenitate şi Virulenţă
9. 1. Agenţii infecţioşi
Agenţii cauzali ai bolilor infecţioase (microorganismele condiţionat patogene, dar mai ales germenii
patogeni) sunt foarte numeroşi. Ei se pot împărţi în următoarele grupe mari:
- virusuri = agent patogen care se reproduce numai în interiorul celulelor vii şi care provoacă boli
infecţioase numite viroze;
- chlamydii = bacterii Gram-negative, strict parazite, imobile, care se multiplică în citoplasma
celulelor gazdă printr-un ciclu de dezvoltare caracteristic;
- mycoplasme = cele mai mici microorganisme care pot trăi liber în natură şi care se pot dezvolta pe
medii artificiale îmbogățite;
- rickettsii = microorganisme care au dimensiuni mai mici decât bacteriile; de regulă nu se pot
cultiva în afara celulelor vii;
- bacterii propriu-zise;
- fungi;
- protozoare = grup de organisme unicelulare, din grupul protistelor;
- metazoare.
110
În ultimii 25-30 de ani se discută din ce în ce mai mult despre rolul jucat de prioni, constituiţi dintr-
o particulă de natură proteică având caracter infecţios, lipsită de acid nucleic, cu potenţial patogen
destul de subtil exprimat. Prionii rezistă la acţiunea a numeroşi factori fizici şi chimici care inactivează
virusurile. Sunt capabili de a se reproduce. Afectează atât oamenii cât şi mamiferele. Sunt implicaţi
etiologic în maladii cu evoluţie lentă, precum encefalopatia spongiformă transmisibilă care include spre
exemplu boala Creutzfeldt-Jacob, insomnia fatală familială etc, afecţiuni în care sunt prezente leziuni
degenerative la nivelul SNC. Pornindu-se de la encefalopatia spongiformă bovină, începând cu anul 1996
au fost descrise afecţiuni umane, după consumul de carne de vită; maladia poartă numele de
„Creutzfeldt-Jacob noua variantă”. Principalele manifestări sunt reprezentate de: depresie, anxietate,
alterarea ritmului somn-veghe. La o treime din pacienți, manifestările oculare pot masca demența.
Deteriorarea mentală este rapid progresivă, de la descoperirea simptomelor până la deces trecând în
medie 7-9 luni. (1)
Microorganismul patogen este capabil să colonizeze diferite zone ale gazdei, producând un proces
infecţios în primul rând prin invazia şi penetrarea barierelor dermice şi ale mucoaselor, multiplicarea
ducând la distrucţia tisulară şi invadarea arborelui limfatic şi vascular (sepsis). Aceste aspecte sunt
influenţate în largă măsură de:
- factorii de patogenitate ai microorganismului;
- factorii de apărare ai gazdei.
9. 2. Patogenitate şi virulenţă.
Caracterele de patogenitate ale
bacteriilor
Patogenitatea reprezintă capacitatea unui germen de a declanşa în organismul gazdă fenomene
morbide, patogene, modificări locale, generale şi „ functio laesa”. Patogenitatea este un atribut de specie
şi este determinată genetic.
Virulenţa reprezintă gradul diferit de patogenitate exprimat în cadrul unei specii. Este un atribut al
tulpinii microbiene agresoare. Variabilitatea în exprimarea patogenităţii depinde de condiţiile în care
trăieşte microorganismul respectiv (de exemplu, o populaţie bacteriană care a pierdut virulenţa în
condiţii nefavorabile poate redeveni virulentă în anumite condiţii, aşa cum se întâmplă cu tulpina
vaccinală BCG la pacienţii cu infecţie HIV / SIDA). Virulenţa poate fi cuantificabilă de ex. prin numărul de
microorganisme necesare în condiţii standard pentru a omorî 50% dintr-un grup de animale (acest
număr este numit DL50, adică doza letală 50%).
Factorii care condiţionează patogenitatea şi virulenţa unei specii (tulpini) microbiene pot fi:
- multiplicarea şi invazivitatea manifestată de germenii patogeni;
- multiplicarea şi elaborarea de toxine de către germenii toxigeni (în general „exotoxine”).
9. 2. 1. Multiplicarea şi invazivitatea
Germenii patogeni se multiplică la poarta de intrare şi invadează organismul prin formarea de
abcese şi prin propagarea din aproape în aproape în „pată de ulei”, dar pot trece şi direct în circulaţia
111
generală. În acest caz produc infecţii la distanţă. Pentru a avea loc această succesiune a evenimentelor,
germenii trebuie să poată rezista reacţiilor de apărare nespecifică a gazdei (de exemplu fagocitozei) şi să
poată adera de celulele mucoaselor (prin adezine) sau de anexele dermului. Există o aderenţă
nespecifică, de fapt un proces chimic şi fizic, reversibil, cu implicarea atracţiei hidrofobe, electrostatice
dar şi a mişcării browniene şi a existenţei biofilmului de polimeri. Aderenţa specifică poate fi la rândul
său reversibilă dar, dacă implică suficient de mulţi factori (structurali, diferite forţe de legătură), poate
deveni ireversibilă.
Biofilmul include populaţii bacteriene aparţinând uneia sau mai multor specii, înconjurate de polimeri
extracelulari (EPS -extracellular polymeric substances). Microorganismele aderă între ele, dar şi la
suprafeţe, formându-se o structură asemănătoare unui sistem circulator ce permite accesul nutrienţilor şi
eliminarea substanţelor reziduale, precum şi comunicarea interbacteriană. Dezvoltarea biofilmului
cuprinde 5 etape (Figura nr. 1):
· ataşarea reversibilă,
· ataşarea ireversibilă,
· maturarea 1,
· maturarea 2 şi
· dispersia.
Industrial, biofilmele sunt responsabile de ancrasarea rezervoarelor de stocare şi de înfundarea
conductelor de apă. Din punct de vedere medical, se pot observa în cazul endocarditei (pe valve), otitei
medii, plăcii dentare şi pot reprezenta o problemă pentru pacienţii cu fibroză chistică. Biofilmele se
dezvoltă şi pe implanturi sintetice cum ar fi: catetere intravasculare, valve, pacemakere, instrumente
ortopedice, lentile de contact etc.
O caracteristică foarte importantă a biofilmelor este reprezentată de rezistenţa crescută la
antibiotice, de până la 500 de ori mai mare. Responsabile de aceasta sunt atât EPS, care acţionează ca o
barieră sau care pot chiar inactiva antibioticele, cât şi faptul că în cadrul biofilmului bacteriile cresc mult
mai greu, astfel încât o activitate metabolică scăzută va conduce la o asimilarea mai lentă a
antibioticelor.
Dintre bacteriile implicate în producerea de biofilme amintim: Staphylococcus aureus, Pseudomonas
aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, streptococi α şi β hemolitici etc. (2)
Poate fi luat în discuţie şi „tropismul”, care poate fi specific pentru anumite structuri ale gazdei [ex.
tulpinile de E. coliuropatogene aderă cu ajutorul unei adezine papG (pyelonephritis-associated
pili), numai la anumiţi receptori situaţi la suprafaţa celulelor epiteliale renale] sau ar putea fi specific de
specie (de ex. streptococul piogen din grupul A, meningococul sau gonococul infectează numai gazda
umană).
9. 2. 1. 1. Factori somatici care permit multiplicarea şi invazivitatea germenilor
- pilii comuni (fimbriile), cu rol în aderare. Bacteriile pot produce unul sau mai multe tipuri de pili,
astfel că cele care produc pili specifici, vor fi asociate cu capacitatea de a infecta un anumit tip de ţesut.
De exemplu, E. coli uropatogenă prezintă pili de tip P sau Pap, având tropism pentru tractul urinar. (3)
- lectinele (proteine care au tropism pentru carbohidraţi);
- liganzii (molecule care realizează legături specifice cu anumite molecule complementare de la
nivelul substratului);
- glicocalixul (componentă structurală externă a polizaharidului de la suprafaţa celulei bacteriene);
112
- „noroiul” (un mediu vâscos peribacterian, constând dintr-o subclasă de substanţe polimerice
extracelulare ce conţin în general polizaharide şi mediază ataşarea nespecifică a bacteriilor într-un strat
vâscos);
- capsula (are proprietăţi antifagocitare şi uneori este implicată în aderare, spre ex. în
cazul Streptococcus mutans, cu efecte cario-genetice);
- adezinele (de fapt, toţi factorii enumeraţi mai sus pot fi definiţi drept „adezine”);
- substanţe componente ale peretelui bacterian
- proteina M a streptococului beta-hemolitic de grup A (Figura nr. 2); Proteina M este un dimer
ancorat în membrana citoplasmatică, ce va proemina la suprafaţa peretelui bacterian, măsurând de la
acest nivel 50-60 nm. Aceasta are rolul de a împiedica fagocitoza sau opsonizarea de către PMN, în lipsa
anticorpilor specifici; anticorpii se vor lega la capătul variabil N-terminal al dimerilor.
- antigenul Vi de suprafaţă al unor bacili Gram-negativi (de exemplu, Salmonella typhi etc).
Antigenul Vi este un polizaharid capsular ce are capacitatea de a împiedica acţiunea anticorpilor, are
proprietăţi antifagocitare şi creşte rezistenţa la peroxid. Serotipurile care prezintă acest antigen sunt:
Typhi, Paratyphi C şi Dublin. Unele tulpini de Citrobacter freundii produc un compus asociat bacteriei
identic cu Vi al primelor două serotipuri, fiind sursa ideală de antigen Vi, necesar preparării antiserului.
- polizaharidul A al S. aureus (un acid teichoic);
- antigenul O al bacteriilor Gram-negative (Figura nr. 3); Antigenul O face parte din
lipopolizaharid/lipooligozaharid (LPZ/LOZ), structură ce are rolul de a proteja bacteria de enzime ce au
capacitatea de a degrada peptidoglicanul (de exemplu, lizozimul) şi oferă rezistenţă împotriva sărurilor
biliare, complementului (diminuând activitatea MAC – membrane attack complex) şi fagocitozei; prezintă
şi activitate mitogenă, stimulând diferenţierea policlonală şi multiplicarea limfocitelor B, determinând
astfel secreţia de imunoglobuline, precum IgM şi IgG. LPZ cuprinde 3 regiuni: lipidul A (regiunea I), o
porţiune centrala rugoasă polizaharidică (regiunea II) şi polizaharidul O / antigenul O (regiunea III).
- antigenele de tip K (cu structură polizaharidică sau polipeptidică - pentru Bacillus anthracis) etc.
În ceea ce priveşte procesul aderenţei, se cunoaşte faptul că orice obiect aflat în imersie atrage
particulele suspendate, inclusiv microorganismele, la suprafaţa lui. Teoria coloidală DLVO (după numele
autorilor) menţionează că la nivelul suprafeţei de imersie există 2 poziţii de stabilitate termodinamică,
prin intervenţia gravitaţiei, chemotaxiei, forţelor de tip van der Waals, forţelor electrostatice şi tensiunii
superficiale (Schema nr. 1).
Contrabalansarea forţelor de atracţie şi repulsie conduce la împingerea dezordonată a particulelor
spre un „minim secundar”, poziţie ce se situează la suprafaţa de imersie. Acest „minim secundar”
corespunde fenomenului de adsorbţie sau reţinere (docking), proces reversibil.
Ulterior sunt implicate şi alte forţe de legătură (covalente, de hidrogen, ionice, hidrofobe) care vor
duce la atingerea „minimumului primar”, când particulele devin legate ireversibil de substrat. Aderenţa
se produce atunci când particulele părăsesc „minimumul secundar” şi intră în „minimumul primar”.
Pentru unele bacterii (ex. V. cholerae, unele tulpini de E. coli, B. pertussis, Helicobacter pylori) ataşarea
este destinaţia finală, în timp ce pentru altele (ex. Salmonella, Shigella, Yersinia) reprezintă doar o
etapă, urmând penetrarea tisulară şi / sau diseminarea în organism.
9. 2. 1. 2. Factori solubili care permit multiplicarea şi invazivitatea germenilor (agresine) (Tabelul
nr. 1)
113
- coagulaza liberă şi/sau legată a S. aureus care transformă fibrinogenul în fibrină şi pe de o parte
poate „masca” bacteria înconjurată de structuri asemănătoare cu ale gazdei, pe de altă parte poate
preveni fagocitarea sau chiar împiedica ajungerea antibioticelor şi chimioterapicelor la sediul infecţiei;
- leucocidina secretată după ce stafilococul a fost fagocitat şi care transformă leucocitul în piocit (se
inseră în membrana leucocitului şi produce pori sau degradează enzimatic fosfolipidele de la nivelul
membranei);
- producerea unor substanţe care cresc concentraţia intracelulară de AMPc până la concentraţii ce
inhibă fuzionarea fagozom-lizozom (de exemplu la Mycobacterium tuberculosis);
- producerea de catalază (de exemplu: Staphylococcus aureus, Mycobacterium fortuitum) , glutation
peroxidază, superoxid dismutază, citocrom oxidază ( Vibrio spp., Pseudomonas aeruginosa, Neisseria
spp.) care inhibă sau inactivează radicalii activi de oxigen;
- producerea unor factori care conferă rezistenţă la enzimele lizozomale, după fuzionarea fagozom-
lizozom (Salmonella enteritidis, Mycobacterium leprae etc);
- producerea de enzime litice:
1. colagenaza (este produsă de Clostridium histolyticum şi Clostridium perfringens şi distruge
colagenul prezent în muşchi facilitând răspândirea procesului infecțios), hialuronidaza (scindează acidul
hialuronic, o componentă a ţesutului conjunctiv), fibrinolizina (determină liza cheagului prin convertirea
plasminogenului în plasmină) etc (streptococ, stafilococ, unele clostridii);
2. lecitinaza (distruge lecitina din structura membranei celulare, de exemplu Clostridium perfringens,
Bacillus anthracis);
3. fosfolipaza (toxina a) (realizează hidroliza fosfolipidelor din membrana celulară, prin îndepărtarea
capetelor polare, de exemplu Clostridium perfringens);
4. neuraminidaze (degradează acidul sialic, de exemplu V. cholerae, Shigella dysenteriae);
5. proteaze, nucleaze ( DN-aze, RN-aze – cu activitate endo- şi exonucleazică asupra ADN şi ARN,
generând 3’-nucleotide), carbohidraze, lipaze etc;
6. hemolizine sunt enzime ce lizează hematiile din mediile de cultură cu sânge (streptococ,
stafilococ, unele clostridii) etc.
- producerea unor substanţe care inhibă sau modifică răspunsul imun
1. IgA proteaza (clivează IgA în regiunea balama, de exemplu gonococ, meningococ, H. influenzae);
2. proteina A stafilococică (inhibă opsonizarea);
3. endotoxina care creşte sinteza de IL-1, IL-6, IL-8, TNF-α etc;
4. inducerea apariţiei unor reacţii autoimune;
5. producerea superantigenelor (de exemplu S. aureus prin producerea toxinei implicată în
sindromul de şoc toxic, TSST-1), molecule care pot activa independent celulele T4 (sunt printre cei mai
puternici mitogeni ai limfocitelor T); stimularea datorată lor poate determina atât anergie, cât şi
hiperactivarea sistemului imun. (Figura nr. 4) Rezultă o secreţie în exces de IL-2 care interferă cu sinteza
altor citokine (TNF-α, IL-1, IL-8 etc). Alte exemple de superantigene ar fi: toxina pirogenică
streptococică (produsă de tulpinile lizogenizate), enterotoxinele stafilococice ( S. aureus), subtanţe cu
efecte asemănătoare hormonilor (ex. toxina stabilă termic produsă de E. coli enterotoxigen) etc.
Fiecare din substanţele de mai sus are un rol bine definit în evoluţia reacţiei inflamatorii locale.
114
9. 2. 2. Multiplicare şi toxinogeneză
Germenii se multiplică la poarta de intrare şi elaborează exotoxine care produc alterări celulare şi
distrucţii tisulare la distanţă, prin inhibarea metabolismului celulei eucariote şi prin „functio laesa”
(„toxikon” era otrava în care erau înmuiate săgeţile luptătorilor greci). Din punct de vedere didactic
trebuie menţionate următoarele noţiuni:
9. 2. 2. 1. Exotoxinele
Exotoxinele sunt elaborate în general de microbi Gram-pozitivi lizogenizaţi (de exemplu bacilul
difteric, streptococul beta hemolitic de grup A, Clostridium botulinum) sau codificat plasmidic
(Clostridium tetani, Bacillus anthracis), dar şi de bacili Gram-negativi, prin mecanism cromozomial ( V.
cholerae, Bordetella pertussis, Shigella shiga, Pseudomonas aeruginosa ) sau sub control plasmidic (unele
tulpini de E. coli). (Tabelul nr. 2)
Au structură proteică, fiind formate dintr-un domeniu B (bind) obligatoriu, necesar legării de
receptorii celulei gazdă şi internalizării ulterioare a porţiuni enzimatice A (active). Exotoxina nu îşi
exercită efectele toxice decât după ce porţiunea A este eliberată din structura iniţială. Sunt secretate în
timpul vieţii germenilor. Sunt difuzibile la distanţă. Toxicitatea lor este foarte mare, doza letală fiind de
circa 0,1 µg/kg corp (până la 1 ng/kg corp în cazul toxinei botulinice).
Au afinitate diferită în funcţie de specia care le-a elaborat (de exemplu pentru miocard, SNC, rinichi
în cazul bacilului difteric). Manifestările clinice apar după o perioadă de latenţă (când toxina este deja
fixată pe celulele ţintă).
Multe din bolile produse pot fi considerate toxiinfecţii şi reprezintă urgenţe medicale, toxina putând
fi neutralizată numai dacă este liberă în circulaţie.
Au putere antigenică mare, faţă de ele apărând anticorpi antitoxină.
Un alt exemplu important privind exotoxinele se referă la Tcd A şi Tcd B, produse de Clostridium
difficile și care acţionează asupra celulelor intestinului gros, fiind responsabile de o boală diareică uşoară,
până la colită fulminantă. Ele produc la acest nivel leziuni microscopice, dar şi leziuni mari,
asemănătoare unor plăgi; endoscopic, se vor identifica noduli.
Prin degradarea proteinelor Rho, Rac şi Cdc 42, responsabile de reglarea proceselor structurale
dependente de polimerizarea actinei, se poate observa la microscopul electronic alterarea
microfilamentelor de actină, rezultând marginalizarea nucleului, schimbări în morfologia citoscheletului,
dar şi alte modificări (alterarea suprafeţei celulare şi rearanjarea microvililor). (Figura nr. 5)
Astfel, modificările produse de toxinele Tcd A şi Tcd B sunt: inflamaţia, creşterea permeabilităţii
ţesutului epitelial intestinal, stimularea producerii de chemokine şi citokine, acumularea de neutrofile,
producerea intermediarilor reactivi ai oxigenului, activarea mastocitelor, producerea substanţei P,
distrugerea directă a mucoasei intestinale, ruperea joncţiunilor strânse ( Zonula occludens), degradarea
actinei F. Substanţa P este responsabilă de: activarea neuronilor din submucoasă, eliberarea TNF-α,
activarea macrofagelor din lamina propria; este implicată în diareea inflamatorie.
9. 2. 2. 2. Antitoxinele
Având structură proteică, exotoxinele sunt imunogene şi determină apariţia de anticorpi specifici
(antitoxine) care pot neutraliza in vitro sau in vivo activitatea toxică prin cuplare specifică cu toxina.
(Tabelul nr. 3) Se pot obţine astfel seruri imune utile în seroterapia specifică. De regulă aceste seruri
115
sunt preparate pe cal şi sunt utile în neutralizarea exotoxinelor (ex. în tratamentul difteriei, tetanosului,
botulismului).
Administrarea antitoxinelor trebuie făcută cu precauţie datorită faptului că anticorpii preparaţi pe cal
reprezintă în acelaşi timp şi antigene pentru gazda umană, dar în acelaşi timp cât mai curând posibil.
Tratamentul acestor entităţi clinice este complex şi nu reprezintă subiectul acestui manual.
Administrarea antitoxinelor trebuie făcută după o testare a unei eventuale hipersensibilităţi şi în cazul că
aceasta există se recurge la desensibilizare şi abia ulterior la seroterapie (administrarea de antitoxină). O
alternativă ar fi administrarea de imunoglobuline umane specifice, dacă acestea sunt disponibile.
9. 2. 2. 3. Anatoxinele
Exotoxinele pot fi detoxifiate într-un anumit interval de timp sub acţiunea conjugată a temperaturii
şi formolului. Prin acest procedeu îşi pierd puterea toxică, dar îşi menţin puterea imunogenă şi devin
anatoxine. Anatoxinele se utilizează în profilaxia bolilor produse de germenii respectivi (în cadrul
vaccinurilor DTP, DT, dT, ATPA, ADPA etc), precum şi pentru hiperimunizarea animalelor în scopul
obţinerii de seruri antitoxice (antidifteric, antitetanic, antibotulinic etc).
9. 2. 2. 4. Endotoxinele
Endotoxinele au fost evidenţiate la germenii Gram-negativi, la nivelul membranei externe. Sunt
elaborate de aceştia şi apoi incluse în peretele bacterian, eliberându-se în urma distrugerii germenilor.
Au structură lipopolizaharidică (LPZ sau LOZ), în constituţia lor intrând acizi graşi, un lipid A şi lanţuri de
polizaharide. (Figura nr. 6)
Au efecte toxice la nivelul celulelor majorităţii mamiferelor; aceste efecte sunt similare indiferent de
specia bacteriană care le eliberează. Toxicitatea lor este ceva mai redusă (în comparaţie cu exotoxinele),
dar pot acţiona la mai multe nivele inducând apariţia febrei, leucopeniei, hiperpermeabilităţii vasculare,
hipotensiunii arteriale până la colaps, sindromului de coagulare intravasculară diseminată etc. Sunt
implicate între altele în apariţia şocului endotoxic (se eliberează o cantitate de endotoxină proporţională
cu numărul germenilor distruşi). Studiile arată că mortalitatea în şocul endotoxic este în relaţie destul de
directă cu cantitatea de endotoxină / ml, fiind de circa 80% la cazurile la care se identifică 100 unităţi
endotoxină / ml de plasmă.
Aşa cum am menţionat în capitolul privind structura bacteriană, componenta toxică este
reprezentată de lipidul A; totuşi, şi polizaharidul O (structură antigenică) contribuie la patogenitate – s-a
dovedit că bacteriile de la care s-a extras polizaharidul O sunt mai uşor distruse prin mecanisme care
implică sistemul complement. LPZ aflat în circulaţie se cuplează cu proteine plasmatice ( LPS-binding
plasma proteins) şi apoi este recunoscut prin intermediul receptorilor CD14 de către monocite şi
macrofage. Se activează răspunsul inflamator, coagularea intravasculară, apariţia de hemoragii şi în final
poate rezulta şocul. Sunt implicate mai multe citokine, de ex. IL-1, IL-6, IL-8 şi TNF-α care la rândul lor
stimulează „cutia Pandorei” şi respectiv producţia de leucotriene şi prostaglandine (cu efect de creştere a
fenomenelor inflamaţiei). Sunt activate atât sistemele de coagulare cât şi sistemul complement iar
cascadele de reacţii care apar sunt rareori reversibile în urma tratamentului.
Puterea antigenică şi imunogenă este mai redusă faţă de exotoxine. LPZ în calitate de mitogen
stimulează o activare policlonală a LB, cu secreţia de IgG şi IgM.
În afara LPZ sau LOZ, mai sunt şi alte endotoxine, prezente la bacteriile Gram-pozitive:
- delta endotoxina prezentă la Bacillus thuringiensis, toxină care nu afectează omul, deoarece acesta
nu prezintă enzime şi receptori care să o proceseze;
116
- Listeria monocytogenes produce o substanţă “endotoxin-like” etc.
9. 4. Povestiri adevărate
9. 4. 1. LPZ și CID
Coagulare intravasculară diseminată în cadrul unei enterocolite ulceronecrotice la un prematur cu
nutriţie parenterală totală (Punct de plecare: LPZ-ul germenilor Gram-negativi)
În primăvara anului 2007, într-o maternitate din Bucureşti s-a născut pe cale naturală un prematur
cu vârsta de gestaţie de 30 săptămâni şi greutate de 1.600 g, cu scorul Apgar 7 (la 5 minute de la
naştere). Mama copilului a prezentat în cursul sarcinii infecţii urinare recidivante cu Escherichia coli. Cu
circa 12-14 ore înainte de naştere a avut loc ruperea prematură a membranelor (travaliul cu membrane
rupte peste 12 ore implică riscul producerii de infecţii).
Prematurul a prezentat de la naştere o detresă respiratorie, pentru care a necesitat ventilaţie cu
presiune pozitivă continuă şi nutriţie parenterală totală (având, în plus, intoleranţă digestivă). Nutriţia
parenterală continuă a presupus cateterizarea venoasă centrală a copilului. Întrucât această cateterizare,
asociată cu ventilaţia asistată cresc riscul infecţios al nou-născutului, s-a instituit antibioterapia empirică
de protecţie cu ampicilină şi gentamicină.
Evoluţia copilului a fost iniţial favorabilă timp de o săptămână, pentru ca ulterior acesta să dezvolte
o patologie digestivă manifestată prin abdomen meteorizat (mărit de volum), vărsături bilioase şi scaune
sanguinolente, asociate cu febră (39°C).
S-a pus diagnosticul clinic şi radiologic de enterocolită ulceronecrotică (necroză intestinală de
etiologie incertă) şi sepsis neonatal.
119
Testele de laborator efectuate (procalcitonină, proteina C reactivă) au fost intens pozitive. Culturile
din aspiratul gastric şi materii fecale au evidenţiat prezenţa E. coli. Hemocultura a fost negativă, ceea ce
nu este surprinzător în contextul în care nou-născutul a primit tratament cu antibiotice anterior recoltării
probelor.
Pe parcursul următoarelor zile, copilul a dezvoltat simptome clinice şi paraclinice de CID (coagulare
intravasculară diseminată): sângerări la locurile de injectare, hemoragie pulmonară, trombocitopenie,
timp parţial de tromboplastină şi timp de protrombină crescute, hipofibrinogenemie, prezenţa în cantitate
mare a produşilor de degradare ai fibrinei). S-a instituit terapia de urgenţă cu imipenem şi gentamicină
(la care E. coli se dovedise a fi sensibil), cu plasmă proaspăt congelată şi cu concentrat trombocitar.
Starea copilului nu s-a ameliorat sub tratament, hemoragia pulmonară agravându-se. S-a efectuat, ca
ultimă alternativă, o transfuzie de sânge izogrup şi s-a recurs la ventilaţie asistată în sistem IPPV –
Intermittent Positive Pressure Ventilation. Evoluţia copilului a fost în continuare nefavorabilă, hemoragia
pulmonară continuând să se agraveze şi ducând în final la stop cardiorespirator ireversibil la manevrele
de resuscitare.
Nou-născutul a decedat după 10 zile din cauza sindromului de CID.
Discuţii
Sursa infecţiei cu E. coli nu a putut fi precizată cu certitudine (medicii au suspicionat, totuşi, ca
sursă cea mai probabilă, lichidul amniotic infectat al mamei).
Detresa respiratorie, ventilaţia asistată şi cateterizarea venoasă centrală au constituit factori de risc
major în producerea enterocolitei ulceronecrotice. Necroza ţesutului intestinal a favorizat diseminarea pe
cale sanguină a E. coli existent la acel nivel. Astfel, s-a instalat sepsisul neonatal, care s-a complicat
ulterior cu CID.
Complexitatea cazului, prin multitudinea complicaţiilor apărute, a fost un factor de gravitate care a
condus în final la decesul copilului.
9. 4. 2. Infecțiile cu Staphylococcus aureus comunitar meticilino-rezistent la pacienții
transplantați renal
Tânăr de 32 ani, afro-american, cu hipertensiune și diabet zaharat tip 1, transplantat renal în urmă
cu 28 luni se internează pentru febră, durere în flancul stâng, și o scădere în greutate de peste 10 kg în
ultima lună. De aproximativ 6 luni pacientul acuză dureri intermitente în flancul stâng. În ultimul an,
pacientul a avut multiple episoade de furunculoză și celulită fesieră. Culturile efectuate evidențiază un
Stafilococ auriu meticilino-rezistent, cu următoarele rezultate la antibigramă: rezistent la oxacilină,
eritromicină, dar sensibil la vancomicină, biseptol, tetraciclină, rifampicină, linezolid. Leziunile au fost
incizate și drenate, iar apoi a primit tratament cu cefalexin, augmentin, biseptol și a efectuat
decolonizarea nazală cu mupirocin. (4)
În cursul anamnezei, pacientul relatează raporturi sexuale cu persoane de același sex și i se
efectuează serologia HIV, rezultatul fiind negativ. Cura posttransplant a fost efectuată fără complicații cu
tacrolimus, micofenolat mofetil și prednison.
La examenul obiectiv: temperatura 36,9˚C, puls 74/min, TA 100/68 mmHg, frecvența respiratorie
19/min.
Analizele de laborator evidențiază o leucocitoză (20.200 cel/mm3) cu neutrofilie, VSH de 107 mm/h,
Proteina C reactivă 21,5 mg/dl, creatinina 1,8 mg/dl.
120
Examenul CT abdomino-pelvin evidențiază un abces la nivelul iliopsoasului de 6,6 pe 8,5 cm, iar pe
IRM-ul de coloană lombară se observă osteomielită la nivelul corpului vertebral L5 și a procesului stâng
transvers.
Abcesul a fost drenat, iar în culturi a crescut Staphylococcus aureus meticilino-rezistent. Culturile în
anaerobioză au fost negative. Hemoculturile nu s-au pozitivat.
A efectuat 6 săptămani tratament parenteral cu vancomicină, urmată 2 săptămâni de tratament cu
linezolid per os datorită dorinței pacientului de a merge la muncă. A primit apoi Biseptol încă 8
săptămâni.
După terminarea tratamentului VSH-ul a scăzut la 14 mm/h, cu o Proteină C Reactivă 0,7 mg/dl. La
6 luni nu s-au înregistrat recăderi.
În afară de identificare bacteriei și antibiogramă s-a efectuat și latex aglutinare pentru evidențierea
PB2 (protein binding 2). Cu ajutorul tehnicii PCR a fost detectată fracțiunea genică responsabilă de
sinteza leucocidinei Panton-Valentine. (5)
Discuţii: Infecțiile reprezintă complicațiile cele mai frecvente la pacienții transplantați. Infecțiile cu
Stafilococ auriu meticilino-rezistent sunt predominant infecții intraspitalicești și au devenit o problemă de
sănătate publică. (6)
Un alt factor de risc important pentru infecția cu Stafilococ este și diabetul zaharat.
Leucocidina Panton–Valentine este un factor solubil, care permit multiplicarea şi invazivitatea
stafilococului. Determină liza polimorfonuclearelor și monocitelor. Este considerată un factor de virulență,
care determină creșterea severității bolii atât în afecțiunile cutanate, cât și în osteomielită sau pneumonii
necrotizante.
9. 5. Evaluarea cunoștințelor
1. Prionii sunt constituiţi din:
A. ADN-înveliş proteic
B. ARN-înveliş proteic
C. o particulă proteică
D. miez glucidic + înveliş proteic
2. Lactoferina are capacitatea de legare a:
A. fierului
B. zincului
C. cuprului
D. magneziului
3. Biofilmul:
A. reprezintă o populaţie bacteriană aparținând unei specii
B. cuprinde bacterii ce aderă doar între ele
C. se poate dezvolta pe un cord transplantat
D. cuprinde bacterii sensibile la penicilină
E. cuprinde bacterii și polimeri extracelulari
121
4. Sunt factori solubili care permit multiplicarea şi invazivitatea germenilor:
A. coagulaza, glicocalixul, capsula
B. superoxid dismutaza, proteina M, antigenul Vi
C. leucocidina, catalaza, hemolizine
D. antigenul K, pilii, capsula
5. Una dintre următoarele reprezintă o substanţă ce modifică răspunsul imun:
A. neuramidaza
B. Ig A proteaza
C. pilii
D. “noroiul”
Noţiuni de imunologie
Imunologia este o ştiinţă care a apărut relativ recent, iniţial ca un domeniu al Microbiologiei, studiind
mecanismele de apărare a organismelor (uman şi animal) faţă de agresiunea din cursul procesului
infecţios.
În Imperiul Roman „immunitas” însemna scutirea de anumite obligaţii.
În primul secol după Iisus Christos, descriind rezistenţa la veninul unor şerpi veninoşi, Lucanus a
considerat că „immunitas” înseamnă „scutit de a te îmbolnăvi”.
Observaţiile medicului englez Edward Jenner privind faptul că o parte dintre persoanele care
mulgeau vacile nu s-au îmbolnăvit în cursul epidemiei de variolă, dar şi faptul că pustulele care apăreau
pe ugerul vacilor, ca şi pe tegumentul mâinii persoanelor care mulgeau se asemănau, au dus la
concluzia că între aceste fenomene există o legătură. În 1796, Jenner a realizat una dintre primele
experienţe pe om (a inoculat secreţie din pustulele de la vaci la un copil; ulterior a inoculat secreţie de la
pacienţi cu variolă, iar copilul se pare că nu s-a îmbolnăvit de variolă). Cu toate acestea, reacţiile în
„mass-media” vremii nu au întârziat să apară. (Figura nr. 1) –vacile din poza de la RM
Imunologia a fost fundamentată de studiile realizate de către marii cercetători Pasteur şi
Metchnikoff. Louis Pasteur a „vaccinat” găini împotriva holerei aviare, a „vaccinat” oi împotriva antraxului
şi a reuşit prevenirea infecţiei cu virusul rabic. Pasteur a decis să denumească procedeul de inoculare cu
germeni atenuaţi, urmat de protecţia faţă de boală, vaccinare(probabil pentru că Jenner a obţinut
primele sale rezultate recoltând şi inoculând produsul obţinut de la vaci). Ilia Metchinikoff a descoperit
fagocitoza. Emil von Behring şi S. Kitasato au studiat fenomenul prin care se obţin antitoxinele şi ulterior
au realizat experimentele care au stat la baza seroterapiei. Despre hipersensibilitate a început să se
discute în 1902, iar termenul de histocompatibilitate este cunoscut din 1946. Aceste studii şi multe
altele, care ar merita dedicarea unui volum întreg, mult amplificate în deceniile care au urmat sunt mai
departe „în continuă mişcare”, cu numeroase descoperiri chiar şi în prezent.
Relaţia între organismul gazdă şi sistemul imun (organe, celule, anticorpi, citokine etc) ar putea fi
asemănată cu relaţia stabilită între o ţară şi armata ţării respective, cu sisteme de control, sisteme de
comandă, reacţii „la nevoie” (uneori în „regim de urgenţă”) în care există implicare importantă şi din
partea altor sisteme (nervos, endocrin). Mai mult decât în exemplul privind situaţia la nivelul unei ţări,
122
„soldaţii” din sistemul imun (de ex. LT citotoxice, celulele NK) pot avea atât o activitate efectoare cât şi
de control şi retro-control (îşi „depăşesc” limitele de „simpli soldaţi”).
S-ar putea ridica o întrebare şi anume: de ce avem nevoie de un sistem imunitar?
Să nu uităm faptul că în fiecare zi organismul nostru se întâlneşte cu nenumărabile microorganisme:
bacterii, virusuri, paraziţi etc. Unele microorganisme nu ne afectează în nici un mod, altele au efecte
benefice faţă de organismul nostru, în timp ce o mare parte dintre microorganisme pot duce la apariţia
unor îmbolnăviri. În acest context, sistemul imun „a fost nevoit” să găsească modalităţi prin care să
„lupte” împotriva microorganismelor patogene şi condiţionat patogene.
Mai mult decât atât, chiar şi substanţe străine (non-self) neinfecţioase dar şi structuri proprii
modificate pot duce la un răspuns imun. S-a demonstrat şi faptul că mecanisme care în mod normal
protejează organismul de eventualele infecţii pot fi implicate în determinarea unor leziuni tisulare sau de
organ.
Având în vedere toate aceste aspecte (dorim să subliniem faptul că realitatea este cu mult mai
complexă), o definiţie a imunităţii ar putea fi următoarea: imunitatea reprezintă o reacţie faţă de
orice structură non-self (fie microorganism sau o substanţă străină de tipul unei macromolecule
proteice, glicoproteice etc) sau faţă de o celulă sau structură proprie care a suferit modificări.
Informaţiile privind sistemul imun sunt prezentate în cadrul mai multor catedre şi discipline. Având
drept ţintă o cât mai bună înţelegere a capitolelor pe care ne-am gândit să le introducem în „Manualul
de Microbiologie” dorim să facem o scurtă „trecere în revistă” a organelor, celulelor, moleculelor şi
mecanismelor implicate în imunitate.
Menţionăm faptul că nu veţi găsi aici toate definiţiile şi explicaţiile; pentru aceasta cititorul va trebui
să parcurgă fiecare capitol în parte. Etapele pe care le descriem au doar scop didactic; în realitate
fenomenele se petrec simultan şi sunt mult mai complexe decât pot fi explicate într-un „simplu manual”
sau chiar şi decât ar putea fi acestea explicate de oamenii de stiinţă, în acest moment. Ceea ce noi
cunoaştem este, de fapt, „o picătură într-un ocean”.
Astfel, ne propunem să luăm ca exemplu un microorganism oarecare - un antigen. în cazul în care
acesta reuşeşte să depăşească barierele naturale ale organismului (piele, mucoase etc) şi să pătrundă în
”gazdă”, următoarea linie de apărare este reprezentată de imunitatea înnăscută.
Fagocitele reprezentate spre exemplu de macrofage şi granulocite recunosc microbii de orice fel
(recunoaşterea nu este specifică) şi încep procesul de fagocitoză. Apare şi răspunsul inflamator.
Ulterior intră în acţiune imunitatea adaptativă care se manifestă cu ajutorul limfocitelor. Aceasta din
urmă este specifică deoarece dezvoltă în timp (cateva zile) celule şi molecule specifice pentru a „lupta”
strict împotriva acestui antigen.
O altă deosebire majoră între cele două tipuri de imunitate este reprezentată de capacitatea
limfocitelor de a se transforma în limfocite cu memorie după întâlnirea cu un anumit antigen. Astfel, spre
deosebire de macrofage şi granulocite, la o a doua întâlnire cu acelaşi antigen, limfocitele îl vor
recunoaşte iar procesul de apărare se va declanşa mult mai rapid.
Explicând puţin mai în în profunzime (menţionăm că explicaţii mai detaliate vor fi furnizate în
capitolul 11 şi în alte capitole care urmează) avem în vedere faptul că antigenul pătruns în organism este
captat de către celulele prezentatoare de antigen (APC) (macrofage, celule dendritice, limfocite B etc).
Antigenul nu poate fi recunoscut ca atare de către sistemul imun deoarece doar o anumită parte a
lui numită epitopprezintă proprietatea de imunogenicitate la valoare maximă şi poate declanşa un
123
răspuns imun. Antigenul este endocitat de către APC, prelucrat în lizozomi iar epitopii rezultaţi vor fi
prezentaţi limfocitelor în complex cu moleculele sistemului major de histocompatibilitate (MHC). MHC
include molecule prezente pe celulele organismului uman (vezi capitolul 12). Limfocitele vor declanşa un
răspuns imun.
Există două tipuri principale de limfocite şi anume limfocitele T şi limfocitele B, după cum există
două tipuri de răspuns imun, umoral şi celular. Limfocitele T secretă citokine care pot activa oricare din
cele două tipuri de răspuns imun iar limfocitele B (după proliferare şi blastizare) secretă imunoglobuline
(anticorpi) implicate în răspunsul imun umoral.
Antigenele pot fi clasificate în mai multe grupe: exogene/endogene, timodependente/
timoindependente etc.
Răspunsul imun umoral este declanşat de antigene exogene timodependente şi independente
prezentate pe MHC II, iar răspunsul imun celular este declanşat de antigene endogene timodependente
prezentate pe MHC I.
În cazul în care ne întrebăm: cine produce aceste celule şi unde se desfăşoară răspunsul imun? O
parte a explicaţiei ar include existenţa organor limfoide primare precum măduva osoasă hematogenă
(sediul producerii limfocitelor T şi B şi maturării limfocitelor B) şi timusul (sediul maturării limfocitelor T)
şi organe limfoide secundare precum pulpa albă a splinei unde se desfăşoară răspunsul imun umoral şi
este iniţiat cel celular care se desfăşoară apoi la locul infecţiei şi ganglionii limfatici (vezi şi capitolul 10).
Sistemul imun se poate confrunta cu o mare problemă, şi anume, aceea de a menţine balanţa între
un răspuns imun eficace şi limitarea apariţiei de leziuni tisulare (în cadrul unui RI exagerat). Când
această balanţă „se rupe” apar bolile autoimune şi stările de hipersensibilitate.
Povestire adevărată: Povestea vaccinului
Edward Jenner s-a născut pe data de 17 mai 1749 în Berkeley, Gloucestershire. Înca de mic el a fost
interesat de ştiinţe şi natură. Pe atunci circula zvonul cum că lăptăresele sunt protejate de variolă, zvon
pe care l-a auzit şi el.
La 21 ani a plecat în Londra şi a devenit studentul lui John Hunter, cel mai renumit chirurg din
Anglia şi un respectat şi cunoscut biolog şi anatomist. Între cei doi s-a închegat o prietenie adevărată.
Jenner a studiat geologia şi a făcut mai multe experimente cu sânge uman. A câştigat experienţă în
biologie şi bineînţeles, în chirurgie.
De-a lungul anilor, Jenner a tot auzit zvonul că lăptăresele erau protejate de variola. Punând
lucrurile în balanţă, Jenner a concluzionat că forma de ”variolă” făcută de vaci ar putea avea o oarecare
legătură cu un posibil mecanism de protecţie. În mai 1796 a găsit o tânără lăptăreasă, Sarah Nelms,
care avea leziuni nou apărute datorită ”variolei vacilor” pe mâini şi braţe. Pe data de 14 mai 1796 a
inoculat material din leziunile ei la băiatul unui servitor în vârstă de 8 ani, James Phipps. Ulterior, băiatul
a prezentat febră şi discomfort în zona axilară. La 9 zile a prezentat simptomele unei răceli şi şi-a pierdut
apetitul dar ziua următoare era iar bine. În iulie 1796 Jenner l-a inoculat iar pe băiat, de data aceasta cu
material dintr-o leziune nou apărută de variolă umană. Baiatul nu a dezvoltat boala aşa că Jenner a
concluzionat că acesta era protejat complet.
În 1797, Jenner a trimis un scurt comunicat spre Societatea Regală descriind experimentul şi
observaţiile sale. Totuşi, lucrarea a fost respinsă. În 1798, după ce a mai experimentat pe câţiva
oameni, Jenner a publicat o mică carte numită “O incursiune în cauzele şi efectele vaccinului antivariolic,
124
o boală descoperită în unele din ţările vestice ale Angliei, mai ales înGloucestershire şi cunoscută sub
numele de variola vacilor”.
Cuvântul latin pentru vacă este “vacca” iar pentru variola vacilor este “vaccinia”. Jenner a decis să
denumească această nouă procedură vaccinare. În 1798 publicaţia avea trei părţi. În prima parte Jenner
prezintă viziunea sa legată de variola vacilor ca o boală a cailor transmisă la vaci. Teoria a fost infirmată
în timpul vieţii lui Jenner. Apoi a prezentat ipoteza că infecţia cu variola vacilor protejează de infecţia cu
variolă umană. În cea de-a doua parte sunt continuate observaţiile critice relevante pentru testarea
ipotezei sale. A treia parte a fost o discuţie lungă, în parte polemică, legată de descoperirile şi
problemele variate legate de variolă. Reacţiile la această publicaţie au fost din cele mai diverse.
Jenner a plecat la Londra în căutare de voluntari pentru vaccinare. După trei luni nu găsise nici
măcar unul singur. El a pornit un studiu la nivel naţional în căutarea persoanelor care prezintă rezistenţă
la variolă în rândul celor care făcuseră variola vacii. Rezultatul acestui studiu i-a confirmat teoria. În
ciuda erorilor şi controverselor nenumărate folosirea vaccinării s-a răspândit rapid în întreaga Anglie şi
până în 1800 a atins majoritatea ţărilor Europene (Jenner a vaccinat în 1801 populaţia din Cluj şi Târgu
Mureş, apoi această procedură s-a extins în întreaga ţară în următorii 31 de ani (1).
Deşi a fost apreciat la nivel mondial şi i s-au acordat multe onoruri, Jenner nu a avut intenţia să se
îmbogăţească. În 1802, Parlamentul Britanic i-a oferit suma de £10,000 pentru descoperirea sa, iar cinci
ani ulterior i-a oferit înca £20,000. Pe de alta parte, el a fost şi subiectul ridiculei şi atacurilor, nu doar al
onorurilor. În ciuda acestor lucruri el şi-a continuat activităţile în slujba vaccinării.
Lucrarea lui Jenner reprezintă prima încercare ştiinţifică de control a bolilor infecţioase prin folosirea
deliberată a vaccinării. Totuşi, nu el este cel care a descoperit vaccinarea, dar a fost primul care a oferit
un status ştiinţific acestei proceduri. Benjamin Jesty este cel care a vaccinat primul împotriva variolei.
La sfârşitul secolului XIX s-a descoperit că vaccinarea nu conferă imunitate pentru toată viaţa şi de
aceea este nevoie de revaccinare. Mortalitatea datorată variolei era în scădere, dar epidemiile arătau că
boala încă nu era ţinută sub control. În 1950 s-au implemantat mai multe măsuri de control şi variola a
fost eradicată în mai multe zone ale Europei şi America de Nord. Procesul de eradicare la nivel mondial
al variolei a fost discutat atunci când Adunarea Mondială a Sănătăţii a primit un raport, în 1958, legat de
consecinţele catastrofale ale variolei în 63 de ţări. În 1967 s-a început o campanie globală condusă de
Organizaţia Mondială a Sănătăţii care a dus la eradicarea variolei în 1977. În data de 8 mai 1980
Adunarea Mondială a Sănătăţii a anunţat că lumea nu mai are variolă şi a recomandat ca toate ţările să
înceteze vaccinarea. (2)
Nu am dorit să povestim totul legat de vaccinare în cadrul acestui capitol, ci doar să vă introducem
puţin în povestea acestei tehnici pentru a arăta evoluţia lucrurilor şi efectul benefic pe care l-a avut
această descoperire în întreaga lume. Aşa cum se ştie, vaccinarea rămâne momentan singura metoda cu
cel mai bun raport cost-eficienţă. Pe această cale dorim să sensibilizăm studenţii la medicină şi cititorii
acestei cărţi în ceea ce priveşte vaccinarea şi să infirmăm teoriile greşite care au circulat și continuă să
circule în ultimul timp.
126
tetanie neonatală (datorată absenţei paratiroidelor) şi malformaţii congenitale diverse (arc aortic dublu,
tetralogie Fallot, micrognatism, atrezie de esofag etc).
Timusul este un organ situat în mediastinul anterior şi superior, retrosternal, format din doi lobi uniţi
printr-un istm median. Fiecare lob este format din lobuli compartimentaţi de septuri derivate din capsula
organului. Lobulul timic este alcătuit din 2 zone: corticală (la exterior) şi medulară (la interior). Iniţial se
dezvoltă zona corticală.
Greutatea sa variază cu vârsta (este bine dezvoltat la făt, greutatea creşte până la pubertate -
dezvoltarea maximă se realizează la vârsta de 10-12 ani, apoi suferă o involuţie lentă, fără să dispară
total).
În zona corticală, trama de-a lungul căreia se plasează protimocitele (sosite în timus de la MOH)
cuprinde celule epiteliale, celule dendritice intratimice şi macrofage. Limfocitele mici, denumite şi
timocite corticale, sunt numeroase, grupate în grămezi, în jurul celulelor epiteliale. Ele se divid activ, dar
nu se structurează în noduli limfatici.
În zona medulară, celulele epiteliale sunt izolate sau grupate formând corpusculii lui Hassal
(formaţiuni de celule epiteliale care degenerează, fiind mereu înlocuite cu alte celule similare),
caracteristici timusului. Se consideră că au rol fagocitar. Cresc atât numeric cât şi ca dimensiuni, probabil
datorită contactului cu microorganismele din flora normală, dar şi contaminării cu alte microorganisme.
Medulara mai conţine şi celule dendritice, macrofage şi timocite. Timocitele medulare sunt mult mai
dispersate decât cele din zona corticală. La acest nivel are loc selecţia negativă a timocitelor.
Timusul are capacitatea de a elimina prin selecţie pozitivă celulele care, odată eliberate în
circulaţie, nu ar fi putut produce efectul scontat, deoarece nu ar fi recunoscut structurile non-self şi
prin selecţie negativă celulele care ar fi dat reacţii autoimune.
Populaţia limfocitară aflată în proces de multiplicare în timus, este foarte sensibilă la acţiunea
corticosteroizilor, 95% din limfocite fiind distruse. Restul de 5% din limfocitele cortico-rezistente sunt
cele care, la finalul maturaţiei, trec în circulaţie. Se pare că iniţial are loc distrugerea a 80% dintre
limfocite, 20% ajung la nivel medular şi dintre acestea supravieţuiesc cele 1-5% limfocite cortico-
rezistente. Timocitele ajunse în zona medulară sunt mai rezistente la acţiunea cortizolului decât cele din
zona corticală. (Figura nr. 1)
Rolul timusului se manifestă local şi la distanţă:
· rolul local, constă în transformarea limfocitelor nediferenţiate în limfocite T mature, cu
achiziţia de receptori pentru antigene (TCR). Procesul de multiplicare şi diferenţiere are loc, în principal,
în regiunea corticală. Celulele achiziţionează progresiv markeri ai limfocitului T adult: molecule CD2,
CD3, CD4, CD8 şi TCR. Urmează o dublă selecţie, pozitivă şi negativă. Înselecţia pozitivă, timocitele
care recunosc antigenele străine fixate pe moleculele MHC pot prolifera (timocitele CD4+ recunosc
moleculele MHC clasa II, timocitele CD8+ recunosc moleculele MHC clasa I), în timp ce acele limfocite
care nu şi-au dezvoltat receptori pentru antigene sunt distruse. În selecţia negativă, timocitele care
recunosc structurile self sunt distruse, eliminându-se astfel timocitele puternic autoreactive, care ar
conduce la apariţia unor fenomene autoimune imediat după naştere. În timus are loc multiplicarea,
diferenţierea şi selecţia limfocitelor T. Tot la nivel timic are loc producerea celulelor de control, cu rol
în prevenirea bolilor autoimune (experienţele realizate prin înlocuirea limfocitelor proprii cu limfocite de
la persoane sănătoase a dus, pentru un timp, la dispariţia semnelor de boală, dovedind astfel existenţa
acestor celule timice). (Figura nr. 2)
127
· rolul la distanţă se realizează prin factorii timici peptidici umorali (timostimulina,
timopoietinele, timozinele, factorul umoral timic etc). Aceşti factori au funcţii diverse, unii dintre ei
influenţând diferenţierea limfocitelor T în ariile timodependente din organele limfoide periferice.
Acţionează atât la nivelul timusului cât şi la distanţă. Câteva informaţii despre factorii timici:
Timozina are efecte asupra limfocitelor T, stimulându-le activitatea citotoxică şi crescând sinteza de
IL-6. In vivo, stimulează LH şi GnRH, iar in vitro Prolactina şi GH.
Timostimulina necesită Zn pentru a acţiona. Are efect asupra dezvoltării protimocitelor în MOH.
Factorul umoral timic induce producerea de IL-2 (are potenţial antiviral).
Timopoietina intervine în procesul de diferenţiere a limfocitelor T.
10. 2. 2. Măduva osoasă hematogenă la mamifere
La mamifere, se menţine divizarea funcţională în limfocite T şi B, dar nu există bursa lui Fabritzius.
Transformarea celulei stem în limfocit B matur are loc în măduva osoasă hematogenă (bone marrow,
LB). La copii, rolul de organ limfoid primar este asigurat atât de măduva din oasele late cât şi din oasele
lungi; ulterior, măduva de la nivelul oaselor lungi este înlocuită cu ţesut adipos, care mai târziu se
fibrozează, iar măduva activă rămâne la nivelul oaselor late (stern, coxal, coaste, vertebre). Cazurile cu
deficit imunitar selectiv pentru limfocite B (ex. maladia Bruton), confirmă existenţa unei autonomii a
acestei populaţii. Transplantul de măduvă osoasă hematogenărestaurează imunitatea umorală, ducând
la dispariţia perturbărilor.
Dintre funcţiile măduvei osoase hematogenă în imunitate amintim:
1. menţinerea unui procent de celule stem cu diferenţiere spre linia limfocitară şi primele stadii ale
seriei T şi B;
2. maturarea şi diferenţierea completă a limfocitelor B în celule B mature, apte să colonizeze
organele limfoide secundare.
La nivelul măduvei există mai multe tipuri de celule: celule „cap de serie” şi celule tinere care derivă
din acestea, celule din seria granulocitară, celule din seria megakariocitară, celule din seria eritrocitară,
celule din seria monocito-macrofagică, celulele din seria limfoidă (dar nu există LT, ci doar protimocite,
limfocite T nediferenţiate).
128
se transformă în foliculi secundari, cu un centru germinativ clar, înconjurat de o zonă mai întunecată.
În jurul foliculului există o zonă marginală puţin vizibilă, constituită din limfocite B cu memorie. Foliculul
secundar persistă câteva săptămâni după care redevine folicul primar.
Organele limfoide secundare cuprind următoarele grupe:
10. 3. 1. Ganglionii limfatici
Ganglionii limfatici (nodulii limfatici) reprezintă structuri imune, organizate, situate la „intersecţiile”
traseelor limfatice. Au următoarele roluri:
· colectează structurile antigenice care traversează teritoriul vaselor limfatice aferente (libere
sau captate de macrofage şi/sau de celulele dendritice);
· induc un răspuns imun faţă de antigenele de tip celular, în regiunea paracorticală (dând
naştere la limfocite T specifice) sau faţă de antigene de tip umoral, în foliculii limfatici cu limfocite B
active, maturate în măduva osoasă hematogenăşi
· stochează informaţiile imune datorită limfocitelor cu memorie dar au rol şi în diseminarea
răspunsului imun prin circulaţia limfocitelor pe calea traseelor limfatice eferente, către torentul circulator
şi ulterior spre alte teritorii ganglionare, splenice, digestive sau respiratorii.
În secţiune anatomo-patologică transversală remarcăm la exterior o zonă corticală (cuprinde în
special limfocite B, „instruite” la nivel medular, aglomerate sub formă de noduli limfatici. În mijlocul
nodulilor se află centrii germinativi. Foliculii cresc mult în dimensiuni după infecţie, iar ganglionii limfatici
devin palpabili şi dureroşi.
Sub zona corticală se află zona paracorticală (cuprinde în special limfocite T). În mijloc se
află zona medulară, în care se găsesc atât limfocite B cât şi limfocite T. În ganglionii limfatici se mai
găsesc macrofage, celule dendritice etc. (Figura nr. 2)
10. 3. 2. Splina
Splina este cel mai mare organ limfoid secundar, având însă şi alte funcţii:
· joacă rolul unui „filtru” care în mod nespecific îndepărtează/elimină complexele antigen-
anticorp circulante, diferite microorganisme, eritrocite parazitate (ex. cu Plasmodium spp., Babesia
microti);
· are o eficienţă remarcabilă în îndepărtarea/eliminarea microorganismelor slab opsonizate
precum şi celor capsulate (ex. Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Neisseria
meningitidis, Capnocytophaga spp.);
· eliminarea hematiilor degradate, îmbătrânite;
· reglarea volumului sângelui etc.
Pe secţiune, splina are o culoare roşie, cu formaţiuni albe diseminate, numite corpusculii Malpighi
(foliculi splenici).
Splina este compusă din două tipuri de ţesuturi: pulpa roşie implicată în distrugerea hematiilor şi
pulpa albă, corespunzătoare ţesutului limfoid. Aceasta din urmă este organizată sub forma unor grupări
de limfocite T dispuse în imediata vecinătate a arteriolelor (manşoane de limfocite T - teaca limfatică
periarterială), iar spre periferia acestora se găsesc cordoane de limfocite B (zona marginală). Se
consideră că zona bogată în limfocite T este zona timo-dependentă, în timp ce zona cu limfocite B
este zona medulo-dependentă.
Vascularizaţia splinei are o serie de particularităţi. Artera splenică intră prin hilul splenic iar
ramificaţiile sale, arterele trabeculare, urmează cloazoanele conjunctive. Din aceste artere se nasc
129
ramificaţii, arterele centrale înconjurate de manşoane de limfocite T, vase care asigură irigaţia foliculilor
limfatici şi artere penicilate care intră direct în contact cu sinusurile venoase ale pulpei roşii. Din arteriole
se nasc capilarele, apoi venulele postcapilare situate în zona sinusului marginal. (Figura nr. 3)
la nivelul zonei marginale are loc captarea antigenelor de către celulele reticulare. După 24 de ore,
antigenul se regăseşte la nivelul centrului germinativ al foliculului sau în zona timo-dependentă.
La periferia foliculilor splenici se găsesc plasmocite. La acest nivel are loc sinteză de anticorpi (în
special după stimuli antigenici „solubili”, veniţi pe calea torentului circulator). După sinteză, moleculele
de anticorpi sunt antrenate sanguin şi pot ajunge în tot organismul. Splina reprezintă un organ în care
are loc sinteza anticorpilor de tip IgM şi diferenţierea spre LB cu memorie în cadrul RI primar.
Splina are şi rol în sinteza unei enzime care desprinde tuftsina (tetrapeptid rezultat din clivarea
enzimatică a porţiunii Fc din molecula de IgG) de pe molecula de IgG (tuftsina la rândul ei are rol în
creşterea funcţiei fagocitare a PMN şi în chemotactism).
Hipofuncţia splenică şi în special splenectomia favorizează apariţia unor infecţii grave, inclusiv
sepsis, cu microorganisme capsulate şi microorganisme care parazitează eritrocitele. Este necesară
aplicarea unei strategii de prevenire a infecţiilor, incluzând vaccinarea şi uneori profilaxia cu antibiotice şi
chimioterapice.
10. 3. 3. Sistemul limfoid asociat mucoaselor (MALT - mucous associated lymphoid tissue)
Căile respiratorii, tractul digestiv şi cel uro-genital sunt înconjurate pe toată lungimea lor de ţesut
limfoid difuz (sau nodular), bogat în limfocite B şi plasmocite care secretă sIgA. Datorită particularităţilor
funcţionale, MALT se subdivide în:
· Sistemul imunitar nazo-faringian (NALT - nasopharynx associated lymphoid tissue) reprezentat
de inelul lui Waldeyer cu diferitele amigdale (palatine, faringiană, linguale) şi structuri adenoide.
Amigdalele sunt constituite din foliculi limfoizi agregaţi şi ţesut limfoid difuz în strânsă asociere cu
epiteliul faringian. Amigdalele sunt lipsite de vase limfatice, la fel ca şi splina. Amigdalele au un rol
protector important în regiunea esofagiană, faringiană şi a arborelui traheobronşic, constituind un prim
obstacol împotriva infecţiilor. Cu toate că după amigdalectomie nu rezultă infecţii severe, decizia privind
această operaţie trebuie luată numai după o analiză critică, punând în balanţă atât beneficiile cât şi
posibilele urmări negative. Structurile adenoide se inflamează frecvent în timpul copilăriei (după diferitele
şi frecventele infecţii respiratorii) şi deseori, crescând în dimensiuni, trebuie extirpate;
· Sistemul imunitar asociat tubului digestiv (GALT - gut associated lymphoid tissue) cuprinde
plăcile Peyer şi formaţiunile limfoide ale apendicelui (secretă IgA), limfocitele intra-epiteliale şi limfocitele
sub-epiteliale. Plăcile Peyer reprezintă aglomerări de celule limfoide (la nivelul jejunului, duodenului şi
ileonului). După infecţii bacteriene se măresc şi se pot uni în adevărate „cordoane” limfoide. Nu au vase
limfatice proprii;
· Sistemul imunitar asociat arborelui bronşic (BALT - bronchus associated lymphoid tissue);
· Sistemul imunitar asociat căilor uro-genitale, prezent în special la nivelul vaginului;
· Sistemul imunitar asociat glandelor mamare (mammary associated lymphoid tissue ).
Laptele matern conţine IgA secretorie (sIgA) cu rol protector pentru noul născut faţă de infecţiile
digestive. IgA nu poate trece prin bariera hemato-placentară, dar sIgA poate fi primit în timpul alăptării,
asigurând protecţia nou-născutului şi sugarului faţă de o serie de patogeni, în primele luni de viaţă.
În organele limfoide secundare, distribuţia limfocitelor şi a celorlalte celule imune este controlată de
citokine şi chemokine. Membrii familiei TNF (tumour necrosis factors) (citokine implicate în reacţii
130
inflamatorii) au un rol deosebit de important în dezvoltarea normală a organelor limfoide. Celulele imune
au receptori pentru aceşti mediatori, acest lucru fiind demonstrat pe cobai la care s-au distrus o serie de
receptori pentru a se pune în evidenţă care este rolul lor.
Molecula MIP-3β face parte din categoria chemokinelor pentru care limfocitele T prezintă receptori.
Datorită acestei substanţe, limfocitele T se localizează cu stricteţe în zonele timodependente. Receptorul
pentru MIP-3β se numeşte CCR7, iar la cobaii la care receptorii CCR7 au fost distruşi s-a observat
absenţa marcată a zonelor timodependente şi un răspuns imun primar extrem de slab. Celulele
dendritice interdigitate produc chemokina MIP-3β şi pentru că sunt prezente în zonele timodependente,
atrag acolo limfocite T mature. Receptorul CCR7 este prezent în proporţie mică şi la nivelul limfocitelor
B, lucru care explică migrarea acestora prin zonele timodependente către foliculii limfatici.
131
10. 5. Verificaţi-vă cunoştinţele
La întrebările următoare, alegeţi un singur răspuns corect.
1. Care este diferenţa dintre organele limfoide primare şi cele secundare?
1. localizarea lor: cele primare au localizare viscerală, cele secundare se localizează în
mucoase;
2. în organele limfoide primare nu apare răspunsul imun faţă de un antigen, pe când în cele
secundare da;
3. nu există diferenţe între cele două tipuri de organe;
4. organele limfoide secundare sunt sediul formării şi diferenţierii limfocitelor, iar organele
limfoide primare sunt destinaţiile la care ajung limfocitele mature.
2. Care este organul care pe lângă funcţia limfoidă, are şi funcţie hematoformatoare în ansamblu?
1. splina;
2. ganglionul limfatic;
3. timusul;
4. măduva osoasă hematogenă.
3. Ce este fenomenul de selecţie a limfocitelor?
1. un mecanism prin care se generează un răspuns imun împotriva unei substanţe non-self;
2. un proces generalizat ce are loc în toate organele limfoide, având ca rezultat limfocite B şi
T mature;
3. un fenomen prin care sunt alese limfocitele T cele mai potrivite să intre în circulaţia
sanguină (5% din limfocitele T totale);
4. totalitatea reacţiilor prin care trece un limfocit B pentru a deveni plasmocit (celulă
secretoare de anticorpi).
4. Care dintre aceste roluri i se atribuie splinei?
1. rol în distrugerea hematiilor îmbătrânite;
2. rol hematoformator, fiind un organ limfoid primar;
3. rol în apărarea mucoaselor, aparţinând MALT;
4. rol în selecţia şi maturarea limfocitelor T.
5. Care este afirmaţia adevărată?
1. un folicul secundar prezintă, din punct de vedere histologic, o zonă periferică şi un centru
germinativ;
2. plăcile Peyer sunt agregate de foliculi limfatici prezente în timus;
3. ganglionii limfatici sunt relee pe calea circulaţiei sanguine;
4. în măduva osoasă hematogenă se maturează atât limfocitele T, cât şi limfocitele B.
132
11. Celulele imunităţii
11. 1. Celula „stem”
Celula multipotentă, primordială, „suşă”, „stem”, „matcă”, se formează la circa 3 săptămâni de la
nidaţia zigotului, iniţial la nivelul peretelui sacului vitelin, ulterior în ţesutul hematopoietic din ficatul
embrionului. După naştere, celula „stem” ar mai putea fi pusă în evidenţă în măduva oaselor late şi
lungi (la copii) şi în măduva oaselor late (la adulţi); un număr foarte mic de celule „stem” mai pot fi
identificate în circulaţie.
Primul derivat al celulei „stem” este hemocitoblastul ( hematopoietic progenitor), care seamănă
foarte mult cu celula „stem” dar deţine probabil un „semnal de orientare” către măduva roşie
hematogenă sau către timus. Există și un alt derivat, limfoblastul ( lymphoid progenitor).
Celula „stem” se află la originea tuturor liniilor hematopoietice. În funcţie de gradul de potenţialitate
există celule „stem” totipotente (CFU-LM), pluripotente, multipotente (CFU-M, GEMM), bipotente,
unipotente (CFU-Eo, CFU-Baso, CFU-Mega). Prezintă capacitate de autoîntreţinere („self-renewal”) şi
generează descendenţi în lipsa stimulilor antigenici. Răspunde la diferite mecanisme de control
complexe. Din punct de vedere morfologic se aseamănă foarte mult cu limfocitul imunocompetent. Este
foarte uşor de distrus de către radiaţii dar nu şi de către chimioterapice.
Descoperirea metodelor de izolare şi cultivare a celulelor stem (1998) a creat o nouă speranţă:
tratamentul cu celule stem ar putea ajuta la vindecarea unor boli grave (considerate astăzi ca fiind
incurabile). Celulele stem fiind progenitori nediferenţiaţi se pot divide şi dezvolta într-o multitudine de
alte tipuri de celule, putând duce la formare de ţesuturi şi organe. Cercetătorii estimează că aceste
celule ar putea fi folosite, în viitor, pentru repararea diferitelor structuri distruse sau în suferinţă, dar
chiar şi pentru „sinteza” de organe. Totuşi, sunt încă destul de multe probleme tehnice care trebuie
surmontate. (Figura nr.1 – Evoluţia celulei „stem”)
133
Plachetele sanguine intervin în lupta anti-parazitară iar globulele roşii participă la eliminarea
complexelor imune.
Celule pot reacţiona în mod nespecific, indiferent de natura agentului agresor (ex. granulocitele
PMN, eozinofilele, bazofilele, mastocitele, monocitele, macrofagele, celulele dendritice etc) sau pot
participa la o reacţie specifică, condiţionată de structura moleculelor antigenice, prin intermediul
receptorilor (ex. limfocitele).
Termenul generic de limfocite, include o multitudine de celule distincte, imposibil de diferenţiat
morfologic (în microscopia obişnuită sau chiar şi în microscopia electronică).
Pe baza caracterelor morfologice, este totuşi posibilă identificarea a două tipuri de limfocite:
- limfocitele mici (small lymphocytes), cele mai numeroase (circa 85% din numărul total al
limfocitelor); aici se încadrează majoritatea limfocitelor T, limfocitelor B, celulelor dendritice şi rarelor
celule stem hematopoietice aflate în circulaţie.
- limfocitele mari cu granulaţii (large granular lymphocytes), reprezentând circa 5-15% din
totalul limfocitelor. Dintre acestea amintim celulele NK (ucigaşe în mod natural / „natural killer”) şi
limfocitele T citotoxice.
Aspectul morfologic nu ne permite să apreciem care este starea de activare celulară. Dacă folosim
culturi celulare, în prezenţa unor agenţi mitogeni nespecifici [ex. fitohemaglutinină, concavalină A,
lipopolizaharide, lectine cum ar fi PWM (pokeweed mitogen) etc] sau a unor antigene specifice,
limfocitele T sau B aflate anterior „în repaus” cresc în dimensiuni, prezintă modificări la nivelul nucleului
(cromatină fină, citoplasmă mai abundentă şi mai albastră pe frotiu), fiind denumiteimunoblaste.
134
Limfocitele care sunt stimulate doar de primul semnal devin neresponsive la alte semnale antigenice
și nici nu se activează pentru a reacționa față de primul semnal antigenic.
Etapele activării limfocitelor:
· sinteza de citokine dar și de receptori pentru acestea de către limfocitele naive dar mature
· proliferarea limfocitară (expansiunea clonală) - în unele infecții numărul LT poate crește de
50.000 ori, iar al LB de 5.000 ori
· transformarea limfocitelor naive în limfocite efectoare cu rol în eliminarea antigenului
· diferențierea limfocitelor efectoare în limfocite cu memorie.
Așadar, avem de-a face cu trei tipuri de limfocite:
· naive – mature dar care nu au avut contact cu antigenul; acestea urmează să fie distruse în
cazul în care într-o perioadă de 1-3 luni nu au contact antigenic
· efectoare
· cu memorie - care vor reacționa mai rapid la a doua stimulare cu același antigen.
136
· LTc CD8+ pot liza oricare dintre celulele organismului care exprimă molecule HLA I (HLA
- human leukocyte antigen system)
· LTc CD4+ îşi limitează funcţia la celulele care exprimă molecule HLA II.
Au mai multe roluri, de ex. realizează „supravegherea imunologică” prevenind multiplicarea anarhică
a celulelor. Dacă de ex. apar antigene tumorale, LTc au capacitatea de a le recunoaşte, de a se
multiplica/activa şi de a le distruge. În această „supraveghere”, LTc sunt ajutate de celulele NK.
Distrugerea antigenelor este indusă prin două mecanisme:
· inducerea apoptozei prin intermediul unui receptor al ”morții celulare”, ceea ce duce la
fragmentarea ADN-ului celulei țintă;
· ”atacul” asupra celulei țintă prin perforine (proteine ce rup membrana plasmatică sau
lizozomală) și granzine(serin proteaze care lizează substraturi sau activează diverse proteaze)
sintetizate și eliberate de către LTc.
LTc au un rol important în apărarea împotriva celulelor infectate viral. Activitatea lor este
intensificată de IFN-g.
Importanța activității litice a LTc a fost demonstrată atât experimental (pe modele animale) cât și la
pacienți care prezentau defecte ale citotoxicității. Există sindroame genetice transmise autozomal recesiv
în cadrul cărora este afectată citotoxicitatea sau prezentând mutații la nivelul genei ce codifică informația
pentru sinteza de perforine. Aceste sindroame au fost asociate cu imposibilitatea controlării infecțiilor
virale, mai ales cu CMV, EBV și HSV (4).
Limfocitele T inductoare ale hipersensibilităţii întârziate
Sunt celule care secretă IL-2 şi în acelaşi timp IFN-g, activatoare pentru alte limfocite T, macrofage
şi celulele NK.
Limfocitele T supresoare (Ts, CD8+)
Limfocitul T supresor este o celulă CD8+, ca şi LT citotoxic.
Limfocitele Ts au rol în reglarea răspunsului imun, menţinându-l în limite normale.
În lipsa Ts, orice stimul antigenic ar putea fi urmat de o proliferare anarhică a unei clone de
limfocite (acele limfocite dotate cu receptorul specific pentru respectiva structură antigenică).
În mod normal, între populaţiile de limfocite Th şi Ts există un echilibru, care se cuantifică prin
raportul Th/Ts, raport care trebuie să fie supraunitar. Exemplul cel mai cunoscut în care valoarea
raportului devine subunitară este infecţia HIV / SIDA.
O parte dintre limfocitele T nu au funcţie efectoare şi se transformă în LT cu memorie.
Limfocitele T γδ (γδ T cells)
Limfocitele T γδsunt sechestrate la nivelul barierelor epiteliale sau la nivelul focarului inflamator și
manifestă citotoxicitate față de diverse ținte.
Sunt activate direct de antigen (non-peptide de dimensiuni mici) fără a fi necesară prezentarea în
conjuncție cu MHC.
Reacționeaza față de extractele mycobacteriene. Sunt stimulate de grupările fosfat din diverși
compuși precum NTP (nucleotid trifosfat din ADN și ARN). Teste efectuate pe animale de laborator care
au fost infectate cu Listeria spp., Leischmania spp., Mycobacterium spp., Plasmodium și Salmonella spp.
au arătat un nivel de protecție mediu realizat de aceste limfocite.
Se acumulează la nivelul focarului inflamator în boli cu implicare imună precum artrita reumatoidă
sau sarcoidoza (cauza nu este cunoscută).
137
Sunt implicate atât în imunitatea înnăscută cât și în cea adaptativă, prin
· secreția de citokine și chemokine
· abilitatea de a ajuta LB să se transforme în limfocite cu memorie.
Limfocitele T NK (NKT cells)
Limfocitele T NKintervin în RIP și produc cantități crescute de IL-4. ”Împrumută” proprietăți atât de
la LT cât și de la NK.
139
Celulele dendritice se găsesc în aproape toate țesuturile organismului, incluzând sângele și
organele limfoide. La nivelul țesuturilor periferice formează o rețea care se extinde și în spațiile dintre
celulele parenchimatoase astfel încât pot detecta orice microorganism aflat în acea zonă. Celulele
dendritice posedă două sisteme de supraveghere imunologică:
· macropinocitoză (în fiecare oră ingeră echivalentul volumului lor; nu așteaptă pasiv apariția
antigenului care să le stimuleze),
· au pe membrană mai multe tipuri de receptori pentru mai multe tipuri de particule.
Sunt clasificate, în funcţie de distribuţia în organism şi de particularităţile fenotipice, în trei mari
clase și şase tipuri:
a). Celule dendritice tisulare
· celule Langerhans – CDL, care la nivel cutanat formează un strat continuu între derm și
epiderm (dar le găsim și la nivelul tubului digestiv și organelor genitale),
· celule interstiţiale - CDI, care se găsesc în interstițiul țesuturilor;
b). Celule dendritice limfoide (din organele limfoide secundare)
· celule interdigitate - CDID, în ariile T dependente din organele limfoide secundare,
· celule foliculare - CDF, în ariile B dependente din organele limfoide secundare;
c). Celule dendritice circulatorii
· celule sanguine - CDS, în vasele sanguine, aflate în tranzit,
· celule limfatice, „văluroase” - CDV, în vasele limfatice, aflate în tranzit.
Toate celulele dendritice au origine medulară, provenind din aceeaşi entitate celulară - CDS (o parte
dintre CDS pătrund în ţesutul cutanat şi mucoase, iar altă parte în interstiţiu). Pot să îndeplinească
funcţia de APC deoarece prezintă receptori de tip CR, FcγR şi sintetizează molecule MHC II (cu excepţia
CDF).
Așadar, celulele dendritice sunt eliberate în circulație din măduva osoasă hematogenă și se
transformă în CDS. De aici pot urma două căi:
· în țesutul cutanat se transformă în CDL (captează antigenele opsonizate), apoi iau calea
vaselor limfatice transformându-se în CDV, ajung la nivelul organelor limfoide secundare unde se
transformă în CDID care prezintă pe membrana epitopi în conjuncție cu MHC II.
· în interstițiu se transformă în CDI, apoi fie iau calea vaselor limfatice (și urmează drumul de
mai sus), fie trec în circulație, se transformă din nou în CDS și ajung în splină unde fie
o ajung periarteriolar (zona cu LT) și se transformă în CDF care reprezintă filtre pentru antigenele
solubile,
o ajung în jurul zonei periarteriolare (zona cu LB) și se transformă în CDID.
Subliniem că este vorba despre aceeași celulă dendritică, în circulație prin organism; în funcție de
locul în care ajunge are alte caracteristici structurale și funcționale.
Celulele dendritice tipice (CDL, CDI, CDID) au formă neregulată, cu prelungiri numeroase, lungi şi
efilate (de unde vine şi denumirea lor). În citoplasma celulelor dendritice se găsesc numeroase
mitocondrii. CDF nu au atât de multe prelungiri și se dispun în grămezi. CDS au aspect rotund ovalar iar
CDL sunt celule văluroase.
Au rol important în maturizarea precursorilor LT.
Induc toleranța LT, eliminând LT autoreactive (cele care la nivel timic au interacționat cu MHC și ar
putea să reacționeze la fel de puternic și cu celulele somatice normale din organismul uman și să
140
genereze autoimunitatea). Astfel, CD elimina LT care au scăpat selecției negative (vezi Cap. 10, paragraf
10.2.1.).
Se pare că aceste celule intervin în declanşarea RI înaintea macrofagelor.
Monocitele / macrofagele pot fagocita exo-antigenele într-o vacuolă numită endozom primar.
Fuziunea endozomilor secundari cu lizozomii permite degradarea antigenelor în peptide imunogenice.
Moleculele MHC II, produse la nivelul reticulului endoplasmic, pot „încărca” aceste peptide. Fago-
lizozomii fuzionează cu membrana plasmatică şi astfel, peptidul de pe MHC II se exprimă la suprafaţa
externă a macrofagelor.
Macrofagele reprezintă APC majoritare în organism, însă nu toate pot îndeplini funcţia de APC,
respectiv:
· cele care nu au capacitatea să funcţioneze ca APC vor rămâne implicate în răspunsul
inflamator,
· celelalte vor funcţiona ca APC în cinci etape
1. captarea Ag (proces imunologic nespecific, mediat de receptori);
2. endocitarea Ag captate (realizată doar de către macrofagele activate metabolic);
3. prelucrarea Ag native captate (are loc la nivel lizozomal iar la finalul ei, rămâne un epitop,
format dintr-o haptenă cu specificitate maximă şi o proteină „carrier”);
4. conservarea epitopilor în anumite sectoare subcelulare (în acest fel este asigurată
autoîntreţinerea RI în timp);
5. prezentarea epitopilor pe membrana APC, cuplaţi în permanenţă cu molecule MHC. Sistemul
MM exprimă molecule MHC II, mai ales după activarea prin interferonul gamma (IFN-g). După contactul
cu limfocitul T, macrofagele secretă IL-1 şi IL-6 şi TNF-a; TNF-a activează RI şi procesul inflamator local.
Limfocitele B pot funcţiona ca APC profesionale numai în condiţii de activare metabolică. Au
capacitatea de a recunoaşte epitopii conformaţionali ai antigenelor şi de a-i prezenta limfocitelor T (de
peste 30 de ani a fost dovedit faptul că RI la antigenele timo-dependente necesită cooperarea LB-LT).
Prezintă pe suprafaţa lor receptori de tip CR şi FcγR şi pot sintetiza molecule MHC II.
LB recunosc şi prezintă numai Ag solubile. Există studii care afirmă faptul că LB au o mai mare
eficienţă în procesul de prezentare al antigenelor în comparaţie cu macrofagele.
LB naive dar mature (încă nu au avut contact cu antigenul, dar au fost maturate în măduva
osoasă hematogenă) sunt stimulate de antigen. Ag este captat prin intermediul BCR (receptor pentru
antigen de pe LB). LB captează antigenul, îl procesează, prezintă apoi epitopii în complex cu molecule
MHC II spre LTh CD4+. Acesta din urmă trimite semnale către alte LB prin citokine şi molecule de
suprafaţă iar LB încep să prolifereze, se transformă în limfoblaste B, apoi în plasmocite care vor secreta
anticorpi.
144
vârstă (valorile cele mai mari sunt înregistrate în primii doi ani de viață și în decada a treia și a patra). Se
datorează mutației genei ce activează factorul de creștere pentru mastocite.
Plachetele
Plachetele au un rol accesoriu în reacţia imună. Ele conţin serotonină şi exprimă receptori pentru
IgG şi IgE. Plachetele aderă la endoteliul vascular, se agregă şi eliberează substanţe care cresc
permeabilitatea capilară şi activează sistemul complement. Datorită Ig fixate pe membrana lor,
plachetele pot adera la paraziţi şi pot elibera radicali liberi ai oxigenului cu efect toxic pentru aceştia.
Globulele roşii
Alături de rolul principal de a transporta oxigenul la ţesuturi şi bioxidul de carbon la plămâni,
globulele roşii deţin receptori pentru sistemul complement, facilitează transportul complexelor imune din
sânge la celulele Kuppfer din ficat, prin fixarea lor pe receptorii pentru complement.
145
12. Complexul major de
histocompatibilitate
12. 1. Definiţie şi istoric
Complexul major de histocompatibilitate (MHC) uman, sau sistemul HLA, corespunde unor
moleculele exprimate pe membrana celulară.
Au fost descoperite ca alloantigene (alloantigen = antigen ce există în forme alternative = alele în
cadrul unei specii;alloantigenul induce răspuns imun atunci când este transferat la indivizii din aceeaşi
specie, cărora le lipsește respectiva formă a antigenului; exemplu: sistemul ABO al grupelor sangvine)
de care depindea compatibilitatea grefelor cutanate sau de organ.
Un fragment de ţesut recoltat de la o gazdă şi grefat la un receptor diferit, chiar dacă face parte din
aceeaşi specie, este de regulă eliminat. Dacă după eliminare se încearcă o nouă grefare, cu acelaşi tip
de ţesut, eliminarea este mai rapidă.
Pornind de la aceste observaţii s-a pus numele de antigene de histocompatibilitate [primul rol
identificat pentru acestea (dar existenţa lor nu este legată doar de fenomenul de
compatibilitate/respingere a grefelor de ţesut sau organ].
Eliminarea ţesuturilor este controlată genetic, de mai multe gene care codifică pentru sinteza de
proteine diferite la subiecţi diferiţi (gene de histocompatibilitate). Există antigene majore de
histocompatibilitate (MHC) şi antigene minore (situaţie în care eliminarea grefelor are loc, de regulă,
tardiv).
Înţelegerea acestor fenomene este legată de 3 descoperiri succesive:
· Complexul major de histocompatibilitate. Cercetările lui Gorer (1963) pe grefe tumorale
prelevate de la un şoarece şi grefate la altul, au arătat că grefa este respinsă în caz de histo-
incompatibilitate sau tolerată în caz de histo-compatibilitate. Rejetul sau toleranţa sunt dictate genetic.
Aceasta a dus la descoperirea sistemului major numit H2 la şoarece şi a mai multor sisteme minore.
Ulterior, existenţa MHC a fost confirmată la toate mamiferele, regiunea fiind denumită în funcţie de
specie (ex. H2 la şoarece, ChLA la cimpanzeu).
· Sistemul HLA. În 1958 se pune în evidenţă, în serul unui pacient cu aplazie medulară şi
politransfuzat, un alloanticorp care aglutinează leucocitele altor subiecţi. Aceasta stă la originea
descoperirii sistemului allotipic HLA (human leucocyte locus A), evidenţiat la nivelul leucocitelor, apoi la
majoritatea celulelor. Există o împărţire a sistemului HLA pe mai multe gene HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-
DR, HLA-DP şi HLA-DQ. Studiul supravieţuirii grefelor cutanate, între donor şi receptor HLA identic sau
diferit a dovedit că sistemul HLA corespunde genetic şi funcţional cu MHC uman.
· Răspunsul imun. Rolul fiziologic a fost descoperit ulterior. Proprietatea de a răspunde la un
anumit antigen depinde de genele MHC, numite din acest motiv gene ale răspunsului imun. Doherty şi
Zinkeragel au demonstrat în 1974 că răspunsul imun este limitat de complexul major de
histocompatibilitate (MHC) individual.
12. 3. Roluri
Limfocitele T protejează organismul uman de 2 mari categorii de agenţi patogeni: virusurile, care
preiau comanda celulei pe care o infectează (devenind astfel antigene endogene) și bacteriile care se
replică autonom, majoritatea extracelular.
Cele 2 clase ale MHC sunt esenţiale în recunoaşterea şi răspunsul imun față de peptide derivate din
„agresori”. În ”lupta” dintr-o infecţie virală, virusul este eliminat de către LT CD8+ care recunoaşte
peptide virale endogene ataşate de MHC-I. În schimb, o bacterie e eliminată prin fagocitare de către
macrofage sau neutrofile.
LT CD4+ recunoaşte peptidele bacteriene legate de MHC-II şi direcţionează răspunsul imun către
activarea macrofagelor şi producţia de anticorpi care opsonizează bacteria.
Moleculele de histocompatibilitate au așadar un rol fundamental în prezentarea peptidului antigenic
către:
· limfocitul T helper - HLA-II sau
· limfocitul T citotoxic - HLA-I.
În această comunicare intercelulară intră în contact 3 molecule:
· HLA
· peptidul antigenic
· TCR.
Rolul moleculelor HLA clasa I
Au rol în principal în reacţia imună care implică intervenţia LTc. Moleculele HLA I prezintă un peptid
endogen sintetizat de o celulă contaminată de o bacterie/un virus/un parazit cu dezvoltare intracelulară
sau un peptid endogen rezultat din degradarea unor celule self tumorale sau îmbătrânite către
receptorul de antigen (TCR) al limfocitului T CD8+. Se va obţine astfel un răspuns imun celular prin
activarea şi multiplicarea LTc având ca rezultat liza celulelor ţintă ce au prezentat antigenul prin HLA-I.
(Figura nr. 4)
Rolul moleculelor HLA clasa a II-a
148
Ele intervin în principal în răspunsul imun în care sunt implicate APC şi LTh. Moleculele HLA II
prezintă limfocitului Th CD4+ peptide de origine exogenă, provenite din proteinele endocitate şi
degradate de APC. (Figura nr. 5)
Etape:
a) Legarea antigenului exogen de molecula HLA clasa II:
1. Endocitoza - particulele antigenice (bacterii, proteine străine) sunt internalizate nespecific de
monocite / macrofage sau specific de limfocitele B prin IgM. Ele urmează calea endocitozei;
2. Generarea peptidelor antigenice - prin fuzionarea endozomilor cu lizozomii, proteinele sunt
degradate în peptide prin activarea proteazelor lizozomale la un pH acid;
3. Asocierea cu HLA II - moleculele HLA clasa II-a sintetizate în reticulul endoplasmic sunt asociate,
sub forma unui complex, cu o proteină accesorie, lanţul invariabil II. Aceasta împiedică legarea
peptidelor endogene de HLA-II prin blocarea situsului de legare în timpul sintezei sale și permite legarea
peptidelor exogene prin distrugerea lanţului după terminarea sintezei;
4. Trecerea prin membrana celulară - ansamblul HLA-II-peptid exogen este exprimat la suprafaţa
APC. (Figura nr. 6)
b) Interacţiunea între APC şi limfocitul T helper:
Peptidele antigenice sunt recunoscute de către LTh prin TCR numai dacă sunt prezentate de către
APC pe MHC-II.
Pe de alta parte, limfocitul helper CD4+, prin TCR-ul său nu poate interacţiona cu o APC decât dacă
recunoaşte antigenele cuplate cu moleculele MHC ale individului (restricţie allogenică).
Molecula accesorie CD4 a limfocitului helper interacţionează cu domeniul β2constant al HLA-II
declanșând astfel primul semnal către limfocit pentru activarea sa. În urma unor reacţii în cascadă LT va
intra în mitoză, va secreta o serie de citokine şi va colabora cu LB spre producţia de anticorpi având ca
scop eliminarea antigenelor exogene. Specificitatea reacţiei este datorată asocierii trimoleculare TCR,
HLA, peptid antigenic.
O parte din moleculele codificate de regiunea HLA-II sunt implicate în procesarea şi încărcarea
peptidelor pe HLA-I. Astfel, PSMB8 şi PSMB9 sunt subunităţi ale proteozomului iar TAP1 şi TAP2
transportă peptidele endogene din citoplasmă în RE. BTNL2 este implicată în susceptibilitatea la
sarcoidoză
Moleculele HLA-III sunt împărţite în două categorii în funcţie de rol:
a.) cu rol în imunitate şi inflamaţie: componentele complementului C2 şi C4, TNF, HSP (proteina de
şoc termic);
b.) cu rol enzimatic: CYP21
149
importanţei HLA în transplant, locusurile HLA sunt printre cele mai frecvent serotipate sau analizate prin
PCR faţă de oricare alte alele autozomale.
În diferite studii, s-a analizat importanţa compatibilităţii HLA în transplantul de inimă, rinichi, celule
stem hematopoietice.
Polimorfismul sistemului HLA este foarte mare şi de aceea probabilitatea ca organele donoare să fie
potrivite primitorului este foarte mică. În transplanturi a existat practica de a se aloca organe fără a se
lua în considerare compatibilitatea HLA donor-receptor. De aceea, în trecut, nu a fost posibilă analizarea
corespunzătoare a ratei de succes a transplantului cu organe compatibile HLA. Într-un studiu realizat pe
8.331 de pacienţi, internaţi în 104 centre din 24 state din USA, doar 128 subiecţi au primit câte o grefă
cardiacă compatibilă HLA (A, B sau DR) sau doar cu o singură incompatibilitate. S-a observat
supravieţuirea ţesutului pe o durată de 3 ani, iar rezultatele au fost dependente de sistemul HLA. Astfel,
au avut succes: la compatibilitate maximă 83±4% transplanturi faţă de 76 ±2% transplanturi la 2
nepotriviri. Aşadar, supravieţuirea grefei în transplantul de cord este semnificativ influenţată de
compatibilitatea HLA.
Există două tipuri de incompatibilitate: a antigenelor (detectabilă serologic) şi a alelelor (detectabilă
prin metode de analizare a ADN-ului). Într-un studiu s-a testat ipoteza conform căreia incompatibilitatea
alelelor este mai puţin imunogenă decât incompatibilitatea antigenelor şi, astfel, este mai puţin asociată
cu rejecţia de transplant cu celule stem hematopoietice. Peste 450 de pacienţi cu leucemie mieloidă
cronică au primit transplant de măduvă de la donori diferiţi. Prin secvenţierea ADN, s-au analizat alelele
clasei I HLA (A, B, C) şi s-au observat ratele de respingere a grefei la transplanturile fără nici o
incompatibilitate, la cele cu o singură incompatibilitate a alelelor sau a antigenelor sau la transplanturile
cu 2 sau mai multe nepotriviri. Rezultatele au confirmat ipoteza şi, astfel, riscul rejecţiei de transplant a
fost semnificativ mai mare la cei cu o incompatibilitate antigenică HLA, faţă de cei cu o incompatibilitate
alelică. Riscul a fost de asemenea crescut la cei cu mai multe nepotriviri HLA şi la primitorii homozigoţi
HLA în locusul de incompatibilitate. În concluzie, transplanturile de la donori cu o singură
incompatibilitate a alelelor HLA au un risc scăzut de rejecţie şi pot fi realizate cu succes. În schimb,
incompatibilitatea de antigene HLA, detectabilă serologic, creşte riscul de respingere a ţesutului.
12.4.2. Asocierea subtipurilor HLA cu susceptibilitatea la boli
Studii epidemiologice au demonstrat că peste 40 de boli se întâlnesc mai frecvent la indivizi purtători
ai anumitor alele HLA I sau II decât la populaţia generală. Importanţa acestor efecte este extrem de
mare, deşi nu vor fi probabil niciodată demonstrate ca absolute. De exemplu, între 90% şi 95% din
pacienţii caucazieni cu spondilită ankilozantă posedă HLA-B27 (1), iar 30%-50% din pacienţii caucazieni
cu diabet zaharat tip I sunt HLA-DQ2/DQ8 heterozigoţi. Interesant este faptul că HLA-DQ6 pare a fi
responsabilă de protecţia împotriva diabetului zaharat de tip I.
Majoritatea bolilor care au legătură cu anumite gene HLA au un caracter autoimun. Baza moleculară
a acestei legături este necunoscută din cauza lipsei identificării autoantigenului primar care reprezintă
„trigger-ul”. (2) Cu toate că mecanismele prin care genotipurile HLA controlează susceptibilitatea la
aceste boli sunt încă incomplet definite, se crede că participarea moleculelor MHC în stabilirea toleranţei
imunologice şi în recunoaşterea antigenelor stă la baza acestor fenomene.
Alelele HLA ce oferă protecţie pot media eliminarea în timus a LT potenţial patogene responsabile de
autoimunitate, în timp ce alelele HLA susceptibile pot eşua în eliminarea LT patogene.
150
Pe de altă parte, genotipurile HLA pot guverna receptivitatea la anumite vaccinuri. Spre exemplu,
subiecţii care au alela HLA-DR3 sunt, într-o proporţie crescută substanţial, nereceptivi la vaccinarea cu
antigenul de suprafaţă al hepatitei B. Totodata, indivizii cu HLA-DRB1*03 sau HLA-DQA1*0201 au o
incidenţă crescută de seronegativitate la vaccinarea împotriva pojarului. (3)
Un studiu realizat de curând pe cetăţeni americani caucazieni certifică faptul că homozigoţii HLA-
DR13-DQ6 prezintă risc crescut de asociere a distoniei cervicale. (4)
O altă boală cu caracter autoimun şi conexiuni certe cu sistemul HLA este scleroza multiplă. (5-6)
12.4.3. Prezentarea de antigene independent de MHC
Recent s-a fundamentat ideea conform căreia există o clasă nouă de LT care recunosc antigene
prezentate de molecule ce nu sunt MHC-I sau MHC-II. Una dintre aceste clase de LT foloseşte un
receptor pentru antigen ce recunoaşte antigene lipidice prezentate pe molecule CD1. CD1 sunt
asemănătoare structural cu MHC-I, însă lanţurile CD1 formează un situs ce poate acomoda componente
glicolipidice ale patogenilor microbieni. Astfel, complexele CD1-glicolipide servesc drept ţintă pentru
recunoaşterea de către LT ce au un tip special de receptor: γδ TCR. Această prezentare a glicolipidelor
microbiene pe molecule CD1 pare să fie responsabilă de recunoaşterea independentă de MHC a
mycobacteriilor. (3)
151
B. sfingolipide
C. peptide exogene
D. TCR
E. peptide endogene
152
· P-selectinele formează împreună cu factorul Willebrand granule denumite corpusculii Weibel-
Palade. P-selectinele sunt primele expuse pe versantul circulator, fiind stocate în vezicule.
Integrinele
Familia integrinelor cuprinde peste 20 de membri, glicoproteine transmembranare cu structură
heterodimerică (a, β). Iniţial au fost caracterizate 3 subfamilii, cu lanţul β comun şi lanţul a diferit,
pentru ca în prezent să se cunoască faptul că lanţul a se poate asocia cu mai multe lanţuri β (β 1-8).
Localizarea integrinelor este ubicuitară (cel puţin un membru al acestei familii pe toate celulele
nucleate). Leucocitele pot exprima cel puţin 13 astfel de receptori. Celulele epiteliale exprimă la rândul
lor o serie de integrine, constitutiv sau indus, în urma procesului inflamator.
Integrinele intervin în legarea intercelulară şi între celulă şi substrat, prin care contribuie la
organizarea tisulară şi migrarea celulară, alături de superfamilia imunoglobulinelor; subfamilia β 2-
integrinelor stimulează proliferarea limfocitelor T, la contactul cu celulele dendritice; cresc sinteza de
citokine (β1 şi β2-integrinele stimulează producţia de TNF-a şi β a celulei T; β 2-integrinele stimulează
producţia de IL-1β a monocitelor, la contactul cu limfocitul T).
Integrinele au două stadii conformaţionale, cu specificitate diferită faţă de substrat (Figura nr. 1).
Acestea sunt influenţate de procese celulare interne de fosforilare ce induc schimbări conformaţionale,
ca răspuns la factori din mediu (vezi secţiunea de integrare a cunoştinţelor: recrutarea celulelor din
torentul sangvin).
Superfamilia imunoglobulinelor (imunoglobulin-like)
Moleculele de adeziune din această clasă au o structură „imunoglobulin-like” prin expresia
extracelulară a unor domenii repetitive de tip imunoglobulinic. Sunt clasificate în trei subfamilii:
· ICAM (intercellular adhesion molecule),
· VCAM (vascular cell adhesion molecule) şi
· PECAM (platelet-endothelial cell adhesion molecule).
Moleculele de adeziune din această clasă intervin în legarea intercelulară, mai ales în interacţiunea
leucocit-endoteliu. Prin cuplarea lor cu liganzii de selecţie (integrine) intervin în legarea leucocitară şi
prin aceasta în controlul infiltratului inflamator local. Expresia lor pe suprafaţa celulară este constitutivă
sau indusă de citokine.
Caderinele
Caderinele sunt formate dintr-un singur lanţ polipeptidic şi sunt exprimate constitutiv pe suprafaţa
celulelor. Au rol în legarea intercelulară prin aderarea unora de altele, pe celulele adiacente, printr-un
mecanism calciu-dependent. Prin funcţia lor asigură integritatea epiteliilor. Caderinele sunt clasificate în
patru subfamilii:
· E-caderine (pe epitelii),
· V-caderine (pe endoteliu),
· P-caderine (placentare),
· N-caderine (în sistemului nervos central şi ochi).
adresine vasculare
Sunt glicoproteine exprimate pe suprafaţa celulelor endoteliale şi intervin în „homing-ul” limfocitar,
respectiv în direcţionarea limfocitelor spre ganglionii limfatici şi ţesuturile extraganglionare.
Carbohidraţii
153
Reprezintă liganzii specifici pentru selectine şi nu constituie o clasă distinctă de molecule de
adeziune.
Aceste două cupluri de adeziune permit recunoaşterea şi interacţiunea între LT CD4+ şi APC sau
între LT CD8+ şi celula ţintă, proces completat de specificitatea TCR. Conexiunea constituită între LT
155
CD4+ şi APC a fost numită „sinapsă imunologică”, subliniind transferul informaţional implicat în
recunoaşterea epitopului exprimat pe moleculele MHC II de către TCR
159
limfocitelor B]. Acţionează sinergic cu IL-12 şi IFN-γ stimulând activitatea citotoxică a celulelor NK. IL-2 a
fost prima dintre interleukine care a fost caracterizată până la nivel structural. Este o interleukină cu 133
aminoacizi, o greutate moleculară de 15,5 kDa; gena care codifică sinteza de IL-2 se găseşte pe
cromozomul 4.
· IFN-g este produs de limfocitele Th1; sursa esenţială pentru această interleukină este
reprezentată de celulele NK. Rolul principal al IFN-g este activarea macrofagelor, cu producerea speciilor
reactive ale oxigenului şi NO, cu efect bactericid asupra microorganismelor intracelulare. Prin acţiunea sa
anti-Th2, reduce răspunsul imun umoral. IFN-γ controlează funcţii imune implicate în apărarea
antibacteriană, antivirală şi antiparazitară.
13. 2. 5. Chemokine
160
Aceste molecule de adeziune cuprind aproximativ 50 de membri divizaţi în mai multe familii (CC,
CXC, XC, CX3C). Denumirea familiilor şi moleculelor aferente a fost standardizată în raport cu structura
chimică, pe baza numărului şi poziţionării grupărilor de cisteină. Numele receptorilor chemokinelor
(citokine cu rol în chemotaxie) se stabileşte pornind de la grupul de litere prezentat, la care se adaugă
litera R şi un număr, în timp ce liganzii conţin litera L şi un număr. Ele prezintă o activitate chemotactică
faţă de limfocite, monocite, eozinofile etc.
Neutrofilele, de exemplu, exprimă receptori CXCR1 şi CXCR2, în timp ce eozinofilele, bazofilele şi
monocitele exprimă receptori CCR1, CCR2, CCR3 şi CCR5. Aceste structuri există în permanenţă pe
suprafaţa celulelor normale circulante şi pot fi detectate prin metode de laborator. Majoritatea liganzilor
sunt molecule solubile, ce se secretă în torentul circulator, în timp ce unii liganzi (CX 3CL1, CXCL16)
conţin o porţiune transmembranară, permiţând ancorarea celulelor de endoteliul vascular în condiţii de
flux fiziologic. Prin intermediul acestor receptori, celulele menţionate vor reacţiona la stimulul primit de la
celulele endoteliale sau de la alte celule agresate de toxine bacteriene; un alt stimul este reprezentat de
citokinele pro-inflamatorii (ex. IL-1, TNF, IFN etc). Trebuie menţionat că studiile arată tot mai des rolul
chemokinele în procese patologice, precum ateroscleroză, scleroza multiplă etc.
13. 2. 6. Hematopoietine
Hematopoieza este controlată de către un sistem fiziologic autoreglabil, prin care se menţine un
compartiment de celule stem şi un compartiment de diferenţiere pentru toate liniile sanguine. Sistemul
necesită un echilibru între sinteza osoasă şi menţinerea unui spaţiu hematopoietic medular graţie
echilibrului între osteoblaste şi osteoclaste. În procesul de proliferare şi diferenţiere a celulelor stem
intervin numeroase citokine:
· SCF (stem cell factor) provine în principal din celulele stromale ale măduvei osoase. SCF este
produs atât în formă solubilă cât şi într-o formă legată de membrana citoplasmatică.
· IL-3 sau multi-CSF (multi-colony stimulating factor) este un polipeptid cu greutatea
moleculară 20-30 kDa, cu 133 aminoacizi. Sinteza IL-3 este apanajul LT activate în urma stimulării
antigenice dar şi al mastocitelor sau eozinofilelor. Gena care codifică pentru sinteza IL-3 se află pe
cromozomul 5. Rolul său este de-a stimula proliferarea şi diferenţierea celulelor stem spre diferitele linii.
· IL-4, IL-5, IL-7, IL-10, IL-11 şi IL-15:
161
13. 3. Mesagerii secunzi
Stimularea celulară debutează prin interacţiunea unui număr mare de receptori membranari celulari.
Alături de moleculele de adeziune şi receptorii de citokine, mai trebuie amintiţi receptorii pentru
fragmentul Fc al imunoglobulinelor (FcR) şi receptorii pentru complement (CR). Aceştia au o importanţă
sporită în recunoaşterea patogenilor şi reprezintă startul procesului de procesare antigenică în cadrul
răspunsului imun înăscut.
Transducţia semnalului primit necesită intervenţia mesagerilor secunzi, care transmit informaţia
printr-o reacţie în cascadă, până la nivelul membranei celulare, al organitelor intracitoplasmatice sau al
nucleului. În acest ultim caz, este vorba de o acţiune asupra unor gene, care va antrena sinteza unor
proteine sau activarea ciclului celular (modificări transcripţionale).
Întregul mecanism este complex şi necesită interacţiunea între partea intracitoplasmatică a
receptorilor membranari şi mesagerii secunzi. În unele cazuri, molecula receptor membranar care
primeşte semnalul extracelular comunică direct cu mesagerii secunzi printr-un motiv intracelular (de
exemplu, motivul activator ITAM). În alte cazuri, molecula receptor cu o parte intracelulară limitată la
câţiva aminoacizi, este asociată la alte molecule, fomând adevărate domenii de amplificare a semnalului
(molecular scaffolds). Partea intracelulară astfel dezvoltată poartă motivul de interacţiune cu mesagerul
secund. În acest sens pot fi citate diverse exemple: complexul CD3 al TCR, moleculele Iga şi Igβ ale
BCR, moleculele gc ale receptorilor membranari pentru interleukine. (Figurile nr. 9-10)
162
Integrinele mediază şi ataşarea leucocitară la componentele matricei extracelulare, conducând la
exocitoza enzimelor de clivare a matricei pentru a permite înaintarea leucocitelor spre focarul de
inflamaţie. Procesul de dirijare a migrării leucocitare se bazează pe emiterea de prelungiri membranare
în direcţia dictată de gradientul de concentraţie a mediatorilor chemotactici.
163
poveste „de eşec” pentru o moleculă candidat a fost publicată şi a contribuit, în felul acesta, la „viitorul
succes” în domeniu.
14. Imunoglobulinele
Imunoglobulinele sunt glicoproteine cu rol de anticorpi. Imunoglobulinele există în plasmă, lichid
interstiţial şi secreţii şi au capacitatea de a recunoaşte şi de a se combina specific cu antigenul inductor
al răspunsului imun. Lor li se adaugă proteinele patologice cu aceeaşi structură dar fără activitate de
anticorpi. De exemplu, în mielomul multiplu sau în macroglobulinemia Waldenström's a fost identificată
proteina patologică Bence-Jones (poate fi identificată în sânge sau în urină; este vorba de o sinteză
anormală de lanţuri uşoare; a fost descrisă de H. Bence Jones în 1847). Termenul de imunoglobuline
(Ig) îl înlocuieşte pe cel de gama-globuline. Acest termen nu este corect, deoarece nu toţi anticorpii
migrează electroforetic în regiunea „gama”.
Toţi anticorpii sunt imunoglobuline. Imunoglobulinele pot fi anticorpi, dar au şi alte roluri.
Denumirea de anticorp se pare că a fost dată pentru substanţele „împotriva corpilor” bacterieni,
ceea ce nu este corect, deoarece există anticorpi şi faţă de alte structuri (inclusiv împotriva structurilor
proprii, în bolile autoimune) sau chiar şi în cazul bacteriilor, pot exista anticorpi diferiţi faţă de structuri
164
diferite ale aceleaşi bacterii (ex. anticorpi faţă de cele peste 90 de tipuri capsulare ale Streptococcus
pneumoniae).
Imunoglobulinele sunt diferite de alte structuri proteice:
- recunosc şi reacţionează specific cu structura antigenică din cauza căreia au apărut;
- au funcţie de anticorp, dar dacă sunt inoculate la un individ dintr-o specie diferită vor avea rolul de
antigene pentru respectivul individ;
- sunt singurele structuri proteice care sunt sintetizate după un stimul antigenic;
- pot activa sistemul complement etc.
S-a reuşit sinteza de anticorpi monoclonali „himerizaţi”, alcătuiţi dintr-o parte de moleculă umană şi
alta animală; fiind de izotip uman nu vor mai apărea ca şi structuri antigenice şi nu vor mai fi „respinşi”.
165
- VL pentru fragmentul uşor variabil (variable light), diferit pentru lanţurile kappa şi lambda: Vk şi
Vl.
- CL pentru fragmentul uşor constant (constant light), cu un singur lanţ Ck şi patru Cl funcţionale.
Domeniile variabile VL şi VH formează locul unde anticorpul se cuplează cu determinantul antigenic
(epitop). Faţa interioară a situsului anticorpului (situs combinativ) vine în contact direct cu epitopul şi se
numeşte paratop. Faţa exterioară a situsului combinativ se numeşte idiotip.
167
În definiţia iniţială, acest caracter antigenic era propriu unei imunizări, la un animal care a produs
anticorpi. Oudin a obţinut primii anticorpi anti-idiotipici în modul următor: într-o primă etapă a imunizat
un iepure împotriva Salmonella spp. şi a obţinut un prim tip de anticorpi numiţi Ab1 împotriva acestei
specii. Apoi un al doilea iepure a fost imunizat cu acest imunoser şi s-au obţinut anticorpi numiţi Ab2 sau
anticorpi anti-anti-Salmonella sau anti-idiotip Ab1. Aceşti anticorpi nu recunosc decât serul primului
animal imunizat şi nu serul dinaintea imunizării sau serul unui alt animal imunizat pentru
aceeaşi Salmonella. Un anticorp Ab2 poate recunoaşte mai mulţi Ab1 de la animale diferite, recunoscând
anticorpii cu aceeaşi specificitate anti-Salmonella.
Pornind de la Ab2 se poate imuniza un alt animal care sintetizează anticorpi Ab3, anti-idiotip Ab2,
aşa-zişi anti-anti-idiotip. Pentru anticorpii Ab2 se disting Ab2-a care nu inhibă reacţia antigen-Ab1 şi Ab2-
β care, dimpotrivă, inhibă această reacţie. Anticorpii Ab2-β sunt numiţi „imagine internă“ a epitopului de
plecare E1, ceea ce înseamnă ce au o structură imunologică asemănătoare, recunoscută de Ab1.
Determinanţii antigenici idiotipici se găsesc la nivelul părţilor variabile ale lanţului greu şi lanţului uşor, şi
uneori sunt constituiţi din cele două lanţuri. Ei pot corespunde segmentelor hipervariabile, respectiv
paratopilor imunoglobulinelor.
168
curburi a arcului normal, având următoarele 3 caracteristici: linie groasă, curbă foarte marcată, poziţie
mai apropiată de imunoserul revelator.
14. 6. Funcţii
Proprietăţile fragmentului Fab
Fragmentul Fv participă singur la formarea situsului de legare al anticorpilor, cu intervenţia egală a
domeniului VH al lanţului greu şi al domeniului VL al lanţului uşor. Aminoacizii celor 3 regiuni
hipervariabile ale fiecărui lanţ, situaţi la distanţă în structura primară, dar apropiaţi în structura
cuaternară, contribuie la formarea acestuia.
Legătura antigen-anticorp se realizează prin legături non covalente, reversibile.
Proprietăţile fragmentului Fc
Unele dintre aceste proprietăţi nu apar decât dacă anticorpul a fixat antigenul sau a fost alterat de
căldură, formând agregate. Acest aspect este valabil pentru fixarea complementului şi recunoaşterea
factorului reumatoid. În cazul subclaselor de IgG ordinea reactivităţii este următoarea: IgG3 > IgG1 >
IgG2 > IgG4.
Viteza de catabolizare depinde de regiunea CH 2 a diferitelor clase şi subclase de Ig. IgG (cu
excepţia IgG3) au un timp de înjumătăţire de 21 de zile.
Toate IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) traversează activ placenta, IgG1 trecând cel mai uşor. Aşa cum
am arătat mai sus, nou-născutul are o concentraţie a IgG de 110% faţă de cea maternă, ceea ce indică
prezenţa unui transfer foarte activ. IgM şi IgA materne nu traversează placenta, Ig din aceste clase
găsite la nou-născut fiind de origine fetală. Cunoaşterea acestor aspecte este foarte utilă pentru
evidenţierea unei afectări intrauterine sau a unui simplu transfer de Ig materne. În caz de suspiciune de
toxoplasmoză congenitală, se indică dozarea IgM şi IgA anti-toxoplasma în serul nou-născutului (au
existat, din nefericire, recomandări de întrerupere a sarcinii în cazul în care la mamă au fost identificaţi
anticorpi anti-toxoplasma de tip IgG).
Fixarea complementului poate avea loc în calea clasică; IgG1, IgG2 şi IgG3 şi IgM au un receptor
ascuns în stare nativă pentru C1q, care va fi activat în timpul fixării anticorpului pe antigen. Acest
receptor se află în regiunea CH2 a IgG şi în domeniul CH4 al IgM. Teoretic, o singură moleculă de IgM
pentamerică este suficientă pentru activarea complementului, datorită celor două situsuri
apropiate. ştiind că IgG sunt de 1.000 de ori mai puţin eficace decât IgM, pentru activarea
169
complementului sunt necesare două molecule IgG, apropiate una de cealaltă. Calea alternă poate fi
activată de IgG sau IgA, prin fixarea pe C3b.
Receptorii pentru fragmentul Fc al imunoglobulinelor (Fc receptor, FcR) sunt molecule membranare
specifice pentru fiecare clasă de Ig, care induc o activare a celulelor purtătoare. Se disting receptori cu
mare afinitate Fc RI, care fixează un monomer de Ig şi sunt activaţi când antigenul se leagă de anticorp
formând o punte între doi receptori cu slabă afinitate Fc R II şi Fc R III, care nu pot fixa decât complexe
antigen-anticorp multivalente, formate în prealabil.
Celulele purtătoare de receptori pentru Ig sunt:
· macrofagele, monocitele şi neutrofilele au următorii receptori: Fc g RI, Fc g RII, Fc g RIII,
care permit fagocitarea complexelor imune, a celulelor sau microorganismelor acoperite cu anticorpi IgG;
· celulele NK cu receptori Fc g RIII, care permit inducerea unei citotoxicităţi faţă de celula ţintă
sau un microorganism, prin citotoxicitate anticorp dependentă (ADCC) ( antibody dependent cellular
cytotoxicity). În acest mod celulele NK se pot fixa pe celula ţintă şi o pot liza;
· bazofilele circulante şi mastocitele au receptori pentru IgE (Fc e RI şi Fc e RII), inductoare
ale hipersensibilităţii imediate;
· eozinofilele şi plachetele au receptori de slabă afinitate Fc e RII. Plachetele au şi receptori
Fc g care le conferă o activitate antiparazitară;
· limfocitele au diverşi receptori de slabă afinitate.
Receptorul numit poly Ig R (receptor Ig polimeric) permite fixarea de IgA dimerică sintetizată pe
plasmocite şi facilitează intrarea lor într-o vacuolă care traversează citoplasma celulelor epiteliale
intestinale. Este prezent şi la nivelul canalelor secretorii ale glandelor exocrine.
170
diagnosticul la internare fiind pneumonie cu pleurezie. În spital s-a administrat o asociere de ceftriaxonă
cu gentamicină, dar semnele respiratorii s-au menţinut, apărând în plus semne de insuficienţă
respiratorie; în aceste condiţii copilul se transferă în clinica de pediatrie. Examenul clinic la camera de
gardă relevă o stare generală foarte alterată, dificultăţi în respiraţie, respiraţii frecvente, tiraj intercostal,
lipsa murmurului vezicular la baza hemitoracelui stâng, submatitate la percuţie şi raluri crepitante
însoţite de frecătură pleurală la auscultaţie în treimea medie a hemitoracelui stâng. În clinica de
pediatrie s-a recoltat sânge pentru hemoculturi şi lichid pleural, produsele fiind trimise pentru
diagnosticul bacteriologic, direct. Hemoculturile au fost negative. Cultura din lichidul pleural a fost
negativă. Valorile celorlalte analize de laborator au fost următoarele: VSH = 85 mm/oră, număr de
leucocite = 28.000/mm3 (dintre care, peste 20.000/mm3 neutrofile, 72%), proteina C reactivă=9,8
mg/dL. Dozarea imunoglobulinelor serice a arătat valori mari pentru Ig G (1.800 mg/dL), o valoare de
242 mg/dL pentru Ig M, în timp ce IgA a fost nedozabilă (0 mg/dl). Fracţiunea C3 a complementului a
fost dozabilă, în cantitate de circa 10 ori mai mare decât valorile normale, cu complexe imune circulante
dozabile, la valori mari.
Diagnosticul de pneumonie stângă cu pleurezie, probabil de etiologie bacteriană, în condiţiile unui
deficit absolut de IgA, a condus la instituirea tratamentului cu o asociere de medicamente antibacteriene
(ceftriaxonă, amikacină şi teicoplanină) alături de dezobstruante, menţinerea permeabilităţii căilor
respiratorii şi administrare de oxigen. S-au administrat de asemenea imunoglobuline pe care
intravenoasă.
Datorită faptului că în ciuda unei evoluţii favorabile din punct de vedere clinic, semnele fizice de la
nivel pulmonar s-au menţinut iar temperatura nu a coborât sub 38,1ºC, s-a administrat suplimentar un
medicament antifungic evoluţia fiind favorabilă. Tratamentul a fost continuat timp de 3 săptămâni, după
care copilul a fost externat cu recomandarea de a reveni la control clinic, radiologic şi bio-umoral. La
controlul efectuat s-a constatat că deficitul de IgA nu a fost corectat şi s-a menţinut şi după vindecarea
pacientului, fiind probabil o cauză a patologiei şi nu un rezultat al acesteia.
Al doilea caz
Un copil de sex feminin, se internează la vârsta de 2 ani şi 6 luni într-o clinică de pediatrie, prin
transfer dintr-un spital de nivel inferior, datorită evoluţiei nefavorabile a unei pneumonii. S-a născut
prematur, după 8 luni de gestaţie, cu greutate de 1.100 g, Apgar 7. A fost îngrijită în maternitate până
la vârsta de 2 luni şi jumătate. Până la vârsta de 2 ani şi jumătate a făcut repetate infecţii acute ale
căilor respiratorii inferioare (IACRI) (minim 4 episoade / an).
Motivele internării au fost: febră, tuse şi dispnee.
Din discuţia cu părinţii s-a aflat că tusea şi febra au apărut cu 10 zile anterior internării; ulterior
copilul a început să respire din ce în ce mai dificil. A primit în ambulatoriu ampicilină (pe cale orală), apoi
cotrimoxazol (biseptol). Pentru că evoluţia a fost nefavorabilă, mama a fost sfătuită să se prezinte
pentru internare, la spital.
S-au prezentat la primul spital. Examenul clinic la internare a evidenţiat: febră (38,3°C), paloare,
număr ridicat de respiraţii/minut, tiraj (deprimare a structurilor suprasternale în timpul inspirului) şi
sindrom de matitate în treimea inferioară a hemitoracelui drept (la inspecţie, auscultator şi la percuţie).
La examenul radiologic s-a văzut opacifierea neomogenă a jumătăţii inferioare a hemitoracelui drept. Din
rezultatele celorlalte investigaţii se amintesc: VSH= 120 mm/oră, leucocitoză (12.400 / mm 3) cu
neutrofilie (75%), hipoxemie (cu scăderea presiunii de oxigen). Imediat după internare s-a administrat
171
ceftriaxonă, apoi amoxicilină-acid clavulanic în asociere cu ciprofloxacină, fără ca evoluţia să fie pozitivă.
În aceste condiţii, s-a recomandat transferul într-o clinică de pediatrie, de nivel superior.
Diagnosticul la internare în clinica de pediatrie a fost: pneumonie dreaptă, sepsis bacterian.
Examenul clinic la internare a revelat o stare generală profund alterată, prezenţa unui facies
suferind, foarte palid, hipertermie (39ºC), deficit al stării de nutriţie (greutate = 10,7 kg), cianoză peri-
oro-nazală accentuată la plâns şi alte eforturi, polipnee (80 respiraţii / minut), bătăi ale aripioarelor
nazale, matitate cu absenţa murmurului vezicular în două treimi inferioare ale hemitoracelui drept, raluri
crepitante la baza hemitoracelui drept, ficat la 2,5 cm sub rebordul costal, dureros la palpare.
Radiografia pulmonară efectuată la internare a evidenţiat opacifierea omogenă a hemitoracelui drept.
Celelalte investigaţii de laborator au avut următoarele valori: VSH = 75 mm/h, hemoglobină = 8,2
g/dL, leucocitoză (L = 24.800/mm3) cu neutrofilie (peste 15.600 neutrofile/mm3, 63%), modificări ECG.
S-a pus diagnosticul de pneumonie cu pleurezie dreaptă importantă, insuficienţă respiratorie acută,
insuficienţă cardiacă, anemie, hipotrofie ponderală. S-a realizat puncţia pleurală (atât pentru a elimina
această cauză de presiune mecanică asupra arborelui cardiovascular cât şi pentru punerea diagnosticului
etiologic şi stabilirea sensibilităţii la antibiotice a agentului sau agenţilor etiologici). S-a recoltat şi sânge
pentru hemoculturi, înainte de administrarea altor medicamente antibiotice sau chimioterapice. Lichidul
pleural era „sub presiune”; s-au extras cu uşurinţă peste 375 mililitri de lichid opac, tulbure. Produsele
au fost trimise imediat către laboratorul de bacteriologie. Frotiul colorat Gram a pus în evidenţă rare
PMN (2-5 / câmp) şi rari coci Gram-pozitivi, aşezaţi unul câte unul sau în diplo. Coloraţia Ziehl-Nielsen nu
a pus în evidenţă bacili acid-alcoolo rezistenţi. Atât culturile din lichidul pleural cât şi cele hemoculturi au
rămas sterile. Prin reacţii antigen-anticorp s-a încercat punerea în evidenţă a prezenţei antigenelor
capsulare în lichidul pleural (pneumococ, H. influenzae, meningococ), dar reacţiile au fost negative.
Dozarea imunoglobulinelor serice a arătat valori mari pentru Ig G (1.400 mg/dL), o valoare de 160
mg/dL pentru IgM, în timp ce IgA a fost nedozabilă (0 mg/dl). Fracţiunea C3 a complementului a fost
dozabilă, în cantitate mai mare decât valorile normale.
În condiţiile obţinerii acestor date clinice, paraclinice şi de laborator, s-au administrat antibiotice în
asociere [iniţial o combinaţie între un glicopeptid şi o cefalosporină de generaţia a III-a (pentru 2
săptămâni), apoi o combinaţie între vancomicină şi amikacină (pentru încă 2 săptămâni)], în afară de
drenajul lichidului pleural (sub control clinic şi paraclinic), administrare de oxigen, administrare de
lichide, electroliţi şi substanţe nutritive intravenos. Avându-se în vedere rezultatul dozării
imunoglobulinelor, s-au administrat şi imunoglobuline intravenos. Lent, evoluţia din punct de vedere
clinic a fost favorabilă. Pe partea dreaptă, radiologic s-a constatat organizarea unui proces pahipleuritic.
Copilul a fost spitalizat pentru o lună, iar înainte de externare valorile bio-umorale au fost următoarele:
VSH =12 mm/oră, număr de leucocite= 6.500/ mm3 (fără neutrofilie), hemoglobină = 10.2/dL,
hematocrit = 34%, IgA = 0 mg/dL.
Discuţii
Cu excepţia vârstei, au existat o serie de asemănări între cele două cazuri. Ambii copii au avut în
antecedente episoade de IACRS şi IACRI, mai multe / an, în fiecare an, fără diagnostic etiologic, pentru
care au primit tratament la domiciliu, de regulă incluzând antibiotice sau chimioterapice. Episodul
infecţios discutat, datorită evoluţiei grave, a condus la recomandarea de internare şi în fiecare dintre
cele două cazuri internarea a fost realizată, succesiv, la două nivele spitaliceşti. În ambele cazuri, la
spitalul de nivel inferior, copii au primit tratament antibiotic înainte de recoltarea produselor pentru
172
punerea unui diagnostic etiologic. În aceste condiţii nu a fost posibilă nici stabilirea sensibilităţii
microorganismelor implicate şi tratamentul anti-infecţios a fost condus „empiric”, ceea ce ar fi putut
reprezenta un important factor de risc, inclusiv pierderea pacientului.
În primul caz nu s-a putut emite nici o ipoteză privind etiologia (alta decât „bacteriană”) iar în al
doilea caz, elementele observate la studierea frotiului din lichidul pleural au permis suspicionarea unei
pneumonii de etiologie pneumococică.
Tratamentele conduse în ambulatoriu, auto-tratamentele stabilite de părinţi (în baza „amintirii” unor
recomandări medicale anterioare), lipsa unei culturi medicale care să ridice suspiciunea privind o „cauză
de bază” care să explice un număr de infecţii respiratorii, repetate, mai numeroase decât în mod
obişnuit, ne fac să realizăm motivele pentru care deficitul imun a fost descoperit relativ tardiv (cu toate
că în ambele cazuri a existat un deficit absolut în sinteza de IgA, foarte probabil un deficit primar).
Pe de o parte, din aceste prezentări sesizăm, foarte concret, importanţa bunei funcţionări a
sistemului imun şi una dintre situaţiile care pot apărea în cazul existenţei unor deficienţe, iar pe de altă
parte este de subliniat că tratamentul bolilor infecţioase ar trebui realizat numai după diagnosticul
etiologic, cu testarea sensibilităţii la antibiotice şi chimioterapice, singura variantă corectă, care poate
veni în sprijinul pacienţilor pe care trebuie să îi îngrijim.
173
Calea lectinică poate fi activată de lectina care leagă manoza de pe suprafaţa bacteriilor
(MBL, Mannan-Binding Lectin), dar şi de alte proteine asemănătoare.
· Lectinele sunt proteine sau glicoproteine ce nu au origine imună şi prezintă cel puţin două
situsuri identice de legare specifică a unor structuri glucidice;
· MBL este o proteină din clasa colectinelor, având domenii lectinice prin care se ataşază
glucidelor şi un domeniu colagen-like. MBL se găseşte în cantitate mică în serul indivizilor sănătoşi, însă
în cazul infecţiilor acute, concentraţia acesteia creşte semnificativ. S-a constatat că persoanele care au
deficit de MBL dezvoltă în copilărie mult mai multe infecţii decât copiii normali, lucru ce atestă
importanţa apărării organismului prin activarea complementului pe calea lectinică la vârste la care
sistemul imun nu s-a constituit în totalitate din punct de vedere funcţional.
Interacţiunea acestora formează un complex asemănător celui format în primele subetape ale căii
clasice (C1qrs) şi activează calea clasică fără a necesita prezenţa complexelor antigen-anticorp.
· Pe lângă MBL, alte trei proteine pot, prin legarea lor de anumite structuri antigenice, să
declanşeze activarea complementului pe calea lectinică. Aceste proteine sunt ficolina-1, ficolina-2 şi
ficolina-3. Pot lega zaharuri sau compuşi acetilaţi prezenţi pe suprafaţa microorganismelor. Dintre MBL
şi ficoline, cea mai abundentă în plasmă şi cea care intervine cel mai adesea în declanşarea căii
lectinice, este ficolina-3, numită şi antigenul Hakata sau β-2 macroglicoproteina termolabilă. (1)
Calea alternă poate fi activată de bacterii, fungi, virusuri, paraziţi, venin de viperă, produşi de
coagulare, celule tumorale etc.
Calea clasică şi calea alternă (alternativă) converg către C3, apoi urmează o cale efectoare
comună, implicând ultimele componente ale sistemului complement (Figura nr. 3). În fiecare dintre
etape, intervin proteine activatoare, inhibitoare sau reglatoare precum şi receptorii pentru complement.
Aceste elemente se găsesc fie în plasmă fie la nivelul peretelui celulelor autologe sau omologe.
În mod curent, sistemul complement este desemnat prin litera C. Pentru fiecare componentă
studiată şi bine delimitată în cadrul „cascadei de activare” se adaugă o cifră, de la C1 la C9, care este
eventual urmată de o literă (care reprezintă o anumită subdiviziune; spre exemplu, pentru C1 există
C1q, C1r şi respectiv C1s).
Ca urmare a activării sistemului C', unele componente (C4, C2, C3, C5), sunt fragmentate, aceste
fragmente fiind desemnate printr-o literă ataşată componentei iniţiale (exemplu C3a şi C3b). În general
componenta b este de dimensiuni mai mari (excepţie C2a, fragment înglobat într-un complex proteolitic
şi care are dimensiuni mai mari decât C2b) şi se fixează la nivelul structurii ţintă, în timp ce
componenta a este mai mică, este solubilă şi posedă o activitate anafilactoidă sau chimiotactică.
Anafilatoxinele sunt polipeptide mici, eliberate în cursul cascadei de activare a complementului,
care prezintă receptori pe mastocite, monocite, macrofage, neutrofile, trombocite şi au efect
proinflamator. Cea mai puternică dintre anafilatoxine este C5a. Acţiunile anafilatoxinelor sunt de tipul:
· contracţie a musculaturii netede,
· creştere a permeabilităţii vasculare,
· degranulare bazofilică şi mastocitară,
· chemotactismul şi activarea granulocitelor care vor conduce la eliberarea enzimelor litice şi a
radicalilor liberi.
Compusul b poate fi mai departe fragmentat (exemplu C3c şi C3d).
174
Un compus inactivat este indicat prin litera i (exemplu: C3bi sau iC3b). Componentele sistemului
complement sunt prezentate în tabelul nr. 1.
176
care rezultă în urma transformării sale în C5-dezarginină, acţionează la nivelul receptorului C5a-R al
mastocitelor şi bazofilelor.
C6, C7, C8. C5b antrenează legătura dintre C6 şi C7, formând un complex C5b67 notat prescurtat
C5b7. Complexele C5b7 se leagă de o moleculă de C8 care se implantează în membrană apoi mai multe
molecule de C9 vor forma un complex membranar C5b9m.
C9. Această proteină are două proprietăţi: 1. de a se insera la nivel membranar, graţie unei feţe
hidrofobe; 2. de a polimeriza, formând astfel peretele unei soluţii de continuitate de circa 10 nm în
diametru la nivelul membranelor celulelor ţintă (limfocitul T utilizează o substanţă numită perforină, cu
efect asemănător cu cel produs de C9). Formarea sau fixarea complexului C5b9 în cantităţi sublitice la
suprafaţa celulelor antrenează sinteza şi eliberarea mediatorilor inflamaţiei (leucotriene, IL-1 etc).
(Figura nr. 3)
Există o serie de mecanisme de reglare a activităţii sistemului complement, acestea fiind mediate de
proteine reglatoare care intervin la un moment dat în cursul cascadei de activare, având capacitatea de
a o limita sau chiar opri. (Tabelul nr. 2)
În general, aceste proteine inhibă formarea C3 convertazei sau promovează disocierea ei (când
aceasta deja s-a format).Decay Accelerating Factor (DAF) – „Factorul de accelerare a disocierii C3
convertazei” este o proteină care poate dezactiva C3 convertaza căii clasice, dar are şi rolul de a inhiba
formarea ei, nepermiţând elementelor C2a şi C4b să interacţioneze. Împreună cu CR1 (complement
receptor 1), DAF competiţionează cu factorul B la legarea de C3b, prevenind astfel constituirea C3
convertazei căii alterne. Acest complex DAF-CR1 poate să disloce Bb din compusul C3bBb, disociind C3
convertaza căii alterne.
Factorul H are acţiune similară.
Tot din categoria proteinelor reglatoare face parte şi Factorul I, o protează din plasmă care clivează
C3b în mai multe situsuri, inactivându-l. Iniţial rezultă C3bi, apoi C3c şi C3dg (fragment ce rămâne
ataşat membranei celulare).
Properdina (factorul P), în contrast cu toţi compuşii enumeraţi anterior, intervine în reglarea
sistemului complement prin stabilizarea C3 convertazei căii alterne. Deficienţele de properdină au fost
asociate cu creşterea susceptibilităţii faţă de infecţiile provocate de Neisseria spp.
178
Prin mecanisme asemănătoare, agenţii infecţioşi pot fi acoperiţi de C3b sau C3bi care sunt
recunoscuţi de diferiţi receptori, prezenţi la nivelul diferitelor celule fagocitare esenţiale: neutrofile şi
macrofage. După aderare, acestea vor fagocita microorganismele. Diferite microorganisme au dezvoltat
mecanisme de rezistenţă la acţiunea complementului: ex. prezenţa unei capsule care împiedică activarea
căii alternative (S. pneumoniae, Haemophilus influenzae), sintetizarea unor substanţe care fixează C3b
sau antrenează o rezistenţă la inserţia complexului de atac al membranei.
15. 5. 3. În metabolismul complexelor imune. Curăţarea (clearance-ul) complexelor imune este
facilitată în mare măsură de către sistemul complement. Simpla fixare a complementului inhibă formarea
complexelor imune de talie mare (calea clasică) şi le solubilizează. Totuşi complexele circulante acoperite
de C3b pot adera la hematii, iar apoi pot fi transportate până la nivelul celulelor Kuppfer hepatice,
pentru a fi fagocitate. C1q are proprietatea de a precipita complexele imune in vitro. Această proprietate
stă la baza diverselor metode de detectare a complexelor imune circulante.
15. 5. 4. În reglarea răspunsului imun.Pe limfocitele B se găsesc receptori pentru C3d sau C3dg
(CR2).
15. 5. 5. În inducerea secreţiei de citokine de către monocite şi macrofage prin intermediul
receptorilor C3. (5)
Sistemul C' poate acţiona în sistem heterolog (C' recoltat de la animale, de ex. nurcă, cobai se
poate folosi în reacţii de diagnostic în microbiologia medicală, sistemul indicator provenind de la un alt
animal de ex. oaie, bou) şi din această cauză a fost şi este încă folosit în foarte multe situaţii. Trebuie
însă reţinut faptul că sistemul C' se degradează rapid la temperaturi mai mari de 56ºC şi din această
cauză reactivii care conţin C' trebuie menţinuţi la rece (0ºC) inclusiv pe timpul transportului.
179
şi receptori CR3. Comparativ cu configuraţia receptorilor la adult, neutrofilele nou-născuţilor sunt
deficitare în exprimarea CR3.
Un studiu recent a demonstrat că blocarea (la adult) receptorilor CR3 împiedică buna desfăşurare a
proceselor de opsonizare şi fagocitoză. Acelaşi studiu a emis ipoteza că depozitarea unor anumiţi
compuşi de clivare ai C3 pe suprafaţa streptococului de grup B ar fi un factor important în apărarea
gazdei împotriva agravării infecţiei.
Alte experimente au arătat că la şoriceii cu deficit de C3 eliberarea de TNF-α indusă de streptococ
este semnificativ redusă. În concluzie, calea alternă a complementului şi factorul C3 ar putea reprezenta
cheia eliberării de TNF-α. Abilitatea streptococului de grup B de a activa sistemul complement a fost
demonstrată în vitro.
Deşi se ştie că nou-născuţii prezintă concentraţii relativ mici ale complementului, în mod aparent
calea alternă este suficient de activă încât să amplifice eliberarea de TNF-α în cazul infecţiilor
streptococice. Acest fapt a fost demonstrat de diferite studii care au certificat creşterea marcată a
eliberării TNF-α de către monocitele nou-născuţilor.
Având în vedere că eliberarea de TNF-α ca răspuns la infecţiile grave cu streptococ de grup B pare
să aibă o strânsă legătură cu fiziopatologia acestor infecţii, se consideră că terapia adjuvantă
imunomodulatoare administrată cu scopul de a reduce activitatea pro-inflamatorie a streptococului ar
putea fi eficientă. O astfel de terapie ar include şi modularea căii alterne a complementului.
15. 6. 2. Consecințe ale deficitului de properdină
Sistemul complement este un complex de molecule care face parte din ansamblul imunităţii
nespecifice. De-a lungul timpului, s-au descoperit o serie de afecţiuni corelate cu deficienţe ale acestor
compuşi dintre care şi boli autoimune, dar şi reacţii de hipersensibilitate.
Un subiect îndelung studiat îl reprezintă deficitul de properdină şi predispoziţia persoanelor care
posedă această carenţă faţă de infecţiile cu specii din genul Neisseria.
Properdina este o glicoproteină reglatoare a căii alterne de activare a complementului, singura care
reglează pozitiv cascada enzimatică prin stabilizarea C3 şi C5 convertazei căii alterne. Concentraţia serică
fiziologică de properdină este de 5-15 μg/ml, fiind un amestec de monomeri, dimeri, trimeri şi tetrameri
în raport de 1:2:1.
În 1982, într-o familie suedeză, a fost descris primul caz de carenţă de properdină în asociere cu o
infecţie meningococică cu debut fulminant. Ulterior, studiindu-se această problemă, s-a ajuns la
concluzia că există 3 tipuri diferite de deficit de properdină (observate clinic la indivizi diferiţi). Primul tip
se caracterizează prin absenţa proteinei în plasmă. Cel de-al doilea se manifestă printr-un titru foarte
scăzut al properdinei, iar cel de-al treile tip presupune o concentraţie serică normală, dar o variantă
nefuncţională a proteinei.
Detectarea unei astfel de condiţii la un pacient este foarte dificil de făcut. Pe lângă testele de
laborator care sunt foarte laborioase, este necesar un istoric infecţios al pacientului şi al familiei
acestuia. Din pricina diagnosticului greu de stabilit, deficitul de properdină este rar întâlnit, însă prezent
în fază „ocultă” (nediagnosticată) în special în cadrul rasei caucaziene, nefiind reportate cazuri la nici o
altă populaţie. Formele de deficit de properdină sunt maladii genetice transmisibile, X-linkate. Se
cunoaşte deja, în toate trei tipurile bolii, care sunt mutaţiile ce survin şi unde sunt acestea localizate.
Predispoziţia faţă de infecţiile cu Neisseria meningitidis apare ca manifestare clinică în toate tipurile
deficitului de properdină. Serotipurile cel mai des implicate în astfel de infecţii sunt W-135 şi Y, mai puţin
180
serotipul B, faţă de care s-a constatat că organismul uman şi-a dezvoltat metode mai eficiente de
apărare prin mecanisme de fagocitoză. Indivizii cu deficit de properdină au un risc mai crescut de 250 de
ori de a dezvolta o infecţie meningocociă decât restul populaţiei sănătoase. Dacă la o persoană normală,
şansele cele mai mari de a face infecţie cu meningococ sunt la vârsta de 6 ani, la un individ cu deficit de
properdină, vârful riscului dezvoltării infecţiei este în jurul vârstei de 14 ani. Mortalitatea în astfel de
cazuri este de până la 75%. Infecţiile recurente sunt extrem de rare în condiţiile date, fapt ce atestă că
probabil apărarea umorală devine mai eficientă la aceste persoane.
Pacienţii cu deficit de properdină au un răspuns umoral adecvat la vaccinul tetravalent
antimeningococic (care conţine antigene din serotipurile A, C, Y, W135), organismul generând anticorpi
anticapsulari ce devin eficienţi în combaterea instalării infecţiei. Partea bună este că nu la toţi pacienţii la
care este detectat deficitul de properdină se dezvoltă infecţii meningococice. Acest lucru a sugerat că
există şi alţi factori adiţionali care favorizează predispoziţia către aceste infecţii. S-a constatat astfel că la
o parte dintre indivizii cu deficit de properdină, lipsea alotipul G2m(n) (alotipul reprezentînd o secvenţă
aminoacidică de pe lanţul g al moleculei de IgG2 specifică fiecărui individ). Se speculează că această
combinaţie: deficit de properdină – lipsa alotipului G2m(n) este un temei relevant care explică de ce
indivizii afectaţi prezintă un risc net superior de a se imbolnăvii de infecţii meningococice.
1. C3 convertaza:
A. este o enzimă proteolitică, cu activitate anafilactoidă
B. se poate constitui pe două căi, rezultând 2 compuşi diferiţi structural, dar cu aceeaşi funcţie
C. scindează componenta C5 în C5a şi C5b
D. sub acţiunea sa, în membrana celulei atacate se formează MAC (Membrane Attack Complex)
E. nici un răspuns nu este corect.
16. Antigenele
Antigenul se defineşte drept o substanţă recunoscută specific de către sistemul imun. Alţi autori
consideră că antigenul este o substanţă capabilă să inducă un răspuns imun (imunogenicitate) şi să
fie recunoscută de către sistemul imun (specificitate). Răspunsul imun (RI) tinde să neutralizeze şi să
elimine antigenul din cauza căruia s-a declanşat. Antigenele (Ag) care pot declanşa RI sunt definite drept
substanţe imunogene.
Haptenele reprezintă Ag care sunt recunoscute de receptorii limfocitari, dar nu pot declanşa
activarea limfocitelor (fără de care nu apare RI). Haptenele devin imunogene numai dacă se combină cu
macromolecule „carrier”. Aşadar, haptena este un antigen incomplet, are specificitate dar nu are
imunogenicitate. Spre exemplu acidul penicilinoic rezultat prin degradarea moleculei de penicilină este o
haptenă. Pot apărea reacţii de hipersensibilitate după cel puţin al doilea contact cu această structură
şi numai în condiţiile în care gazda întră în categoria persoanelor „atopice”, având structura genetică
de codificare pentru o proteină „carrier”, care cuplează acidul penicilinoic stimulând astfel RI.
Tolerogenele sunt Ag care declanşează activarea limfocitelor, însă RI este inhibat activ, imediat.
Orice bacterie trebuie văzută ca un ansamblu de antigene, din care nu toate sunt imunogene (unele
pot fihaptene altele tolerogene). Mecanismele de apărare împotriva microorganismelor sunt diferite dar
pot fi deduse în funcţie de structura şi caracterele de patogenitate ale respectivei bacterii. Acesta este
182
un alt exemplu care demonstrează faptul că între capitole diferite există legături
importante, iar noțiunile citite și înțelese ”la timpul lor” pot fi foarte utile, ulterior.
Există 4 tipuri principale de perete bacterian (tip gram pozitiv, gram negativ, tip micobacterian și
spirochetal) iar patogenitatea poate varia între 2 ”extreme” (toxicitate fără invazivitate și invazivitate fără
toxicitate). (Figura nr. 1)
Recunoaşterea antigenului depinde de structurile complementare ale sistemului imun, preexistente
introducerii sale. Moleculele CMH clasa I sau II pot prezenta o multitudine de peptide antigenice diferite
şi nu sunt specifice unui antigen în mod particular.
Moleculele simple precum apa, sărurile minerale şi ureea sau comune majorităţii speciilor (ca acizii
graşi, creatinina, mono- şi dizaharidele, fibrina) nu sunt antigene. Pe de altă parte, moleculele mici de
tipul metalelor grele (crom, nichel), responsabile de apariţia hipersensibilității, sau medicamentele, pot
deveni antigene după ce se asociază cu diferite macromolecule.
Alloantigenele sunt prezente la unii indivizi din aceeaşi specie. Alloanticorpii sunt obţinuţi prin
imunizarea intra-specie sau inter-specii, după absorbţia anticorpilor anti-izotip.
Autoantigenele sunt substanţe recunoscute prin răspunsul imun şi prezente la animalul imunizat
sau la om în contextul unei afecţiuni autoimune. În mod normal, un individ nu declanşează un răspuns
imun împotriva structurilor proprii. Un răspuns autoimun se poate obţine prin imunizarea animalului cu
substanţe proprii împreună cu adjuvanţi sau prin injectarea unor substanţe self uşor alterate.
Idiotipul se referă la un caracter propriu părţilor variabile ale TCR-ului limfocitului T sau anticorpilor
apăruţi după imunizarea faţă de un antigen dat.
16. 2. 2. Imunogenicitatea
Imunogenicitatea este capacitatea unui Ag de a induce un răspuns imun umoral sau celular.
O haptenă este o moleculă mică (naturală sau artificială), incapabilă să inducă singură un răspuns
imun dar care poate fi recunoscută de componentele sistemului imun. Termenul a fost introdus de
Landsteiner în 1930. Haptena are specificitate dar nu are imunogenicitate. Termenul de haptenă nu este
sinonim cu cel de determinant antigenic: haptena poate fi mai mică, egală sau mai mare ca epitopul.
Purtătorul(carrier-ul) este partea Ag cu structură proteică, în general, care prin cuplare cu haptena
face ca aceasta să devină imunogenă.
16. 2. 3. Alergenicitatea
Unele antigene sunt capabile să inducă producţia de anticorpi IgE şi prin aceasta să provoace o
reacţie de hipersensibilitate mediată umoral (tip I). Principalele alergene cunoscute sunt polenul, veninul
de viperă, praful de acarieni şi unele fragmente sau produse de origine animală.
186
16. 2. 5. Răspunsul la mitogene
Pe lângă răspunsul imun specific, antigenele pot antrena o hipergamaglobulinemie globală,
stimulând diviziunea limfocitelor B. Aceasta se observă frecvent în cursul infecţiilor sau inoculării de
lipopolizaharide enterobacteriene.
190
După cum știți, macrofagele produc specii reactive de oxigen (foarte toxice pentru microorganism,
dar şi pentru celulele organismului gazdă). O specie reactivă de oxigen se formează în principal pe calea
anionului superoxid. O astfel de substanţă are adăugat un electron, care o va face instabilă şi care va
determina un şir de reacţii în lanţ în organism. Studii recente pe neutrofile au demonstrat că speciile
reactive de oxigen sunt bactericide şi indirect (prin inducerea unui flux de K în fagozomi)activează
producerea de proteaze. NO se formează din L-arginină sub acţiunea NO-sintetazei, care poate fi indusă
de IFNγ și TNFα, NO fiind tot o specie reactivă de oxigen, formată pe altă cale decȃt a anionului
superoxid.
Dar există şi metode oxigen-independente prin care fagocitele pot distruge bacteriile, de exemplu,
prin intermediuil proteinelor cationice. Defensina din granulele neutrofilelor se inseră între lipidele
membranei bacteriene şi crează un canal transmembranar care va duce la liza respectivului
microorganism. Microbii sensibili la defensină sunt Staphylococcus aureus,Pseudomonas aeruginosa, E.
coli, Cryptococcus neoformans. Catepsina G şi azurocidina sunt active pe bacteriile Gram negative.
Fierul este foarte important pentru dezvoltarea bacteriilor intracelulare, neutrofilele îngreunȃnd accesul
microorganismelor la acest element. Ȋnsă, organismul gazdă are nevoie crescută de fier de vreme ce
este co-enzimă pentru generarea NO şi pentru lanţul respirator. E foarte important de reţinut că
neutrofilul are o viaţă scurtă dar este foarte agresiv cu bacteriile, în timp ce macrofagul are o viață mai
lungă, însă neactivat, este un ... prieten al bacteriilor. Cel mai important factor de activare a
macrofagelor este IFNγ, iar acesta este produs în cele mai mari cantităţi de TH1 (CD4+).
Există diferite metode prin care patogenii ”păcălesc” apărarea fagocitară. Listeria
monocytogenes, Shigella spp. şiBurkholderia pseudomallei eliberează enzime care distrug membrana
fagozomilor, împidedicând asfel unirea cu lizozomii şi formarea complexului fago-lizozom.
M. leprae şi Salmonella spp. se îndreaptă spre celulele Schwann, hepatocite şi celulele epiteliale,
care au o capacitate mai redusă de apărare. Streptococcus pneumoniae şi C. neoformans au un înveliş
protector, care inhibă ataşarea macrofagelor de aceste bacterii. Stafilococii posedă catalază, care scade
stresul oxidativ. M. leprae se înconjoară cu un glicolipid care absoarbe radicalii liberi. Micobacteriile, în
general, eliberează lipoarabinoman, care scade eficienţa IFN în activarea macrofagelor. Celulele gazdei
infectate cu Salmonella enteritidis, M. tuberculosis sau Chlamydia trachomatis nu işi exercită
corespunzător funcţia de prezentare a antigenelor. Yersinia spp. induce apoptoza celulei gazdă.
După internalizarea anumitor antigene urmează expunerea acestora la suprafaţa APC.
Recunoaşterea de către TCR (T cell receptor) a Ag impune ca acest Ag să fie legat de o moleculă MHC
(major histocompatibility complex). Ag endogene (peptide) vor fi prezentate pe MHC I, iar Ag exogene
(peptide derivate din proteine extracelulare, care au ajuns la nivelul APC prin fagocitoză sau endocitoză,
aşa cum este cazul antigenelor bacteriene) pe MHC II. Genotipic, MHC I sunt codificate de genele HLA-
A, HLA-B, iar MHC II, de HLA-DP, HLA-DQ, HLA-DR. CD1 este o moleculă asemănătoare MHC I care
prezintă antigene lipidice (M. tuberculosis, H. influenzae). (Film nr. 4)
http://www.youtube.com/watch?v=m0ShUtbPllY
16.4.5. Intervenția LT ...
LTc (CD8+) pot elibera microorganismele care s-au „ascuns” la nivelul celulelor gazdă. S-a
demonstrat că prăbușirea sistemului MHC I la şoareci duce la lipsa de răspuns din partea LTc şi
consecutiv, aceşti şoareci devin susceptibili la infecţia cu M. tuberculosis. Tendinţele actuale sunt de a
191
găsi un vaccin care să stimuleze formarea LTc (Figura nr. 3). S-a mai observat că pe lȃngă dependenţa
activării LTc de prezentarea MHC I-Ag, mai există şi o dependență de activitatea litică a fagozomilor.
TCR (fie ei situaţi pe LT CD4+ sau CD8+) sunt de 2 tipuri: cu lanțuri αβ şi cu lanțuri γδ. Aceste 2
tipuri diferă prea puţin ca structură şi mai mult ca distribuţie. Consecutiv, cele 2 specii de receptori vor
avea funcţii diferite. TCR αβ se găsesc la nivelul sȃngelui periferic şi a timocitelor, iar TCR γδ la nivelul
pielii, mucoaselor, aparatului digestiv şi reproducător. De aceea s-a ridicat ipoteza conform căreia LT în
care predomină TCR γδ să nu aibă neaparat nevoie de prezentare MHC-Ag pentru activare (Unele LT γδ
recunosc fosfoliganzi derivaţi din M. tuberculosis care le determină activarea).
Superantigenele activează direct LT, fără a mai fi nevoie de prezentarea lor de către un APC pe un
MHC. Stafilococcii şi streptococcii posedă 21 de superantigene, probabil cu rol adaptativ. S-ar putea ca
motivul să fie o cât mai rapidă depleţie de LT a gazdei și inhibarea producerii de anticorpi. Certa e însă
toxicitatea determinată de eliberarea masivă de citokine. TSST-1 ( toxic shock syndrom toxin-1)
aparţinȃnd stafilococcilor este un exemplu de superantigen. Și proteina M a Streptococcus
pyogenes formeză un complex cu fibrinogenul, complex care se leagă de integrinele de pe neutrofile,
determinȃnd eliberarea în cantităţi mari a mediatorilor inflamatori. Dacă un antigen convenţional
activează 0,01-0,1% LT, superantigenele activează 5-30% din populaţia LT.
16.4.6. TSS ... HSP ... utilitatea antigenelor ...
Datele din USA referitoare la TSS (toxic shock syndrome) publicate într-un articol în 2010 relevă o
incidenţa a infecţiilor GAS (group A streptococci) de 1,5-5,2o/oooo/an, din care 8-14% au dezvoltat TSS,
cu o mortalitate de 30-70%. O epidemie de varicelă creşte riscul de TSS la 62,74 o/oooo. La 50% din
pacienţii cu TSS au avut afectări severe de ţesuturi moi, precum fasciita necrozantă, miozită, celulită. (1)
HSP (Heat shock proteins) sunt proteine comune atȃt organismelor umane, cȃt si bacteriilor şi au
fost denumite astfel datorită faptului că s-a remarcat creşterea expresiei acestora în condiţii de
temperaturi ridicate sau față de alţi factori de stres (ex. un proces infecţios). HSP au rol în asamblarea,
formarea structurii cuaternare a proteinelor şi în transportul altor molecule. Ȋn timpul unei invazii
bacteriene, sistemul imun se îndreaptă şi împotriva HSP, atȃt a celor autohtone, cȃt şi a celor
bacteriene. HSP activează sistemul imun prin intermediul CD91, CD40, CD14 şi anumiţi TLR. Datorită
asemănării structurale între cele 2 tipuri de HSP se presupune că aceste proteine ar avea un rol
important în generarea bolilor autoimune.
Tot timpul ne aflăm sub influenţa antigenelor bacteriene. Unele asigură sau înlesnesc procese
fiziologice, aşa cum se întȃmplă la nivelul intestinului gros, altele, prin competiţie ne protejează de
germeni virulenţi, aşa cum se întȃmplă de ex. la nivelul foselor nazale. Dar există şi ”teoria igieniei”,
neconfirmată şi nu neapărat adevarată sau aplicabilă tuturor microorganismelor, conform căreia şi
infecţia uşoară şi tranzitorie (nu boala) cu bacterii patogene este de folos. ”Alergiile” (stările de
hipersensibilitate), bolile inflamatorii ale intestinului subțire şi bolile autoimune ar fi generate de un
dezechilibru imun generat de igienă, vaccinuri și antibiotice. Ideea este nu de a elimina aceste 3
modalități clasice de apărare împotriva infecțiilor, ci de a afla cum, cȃnd și cȃt trebuie folosită fiecare
”armă” şi de a cunoaște cȃt mai bine adversarul împotriva căruia o folosim.
16.4.7. Şoc toxico septic sau alergie? Streptococ sau Stafilococ?
Pacienta în vȃrstă de 25 ani, se prezintă la camera de gardă după 2 zile de rash cutanat şi o durere
surdă difuză în cadranul stȃng inferior al toracelui.
192
Ȋn urmă cu o săptămȃnă a fost diagnosticată cu faringita streptococică şi a primit amoxicilină. S-a
prezentat după 3 zile la serviciul de dermatologie datorită rash-ului, unde i s-a pus diagnosticul de
alergie la amoxicilină. Prin urmare, a fost întrerupt tratamentul cu amoxicilină şi s-a recomandat
prednison.
Este corectă atitudinea dermatologului?
Argumentaţi.
La efectuarea anamnezei pacienta acuză greață, vărsături, febră, fatigabilitate, dezorientare și
durerea surdă menţionată mai sus. Neagă să fi avut sȃngerări (melenă, hemoptizie, hemoroizi). Examen
și analize: TA=65/35 mmHg, AV=110-120bpm, FR=20/min, T:39,7°C, SO2=93%.
La examenul fizic: pacienta este palidă, cu starea generală alterată. Orofaringele clar, fără exsudate
sau eritem, crepitaţii difuze la auscultaţia pulmonară, fără sufluri supraadăugate sau zgomote patologice
cardiace, abdomen suplu, mobil cu respiraţia. În tabel sunt listate determinările biochimice şi
hematologice anormale (comparativ, valorile normale). (Tabelul nr. 1)
Se efectueaza o radiografie (Rx) cardio-pulmonară, care este în concordanţă cu explorările
paraclinice şi cu examenul clinic, punȃndu-se diagnosticul de etapă, ARDS (adult respiratory distress
syndrome). (Figura nr. 3)
La întoarcerea de la radiologie, pacienta devine iar hipotensivă, tahicardică, tahipneică; febra se
menţine în ciuda adminitrării de acetaminofen. Se decide intubarea pacientei datorită insuficienţei
respiratorii ce se agravează, se recoltează probe de sȃnge, urină, exsudat faringian şi se face o puncție
lombară. Se solicită titrul ASLO și TSST-1. Se iniţiază tratament cu clindamicină, vancomicină și
meropenem iar pacienta este transferată în serviciul de ATI.
Comentarii explicative
Ȋn 1993 s-a ajuns la un consens privind TSS produs de streptococi, care presupune stabilirea
diagnosticului pozitiv dacă sunt îndeplinite concomitent următoarele condiţii:
1) Izolarea streptococcilor de grup A (GAS) dintr-o zonă în mod normal sterilă (sȃnge, fluid
cerebro-spinal, pleural, peritoneal)
2) Hipotensiune
3) 2 sau mai multe dintre următoarele:
· Insuficienţă renală (creatinina>2mg/dL sau valori de 2 ori mai mari decȃt în mod normal la
pacienţii cu boală renală)
· Coagulopatie
· Enzime hepatice crescute
· ARDS (adult respiratory distress syndrome)
· Rash maculo-eritematos
· Necroză de ţesut moale.
Introducerea vaccinurilor antivaricelă a scăzut incidenţa TSS de la 27% în 1993-1995 la 2% 1995-
2001. Utilizarea de medicamenteantiinflamatorii nesteroidiene (AINS) se pare că favorizează TSS. Un
articol din 1995 a Chuang șsi colab. arată că 92% din pacienţii cu TSS folosiseră anterior AINS. Mai mult,
AINS pot masca simptomatologia şocului toxico-septic.
Diferenţierea între TSS stafilococic şi steptococic este greu de făcut. Pacienţii cu infecție stafilococică
pot prezenta diaree, vomă, eritrodermie generalizată, insuficienţa conjunctivală, mialgie severă. Pacienţii
193
cu infecție streptococă pot prezenta necroză de ţesut moale (celulită, fasciită, abces, miozită),
simptomatologie influenza-like, varicelă în antecedente în cazul celor nevaccinaţi.
Ȋn cazul TSS stafilococic, se pare că toxina TSST-1 este responsabilă de 75% din cazuri. Pentru TSS
steptococic, proteina M este responsabilă de 75% cazuri iar SPEs A, B, C sunt responsabile de circa
13% (SPEs = Streptococcus pyogenes exotoxins). Specificitatea determinării Ac anti TSST-1 este de
90%, în timp ce pentru determinarea titrului proteinei M nu există teste fiabile. Se poate folosi în schimb
titrarea ASLO în dinamică.
Ȋn ciuda ambiguităţii privind etiologia, tratamentul rămȃne acelaşi:
· cristaloizi şi agenţi inotrop pozitiv contra şocului hipovolemic, cu monitorizarea TA şi a PVC
· antibiotice: penicilină, vancomicină şi clindamicină (penicilină sau alte beta-lactamine pentru
streptococ; vancomicină sau peniciline sintetice pentru stafilococ; clindamicina s-a introdus pentru că are
un efect mai îndelungat după administrare, facilitează fagocitoza bacteriei, inhibă liza celulelor
bacteriene cu eliberarea consecutivă suplimentară de citokine în circulaţie).
· terapii adjuvante (încă în stadiu de cercetare): =imunoglobuline administrate
intravenos, O2 hiperbar, Ac antiTNF.
Evoluţia pacientei: Statusul respirator s-a îmbunătăţit, cu detubare la 48 de ore. Titrul Ac anti TSST-
1 s-a pozitivat după 2 săptămȃni, ASLO a rămas normal. S-a trecut pe antibiotice orale, funcţia renală şi
WBC au revenit uşor la normal, s-au efectuat radiografii toracice zilnice, care au confirmat şi rezolvarea
ARDS. Pacienta a fost externată după 14 zile de spitalizare.
Diagnosticul final: Şoc toxico-septic stafilococic, probabil post-pneumonic.
194
d) o marca a RIC împotriva bacteriilor extracelulare.
4. Găsiţi afirmaţia greşită
a)Haptenele reprezintă Ag care sunt recunoscute de receptorii limfocitari, dar nu pot declanşa
activarea limfocitelor
b) Tolerogenele sunt Ag care declanşează activarea limfocitelor, însă RI este inhibat activ, imediat.
c) Idiotipul se referă la un caracter propriu părţilor variabile ale TCR-ului limfocitului T sau
anticorpilor apăruţi după imunizarea faţă de un antigen dat
d) Autoantigenele sunt substanţe diferite de antigenele proprii animalului imunizat, provenite de la o
altă specie.
5.Iată 3 afirmaţii: (1) „cu cât structura chimică antigenică provine de la o specie mai îndepărtată
filogenetic, cu atât RI va fi mai slab”; (2) „structura chimică trebuie să fie cât mai simplă” și (3)
„greutatea moleculară trebuie să fie cât mai mare (de regulă peste 4-5.000 Da) ”. Alegeţi varianta
corectă dintre urmatoarele:
a) (1) și (3) sunt false
b) (1) și (2) sunt adevărate
c) doar (3) este adevărată
d) doar (2) este falsă
195
cheie şi broască”, între structurile Ag şi Ac. Acest exemplu are un grad de sugestivitate, dar este
incomplet în comparaţie cu realitatea. O altă modalitate de a sugera specificitatea răspunsului imun ar fi
„potrivirea dintre mâna aşezată în faţa oglinzii şi imaginea din oglindă”.
Probabil, o modalitate şi mai sugestivă ar fi cea discutată la cursurile de imunologie din INCDMI
”Cantacuzino”: răspunsul imun este atât de specific, încât dacă ne-am închipui că Ag este reprezentat de
o pagină dintr-un manual, dacă am schimba nu o frază, un rând, un cuvânt ci chiar o singură
literă într-un cuvânt de pe o anumită pagină, această schimbare ar fi sesizată de sistemul imun iar Ac
produşi se vor „potrivi” cu această pagină în care a fost schimbată o singură literă. Totuşi, aşa cum am
menţionat la punctul 16. 2. 1., există şi reacţii încrucişate.
O altă caracteristică foarte importantă a RI, în condiţii fiziologice, este capacitatea de a discerne
între self şi non-self şi de a reacţiona numai faţă de moleculele care îndeplinesc definiţia de antigen (vezi
şi MHC/CMH).
Răspunsul imun poate fi de tip umoral, mediat prin anticorpi sau de tipcelular, mediat de către
celule. În cazul antigenelor timodependente (cea mai mare parte a antigenelor), se dezvoltă un răspuns
imun celular specific prin LT citotoxice şi unul umoral specific prin anticorpi. Diferite citokine pot activa
sau inhiba, în mod preferenţial, unul sau ambele tipuri de răspuns. În cazul antigenelor
timoindependente, răspunsul imun este umoral. În continuare vor fi prezentate în mod schematic aceste
două tipuri de răspuns imun umoral şi celular.
196
ale ganglionilor corespunzători anatomic, apoi în zona medulară şi în final (24 de ore) ajunge în regiunea
corticală, la periferia foliculilor primari. În interiorul organelor limfoide, antigenul se regăseşte în celulele
fagocitare. În prezenţa anticorpilor preformaţi şi a sistemului C', unele antigene se localizează la
suprafaţa celulelor dendritice intrafoliculare din centrii germinativi. Contactul cu antigenul antrenează
importante modificări histologice ale organelor limfoide: centri germinativi se dezvoltă în foliculi şi
persistă mai multe săptămâni; în paralel apar atât imunoblaştii şi plasmocitele, cât şi limfocitele de
memorie; după 3-4 zile se pot detecta limfocite cu anticorpi membranari, apoi celule care sintetizează
anticorpi serici.
17. 2. 1. Răspunsul imun primar (RIP)
Înaintea primului contact cu un anumit antigen, nu există anticorpi „potriviţi” față de acesta.
Stimulul antigenic primar „selectează” LB care au receptori pentru respectivul Ag. După primul contact
cu Ag se dezvoltă RIP, cu următoarele caracteristici:
· Latenţa: reprezintă perioada de la contactul cu Ag până la prezentarea structurilor Ag către LB
(în conjuncţie cu moleculele MHC); variază în funcţie de natura antigenului, calea de administrare şi
doza administrată; durează între 2 şi 3 zile;
· Creşterea logaritmică: (sinteză activă de Ac, de către plasmocite) durează circa 3 zile; în
timpul acestei perioade, Ac devin decelabili prin reacţii Ag-Ac; urmează o fază de stagnare (câteva zile),
timp în care titrul anticorpilor serici se menţine relativ constant;
· Ulterior are loc scăderea progresivă a titrului anticorpilor serici.
De regulă, tehnicile imunologice uzuale permit identificarea Ac după 5-14 zile de la stimulul
antigenic primar.
Natura anticorpilor:
· examinarea claselor de anticorpi produşi arată că primii anticorpi care apar sunt de tip IgM
(cei din clasa IgG apar câteva zile mai târziu iar nivelul lor creşte pe măsură ce nivelul IgM scade);
· în următoarele 2-3 săptămâni, în ser predomină anticorpii de tip IgG;
· în următoarele luni, eventualii anticorpi care persistă sunt de tip IgG.
17. 2. 2. Răspunsul imun secundar (RIS)
Răspunsul imun secundar apare după al doilea contact cu acelaşi antigen (sau după contacte
ulterioare). RIS are următoarele caracteristici:
· poate apărea chiar şi după administrarea unor doze destul de mici de antigen;
· latenţa este redusă la circa 24 ore; se ajunge repede, abrupt la faza de creştere logaritmică;
· anticorpii sunt de tip IgG;
· titrul Ac produşi este mult mai înalt;
· persistenţa acestora este mai lungă (Ac produşi se menţin timp mai îndelungat, luni de zile).
Diferenţa dintre RIP şi RIS este datorată în primul rând existenţei limfocitelor cu memorie. După
eliminarea Ag, în organism continuă să „circule” celule cu memorie, reacţia imună la al doilea contact cu
acelaşi Ag având caracteristicile de mai sus. Memoria imună se stabileşte din timpul RIP şi este specifică.
Determinarea claselor IgM şi IgG are o dublă importanţă practică:
· face posibilă distincţia între o afecţiune recentă şi una mai veche şi
· permite recunoaşterea unei infecţii congenitale (cu anumite excepţii).
Cunoașterea caracteristicile RIP şi RIS are importanță practică. Ne permite să înţelegem şi motivul
pentru care reacţiile Ag-Ac trebuie făcute, de regulă, „în dinamică”.
197
17. 2. 3. Succesiunea de evenimente în producerea anticorpilor
După pătrunderea antigenului şi recunoaşterea acestuia ca non-self urmează fagocitarea şi
prelucrarea de către celulele prezentatoare de antigen care sunt reprezentate în principal de celulele
dendritice foliculare, macrofage și limfocitele B.
APC, prin IgM şi IgD membranar, posedă tot ce este necesar pentru recunoaşterea epitopilor
antigenici (diversitatea rearanjării genice demonstrează un repertoriu bogat de limfocite B, estimat la
107 posibilităţi; mutaţia somatică conduce la posibilităţi mult mai mari de diversificare).
Pentru majoritatea antigenelor (în special cele de natură proteică), activarea şi etapele următoare
ale RIU necesită prezenţa limfocitelor Th CD4+ (cu intervenţia TCR, APC cu expunerea pe MHC II de
peptide antigenice, molecula CD4 şi moleculele de aderenţă).
După contactul cu antigenul și activarea completă, LTh se vor numi LThp (primitive), care ulterior
vor începe proliferarea și sinteza de IL2. Prin stimulări autocrine repetate LThp se vor diferenția în LTh0
și apoi în LTh1 sau LTh2 în funcție de mediul citokinic din jur și de citokinele produse (vezi și 11.3.1.).
Limfocitele Th2 sunt reprezentative pentru RIU (Figura nr. 1). LTh2 secretă IL-2, IL-4, IL-5 şi IL-6,
care activează LB și stimuleaza mecanismul de „switch” izotipic în genomul LB. Acest „switch” se
realizează prin rearanjarea ADN-ului, pentru sinteza Ac diferiți structural, dar cu aceeași specificitate
pentru antigen.
Limfocitele B pot fi activate şi direct, în cazul antigenelor timoindependente de origine polizaharidică,
cu epitopi repetitivi. Aceasta se realizează prin formarea unor punţi între receptorii de suprafaţă şi
determină redistribuţia Ig pe suprafaţa membranei celulare. În lipsa interleukinelor produse de LT,
activarea LB este limitată la sinteza de IgM, fără „comutarea” spre IgG.
Prima etapă constă în activarea limfocitelor B din stadiul G 0 al ciclului celular spre stadiul G1 (celula
sintetizează ARN şi creşte în volum); stimulul este reprezentat de contactul cu antigenul.
IL-4, secretată de limfocitele Th, poate transforma limfocitele B din stadiul G 0 şi G1 şi creşte expresia
moleculelor MHC. În acest stadiu LB activat exprimă molecule noi: CD23, CD34 şi CD40.
Al doilea timp corespunde proliferării policlonale a celulelor B activate, care trec din stadiul G 1 în
fazele S şi M. Această fază necesită prezenţa IL-2 şi IL-5.
Ultima fază constă în diferenţierea în celule producătoare de anticorpi - plasmocite; secreţia de IL-6
ajută procesului de maturizare iar diferitele interleukine permit orientarea izotipică spre sinteza unei
clase particulare de imunoglobuline.
Așadar, există o intensă colaborare între LB, LTh și APC atât prin contact direct cu ajutorul unor
molecule de adeziune, cât mai ales prin intermediul citokinelor, adevărați mesageri (”hormoni”) ai
imunității.
17. 2. 4. Teoria selecţiei clonale
Teoria selecţiei clonale a fost propusă în jurul anului 1950 de către McFarlane Burnet. Această teorie
afirmă că la nivelul sistemului imun există un număr imens de „capi” de clone de limfocite, fiecare dintre
aceşti „capi de serie” corespunzând unei structuri antigenice (unui anume epitop); în cadrul aceleaşi
teorii, Burnet a făcut estimarea că în lume ar exista circa 100 de milioane de tipuri de epitopi diferiţi.
Clona, aşa cum se cunoaşte, este o populaţie de celule identice din punct de vedere genetic,
descendente ale unei singure celule „mamă”.
198
Toate celulele unei anumite clone au la suprafaţă, molecule identice cu structură imunoglobulinică;
aceste imunoglobuline au rol de receptori pentru structurile antigenice (pentru fiecare antigen diferit
există un receptor diferit).
Structurile antigenice „selectează” din acest număr imens de limfocite „cap de serie” pe acelea care
au receptori complementari (configuraţie spaţială etc) şi astfel determină proliferarea şi diferenţierea lor
în celule producătoare de anticorpi. Celulele unei clone au aceeaşi specificitate pentru structura
antigenică datorită căreia au proliferat.
Clonele de limfocite care ar putea să producă anticorpi faţă de structurile proprii („self”) sunt
reprimate în timpul vieţii intra-uterine şi numai celelalte clone pot ajunge la maturitate. În lipsa acestei
represii apar boli autoimune grave, potenţial fatale.
199
LT CD8+ sunt selecţionate după specificitatea lor faţă de antigen şi activate de diferitele citokine
(IL-2, IFN-g) secretate de limfocitele Th1 activate în prealabil.
Recrutarea altor celule pentru cooperare
Prin citokinele secretate, imunitatea celulară permite recrutarea şi activarea unor celule care nu sunt
specifice antigenului:
¨ IL-2 - produsă numai de LT (în principal CD4+ şi numai într-o mică măsură de către
CD8+), are o acţiune autocrină asupra LT dar şi asupra monocitelor, macrofagelor, LT CD8+ şi a
celulelor NK;
¨ IFN-g - produs în principal de LT (CD8+ şi mai puţin din CD4+) dar şi de celulele NK,
activează macrofagul, creşte sinteza de molecule MHC II, recrutează celule NK şi le activează funcţia
citotoxică sub efectul TNF-a şi împiedică infectarea celulelor cu virusuri (acţiune antivirală).
200
numărul celulelor și/sau potențând mecanismele imunosupresoare (limocitele T reglatorii). Stresul cronic
poate perturba RI și prin promovarea răspunsului proinflamator.
2. distribuția leucocitelor: compartimentele cu un număr crescut de leucocite în timpul stresului
acut determină imunostimulare;
3. concentrația fiziologică vs. farmacologică a glucocorticoizilor și structura endogenă
vs. sintetică a acestora: hormonii endogeni în concentrație fiziologică au efect imunostimulant, în
timp ce hormonii endogeni în concentrații farmacologice și hormonii sintetici au efect imunosupresor.
4. corelația timp de acțiune al agentului stresor – timp de activare a răspunsului imun:
imunostimularea se observă când agentul stresor acționează în stadii incipiente ale activării imune, iar
imunosupresia este asociată cu stadiile tardive ale RI.
Se consideră că stresul pe termen scurt induce o redistribuție a celulelor imune în organism, funcția
imună fiind semnificativ stimulată în organe pe unde leucocitele trec în timpul stresului acut.
Un exemplu interesant este cel al unor parașutiști cărora li s-au măsurat nivelul plasmatic al
cortizolului și al celulelor LT și NK cu 2 ore înainte, și la 1 oră după săritură. Rezultatele arată o creștere
semnificativă în numărul celulelor imune înainte de săritură, urmată de o scădere dramatică la 1 oră
după, modificări concomitente cu creșterea catecolaminelor, respectiv creșterea cortizolului plasmatic.
(2)
Așadar, imediat după debutul unui stres (minute) sau în timpul unui stres de intensitate ușoară, sau
efort fizic catecolaminele determină ieșirea „soldaților” (leucocite) din tranșee (splină, plămâni) și
intrarea pe” bulevarde” (vase sangvine și limfatice). Ulterior, cortizolul induce trecerea leucocitelor din
sânge la „locurile de luptă” (piele, plămâni, tract gastrointestinal, mucoase, ganglioni limfatici).
Stresul cronic, numit și distres are drept mecanism fiziopatologic persistența RI după încetarea
acțiunii agentului stresor sau activarea repetată.
Răspunsul la stresul acut are rol critic în adaptarea organismului, hormonii de stres pregătind
sistemul imun pentru eventuale provocări (ex. rănire, infecție).
17.4.3. Interacțiunea somn – răspuns imun
Deși deprivarea de somn este considerată un factor de risc pentru sănătate, asocierea consecințelor
a fost dificilă, întrucât semnele clinice măsurabile, specifice acesteia, lipsesc. S-a constatat însă că peste
64 de ore fără somn la persoane sănătoase au consecințe cognitive marcate, dar numai câteva semne
fiziologice și neurologice minore. Similar, 9 zile de deprivare de somn au ca rezultat colapsul
iarspitalizarea devine obligatorie.
Se știe că există o relație între somn și sistemul imun, însă natura acesteia nu este foarte clară.
Unele studii au sugerat că deprivarea de somn determină un dezechilibru cronic energetic, deteriorarea
graduală a sănătății, cu scăderea activității răspunsului imun, accelerarea catabolismului, malnutriție
putând conduce la deces, în cele din urmă. Cauza morții șobolanilor deprivați de somn (3 săptămâni) a
fost sepsisul cu bacterii facultativ anaerobe, prin multiplicare excesivă ( Pseudomonas
aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae și Corynebacterium
jejikum). Translocarea bacteriilor și a toxinelor extraintestinal, sangvin, reprezintă trigger-ul unei stări
hipermetabolice și inflamatorie sistemice având ca rezultat sepsisul fără a se putea pune în evidență un
focar septic.
201
Semnele care certifică prezența unui status de imunosupresie includ absența abceselor în ciuda
colonizării cu S. aureus, absența febrei și bacteriemia primară indusă de microorganisme oportuniste,
similar cu patogenia sepsisului la pacienții imunocompromiși.
203
controlul epidemiei. Totuşi, în perioada 1990-1998, peste 150.000 de cazuri de difterie au fost raportate,
din toate statele foste membre ale URSS, înregistrându-se şi un foarte mare număr de decese.
Dar care a fost motivul şi de ce a apărut o epidemie de difterie după 1990 ?
Incidenţa difteriei în Rusia era foarte mare în prima jumătate a secolului 20; peste 750.000 de cazuri
au fost raportate doar în Rusia în anii ’50 (imunizarea împotriva difteriei a început în anumite zone ale
Uniunii Sovietice în 1920, însă abia în 1958 a fost statuată imunizarea universală a copiilor, în toată
Uniunea Sovietică). Este adevărat că în 1977, au început să fie din nou raportate cazuri de difterie, în
URSS, atingând o valoare maximă în 1984 (1.609 cazuri). Din 1978, pentru prima dată, majoritatea
cazurilor au apărut la adulţi.
Mass-media a avut un rol extrem de negativ prin atitudinea adversă faţă de imunizare. Multe dintre
bolile prevenite de vaccin aveau o incidenţă scăzută şi în acest context a apărut o „mişcare anti-
imunizare” în presă, în contextul unei perioade (1985-1990) de profundă neîncredere în guvern. După
1990, părinţii nu mai erau de acord să permită imunizarea copiilor cu vaccinuri produse în Rusia fiind
făcuţi să creadă că acestea le fac rău şi îi îmbolnăvesc. Chiar şi membri ai comunităţii medicale au avut
„ieşiri în presă” în care au exprimat părerea că aceste vaccinuri dăunează.
În plus, o parte din părinţi considerau că amânarea (nerespectarea schemelor de vaccinare,
neprezentarea la medic atunci când erau invitaţi să o facă) sau evitarea vaccinării copiilor sunt o nou-
descoperită libertate, în cadrul democraţiei instaurate odată cu dizolvarea URSS.
Epidemia apărută în anii ’90 a îngrijorat comunitatea medicala internaţională în legătură cu vaccinul
produs în Rusia. Contrar opiniilor anecdotice, studiile realizate au demonstrat că vaccinul era eficient
[este totuşi posibil ca vaccinul să fi fost transportat în condiţii improprii şi astfel să fi avut, în mod real, o
eficacitate mai mică (presupunere care nu a fost demonstrată)].
Este adevărat că şi schemele de vaccinare din URSS au suferit în anii '80 unele modificări, diferind
de schemele recomandate de OMS (ex. conţinut mai mic de antigen, creşterea intervalului între
vaccinări, renunţarea la administrarea DT la intrarea în şcoală) iar preocuparea pentru sănătatea publică
a scăzut, din diverse motive. Rata vaccinării la copii a scăzut în anii ’80, la mai puţin de 70% (mult sub
recomandările OMS).
Reacţia faţă de această epidemie s-a concentrat iniţial asupra vaccinării a cât mai multor copii dar şi
a adulţilor din grupele de risc. Vaccinarea tuturor adulţilor a fost aprobată abia în 1993. S-au făcut
vaccinări la locul de muncă dar şi vizite la domiciliu pentru vaccinarea şomerilor. Pentru a creşte rata
imunizării la copii s-a diminuat lista contraindicaţiilor şi a început să se folosească schema completă de
vaccinare. În octombrie 1994, s-a reintrodus vaccinarea copiilor la intrarea în clasa I. În 1995 - 1996,
epidemia a început să fie controlată. Dar care au fost pierderile umane şi materiale, reale, probabil că nu
vom cunoaşte, vreodată.
În timp ce apariţia epidemiei a fost unul dintre cele mai spectaculoase exemple ale intervenţiei
negative a mass-media în problemele de sănătate publică, controlul epidemiei de difterie a fost unul
dintre cele mai spectaculoase succese ale intervenţiei de sănătate publică în secolul 20.
205
bazofile) acoperite de „reagine” (în principal IgE), care eliberează mediatori chimici (histamina fiind cel
mai important şi cel mai cunoscut dintre aceştia).
Anafilaxia este un fenomen general, obţinut ca răspuns la antigene variate: toxine, proteine,
medicamente, alloantigene de transplant. Codeina, morfina, vancomicina şi substanţele de contrast
folosite în imagistică pot determina şoc anafilactoid, cu aceleaşi manifestări ca în şocul anafilactic, însă
fără participarea IgE.
Anticorpii anafilactici (reaginele) sunt anticorpi care se fixează prin fragmentul lor Fc pe receptorii
specifici exprimaţi la suprafaţa bazofilelor şi mastocitelor.
Controlul producerii de IgE este realizat de LT. LTh2 stimulează producerea IgE (sunt implicate IL-4,
IL-5, IL-10). LTh1 inhibă producerea IgE (fiind implicate IFNγ și IL-12).
Th2 (Figura nr. 1) are o acţiune autocrină, secretă IL-4 cu acțiune atât asupra LB cât şi asupra
celulei secretoare.
Sinteza de IgG4 și sinteza de IgE se află sub controlul aceloraşi citokine şi se realizează de aceeaşi
populaţie celulară. Genele pentru cele 2 tipuri de imunoglobulină sunt situate foarte apropiat una de
cealaltă, pe cromozomul 14. Mecanismul prin care sinteza de IgG4 devine independentă de cea de IgE
nu este clar elucidat, dar se pare că un rol l-ar putea juca Il-10.
Efectele diferite induse de cele 2 tipuri de imunoglobuline se datorează structurii diferite. IgE
prezintă faţă de IgG4 un domeniu constant suplimentar, o zonă balama diferită şi zone de recunoaştere
pentru ambele tipuri de receptori: FcεRI (afinitate înaltă) şi FcεRII (afinitate joasă).
IgE au un timp de viaţă mai scurt (<2 zile) comparativ cu 21-23 zile pentru IgG, iar concentraţia
acestora este foarte scăzută în serul individului normal.
Ataşarea IgE de mastocite şi bazofile (ca dimeri cuplaţi cu alergenul) duce la creşterea duratei de
viaţă a IgE de la mai puțin de 2 zile la 10 zile.
IgE nu trec de bariera feto-placentară datorită faptului că placenta nu conține FcεR. Ȋn sângele fetal
se pot găsi IgE în cantităţi sub 1UI/ml prin ataşare de FcγRI de pe macrofagele fetale. FcγRI pot
semnaliza pentru degranulare şi după cuplarea cu alte molecule (ex. lectine, Ac anti lanțt α FcγRI).
Bazofilele şi mastocitele se caracterizează prin prezenţa unor granule metacromatice, roşii după
coloraţia cu albastru alcyan, datorită histaminei şi heparinei.
Mediatorii mastocitari sunt reprezentaţi de histamină, leucotriene, prostaglandine, factorul activator
plachetar (PAF), adenozină, factori chemotactici pentru eozinofile (ECF) şi neutrofile (NCF) şi o serie de
citokine proinflamatorii (IL-1, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, GM-CSF, TNF-a, TGF-β1, IFN-g). La suprafaţa
bazofilelor şi mastocitelor sunt exprimaţi diverşi receptori, dintre care cei mai importanţi sunt FceRI,
FceRII (CD23) şi C3aR şi C5aR (CD88).
Legarea reaginelor de receptorii FceRI, FceRII iniţializează semnalizarea spre interiorul celulei,
ducând la activarea celulară.
Activarea bazofilelor şi mastocitelor se realizează prin mecanisme mediate imun şi necesită prezenţa
unui mesager secund intracelular (Ca2+ sau AMPc). Procesul de activare constă dintr-o serie de reacţii
biochimice în trepte, cu participarea fosfolipidelor membranare, activarea PKC, fosforilarea tirozinei,
toate ducând la creşterea influxului de Ca2+ extracelular alături de mobilizarea rezervelor de
Ca2+ intracelular. Rolul Ca2+ este de a iniţia eliberarea mediatorilor preformaţi şi sinteza de novoa
mediatorilor lipidici.
206
Exemplificăm efectele acestor mediatori prin histamină care produce:
· bronhoconstricţie prin acţiune directă pe receptorii H1 ai musculaturii netede traheo-
bronşice,
· vasodilataţie arterio-capilară prin contracţia fibrelor musculare netede din peretele
venulelor postcapilare,
· creşterea permeabilităţii capilare,
· creşterea motilităţii intestinale şi
· reacţie urticariană la nivel cutanat.
Mastocitele eliberează histamină şi LTD4, care vor determina edem, hipersecreţie de mucus şi
bronhoconstricţie, cu scăderea FEV1, însă eliberează şi IL-5, TNFα, care vor atrage eozinofile, limfocite,
neutrofile şi macrofage.
Aceste celule inflamatorii vor determina modificări cronice la nivelul plămȃnului: hiperplazie a
celulelor secretoare de mucus, depunere de colagen la nivelul membranei bazale şi hiperplazie
musculară netedă. Aceste modificări vor determina o hiperreactivitate bronşică, dar de data aceasta,
nespecifică (hiperreactivitate bronşică la aer rece, efort). Activitatea inflamatorie care are loc la nivelul
bronhiilor se corelează cu valoarea NO expirat (inducere iNOS la nivelul macrofagelor), cu un număr
crescut de eozinofile şi cu valori mari ale ECP (eozinophil cationic protein) în sputa indusă. Aceste teste
nu au valoare diagnostică, însa pot fi utilizate orientativ pentru aprecierea severităţii astmului.
Faptul că mastocitele intervin în ambele faze, imediată şi tardivă, o demonstrează efectul benefic pe
care îl are cromoglicatul (stabilizator de membrană, se opune degranulării) în tratamentul astmului
bronșic. Corticosteroizii acţionează numai pe răspunsul tardiv. Ei nu pot face discriminarea între
implicarea mastocitelor şi LT în inflamaţia cronică datorită faptului că inhibă ambele celule.
Dintre manifestările clinice sistemice care pot apărea în cazul unei stări de HS de tip I, sunt de
reţinut:
- şocul anafilactic, care la om se manifestă prin colaps cardio-vascular şi bronhospasm; în lipsa
tratamentului poate evolua către deces. Principalele antigene care pot declanşa şocul anafilactic sunt
înţepăturile de himenoptere (albine, viespii), injectarea unor medicamente (penicilina, miorelaxante,
ACTH etc), latexul (la infirmiere, chirurgi) şi
- edemul Quincke care cuprinde faţa, gura şi uneori faringele şi laringele, ducând la asfixie şi deces.
Dintre manifestările clinice localizate ar fi de amintit:
- manifestările localizate la nivelul mucoasei oculare sau respiratorii, având drept principali agenţi
declanşatori polenul, acarienii, praful de casă, sporii de ciuperci (conjunctivite alergice, rinite alergice
inclusiv febra de fân, traheita spasmodică şi astmul alergic);
- manifestările cutanate (urticarie, dermatite sau eczema atopică) şi
- manifestările digestive (diaree, vomismente în caz de alergie la laptele de vacă, ouă, peşte, fructe,
ţelină etc).
O tânără de 19 ani ajunge la camera de urgenţă din cauza unui atac acut de dispnee, respiraţii
şuierătoare (wheezing), înroşire (erupţie eritematoasă) generalizată la nivelul tegumentelor şi
vărsături. Era cunoscută ca suferindă de astm bronşic, ţinut sub control cu tratament
medicamentos. Din antecedentele din copilărie, avea notat în carnetul de sănătate o reacţie
„alergică” (dermatită atopică şi urticarie) după ingerarea de unt de arahide.
După spusele colegilor care au însoţit-o la spital, înainte de a-i apărea simptomele, a mâncat o
ciocolată de la un tonomat din cămin. Pe ambalaj nu apăreau notate alunele ca ingredient.
Totuşi ...
În primul rând şi cel mai important este ca reacţia de hipersensibilitate (HS) de tip I să fie
prevenită şi măsurile includ educarea pacienţilor şi a familiilor acestora cu privire la modul în care
208
să evite ingestia accidentală de alune, cum să recunoască primele semne şi simptome ale unei reacţii
„alergice” şi cum să reacţioneze în primele stadii ale unei reacţii anafilactice.
Pentru a bloca interacţiunea Th2 - IL-4 se pot folosi Ac anti IL-4 sau receptori solubili pentru
IL-4. Utilizarea receptorilor solubili IL-4 s-a încercat terapeutic, cu rezultate bune in
vitro (administrare inhalatorie), dar nu și in vivo (probabil datorită contracarării acțiunii acestora
prin intervenția altor citokine implicate în sinteza de IgE).
Sinteza de IgG4 și sinteza de IgE se află sub controlul aceloraşi citokine şi se realizează de
aceeaşi populaţie celulară. Genele pentru cele 2 tipuri de imunoglobulină sunt situate foarte
apropiat una de cealaltă, pe cromozomul 14. Mecanismul prin care sinteza de IgG4 devine
independentă de cea de IgE nu este clar elucidat, dar se pare că un rol l-ar putea juca Il-10.
209
va scădea sinteza de IgE.
Testele cutanate, prick-test, reprezintă metoda cel mai des utilizată în diagnosticul HS de tip I.
Se introduc cȃte 0,1μl din fiecare preparat antigenic de testat intradermic (de obicei se testează
25 de astfel de preparate), un martor pozitiv (histamina), şi unul negativ (soluție salină fiziologică).
Modificările cutanate apar în 5-15 min şi durează 30 minute sau mai mult. Vor fi 2 tipuri de
răspuns:
papulă, cu aspect eritematos şi dimensiuni mai mari şi care are ca mecanism reflexul de axon.
(Figurile nr. 5 și 6)
Altă tehnică ar include dozarea IgE, însă testul este mai puţin sensibil decȃt testele cutanate.
210
Un test cutanat pozitiv nu inseamnă neapărat că persoana prezintă HS de tip I, ci că există o
mare probabilitate să fie aşa. Numai un test cutanat pozitiv de mari dimensiuni (>10mm diametru)
este urmat şi de un răspuns tardiv, caracterizat prin eritem şi induratie. Răspunsul tardiv apare la
2-3 ore după injectarea intradermica a antigenului, ţine pȃnă la 24 ore şi este sugestiv pentru
inflamaţie cronică la nivelul foselor nazale, plămȃnului, pielii, datorându-se:
Testele ”patch” reprezintă aplicarea cutanată a 10μg alergen şi realizarea unei biopsii din zona
respectivă după 24 sau 48 ore. Există 3 moduri de aplicare a antigenului în cazul patch-test: injecţii
intradermice locale, plasture sau godeu. Ultima metodă are avantajul că se pot lua probe repetate
fără traumatizarea suplimentară a pielii la fiecare prelevare.
(Figurile nr. 7 și 8)
(Figura nr. 9)
Un alt test care se poate folosi este testul de provocare prin nebulizarea antigenului, cu răspuns
rapid în 20 minute constȃnd în bronhospasm şi cu un raspuns tardiv în 4-8 ore, constȃnd în
eliberare de mediatori de novo şi infiltrat celular. Răspunsul tardiv pozitiv se poate pune în
211
evidenţă prin LBA (lavaj bronho-alveolar), cȃnd se identifică nu celulele, ci produşi ai acestora
(histamina, prostaglandine, leucotriene, MBP, ECP) sau prin biposie, cȃnd se pot identifica toate
modificările patologice care pot să apară în astm (celule inflamatorii, depunere de colagen,
subţierea peretelui bronşiolelor), reunite sub denumirea de remodelare bronşică. Pentru
demonstrarea hiperreactivităţii bronşice nespecifice se fac teste de provocare cu histamină,
metacolină sau aer rece. Teoriile spun că evaporarea crescută de apă, care va răci epitelilul, ori
stimulează direct terminaţiile nervoase, ori stimulează eliberarea de mediatori din celulele locale
(histamină din mastocite).
Pe frotiul de sânge periferic se remarcă eozinofilie, iar în secreţiile nazale ale unui astmatic,
titrurile de ECP şi CXCL8 (IL-8) vor fi crecute. pH-ul vaporilor de apă în criză va fi acid.
Examenul CT al sinusurilor nazale poate arăta opacifierea acestora, situaţie întȃlnită la o treime
din astmatici.
Ca și în cazul oricărei alte patologii nu se poate rămȃne doar la stadiul de observare, nici la cel
de diagnostic, ci trebuie să se meargă la următorul nivel, identificarea unui tratament.
212
Întrebarea 1
1). Anafilaxia apare după un contact nou cu un antigen la care organismul nu era sensibilizat.
2). Ȋn HS de tip I intervin mastocite, bazofile cuplate cu Ac anafilactici care se mai numesc şi
reagine.
3). mediatorul mastocitar principal este histamina, care este un mediator sintetizat de novo.
Dintre cele 3 afirmaţii de mai sus, care este adevărată/care sunt adevărate?
A) 2
B) toate
C) nici una
D) (1) si (3)
Ȋntrebarea 2
Alegeți afirmațiile care sunt amândouă corecte și se află în relație de cauză-efect.
a). Activarea bazofilelor şi mastocitelor se realizează prin mecanisme mediate imun pentru că
necesită prezenţa unui mesager secund intracelular (Ca 2+ sau AMPc).
b). Histamina determină bronhoconstricţie la nivelul plămȃnului pentru că acţionează pe receptorii
H1 ai musculaturii netede traheo-bronşice
c). Şocul anafilactic la om se manifestă prin colaps cardio-vascular şi bronhospasm pentru că în lipsa
tratamentului poate evolua către deces
d). Polenul, acarienii, praful de casă, sporii de ciuperci nu pot determina leziuni la nivelul mucoasei
oculare sau respiratorii deoarece ei nu pot declanșa un raspuns imun.
Intrebarea 3
Care dintre următoarele nu reprezintă un test diagnostic al hipersenibilității tip I
a). prick-test
b). dozarea IgE
c). patch test
d). dozarea IgG
Intrebarea 4
Nu se folosește ca tratament al hipersensibilității tip I
a). hiposensiblizarea prin injectarea alergenului în cantităţi mici pentru o perioadă de cȃteva luni
b). un fragment antigenic conţinȃnd numai primii 20 aminoacizi din structura primară a alergenului
caruia i s-a crescut şi capacitatea de legare de IgE
c). introducerea genomului alergenului bacterian cu ajutorul unui vector în celulele gazdei, cu
modificarea răspunsului imun al acesteia
d). anticorpii monoclonali anti-IgE umanizaţi
Intrebarea 5
Pentru a găsi afirmaţia corectă ajutaţi-vă de povestirea adevărată
a).La un pacient astmatic, un atac acut, sever, de bronhospasm, în absenţa unor semne recente de
astm, nu ar trebui să ridice niciodată suspiciunea anafilaxiei.
213
b). Cel mai important este ca reacţia de hipersensibilitate (HS) de tip I să fie prevenită
c). Ȋn cazul HS tip I se evită adrenalina, antagoniştii receptorilor histaminici H1 şi H2, oxigenul,
albuterolul şi corticosteroizii
d). Pentru că aproximativ 90% din răspunsurile bifazice apar în primele 4 ore de la reacţia
anafilactică iniţială, pacienţii pot fi externaţi din camera de urgenţă înainte de atingerea a 4 ore de la
prezentare.
214
Organismul uman posedă în mod normal în sȃnge anticorpi față de Ag sistemului ABO pe care nu le
deține. În aceste condiții, Ac nu se vor întȃlni niciodată cu fără o intervenţie din afară. Ȋn cazul unei
transfuzii cu sȃnge incompatibil simptomele vor fi reprezentate de febră, hipotensiune, vomismente,
dureri la nivelul toracelui (anterior și posterior), datorită hemolizei intravasculare.
Este de menționat că o femeie însărcinată poate păstra sarcina în cazul unui făt cu o altă grupă de
sȃngepentru că Ac formaţi împotriva Ag eritrocitare sunt de tip IgM (pentameri) care nu vor trece
bariera fetoplacentară.
Sistemul Rh, însă, poate provoca sindromul hemolitic al nou-născutului. Mama, sensibilizată
împotriva Ag Rh fetale, produce Ac anti Rh fetal de tip IgG, care vor trece bariera feto-placentară.
Manifestările sindromului hemolitic al nou-născutului constau în hepatosplenomegalie, icter şi peteșii
apărute de exemplu la nivel facial. Primul copil Rh incompatibil cu mama sa, nu va suferi, însă, următorii,
da. Situaţia caracteristică este: mama, Rh- iar fătul, Rh+. Ac anti Rh+ rămân ”in amonte” de placentă.
Pornind de la aceste constatări s-a imaginat un tratament care şi-a dovedit eficienţa. Se administrează
mamei imediat post- partum Ac anti RhD, care vor distruge hematiile Rh+ materne.
Alte sisteme sangvine implicate în reacţiile posttransfuzionale, în afară de sistemele ABO şi Rh, sunt
MN, Duffy şi Kell. Formarea de IgG vor induce o reacţie hemolitică mai puţin accentuată. Eritrocitele
transfuzate vor fi preluate de fagocitele de la nivelul ficatului şi splinei, şi nu vor da o hemoliză
intravasculară sistemică. Ȋnsă poate apărea şi în acest caz necroza acută tubulară datorită eliberării
masive a componentelor eritocitare.
Pot apărea reacţii postransfuzionale îndreptate şi împotriva altor componente celulare sangvine,
însă consecinţele nu sunt la fel de pregnante ca în cazul eritrocitelor.
Reacţiile de respingere de grefă se manifestă la nivelul ţesuturilor vascularizate direct (un exemplu
de țesut care nu suferă reacţii de respingere este corneea). Cele mai severe manifestări se datorează tot
sistemului ABO, cu activarea complementului, liza eritrocitelor, recrutare de neutrofile şi trombocite. Ȋnsă
frecvente sunt şi manifestările datorate incompatibilităţii MHC.
Alte exemple:
- anemia hemolitică după ataşarea de proteinele de suprafaţă a hematiilor a unor medicamente
(penicilină, fenacetină, chinidină etc) şi iniţierea producerii şi cuplării unor anticorpi de tip IgG. HS de tip
II la medicamente se poate produce în 3 modalități diferite:
· prin ataşarea medicamentului la membranna celulară cu producerea ulterioară de Ac (cazul
penicilinei, quininei, sulfonamidelor),
· prin formarea de complexe imune circulante medicament-anticorp care se ataşează pe
membrana celulară şi
· prin inducerea producerii de autoanticorpi (alfa metildopa). (Figura nr. 11)
- apariţia unui sindrom asemănător lupusului eritematos după administrarea de hidralazină care
stimulează producerea de autoanticorpi anti-ADN;
- anemia hemolitică după infecţii cu Mycoplasma pneumoniae, datorită stimulării producerii de
anticorpi care se fixează pe hematii;
215
- cardita reumatismală din reumatismul articular acut (anticorpii faţă de streptococul beta-hemolitic
de grup A reacţionând încrucişat cu ţesutul cardiac);
- sindromul Goodpasture (după apariţia de Ac care se fixează pe membrana glomerulară renală sau
la nivel pulmonar, se activează C', rezultând leziuni grave ale membranelor celulare).
Studiul mecanismului de producere a HS de tip II a stat la baza imaginării unor tratamente ce
folosesc Ac citotoxici: Trastuzumab (antihuman epidermal growth factor receptor 2) în terapia cancerului
de sȃn; Infliximab (Ac anti-TNF) în boala Crohn; Rituximab (Ac anti-CD20) în limfoamele non-Hodgkin,
trombocitopenie autoimună, artrită reumatoidă şi lupus eritematos sistemic; Alemtuzumab (Ac anti
CD25) în leucemii şi pentru inducerea imunosupresiei la pacienţii ce suferă un transplant de celule stem.
- unei infecţii persistente (ex. lepră, malarie, hepatită virală, endocardită stafilococică);
- unei boli autoimune (ex. artrită reumatoidă, lupus eritematos sistemic, polimiozită);
- inhalării de material antigenic (ex. actinomicete în cazul plămȃnului de fermier, antigene aviare în
cazul plămȃnul crescătorilor de păsări).
Complexele imune activează o serie de căi ale răspunsului imun. Aminele vasoactive eliberate în
cadrul activării acestor căi determină retracţia celulelor endoteliale, ceea ce are ca efect creşterea
217
permeabilităţii vasculare, depunerea complexelor imune, dar şi expunerea colagenului, care va stimula
agregarea trombocitelor şi formarea de microtrombi.
Se intră într-un cerc vicios deoarece complexele imune depuse pe membrana bazală continuă să
genereze C3a şi C5a (anafilatoxine). Astfel, complementul, iniţial cu rol protectiv, determină ulterior
creşterea suplimentară a permeabilităţii capilare. Polimorfonuclearele sunt atrase şi îşi exocitează
conţinutul în loc să endociteze complexele imune (acestea nu pot fi desprinse de pe membrana bazală
vasculară). Enzimele inhibitoare serice împiedică enzimele lizozomale să acţioneze la nivel sistemic, însă
nu şi local, de aceea se vor genera leziuni tisulare locale. Eritrocitele primatelor conţin receptori pentru
C3b, importanţi pentru preluarea complexelor imune şi transportul lor către splina şi ficat, unde vor fi
fagocitate. Ȋn HS de tip III, sistemul este suprasaturat, ceea ce îi scade eficienţa. Complementul
menţine complexele Ag-Ac solubile pe calea clasică şi resolubilizează complexele Ag-Ac agregate pe
calea alternă, de aici putȃndu-se deduce rolul depleţiei de componente ale complementului sau a unor
boli ereditare (deficit C2) în patologia HS de tip III. Este importantă şi dimensiunea complexelor imune.
Cele mari sunt repede preluate de ficat şi eliminate, în timp ce complexele mici rămȃn în circulaţie o
perioadă mai lungă de timp. Un defect genetic ce determină sinteza de Ac cu afinitate joasă, va favoriza
producerea de complexe Ag-Ac mici şi deci, leziunile caracteristice HS de tip III.
Depunerea complexelor imune
Administrarea de metilsergida sau clorfenilamina (antagonişti ai aminelor vasoactive) reduce
considerabil depunerea complexelor imune prin scăderea permeabilităţii vasculare.
Depunerea complexelor mai este dependentă de regimul presional crescut şi de prezenţa
turbulenţelor. Ȋn capilarele glomerulare presiunea sȃngelui este de 4 ori mai mare decȃt în restul
capilarelor. Turbulenţe se întȃlnesc în zonele de bifurcaţie a arterelor şi în zonele de filtru vascular
(plexurile coroide şi corpii ciliari). Preferinţa pentru un ţesut sau altul poate fi dependent de sarcina
electrică a complexului imun, de gradul de glicozilare a Ac.
Fenomene experimentale
Reacţia Arthus a fost descrisă în 1903 de Maurice Arthus şi Nicholas Breton, după injectarea
subcutanată de ser de cal la un iepure hiperimunizat. Leziunile au fost maxime după aproximativ 6 ore.
Boala serică acută, descrisă în 1911 de von Pirquet, a fost studiată din nou în anii 1960, descriindu-se
zece modele de glomerulonefrite experimentale (Dixon). Deoarece complexele imune circulante (CIC) se
depozitează în ţesuturi, apare conceptul de antigen in situ. După ce complexul imun se formează în locul
respectiv sau este fixat secundar, se iniţiază (așa cum am menționat anterior) o cascadă de evenimente:
· activarea complementului şi a factorilor anafilactoizi chimiotactici C3a şi C5a;
· afluxul de neutrofile, care produc leziuni prin enzimele lizozomale şi
· afluxul de trombocite, cu generarea fenomenelor de tromboză.
Fenomenul Arthus a fost observat la iepure, cobai, şoarece etc, dar şi la om. Experimentul a fost
efectuat pe iepure prin injectarea de antigen netoxic (ex. albumină) de la altă specie, asociat cu un
adjuvant imun. După unele rapeluri, necesare uneori pentru obţinerea de anticorpi circulanţi IgG
precipitanţi, reacţia Arthus poate fi obţinută prin injectarea subcutanată a antigenului. Manifestările apar
după 2 ore, atingând maximum la 6 ore şi dispar după 24-48 ore. Constau în edem, eritem indurat,
peteşii şi uneori purpură necrotică sau chiar necroză. Leziunile de la locul injectării antigenului duc la
fixarea de igG şi C3b cu sediul perivascular sau în peretele vascular.
Boala serului
218
a) Boala serului acută. Înaintea erei antibioticelor, multe boli infecţioase erau tratate prin
injectarea de ser de cal hiperimunizat. În 1911, von Pirquet descrie complicaţiile acestei terapii sub
termenul de boală serică (febră, artralgii, vasculită cutanată), survenită la unii bolnavi după 8-12 zile de
la prima injecţie.
Injectarea unică, pe cale intravenoasă, a unei substanţe netoxice, ca serumalbumina bovină (BSA),
în cantitate mare, la animalul neimunizat (iepure), este urmată de apariţia bolii serice acute
(experimentală) cu 3 faze: 1. faza anterioară imunizării (durează 5-8 zile. BSA marcată radioactiv, scade,
iniţial brutal prin difuziune în spaţiile extravasculare, apoi după 24 de ore, lent, corespunzător propriului
catabolism); 2. faza complexelor imune (corespunde prezenţei concomitente de BSA şi a anticorpilor
anti-BSA); este boala serică cu glomerulonefrită. În jurul zilei a 5-a, concentraţia sangvină de BSA scade
rapid. Anticorpii anti-BSA liberi nu sunt decelabili decât după dispariţia BSA liberă. Detectarea
complexelor imune corespunde acestei perioade, ca şi scăderea complementului seric. Manifestările
patologice nu sunt datorate anticorpilor anti-BSA liberi şi nici complexelor imune circulante. Ca şi în
reacţia Arthus, leziunile sunt datorate acţiunii complementului, care este urmată de un aflux de
neutrofile. La animalul fără complement apare o simplă albuminurie fără glomerulonefrită); 3. faza
de restitutio ad integrum (nu mai există antigen liber sau conjugat decelabil; anticorpii anti-BSA sunt
crescuţi; manifestările clinice, în special glomerulonefrita, regresează rapid).
b) Boala serică cronică. Este dificil de reprodus la animal. Totuşi administrarea repetată a
antigenului (din 2 în 2 zile), permite producerea unei glomerulonefrite cronice extramembranare
proliferante.
Patologia umană
Principalele afecţiuni umane sunt:
· bolile comparabile cu reacţia Arthus (în care antigenul induce o reacţie locală prin difuziunea
anticorpilor IgG precipitanţi); un exemplu este boala plămânului de fermier [după contactul în timpul zilei
cu fânul mucegăit (Actinomyces thermophylus), apare la începutul nopţii (după 6 ore) o stare de asfixie
care dispare în următoarele ore];
· manifestări mai generale, cu atingerea rinichiului, articulaţiilor, pielii şi uneori a creierului;
apar leziuni de tipul glomerulonefritei extramembranare, uneori proliferative. Afecţiunile mai frecvente
sunt lupusul eritematos diseminat, crioglobulinemia mixtă, glomerulonefritele şi periarteritele
poststreptococice etc. În 2/3 din cazurile de anemie hemolitică imuno-alergică medicamentoasă se
formează anticorpi IgM anti-medicament. În aceste cazuri apar adesea manifestări generale: febră,
frison, mialgii cu dureri lombare şi uneori anurie tranzitorie, prin necroză tubulară acută.
222
18. 10. Hipersensibilitatea de tip IV
(întârziată, mediată celular)
Hipersensibilitatea de tip IV reprezintă o reacţie (mai) întârziată, care apare la 48-72 de ore după
contactul cu antigenul şi se datorează limfocitelor Th1 specifice antigenului. HS de tip IV este un tip
exagerat de răspuns imun celular.
HS de tip IV poate fi considerată ca un martor al mecanismelor protective față de germenii
intracelulari dar şi de alte substanţe chimice care se leagă puternic de membrana celulară. Totuşi,
corelaţia protecţie-hipersensibiltate nu e perfectă, în sensul că se poate ca un pacient cu HS de tip IV la
un anumit germen să dezvolte infecţii progresive cu acel patogen (ex. situația din infecțiile cu M. leprae).
Au fost descrise patru tipuri diferite de hipersensibilitate (de tip IV), dintre care ultimele trei sunt
importante în patologia umană.
- Hipersensibilitatea de tip Jones-Mote (nu are echivalent la om);
- Hipersensibilitatea de contact
Este o reacţie epidermică, care corespunde la om cu eczema de contact / dermatita de contact. În
experimentele pe animal se plasează pe piele diferite antigene, care penetrează uşor în epiderm şi se
leagă solid de celule. Cel mai frecvent se utilizează DNCB (dinitroclorbenzen), DNFB (dinitrofluorbenzen),
Oxazolina sau Clorura de picryl. DNCB este un exemplu de haptenă care sensibilizează aproape toţi
contacţii, şi pe care o putem folosi ca să stimulăm imunitatea mediată celular.
Un rol important în sensibilizare îl joacă keratinocitele şi celulele Langerhans.
Reacţia de hipersensibilitate de contact survine după ce animalul a fost sensibilizat în prealabil. După
o injecţie ulterioară intradermică sau după aplicarea antigenului pe tegument, urmează legarea
haptenei de un carrier, complexul antigenic este fagocitat de o celulă Langerhans care se va activa,
matura şi îşi va începe migrarea spre zona paracorticală a nodulilor limfactici sub acţiunea IL-1 şi TNF
secretaţi de keratinocitele agresate.
Corespunde unei infiltrări dermice şi epidermice, edemului epidermic şi eritemului apărut după 48-
72 ore, care va persista câteva zile. Absenţa reacţiei se datorează unui deficit imun celular. Sensibilizarea
prealabilă cu DNCB (ex. la fotografii) poate declanşa un şoc anafilactic la IgE.
Primele modificări apar începând cu a 6-a până la a 8-a oră după contactul cu alergenul; LT activate
şi cele cu memorie vor ajunge în circulatie şi ulterior în zona inflamată, alături de monocite, unde vor
îndepărta complexul haptenă-carrier. Ele înconjoară vasele sanguine, glandele sudoripare, glandele
sebacee, foliculii piloşi şi infiltrează epidermul. Infiltratul celular se accentuează progresiv şi ajunge
maxim spre a 72-a oră.
Infiltratul conţine celule T CD4+ (în majoritate), T CD8+, celule Langerhans, macrofage şi bazofile.
Aceleaşi keratinocite, dar şi macrofagele, vor produce ulterior PGE, cu rol inhibitor al reacţiei
inflamatorii.
LTs intervin de asemenea în terminarea reacţiei de HS (la fel ca şi ultravioletele), prin scăderea
producerii de IL-1. Ultravioletele inhibă direct şi celulele Langerhans.
Ȋn concluzie, fenomenele apar în următoarea succesiune: celulele Langherhans activează LT CD4+
cu memorie; acestea produc diferite citokine: IL-2, IL-3, IFN-g şi GM-CSF. Celelalte celule sunt recrutate
şi activează o reacţie inflamatorie în care predomină celulele mononucleare.
223
- Hipersensibilitatea de tip tuberculinic (Figura nr. 12)
Persoanele infectate cu unul din germenii (M. tuberculosis, M. leprae, Leishmania tropica etc.) / sau
care vin în contact cu substanţele chimice (beriliu, zirconiu etc.) care pot provoca hipersensibilitatea de
tip tuberculinic au LT deja activate.
În laborator, pentru sensibilizare se injectează la un animal Ag împreună cu adjuvantul complet
Freund (pregătirea animalului prin imunodepresie cu ciclofosfamidă permite şi utilizarea adjuvantului
Freund incomplet). Această fază de sensibilizare începe cu 2-3 săptămâni înainte de testarea HS.
După injectarea antigenului la animalul sensibilizat, LT specific sensibilizate migrează în jurul vaselor
sanguine (la 12 ore) iar activarea lor duce la secreţia de interleukine care recrutează alte celule
nesensibilizate. Infiltratul desparte fibrele de colagen din derm şi atinge un maxim la 48-72 ore după
injecţie. Celulele observateiniţial sunt LT [predomină T CD4+ (raport CD4/CD8 - 2/1)], ulterior încep să
se acumuleze macrofagele (atingând un maxim spre finalul celei de a treia zi de la inoculare).
Fenomenele sunt maxime la nivelul dermului dar pot atinge şi epidermul; keratinocitele exprimă la
suprafaţa lor molecule HLA DR (la 48-96 de ore după apariţia infiltratului limfocitar, fapt care va
amplifica răspunsul imun al gazdei), circulaţia aferentă şi eferentă a celulelor imunocompetente seamănă
cu cea observată în hipersensibilitatea de contact; se poate observa o infiltrare uşoară cu bazofile; în
timp se poate dezvolta o reacţie granulomatoasă.
La om se practică intradermoreacţia cu tuberculină (PPD, derivat proteic purificat, un amestec
relativ bine standardizat de antigene proteice mycobacteriene). Citirea rezultatului se face după 72 ore,
asigurând o bună iluminare a zonei examinate (de preferat lumina naturală). Se identifică existenţa unei
eventuale arii intens eritemato-violacee, circumscriind urma înţepăturii dermice. Apoi se apreciază tactil
(prin repetate mişcări într-un sens şi altul deasupra zonei de reacţie) cu pulpa inelarului, limitele unei
zone de induraţie (percepută ca fiind reliefată) şi care corespunde histopatologic infiltraţiei dermice
(edem, limfocite, macrofage, PMN), reprezentând răspunsul imun faţă de antigenul injectat. Se măsoară
şi se înregistrează „diametrul maxim” al zonei de infiltraţie (a se vedea şi anexa nr. 3). Leziunile
dezvoltate la injectarea intradermică de tuberculină se rezolvă în mod normal în 5-7 zile; persistenţa
acestora face ca leziunea să se transforme dintr-una tuberculinică într-una granulomatoasă.
- Hipersensibilitatea granulomatoasă
Este o formă mai gravă de hipersensibilitate (întârziată) de tip IV care survine atunci când antigenul
persistă şi nu poate fi eliminat. Se caracterizează printr-o acumulare şi o proliferare de macrofage, care
stau la originea granulomului care apare la 21-28 zile după sensibilizare şi poate să persiste mai multe
săptămâni. Hipersensibilitatea granulomatoasă poate succeda diferite hipersensibilităţi întârziate
precedente, în general după o perioadă de 3 - 4 săptămâni.
Elementul distinctiv al hipersensibilităţii granulomatoase este formarea de celule epiteloide, celulele
derivate din macrofage, de dimensiuni mari pe seama dezvoltarii reticulului endoplasmatic, cu rolul lor
de a întreţine inflamaţia prin secreţia continuă de TNF. Persoanele cu deficit de IFN nu dezvoltă
granuloame, însă nici nu se apără eficient împotriva tuberculozei, leprei, leishmaniozei, schistosomiazei
etc. Prin fuziunea celulelor epiteloide rezultă celule gigante. Mai sunt denumite şi celule Langhans.
Atenţie, sunt diferite de celulele Langerhans! Aceste celule gigante au mai mulţi nuclei, însă periferici,
reticulul endoplasmic este puţin dezvoltat, iar mitocondriile şi lizozomii sunt în degradare. Se pare ca
aceste celule Langhans ar reprezenta etapa finală din diferenţierea macrofagelor.
224
Reacţiile de hipersensibilitate de tip IV observate în patologia umană pot fi observate în trei grupe
principale de afecţiuni:
1. Eczema de contact care poate apărea datorită bijuteriilor care conţin nichel, produselor din piele
de animal, produselor cu săruri de crom, cremelor „solare”, compuşilor chimici de cauciuc, produselor
farmaceutice (penicilină, streptomicină, neomicină) etc;
2. Maladii infecţioase în care agenţii patogeni se dezvoltă intracelular (tuberculoză, lepră,
leishmanioză, listerioză, micoze profunde etc);
Ȋn cazul M. tuberculosis, leziunea granulomatoasă conţine pe lȃngă macrofage, celule epiteloide,
celule gigante şi LT dispuse centrifug, şi o zonă de necroză centrală, un fel de puroi numit cazeum. Ȋn
jurul întregului ansamblu se află o zonă de fibroză şi o cantitate crescută de colagen.
Ȋn cazul M. leprae, reacţia granulomatoasă se numeşte reacţia Mitsuda.
Apariţia de leziuni la injectarea de antigene splenice de la un alt pacient cu sarcoidoză unei alte
persoane cu sarcoidoză, constituie pozitivarea testului Kweim.
3. Alte maladii (sarcoidoză ciroză biliară primitivă, hepatitele cronice virale B şi C, SIDA, infecţia HIV,
poliartrita reumatoidă, reumatismul articular acut, b. Crohn etc).
225
După 2 luni bărbatul a fost reinternat cu deficienţe motorii şi febră (38,2ºC). S-a indicat din nou
examen CT; rezultatul nu a permis explicarea simptomatologiei. Recoltându-se produse din mai multe
zone, examenul bacteriologic, complet, a permis punerea diagnosticului de tuberculoză diseminată.
S-a continuat tratamentul cortizonic, dar s-a început tratamentul anti-tuberculos cu o asociere de 4
medicamente (izoniazidă, rifampicină, pirazinamidă şi etambutol).
După 4 luni simptomele au reapărut şi s-a luat decizia intervenţiei chirurgicale, pentru excizia
formaţiunii. Analiza anatomo-patologică a pus în evidenţă structura tipică pentru granulomul tuberculos
(ceea ce prin biopsia „oarbă” efectuată cu câteva luni înainte, nu s-a reuşit). Tratamentul a continuat,
dar a fost adăugată amikacina, penta-terapia anti-TB realizându-se pentru o durată de 6 luni. Pacientul
nu a prezentat reacţii adverse. După un an, au fost scoase din asocierea medicamentoasă 3
medicamente iar pacientul a primit pentru încă 6 luni (durata totală a tratamentului anti-TB a fost de 18
luni) numai izoniazidă şi rifampicină.
Discuţii
Tuberculoza cerebrală are o rată de mortalitate care variază între 5 şi 60%. Tratamentul de elecţie
este cel medicamentos, cu o durată de circa 18 luni, până la dispariţia leziunilor sau până la calcificarea
acestora. O creştere paradoxală în dimensiuni a leziunii, sub tratament, poate duce la recomandarea
intervenţiei chirurgicale de excizie a tuberculomului, aşa cum s-a întâmplat şi în această situaţie.
226
infiltraţiei dermice (edem, limfocite, macrofage, PMN), reprezentând răspunsul imun faţă de antigenul
injectat”
a). tuberculină; eritemato-violacee, indurate
b). bacil Koch; eritemato-violacee; indurate
c). tuberculină; cianotice; retractile
d). bacil Koch; cianotice; indurate
Ȋntrebarea 4 (aveți de stabilit asocierea corectă)
1). Leziunile dezvoltate la injectarea intradermică de tuberculină se rezolvă în mod normal în...........
2). Citirea rezultatului se face după...........
3). Hipersensibilitatea de tip IV reprezintă o reacţie întârziată, care apare la...............
a). 5-7 zile
b). 48-72 ore
c). 72 ore
Care este asocierea corectă?
a). 1-a; 2-b; 3-c
b). 1-c; 2-b; 3-a
c). 1-a; 2-c; 3-b
d). 1-b; 2-a; 3-c
Ȋntrebarea 5
Care dintre următoarele tipuri de HS de tip IV nu are echivalent la om?
a). Hipersensibilitatea tuberculinică
b).Hipersensibilitatea de tip Jones-Mote;
c). Hipersensibilitatea de contact
d). Hipersensibilitatea granulomatoasă
227
mecanisme. De exemplu, exoftalmia poate fi explicată prin faptul că atât glanda tiroidă şi muşchii externi
ai globului ocular prezintă un Ag comun care este recunoscut de către auto-Ac; rezultă un proces
inflamator retroocular şi protruzia globilor oculari. Aspectul de „coajă de portocală” al pielii se datorează
infiltrării de Ac subcutanat, determinând un proces inflamator la acest nivel.
Miastenia gravis este o boală neuromusculară caracterizată clinic prin hipotonie musculară
intermitentă (accentuată în efort, ameliorată în repaus) şi oboseală musculară. Mecanismul de producere
este autoimun, prin blocarea receptorilor de tip N (nicotinic) ai acetilcolinei de către auto-Ac circulanţi,
care ajung la nivelul joncţiunii musculare post-sinaptice.
Anticorpii din clasa IgG, care apar în RIS au afinitate mică, dar aviditate mare pentru Ag (şi
legăturile sunt mult mai stabile).
Marea majoritate a infecţiilor aparatului locomotor sunt produse de stafilococi (osteomielite, fasciite,
miozite etc.), însa un procent de până la 7% au ca etiologie streptococii. Într-un studiu retrospectiv la
un spital din Geneva, a fost analizat un grup de pacienţi cu infecţii musculo-scheletale dovedite clinic
prin culturi şi cărora li s-a măsurat şi titrul ASLO în dinamică în timpul internării. Doar 5 dintre cei 21 de
pacienţi urmăriţi aveau titrul ASLO crescut, iar agenţii patogeni identificaţi la aceşti pacienţi au fost: S.
pyogenes si streptococi β-hemolitici din grupurile C şi G. La restul de 16 pacienţi care aveau titrul ASLO
normal, germenii infectanţi au fost stafilococi, enterobacterii, streptococul β -hemolitic de grup B şi
bacilul piocianic. Din aceste date se constată că titrul ASLO a fost crescut doar în infecţiile streptococice
cu streptococi de grup A, C şi D şi nu în alte infecţii date de alţi germeni.
În literatura se cunoaşte că detectarea ASLO are drept scop identificarea aproape exclusivă a
infecţiilor provocate de S. pyogenes şi mai ales a sechelelor post-infecţioase precum reumatismul
articular acut, cardita reumatismală sau glomerulonefrita poststreptococică. Se dovedeşte aşadar că
titrul ASLO nu este o metodă specifică pentru detectarea infecţiei exclusiv cu S.pyogenes.
Streptolizina O este secretata de streptococii din grupurile A, C şi G şi de Streptococcus canis.
Măsurarea în dinamică a titrului ASLO este o metodă simplă şi eficientă pentru a diagnostica infecţiile cu
aceste tipuri de streptococi. Toţi dintre ei sunt implicaţi în infecţii musculoscheletale şi toţi au rămas
sensibili la penicilină. Aşadar la un pacient cu semne de osteomielită sau fasciită la care nu se pot lua
probe din produsul patologic, este recomandat să se utlizeze măsurarea titrului ASLO şi dacă acesta este
foarte mare, balanţa se înclină către o infecţie streptococică, uşor de tratat cu penicilină. Această
abordare ar fi ideală pentru a reduce administrarea abuzivă de antibiotice cu spectru larg, fiind nevoie
doar de un test de laborator simplu şi sensibil.
238
colesterol etc), determinând aglutinarea acestora prin scăderea forţelor electrostatice de repulsie dintre
particule şi formarea unor punţi de legătură.
Aglutinareaeste mai sensibilă decât precipitarea, Ag fiind o particulă şi nu o moleculă solubilă.
Anticorpii de tip IgM sunt mai aglutinanţi decât Ac de tip IgG (pentru că au mai multe valenţe). Există şi
Ac neaglutinanţi (incompleţi / blocanţi) sau care aglutinează numai la rece.
243
o ser hemolitic anti-hematii de berbec (obţinut prin injectări repetate de hematii de oaie la iepurele
de laborator, spălate cu soluţie salină fiziologică) titrat şi conservat la 4°C;
- baie de apă cu temperatură reglabilă;
- plăci cu godeuri, tuburi de hemoliză, pipete diferite etc.
Tehnica de lucru:
Aşa cum am menţionat, tehnica de lucru este laborioasă şi nu va fi prezentată în totalitate, în cele
ce urmează.
Serul de cercetat se va menţine 30 minute la 56°C, în baia de apă, pentru inactivarea C' propriu.
Aşa cum am menţionat anterior, principial, RFC are loc în 2 etape (Figura nr. 1):
o în prima etapă se pun în reacţie C', serul de cercetat şi Ag cunoscut; există 2 posibilităţi: a. în
serul de cercetat există Ac specifici, rezultând un complex Ag-Ac pe care se va fixa C'; b. în serul de
cercetat nu există Ac specifici, nu se formează complex Ag-Ac, C' rămâne liber;
o în a doua etapă se introduce în reacţie sistemul hemolitic indicator (hematii + Ac anti-hematie);
există 2 posibilităţi: a. C'nu este liber, nu are loc hemoliza, b. C' se fixează pe sistemul hemolitic, lizează
hematiile şi observăm apariţia hemolizei.
Toţi reactivii utilizaţi trebuie standardizaţi, respectiv se vor realiza:
o omogenizarea suspensiei de hematii cu eventuală etalonare prin spectrofotometrie;
o titrarea serului hemolitic;
o titrarea C' în prezenţa Ag;
o titrarea „bidimensională” a Ag şi a serului de referinţă.
În RFC „finală” se va proceda astfel:
o se diluează conform indicaţiilor din protocolul de lucru reactivii utilizaţi (serul hemolitic, serurile
de cercetat, Ag, serurile de referinţă, C');
o se repartizează în godeurile corespunzătoare serurile de cercetat, Ag şi C';
o pe o placă separată se prepară martorii (martor pentru sistemul hemolitic, martor pentru C',
martor pentru Ag, 2 martori pentru serul de referinţă, martor sigur negativ);
o plăcile se introduc până a doua zi la 4°C;
o a doua zi, plăcile se menţin la 37°C timp de 30 minute;
o se adaugă în toate godeurile sistem hemolitic;
o plăcile se menţin la 37°C timp de 30 minute;
o se pun plăcile la 4°C, până la sedimentarea hematiilor.
Există anumite diferenţe între tehnicile cantitative şi cele calitative, dar principiile sunt aceleaşi.
Interpretare:
Iniţial se verifică rezultatele apărute pentru martori (fie că este vorba de o metodă cantitativă sau
calitativă); spre ex. în cazul metodei calitative, în tubul martor pentru serul de cercetat trebuie să fie
244
hemoliză, la fel ca şi în tuburile martor pentru Ag,C' şi ser sigur negativ. În tuburile martor sigur pozitiv
şi martor pentru sistemul hemolitic, nu trebuie să fie hemoliză.
În tuburile cu serul de cercetat, dacă apare hemoliza, înseamnă că nu există Ac iar testul
este negativ (lichidul din tub va avea un aspect roşu, limpede).
Testul este pozitiv atunci când în tuburile cu ser de cercetat nu apare hemoliză, hematiile se depun
formând un „buton” în partea inferioară a tubului (în serul de cercetat există Ac). Pentru a stabili
diagnosticul final, este necesar ca RBW să fie confirmată prin reacţii specifice (vezi capitolul dedicat
genului Treponema).
Control de calitate:
Cu privire la controlul de calitate am menţionat utilizarea martorilor, pentru fiecare reacţie.
În RFC utilizată în diagnosticul serologic, Ag cunoscut va fi ales în funcţie de suspiciunea de
diagnostic. RFC cantitativă se poate utiliza pentru diagnosticul serologic al infecţiilor produse
de Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia spp., Rickettsia spp.,Treponema pallidum, Leptospira
spp., Borrelia spp., Brucella spp., diferite virusuri etc.
În scopul creşterii sensibilităţii şi specificităţii se aleg proprietăţile Ag cunoscut, o anumită
temperatură „de incubare” (de ex. 4°C în loc de 37°C în RFC Kolmer) etc. Ac fixatori de C' apar precoce
în cursul bolii astfel încât identificarea prezenţei lor poate semnifica o infecţie acută sau recentă.
245
· tratamentul / profilaxia unor boli infecţioase prin utilizarea de imunoglobuline specifice
omologe sau utilizarea unor seruri hiperimune heterologe.
246
Ultimele 2 tuburi sunt reprezentate de tubul martor pentru hematii, în care se verifică rezistenţa
hematiilor şi respectiv tubul martor pentru SLO în care se pun SLO şi suspensia de hematii.
Există şi posibilitatea de a realiza o micrometodă ASLO, reacţia efectuându-se în plăci de material
plastic cu godeuri.
Rezultatul acestei reactivităţi este reprezentat de ex. de apariţia exsudatului inflamator (care poate
fi examinat prin metode de laborator).
Aşa cum am menţionat mai sus, toate aceste fenomene sunt declanşate pentru neutralizarea activităţii
„agentului determinant” (al inflamaţiei). Fenomenele vasculo-exsudative, la fel ca şi exsudatul
inflamator, încearcă să limiteze efectele produse de agentul pro-inflamator şi să împiedice extinderea
procesului inflamator spre zonele învecinate sau la nivelul întregului organism. În cazul în care aceste
activităţi au succes, alte fenomene vor conduce la asanarea focarului inflamator. Aceste fenomene, în
ansamblu, pot determina:
- vindecarea anatomică în totalitate (restitutio ad integrum),
- vindecarea însoţită de cicatrizare sau
- cronicizarea inflamaţiei.
249
Aşa cum am aminitit, procesul inflamator este un proces fiziopatologic. Cel mai frecvent există tendinţa
către vindecarea ţesuturilor lezate. Inflamaţia devine un fenomen patologic în cazul în care sistemele de
control sunt dezorganizate sau atunci când procesul inflamator se cronicizează.
Modificările fiziopatologice apar independent de cauza inflamaţiei sau, cu alte cuvinte, indiferent de
„agentul determinant”. Chiar dacă acesta este reprezentat de un traumatism prin compresiune, o
înţepătură sau o tăietură (de ex. cu un instrument chirurgical), o arsură (indiferent de procentul de
tegument afectat), de bacterii, virusuri, paraziţi, sau este vorba de o necroză (mortificare) tisulară care
apare în cursul dezvoltării unui neoplasm (cancer) sau în urma apariţiei metastazelor tumorii primare, în
cursul procesului inflamator va rezulta sinteza şi eliberarea reactanţilor de fază acută (RFA).
Diferitele particularităţi structurale ale organismului gazdă sau ale unui anumit ţesut ar putea explica
(parţial) diversitatea fenomenelor inflamatorii identificate ca fiind produse de către acelaşi agent
etiologic. Spre exemplu, Salmonella enteritidisserotipul typhimurium produce inflamaţii proliferative la
nivelul sistemului limfatic şi respectiv inflamaţii exsudative în parenchimul pulmonar. Mycobacterium
tuberculosis, agentul etiologic al tuberculozei, produce inflamaţii alterative (la nivel pulmonar), inflamaţii
exsudative (la nivel pleural) sau inflamaţii proliferative (la nivel dermic).
În completare la răspunsul celular, citokinele sintetizate de către diferitele celule stimulate specific,
antigene, mitogeni, endotoxine etc. vor influenţa / stimula şi activitatea celulelor producătoare de
citokine, rezultând sinteza şi eliberarea de noi tipuri de citokine. Se constituie „anse de tip feed-back”
endocrine şi autocrine, care sporesc sinteza de citokine de către o singură celulă, în timp ce o singură
citokină poate acţiona asupra mai multor celule. (Figura nr. 6)
Spre exemplu, IFN-g(sintetizat şi eliberat de limfocitul T) are cel puţin trei acţiuni importante şi anume:
deviază sinteza la nivelul măduvei osoase hematopoietice spre linia monocito-macrofagică, activează
exprimarea Ag HLA de clasa a II-a la nivelul membranei macrofagelor şi creşte puterea de fagocitoză a
sistemului MM în vederea fagocitării atât a actualelor antigene, cât şi a viitoarelor complexe imune ce se
251
vor constitui în cursul procesului inflamator.
Aproape simultan, celulele endoteliale reacţionează eliberând diferiţi produşi de secreţie, precum
endotelinele (ET) şi EDRF (endothelium-derived relaxing factor). „Jocul” dintre cele două proteine
vasoactive condiţionează pentru un timp aportul local de oxigen şi nivelul acidozei. Iniţial se eliberează
local factorii vasodilatatori (EDRF) şi NO, care au drept scop creşterea fluxului sanguin local, cu creşterea
atracţiei de celule ale răspunsului imun la locul impactului cu ”agentul determinant” al procesului
inflamator. EDRF este rapid inactivată de hemoglobină şi de substanţe antioxidante (care apar în urma
stimulării activităţii PMN dar şi datorită prezenţei eritrocitelor).
Pe măsură ce debitul sanguin local creşte (determinat de sistemul kinină / bradikină), creşte şi sinteza
de EDRF (EDRF are însă o „viaţă” de numai 6-10 secunde). Vasodilataţia locală se dezvoltă până în
momentul în care celulele endoteliale, fiind comprimate de edemul perilezional, încep să sintetizeze şi să
elibereze local endoteline (ET), în special ET1. Această endotelină (care are de asemenea o „viaţă”
foarte scurtă) induce vasoconstricţie brutală şi foarte intensă, tocmai pentru scăderea debitului sanguin
şi limitarea amplitudinii răspunsului inflamator local (endotelina este considerată cel mai puternic
vasoconstrictor din organism). Rezultatul etapei de declanşare este reprezentat de răspunsul
inflamator acut, manifestat prin vasodilataţie capilară (eritem, înroşire), exsudarea proteinelor
plasmatice (edem) şi acumulare de leucocite PMN.
2.Etapa efectoare, care la rândul ei se subîmparte în trei subetape:
A) Subetapa moleculară, în care se activează:
- cascada complementului;
- sistemul de coagulare-fibrinoliză;
- diferitele căi de metabolizare ale acidului arahidonic (care provine din peretele bacterian în urma
scindării date de fosfolipază), respectiv: a) calea ciclooxigenazei prin care rezultă prostaciclină (PGI)
care determină vasodilataţie, inhibă agregarea trombocitelor şi aderarea PMN, prostaglandină (ex. PGE2)
şi tromboxan (TxA2) care determină agregare plachetară, are efect vasoconstrictor şi de creştere a
permeabilităţii capilare); b) calea lipooxigenazei, care duce la apariţia leucotrienelor, de exemplu LTD 4,
LTG4(care determină bronhoconstricţie, vasoconstricţie sistemică, vasodilataţie la nivelul microcirculaţiei)
şic)calea epooxigenazei;
(Figura nr. 7, Căile ciclooxigenazei si liopooxigenazei)
- sistemul kinină-bradikinină;
- familia citokinelor;
- superfamilia interferonilor;
- sistemul extracelular „gunoier” al actinei. Actina este o proteină care se găseşte în cantităţi mari şi este
responsabilă pentru motilitatea celulară, schimbarea formei şi mărimii celulelor (care depinde de
proprietatea monomerilor de a polimeriza). După apoptoză, actina eliberată are tendinţa de a polimeriza,
ducând la apariţia de filamente de actină în vase, cu un rezultat catastrofal (de exemplu în şocul septic,
necroza hepatică etc). Există însă şi un mecanism homeostatic ce are la bază două proteine plasmatice,
gelsolina şi proteina Gc (care sunt depăşite însă din punct de vedere funcţional în distrugerile masive).
B) Subetapa vasculară, în care au loc modificări ale calibrului vaselor mici, ale vitezei de circulaţie a
sângelui, ale permeabilităţii vaselor mici din aria tisulară lezată. Iniţial se produce vasoconstricţie, în
decurs de secunde / minute (are loc un aflux masiv de celule sanguine proinflamatorii - neutrofile,
monocite, eozinofile - sub acţiunea unor mediatori solubili eliberaţi din zona tisulară afectată, care
252
produc două categorii de efecte:
a) vasculare (dilataţie arteriolocapilară cu creşterea numărului de capilare active, hiperemie, stimularea
expresiei pe celulele endoteliale din zonă a unor receptori de adeziune intercelulară astfel încât celulele
sangiune recrutate vor adera la endoteliul vascular prin cuplaj receptorial şi în final o fază de stază
vasculară pasivă, cu hipoxie şi creşterea permeabilităţii vaselor mici) şi
b) chemotactice (celulele proinflamatorii sunt atrase către ţesutul lezionat şi activate metabolic)..
C) Subetapa exsudativă, în care se formează exsudatul inflamator (plasma exsudată, bogată în proteine
şi LDH) la care se adaugă elementele figurate extravazate, elementele celulare mobilizate local şi produşi
rezultaţi din diferite modificări locale. Prin constituenţii săi celulari şi moleculari, exsudatul asanează
focarul inflamator şi tinde să blocheze procesul infecţios la poarta de intrare, constituind bariera fibrino-
imuno-leucocitară.
24. 1. 4.Consecinţele activării mecanismelor implicate în procesul inflamator
În funcţie de cascadele activate poate rezulta un anumit tip de inflamaţie. Putem lua în discuţie diferitele
forme clinice evolutive (acută, subacută, cronică) precum şi formele anatomoclinice.
24. 1. 4. 1.Evoluţia spre cronicizare se datorează agenţilor inflamatori care au proprietatea de a stimula
în special sistemul efector timodependent, autoantigenelor sau persistenţei stimulului inflamator.
Inflamaţia cronică este din ce în ce mai mult privită nu numai ca o consecinţă a unui risc infecţios
continuu, dar şi ca o parte integrantă a multor boli neinfecţioase, cum ar fi disfuncţiile autoimune,
diabetul sau bolile cardiovasculare etc.
Astfel, nu este surprinzător că unele sisteme hormonale, cum ar fi sistemul renină-angiotensină (SRA),
care a fost descris prima dată în contextul bolilor cardiovasculare, s-a dovedit a fi factorul major de
reglare a răspunsului inflamator. (4) (Figura nr. 8)
24. 1. 4. 2.Evoluţia spre vindecare presupune:
- asanarea focarului inflamator (începe concomitent cu constituirea barierei fibrino-leucocitare şi cu
îndepărtarea resturilor celulare şi a eventualelor microorganisme care sunt „agenţi determinanţi”);
devine maximă după acumularea de leucocite PMN şi macrofage.
- vindecarea propriu-zisă începe relativ rapid în cursul procesului inflamator; vindecarea începe aproape
concomitent cu fenomenele distructive, pe care tinde să le înlocuiască pentru a conduce la una dintre
variantele evolutive menţionate anterior.
Varianta cea mai favorabilă este reprezentată de vindecarea completă, anatomică (numită şi „ restitutio
ad integrum”). Cealaltă posibilitate este reprezentată de evoluţia spre apariţia unei cicatrici
(cicatrizarea). Cicatrizarea apare în cazul unor inflamaţii însoţite de fenomene lezionale întinse, pierderi
de ţesut şi eventual de infecţii şi cronicizarea infecţiei.
24. 1. 4. 3.Aspecte anatomo-clinice:
- inflamaţii alterative în care predomină procesele distrofice şi necrobiotice (de exemplu în miocardita
difterică sau în miozita produsă de Clostridium spp.);
- inflamaţii exsudative în care predomină procesele exsudative şi care se pot subîmpărţi în inflamaţii:
a) seroase (3-5% proteine, număr scăzut de leucocite, cu eozinofile), de exemplu în pleurezia sau
meningita produse deMycobacterium tuberculosis;
b) fibroase, destul de frecvent rezultate în urma unui proces infecţios, cu acumulare de fibrinogen care
determină apariţia fibrinei şi formarea de depozite care se organizează şi duc la apariţia „aderenţelor”,
care se organizează (de ex. în pneumonia cu Streptococcus pneumoniae, în dizenteria bacteriană, în
253
miocardita difterică etc.);
c) purulente, produse de exemplu de coci piogeni, precum Streptococcus
pneumoniae, Staphylococcus aureus, Neisseria meningitidis etc., de ex. cu formarea de abcese;
d) hemoragice, de exemplu în ciumă (produsă de Yersinia pestis) sau în pneumonia hemoragică produsă
de Bacillus anthracis(extrem de gravă, însoţită de hemoptizie şi asociată frecvent cu pleurezie
hemoragică şi adenopatie mediastinală importantă).
- inflamaţii proliferative, având ca formă particulară granulomul, de aspect nodular (de ex. apărute
după infecţii cuMycobacterium tuberculosis, Treponema pallidum, diferite specii de Brucella sau datorate
prezenţei unui corp străin). (Video nr. 1, Inflamaţia acută http://www.youtube.com/watch?
v=yQwxHmn6tvw); (Video nr. 2, Răspunsul inflamatorhttp://www.youtube.com/watch?v=aIzE-XsBrcg-)
Febra
Febra (pyrexia) este un semn şi simptom medical caracterizat de creşterea temperaturii corpului o
anumită valoare (ex. peste 37,8°C; însă este important de cunoscut valoarea temperaturii bazale, pentru
fiecare subiect) datorită stabilirii unui alt punct de echilibru la nivelul centrului reglator din hipotalamus.
Se acompaniază de creşterea tonusului muscular, tremurat (frison) şi paradoxal, de senzaţia de frig.
Senzaţia de cald apare odată ce noua temperatură de echilibru este atinsă. Etimologia termenului este
dublă: din grecescul pyretos (foc)şi din latinesculfevris (febră).
Febra este o dovadăa funcţionării sistemului imun, deoarece prin această modificare de temperatură,
organismul încearcă “să distrugă” bacteriile şi virusurile. Dar infecţiile nu sunt singurul mecanism
declanșator al febrei.
De obicei nu este nevoie de tratament antipiretic. Acesta se administrează doar în cazurile în care
temperatura crește foate mult sau pentru confortul pacientului.
Hipertermia, spre deosebire de febră, nu presupune un nou punct de echilibru, ci depăşirea capacităţii
de termoreglare (ex. o zi în soare înnăbuşitor fără consum adecvat de lichide) sau supraîncălzirea (ex.
după un efort fizic foarte intens).
Temperatura se măsoară clasic la nivel anal, la nivel axilar, în cavitatea bucală, sau la nivel auricular.
Vorbim despre febră dacă temperatura intrarectală depăşeşte 37,5-38,3°C și/sau cea din cavitatea
bucalădepășește 37,7 °C (”în mare” vorbim de subfebră între 37-38°C şi de febrăpeste 38°C).
Persoanele maiîn vȃrsta au o abilitate scăzută de a genera caldură, astfel că și o temperatură nu foarte
crescută poate fi expresia unei afecțiuni grave.
Cauze posibile de febră ar fi: hemoragia intracraniană, administrarea anumitor medicamente, boli ale
țesutului colagen, distrucţii tisulare de diverse cauze (traumatisme, intervenţii chirurgicale, iradieri,
arsuri, infarcte), neoplazii, hemopatii maligne,reacţii ”alergice”, conflicte de ordin psihologic, probleme
neurologice, endocrine, metabolice sau pot fi de cauză iatrogenă (de cauză medicală).
Infecţia este ce mai comună cauză de febră.
Febra infecţioasăse instalează în: infecţii generalizate acute şi cronice fără semne de localizare
(în viroze, bacteriemii, rikettsioze, spirochetoze etc.); infecții generale cu semne de
localizare (tuberculoza pulmonară ganglionară, endocardita septică etc.);infecţii localizate
254
superficiale (celulite, plăgi infectate) sau profunde (flegmon, abces subfrenic, abces apendicular,
salpingite, pielonefrite, colecistite) etc.
Un trigger al febrei se numeşte pirogen. Pirogenul determină secreţia de PGE2, care acționează la nivelul
hipotalamusului (aria preoptică), determină un răspuns sistemic (simpatic) de creştere a temperaturii
(prin vasoconstricție, secuse ale muşchilor, catabolism crescut şi creşterea activităţii diferitelor organe
endocrine. Aceste modificări duc şi la creşterea TA. Ȋn cazul nou-născuţilor, se mai obţine căldură în
principal prin consumarea grăsimii brune perirenale. Reversul presupune vasodilataţie şi transpiraţie.
PGE2 provine din acidul arahidonic, sub acţiunea PLA2, COX-2 şi PGE2-sintetaza.
Pirogenii pot fi endogeni sau exogeni. LPZ-ul din peretele bacteriilor Gram - (precum şi alte
superantigene) reprezintă exemplul clasic de antipiretic exogen.
Pirogenii endogeni sunt citokinele. Il-1; Il-6; TNF-αsunt pirogeni majori. Alţi pirogeni: Il-8, macrophage
inflammatory protein-α, IFN α, βsi γ.
Febra evoluează în 3 stadii:
a) stadium incrementi: stadiul de creştere a temperaturii, de la cȃteva minute la cȃteva ore, zile sau
săptămȃni.
b) stadium fastigium: stadiul de temperatura maximă reprezintă perioada de apogeu a temperaturii.
c) stadium decrementi stadiul de scădere a temperaturii, de declin sau defervescenţă se
caracterizează prin creşterea termolizei.
Iată tipurile de febră, fiecare patologie caracterizȃndu-se prin una din urmatoarele:
Febra prelungită. Orice stare febrilă care persistă mai mult de trei săptămȃni reprezintă o febră
prelungită.
Febra continuăeste o febră ridicată în care diferenţa dintre temperatura matinală şi cea vesperală timp
de mai multe zile nu depăşeşte 1 grad C. Ea este întȃlnită în pneumonia francă lobară, febra tifoidă (în
perioada de stare a bolii), tifosul exantematic, osteomielită etc.
Febra remitentăeste febra ce se caracterizează prin aceea că diferenţa dintre temperatura matinală şi
cea vesperală depăşeşte 1 grad C. Ea apare în septicemii, supuraţii pulmonare, tuberculoza pulmonara
gravă, în perioada a doua a febrei tifoide.
Febra intermitentăse caracterizează printr-o alternanţă în timp de 24 de ore a temperaturii normale
cu febră mult ridicată. Cȃnd oscilaţiile devin foarte mari (ex. 3-5 grade C pe parcursul a 24 de ore) febra
foarte ridicată oscilȃnd cu temperatura normală sau chiar subnormală vorbim de febră hectică. Ea
apare în supuraţiile pulmonare, infecţii urinare şi unele septicemii etc.
Febra recurentăevoluează cu febră ridicată şi continuă timp de 5-8 zile alternȃnd cu perioade afebrile.
Ea apare în limfogranulomatoza malignă, tuberculoza pulmonară, infecţii urinare sau biliare, leptospiroze
etc.
Febra recidivantăeste o variantă de febră recurentă caracterizată prin faptul că ascensiunile termice
survin la intervale foarte variate şi îmbracă caracter de puseuri (o întȃlnim în colangite, pielite, carcinom
şi unele forme de tuberculoză etc.).
Febra ondulantăeste caracterizată prin ascensiuni termice ce se repetă periodic. Ridicarea temperaturii
este progresivă, iar defervescenţa este lentă pȃnă la afebrilitate sau subfebrilitate urmată de cicluri
repetate.
Febra de tip inverseste febra în care temperatura matinală este mai ridicată decȃt cea vesperală.
Apare în tuberculoza pulmonară gravă, supuraţii profunde şi inflamaţii cavitare etc.
255
Febra neregulatăse referă la febra care nu poate fi încadrată în nici unul din tipurile descrise şi care nu
poate fi descrisă așa cum s-a menționat mai sus. (3)
Febra de origine necunoscutăeste luată în considerație atunci când, după 1 săptămână de încercări
în a pune diagnosticul și a stabili etiologia febrei (clinic, paraclinic, alte metode de laborator), nu am
reușit să identifică o cauză pentru creșterea temperaturii.
VSH-ul
VSH reprezintă rata la care sedimentează hematiile dintr-o probă de sȃnge cu anticoagulant, într-o
oră. Ȋn mod normal hematiile dintr-o probă de sȃnge sedimentează lent datorită încărcăturii de suprafaţă
negative a acestora, care face ca celulele adiacente să se respingă cȃnd distanţa intercelulară scade sub
un nivel minim. Ȋn anumite afecţiuni care determină creşterea proteinelor de fază acută (alfa-globuline,
fibrinogen) sau creșterea valorii imunoglobulinelor, proteinele plasmatice se ataşează pe suprafaţa
hematiilor şi reduc potenţialul de suprafaţă determinȃnd agregarea hematiilor şi creşterea sedimentării
acestora.
Care sunt recomandările efectuării acestui test?
VSH poate fi folosit ca test screening în suspiciunea unor reacţii inflamatorii, infecţii, boli autoimune,
discrazii plasmocitare, dar şi pentru monitorizarea evoluţiei şi tratamentului în anumite boli (ex. arterită
temporală, polimialgie reumatică, artrita reumatoidă, reumatism articular acut, lupus eritematos
sistemic, boală Hodgkin, tuberculoză, endocardită bacteriană). De reţinut: VSH nu este un test
diagnostic pentru o anumită boală şi nu trebuie utilizat pentru screening-ul pacienților
asimptomatici.
1. Variații fiziologice:
a. În menstruație: VSH creşte în timpul ciclului menstrual, atingȃnd nivelul maxim în faza premenstruală
şi scăzȃnd în timpul menstruaţiei.
b. În sarcină: VSH-ul creşte continuu începȃnd cu a 4-a săptămȃnă de sarcină pȃnă în a 3-a săptămȃnă
256
postpartum şi atinge un nivel maxim de pȃnă la 45 mm/h în prima săptămȃnă postpartum.
c. la nou-născuţi: VSH-ul este scăzut datorită hematocritului crescut şi nivelului scăzut de fibrinogen.
d. la femei vȃrstnice (70-89 ani) aparent sănătoase VSH poate atinge valori de pȃnă la 60 mm/h.
2. Factori care determină creșterea VSH:
a. Refrigerarea sângelui;
b. Anemia: datorita numărului scăzut de eritrocite; în anemia feriprivă creşterea VSH nu corespunde
numărului de eritrocite deoarece microcitoza concomitentă încetineşte sedimentarea hematiilor;
c. Macrocitoza.;
d. Medicamentele: contraceptive orale, dextrani (datorită absorbţiei pe suprafaţa eritrocitelor),
anticonvulsivante, carbamazepină, cefalotină, ciclosporină A, dexametazonă, etretinat, fluvastatin,
hidralazină, indometacin, isotretinoin, sulfametoxazol, ofloxacină, lomefloxacină, metisergid, misoprostol,
procainamidă, propafenonă, quinină, zolpidem etc.
3. Factori care determină scăderea VSH:
a. Temperaturi >20-24o C;
b. Hiperglicemia;
c. Hiperlipoproteinemia (în special chilomicronii);
d. Hipofibrinogenemia;
e. Policitemia;
f. Leucocitoza;
g. Prezenţa de eritrocite anormale: microcite, drepanocite, echinocite, poichilocite, stomatocite,
acantocite, sferocite (prin scăderea suprafeţei necesare pentru agregarea hematiilor);
h. Caşexia;
i. Medicamentele: aspirină, aur, corticotropină, ciclofosfamidă, glucocorticoizi, hidroxiclorochină,
metotrexat, antiinflamatorii nesteroidiene, penicilamină, sulfasalazină, tamoxifen, trimetoprim etc.
Concomitent, macrofagele dezvoltă o serie de activităţi şi anume: pregătesc superantigenul, eliberează
în circulaţie monokine şi îşi expun (la suprafaţa membranei) Ag HLA de clasa a II-a (vezi și capitolul 11).
(Figurile nr. 4 și 5)
Procesul infecţios defineşte ansamblul relaţiilor stabilite între microorganism şi gazdă, apărute după
infecţie.
Starea de boală (manifestă clinic sau fără ca modificările apărute să fie exteriorizate şi constatabile de
către medicul clinician) se datoreşte interacţiunii dintre microorganism (bacterie, parazit, virus, fung,
257
prion) - gazdă şi este urmată de apariţia unor simptome (de ex. temperatură peste 39ºC, cefalee,
eliminarea unor scaune diareice etc.) şi de reacţii funcţionale din partea gazdei (de ex. stare generală
modificată, senzaţie de febră, frisoane, creşterea numărului de respiraţii pe minut, creşterea numărului
de bătăi cardiace pe minut etc). Infecţia nu este urmată obligatoriu de starea de boală, putând fi
inaparentă, subclinică sau latentă. Poate apărea şi starea de purtător şi / sau eliminator de germeni.
Datorită infecţiei pot apărea, sau nu, manifestări foarte variate în funcţie de:
- agentul infecţios (factori de patogenitate, gradul de virulenţă);
- organismul gazdă (rezistenţa specifică şi nespecifică);
- mediul extern (factori geografici, climatici, sociali, economici etc).
Manifestări subclinice
a) Infecţia inaparentă nu se asociază cu semne sau simptome şi ar putea fi decelată numai prin
examene de laborator. Spre deosebire de infecţia latentă, infecţia inaparentă este limitată în timp şi
poate contribui la crearea unei stări de imunitate (ex. infecţia cu Neisseria meningitidis, infecţii
cu Haemophilus influenzae etc).
b) Boala subclinică se deosebeşte de infecţia inaparentă prin apariţia unor tulburări funcţionale (febră,
transpiraţii, dureri etc) şi chiar a unor leziuni organice (de multe ori fără o simptomatologie distinctă /
specifică, dar există şi situaţii în care nu este decelat nici un simptom, de exemplu în formele subclinice
de hepatită virală acută).
c) Infecţia latentă este asimptomatică, agenţii patogeni putând persista timp îndelungat în ţesuturile
gazdei. După un timp variabil, infecţia latentă poate deveni evidentă clinic, de obicei în urma acţiunii
unor factori favorizanţi externi sau interni, proprii organismului (de exemplu infecţia cu Mycobacterium
tuberculosis care este un microorganism condiţionat patogen, infectează circa o treime din populaţia
globului dar produce tuberculoză la circa 8 milioane de persoane, pe an).
d) Starea de purtător de germeni se referă la bolnavul cu o stare infecţioasă, la persoana aflată în
convalescenţă, înainte de „eradicarea” infecţiei suferite dar şi la persoanele aparent sănătoase care
adăpostesc germeni patogeni (de exemplu Salmonella typhi la nivelul veziculei biliare, microorganismul
putându-se „cantona” la acest nivel după o febră tifoidă). Starea de purtător reprezintă atingerea unui
echilibru relativ între cele două verigi, de multe ori fiind însoţită de eliminarea în mediu a germenilor care
au produs infecţia şi se află în diferite focare latente (precum în exemplul de mai sus, situaţie în care
starea de purtător se elimină doar prin extirparea veziculei biliare). De exemplu, în ţara noastră apar din
când în când izbucniri epidemice („outbreak”) de febră tifoidă, după inundaţii, dacă în zona respectivă
există un purtător de S. typhi, iar condiţiile igienico-sanitare pentru prevenirea transmiterii pe calea
fecal-orală nu sunt respectate. În cursul stării de purtător există teste biologice şi imunologice care pot
certifica prezenţa microorganismelor (direct, de ex. după cultivare sau amplificare genică şi / sau
indirect).
Manifestări clinice
a) Infecţia locală, în care agenţii patogeni rămân cantonaţi la poarta de intrare şi în vecinătatea acesteia,
unde se multiplică (de exemplu în furunculul stafilococic, infecţia amigdaliană produsă de streptococul
piogen).
b) Infecţia de focar este o formă particulară a infecţiei locale. Evoluează cronic, cu manifestări locale
minime (acestea putând chiar lipsi), adesea însă cu tulburări la distanţă (subfebrilitate, mialgii, artralgii
etc.) a căror apariţie încă nu a fost complet explicată.
258
c) Infecţia regională cuprinde un teritoriu mai extins, de obicei aferent porţii de intrare, prin afectarea
vaselor limfatice şi a ganglionilor limfatici regionali (de exemplu, infecţia tuberculoasă, cu producerea de
manifestări anatomo-clinice şi paraclinice relativ caracteristice).
d) Boala infecţioasă cu manifestări clinice la nivelul întregului organism (sistemice), în care germenii
patogeni diseminează pe cale circulatorie (bacteriemie) în diferite ţesuturi şi organe, la distanţă de
poarta de intrare sau de focarul infecţios primar. Se descriu două forme:
- boala infecţioasă ciclică, cu evoluţie regulată, în mai multe etape care se succed într-un timp limitat, de
exemplu febra tifoidă produsă de S. typhi.
- septicemia (conform nomenclaturii mai vechi) are evoluţie clinică neregulată, de obicei foarte gravă,
fiind definită prin existenţa unei porţi de intrare, a unui focar septic (detectat sau suspectat),
bacteriemiei şi a unor „metastaze” septice care pot deveni focare secundare; din focarele secundare au
loc descărcări secundate de germeni în circulaţie.
Drept bacteriemie definim prezenţa pasageră de germeni viabili în sânge. Bacteriemia nu duce, de
regulă, la apariţia de metastaze septice şi nici la apariţia unui tablou clinic manifest. Bacteriemii pot
apare de ex. după extracţii dentare sau intervenţii chirurgicale pe focare septice, ca şi în multe dintre
bolile infecţioase (exemplu în pneumonia cu pneumococ, meningita cu meningococ etc; se explică astfel
utilitatea recoltării de sânge pentru hemocultură, cu toate că produsul patologic „principal” este
reprezentat de spută în primul caz şi lichid cefalorahidian în al doilea caz).
În momentul de faţă, s-a decis utilizarea noţiunii de sepsis, entitate care reuneşte existenţa unui proces
infecţios şi respectiv existenţa răspunsului inflamator sistemic. Starea de sepsis include prin definiţie
două sau mai multe din următoarele elemente:
259
ţesuturile gazdei, de exemplu în bruceloză.
Poarta de intrare
Pentru a produce infecţia (după parcurgerea etapelor menţionate anterior privind „definiţia” infecţiei) şi a
invada organismul gazdă după multiplicare sau prin intermediul unor produse toxice specifice (ex.
exotoxine), fiecare microorganism patogen utilizează una sau mai multe căi de pătrundere. Spre
exemplu, vibrionul holeric (Vibrio cholerae) pătrunde pe cale digestivă (ex. consum de apă contaminată),
se multiplică şi produce manifestările caracteristice la nivel intestinal (rolul esenţial revenind toxinei
holerice) etc.
Difuzarea în organism a microorganismului patogen de la poarta de intrare se realizează în diferite
moduri şi pe mai multe căi:
- extindere locală în suprafaţă, ex. în cazul erizipelului produs de streptococul beta-hemolitic de grup A;
- extindere în profunzime, ex. în miozita produsă de Clostridium spp. (C. septicum, sporogenes,
histolyticum etc.);
- extindere regională;
- diseminare sanguină, de exemplu în febra tifoidă (produsă de Salmonella typhi);
- diseminare pe cale nervoasă, de exemplu în infecţia cu virusul rabic.
Perioadele bolii infecţioase:
- Incubaţia reprezintă intervalul de timp din momentul infectării până la apariţia primelor semne şi
simptome ale bolii; durata incubaţiei variază în limite relativ stabile (ex. 1-5 zile în dizenterie, circa 14
zile în febra tifoidă);
- Invazia este de obicei concomitentă cu debutul bolii, care poate fi brusc (în plină stare de sănătate)
sau lent progresiv; în momentul invaziei este posibil să „surprindem” prezenţa bacteriemiei (recoltăm
sânge pentru hemocultură);
- Perioada de stare se caracterizează prin manifestările esenţiale şi deseori caracteristice ale bolii;
- Încheierea evoluţiei bolii, care se poate face prin:
1. convalescenţă, în care boala clinică a încetat şi organismul îşi recapătă treptat capacitatea de apărare
şi revine la starea anterioară bolii infecţioase respective;
2. vindecare, urmată de stabilirea unui grad de imunitate; în unele cazuri imunitatea este de durată,
chiar şi pentru tot restul vieţii; instalarea răspunsului imun, precum şi statusul imun în relaţie cu un
anumit microorganism / produs al acestuia, pot fi dovedite prin teste de laborator (reacţii antigen-
anticorp); pentru unele entităţi este stabilit nivelul de protecţie (de ex. prezenţa anticorpilor în valoare
de 0.01 UAI/mLasigură protecţie faţă de apariţia tetanosului);
3. cronicizare (uneori prin atingerea unui echilibru microorganism şi gazdă; în alte situaţii cronicizarea
poate crea probleme importante) sau
4. exitus, fie datorită agresivităţii (virulenţei) particulare a tulpinii bacteriene implicate, fie datorită
incapacităţii organismului de a reacţiona în mod eficient.
260
drepte evoluând de circa 36 de ore. Anamneza nu a identificat existenţa unor traumatisme sau a unui
efort fizic deosebit, care să justifice prezenţa acestor dureri. Medicul de gardă a indicat efectuarea unei
radiografii a articulaţiei mâinii. Rezultatul radiografic nu a pus în evidenţă aspecte patologice. Concluzia
medicului examinator a fost că este vorba de o entorsă (chiar şi în lipsa datelor anamnestice), a aplicat o
faşă gipsată şi a indicat tinerei să ia un medicament antiinflamator (diclofenac), pe cale orală (2 × 50
mg / zi, timp de 5 zile) şi să revină, la nevoie, pentru reevaluare. La circa 48 de ore de la debutul durerii
în articulaţia mâinii drepte, pacienta a decis să revină la camera de gardă pentru că prezenta lipsa poftei
de mâncare, ameţeli şi senzaţie de febră. Termometrizarea a arătat că pacienta are, într-adevăr, febră
(38,3°C).
Discuţia cu pacienta şi examenul clinic au permis înregistrarea următoarelor date: pacienta nu a avut
greţuri, vărsături, tulburări de tranzit intestinal şi nici semne care să poată fi încadrate într-un sindrom
meningean; erau prezente edem (umflătură) de culoare uşor eritematoasă (roşiatică) al articulaţiei
mâinii drepte, căldură la nivelul acestei articulaţii (în comparaţie cu articulaţia simetrică), dificultate în
utilizarea mâinii; la nivel palmar, bilateral, a fost pusă în evidenţă o erupţie cu mai multe elemente de
culoare violacee, dureroase spontan şi la palpare.
De această dată, medicul clinician a luat în considerare mai multe variante de diagnostic. Totuşi, o parte
dintre supoziţii au putut fi eliminate relativ uşor (reumatism articular acut, lupus eritematos diseminat) în
timp ce datele obţinute în cadrul unei anamneze mai riguros realizate (dar şi în contextul în care
pacienta, îngrijorată de condiţia fizică personală, a fost de acord să ofere date suplimentare) au permis
restrângerea ipotezelor la o reacţie în cadrul unei infecţii care a fost transmisă pe cale sexuală.
Examenul ginecologic a evidenţiat congestie şi eritem la nivelul colului uterin şi leucoree (secreţie
abundentă la nivel vaginal, cu aspect purulent).
S-a recoltat secreţia vaginală dar s-a realizat şi o recoltare cu un tampon fin, de la nivelul endocolului
(tamponul a fost introdus în endocol pe o distanţă de circa 1,5-2 cm).
S-a administrat „tratamentul minut” recomandat în unele dintre infecţiile cu transmitere sexuală,
respectiv ceftriaxonă (o doză, 250 mg, injectabil, intramuscular).
Examenul microscopic a relevat numeroase leucocite PMN în secreţia genitală şi un număr mai mic de
PMN pe frotiul din produsul recoltat de la nivelul endocolului.
Pacientei i s-a recomandat o internare de scurtă durată, ceea ce a acceptat.
După 36 ore, medicul de gardă din laboratorul de microbiologie clinică, examinând cultura din secreţia
vaginală a realizat frotiuri, a executat textul oxidazei şi testul superoxol şi a început testarea sensibilităţii
la antibiotice şi chimioterapice.
Diagnosticul microbiologic a fost infecţie cu Neisseria gonorrhoeae, iar diagnosticul final a fost cel de
artrită gonococică.
Rezultatul testării sensibilităţii la antibiotice (antibiograma difuzimetrică standardizată) a demonstrat o
tulpină cu sensibilitate la majoritate antibioticelor şi chimioterapicelor testate, inclusiv la penicilină.
Pentru mai multă siguranţă, deşi în literatură a fost descris faptul că „tratamentul minut” este eficient, s-
a prescris penicilină G, 1 doză la 12 ore, timp de 10 zile. În a treia zi de la internare, starea generală a
pacientei era bună, durerea articulară diminuase semnificativ, edemul şi erupţia erau abia perceptibile,
curba febrilă a înregistrat valori normale iar pofta de mâncare a revenit.
Comentarii cu privire la caz
Există statistici în literatura de specialitate internaţională care consideră că artrita gonococică reprezintă
261
una dintre cele mai frecvente cauze de artrită inflamatorie localizată la o singură articulaţie, la tineri. Nu
există date statistice relevante la nivel naţional. În aceste condiţii, trebuie să luăm în seamă datele puse
la dispoziţie cu generozitate de CDC (Center for Diseases Control and Prevention); pe site-ul CDC se
discută că 3% dintre cazurile de infecţie gonococică sunt însoţite de diseminarea N. gonorrhoeae, mai
frecvent la femei decât la bărbaţi. Infecţia gonococică se poate însoţi de diseminare, indiferent de calea
de pătrundere. Ca şi în cazul meningitei produsă de meningococ, un factor de risc este reprezentat de
deficienţe ale sistemului complement. Sindromul infecţiei gonococice diseminate include în mod clasic:
dermatită, sinovită, artrită migratorie („prinzând” eventual mai multe articulaţii).
În funcţie de localizare, diagnosticul microbiologic se poate pozitiva după cultivarea unor produse
recoltate de la nivel genital, de la nivel articular sau poate fi vorba de sânge.
O problemă care poate apărea este legată de tulpinile de gonococ rezistente la antibiotice şi
chimioterapice, ceea ce nu a fost constatat în această situaţie.
262
câteva dintre aceste cazuri a primit antibiotice, datorită faptului că intervenţiile au fost „sângerânde”. Cu
toate acestea, în urma uneia dintre aceste intervenţii (timp în care a primit o cefalosporină cu spectru
lărgit), la câteva zile de la intervenţie pacienta a început să prezinte febră (38,8ºC), transpiraţii,
oboseală şi dureri la nivelul toracelui. Numai după încă o săptămână a decis să se adreseze spitalului
(necăjită datorită prea multelor spitalizări din ultimii ani), iar la camera de gardă i s-a propus internarea,
ceea ce pacienta a acceptat.
Atitudinea a fost corectă şi susţinută de datele anamnestice, pentru că în urmă cu circa 3 ani pacienta
mai fusese internată în spitalul de profil, iar diagnosticul la acea dată a fost cel de sepsis
cu Enterobacterspp., ca urmare a unei extracţii dentare (şi de acea dată pacienta a primit antibiotice,
dar tulpina izolată s-a dovedit a fi rezistentă la toate medicamentele beta-lactamice care au fost testate
prin antibiogramă difuzimetrică standardizată, inclusiv la medicamentele administrate profilactic).
La internare, tensiunea arterială era în limite normale, dar auscultator medicul de gardă a detectat suflu
sistolic atât în focarul mitral cât şi în focarul tricuspidian, iar după câteva ore de la internare, la
contravizită, au putut să fie auscultate frecături pericardice. Datele de laborator obţinute în regim de
urgenţă au relevat leucocitoză (15.850/μl) cu neutrofilie (10.900 PMN/μl), valori crescute ale reactanţilor
de fază acută (proteină C reactivă 6mg/l, VSH 112 mm/oră, fibrinogen 526 mg/dl) şi anemie (nr. hematii
3,1×106/μl). A fost recoltat sânge pentru trei hemoculturi incubate atât în aerobioză cât şi în
anaerobioză. Prima hemocultură a fost recoltată imediat după internare. În două dintre cele trei
hemoculturi a fost izolat Enterobacterspp., tulpină care s-a dovedit sensibilă la ampicilină, gentamicină,
amikacină, ciprofloxacină, carbenicilină şi asocierea piperacilină-tazobactam. S-a decis instituirea unui
tratament cu ampicilină plus gentamicină, pentru o durată de 3 săptămâni. Nu a fost utilizată ampicilina
în monoterapie, fiind cunoscut faptul că într-o astfel de eventualitate ar fi fost posibilă dezvoltarea
rezistenţei nu numai faţă de acest antibiotic dar şi faţă de alte antibiotice (ex. piperacilină).
Temperatura a rămas ridicată, iar pacienta a menţionat că simptomele nu se ameliorează, în cursul
primelor două săptămâni de terapie. Reactanţii de fază acută au diminuat ca valoare, menţinându-se
însă peste valorile normale. Examenul clinic realizat (repetat) de către medicul stomatolog al unităţii nu a
revelat o afecţiune care să pară a fi în legătură cu evoluţia insuficient de favorabilă, sub tratament.
Totuşi, după ce mandibula a fost examinată radiologic, cu foarte multă atenţie, a fost remarcată o
situaţie patologică şi s-a presupus existenţa unui granulom care nu era cunoscut anterior.
Luând în calcul aceste noi informaţii şi solicitând un examen de specialitate la o clinică universitară cu
profil stomatologic, s-a decis extracţia dintelui situat în vecinătatea granulomului respectiv, chiuretarea
zonei şi asanarea presupusului focar de infecţie. Intervenţia stomatologică a avut rezultate foarte bune,
după 14 ore de la aceasta constatându-se diminuarea temperaturii. În următoarele 2-3 zile simptomele
s-au ameliorat semnificativ. S-a decis continuarea tratamentului antibiotic în aşa fel încât durata totală
să fie de 4 săptămâni. După a treia săptămână de tratament probele biologice au revenit la valori
normale, starea generală a fost considerată ca fiind bună iar după patru săptămâni de tratament
pacienta a fost externată, vindecată.
24. 3. 6. Farmacogenomică?
Aţi mai auzit termenul acesta? Dar farmacogenetică?
Credeţi că există vreo diferenţă? Si dacă da, ce legătură au ele cu inflamaţia?
Să vedem.
S-a estimat că genele sunt responsabile de 20-95% din variabilitatea interpersonală cu privire la
răspunsul la medicamente. Primele investigaţii pe această latură au fost făcute în 1950, constituind baza
farmacogeneticii, iar mai apoi, a farmacogenomicii. Termenii sunt parţial sinonimi. Farmagenomica
studiază efectul unui medicament în relaţie cu întregul genom, în timp ce farmacogenetica, în relaţie cu
o singură genă sau cu un anume set de gene.
Principala ocupaţie actuală a farmacogenomicii şi a farmacogeneticii este detecţia unui „profil de risc”, ce
va permite probabil, 2 eventualități:
Să luăm un caz ... alegem... boala Alzheimer. Bine, bine....dar ”Alzheimer-ul acesta” nu e o boală
neurologică? Da, foarte bine. Ȋnsă, ca și în situația multor altor boli, astăzi i se recunoaşte şi o
componentă inflamatorie.
Iată cȃteva argumente pentru a susţine componenta de inflamaţie cronică a bolii degenerative
Alzheimer:
Unii se bazează pe dovezi terapeutice, respectiv pe faptul că AINS ameliorează evoluţia (în special AINS
de tipul ibuprofen, indometacin, sulindac)
Alţii se bazează pe markeri biologici, arătând că PCR este crescută, cu valori în cele 3 quartile superioare
ale valorilor, cu 25 ani înaintea diagnosticului bolii.
Sunt luate în discuție și teste genetice, spre exemplu mutaţia genei M694 pentru gena Pyrin, care
reprezintă un factor de risc pentru boala Alzheimer pentru populaţia reprezentativă >65 ani din Italia. Şi
se pare că este factor de risc şi pentru alte boli, cum ar fi infarctul miocardic.
Iată şi cȃteva exemple concrete ale farmacogeneticii/farmacogenomicii în cadrul bolii Alzheimer, luate ca
exemplu (nu poate fi o abordare exhaustivă).
Asocierea dintre genotipul ApoE şi boala Alzheimer reprezintă una din întrebările ştiintifice ridicate de
dezvoltarea farmacogenomicii. Dar genotipul nu este numai „profil de risc”, ci şi indiciu terapeutic.
Tacrina (inhibitor de acetilcolinesteraza) se pare că încetineşte progresia bolii pentru cei care nu sunt
homozigoţi pentru ApoE4. Pe de altă parte, există şi studii cu rezultate negative privind valoarea
predictivă a genotipului ApoE. Un al doilea exemplu relevant este cel al promotorului sintezei 5-LO. Ȋn
urmă cu câţiva ani s-a observat că inhibitorii căii lipooxigenazei aveau efect numai pentru unii pacienţi,
variabilitate în strȃnsă legatură cu polimorfismul 5-LO. S-a tras concluzia că putem stabili un tratament
diferenţial, în funcţie de genotipul pacientului, concluzie extrapolată de la astm la boala Alzheimer.
265
Un alt exemplu se referă la polimorfismul TLR4, receptor ce se pare că este implicat in fiziopatologia bolii
Alzheimer şi care ar putea fi folosit pentru înţelegerea rolului profilaxiei cu antibiotice în acest caz. (9)
266
B).PCR este secretată de către adipocite și ficat în mod fiziologic, însă valori mai mari de 1mg/dL indică
existenţa unui proces inflamator.
C).VSH-ul este un test diagnostic pentru infecţie localizată sau generalizată.
D).VSH-ul reprezintă rata la care sedimentează hematiile dintr-o probă de sȃnge coagulat, într-o oră.
E).Ceruloplasmina şi amiloidul P seric nu sunt RFA (reactanţi de faza acută).
Ȋntrebarea 5:
A).Coccii piogeni, precum Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, Neisseria meningitidis nu
pot provoca inflamaţii exsudative purulente.
B).Inflamaţiile fibroase, care reprezintă acumularea de fibrinogen, cu apariţia fibrinei şi formarea de
depozite care se organizează şi duc la apariţia „aderenţelor”, nu apar în pneumonia cu Streptococcus
pneumoniae, în dizenteria bacteriană, în miocardita difterică.
C).Vindecarea propriu-zisă începe tardiv în cursul procesului inflamator.
D).Inflamaţii proliferative, având ca formă particulară granulomul, de aspect nodular, apar în infecţia
cu Mycobacterium tuberculosis, Treponema pallidum, infecția cu diferite specii de Brucella sau datorate
prezenţei unui corp străin.
E).Ȋn miocardita difterică sau în miozita produsă de Clostridium spp predomină procesele distrofice şi
necrobiotice, care corespund inflamației seroase.
Pentru a menţine homeostazia imunologică, indivizii trebuie să fie aresponsivi faţă de antigenele
proprii (numite self). Limfocitele activate de auto-antigene se distrug (inducţia apoptozei - proces
cunoscut şi sub numele de "moarte celulară programată"), sunt inactivate (inducţia anergiei) sau îşi
schimbă specificitatea (Figura 1.)
267
Figura 1. Schemă generală reprezentând posibilile mecanisme de inactivare a limfocitelor autoreactive, la nivelul
organelor limfocitare centrale cât şi în periferie. Celulele sistemului limfocitar provin dintr-o populaţie suşă ( stem),
comună limfocitelor T şi B, ce îşi are sediul în măduva hematogenă. Limfocitele T migrează în timus pentru a
268
continua dezvoltarea. Ambele seturi limfocitare sunt expuse la antigene self, pentru care unele din aceste celule
prezintă receptori. Acestea au potenţial auto-reactiv, astfel încât, fără mecanisme de reglare, ar putea duce la
apariţia unor boli autoimune. Mecanismele implicate în reglarea răspunsului limfocitar sunt: apoptoza, anergia,
editarea de receptori, generarea de limfocite reglatorii şi supresia de către acestea a răspunsului imunitar.
Toţi indivizii moştenesc, în mare, aceleaşi gene care codifică receptorii antigenici. Rearanjarea
acestor gene duce la generarea unui imens repertoriu imunologic ce permite organismului să răspundă
faţă de o paletă foarte largă de antigene. Pentru a ajunge la acest nivel de variabilitate, rearanjarea
genelor codante are loc la întâmplare. (NB: Doar genele codante pentru receptorii antigenici suferă
procesul de rearanjare, nu întreg genomul limfocitar.)
Invariabil, unii din receptorii generaţi vor recunoaşte auto-antigene. Celulele ce poartă
aceşti receptori trebuie eliminate, sau organismul riscă să iniţieze un răspuns împotriva propriilor
ţesuturi.
Rreactivitate faţă de auto-antigene se numeşte autoimunitate.
Imunogenitatea antigenului este dictată de caracteristicile fizico-chimice ale antigenului cât şi de
condiţiile în care acesta este prezentat sistemului imun. Deducem de aici că nu toate antigenele sunt
capabile să inducă un răspuns imun.
După acest criteriu, putem clasifica antigenele ca fiind:
Antigene imunogene - antigene capabile să inducă un răspuns imun.
Antigene tolerogene - antigene capabile să inducă toleranţă imunologică.
Calităţile antigenice care dictează statul tolerogen sau imunogen sunt rezumate în Tabelul 1:
269
Toleranţa poate fi indusă în limfocite imature în organe limfoide centrale ( toleranţă centrală), sau
în limfocite mature în organe periferice (toleranţă periferică).
Toleranţa centrală reprezintă un proces intricat cu maturarea limfocitară. În cadrul acestuia,
limfocitele imature din organele limfoide centrale devin incapabile sa răspundă la auto-antigene
prezentate. Aceasta se referă la:
- antigene exprimate ubicuitar
- antigene circulante
prin expunerea acestora pe celule specializate în timus (antigenele poartă numele de timo-dependente)
sau captate direct de LB în măduva hematogenă (antigene timo-independente). Toleranţa centrală nu
este un mecanism perfect şi necesită consolidare prin mecanismele toleranţei periferice (unele
antigene sunt exprimate numai în ţesuturile periferice).
270
În timpul dezvoltării, toate limfocitele ce se dezvoltă în organele limfoide centrale trec printr-o fază
în care sunt expuse doar la auto-antigene. Astfel că, în timus, limfocitele T care recunosc cu afinitate
crescută un astfel de auto-antigen sunt distruse.
Pentru a asigura o selecţie cât mai bună a limfocitelor, este necesar ca în această etapă limfocitele
să întâlnească cât mai multe antigene self. Pentru a facilita acest deziderat, timocitele exprimă antigene
"periferice" după inducţia factorului de transcripţie AIRE – AutoImmune REgulator. Trebuie reţinut că
(aproape) toate celulele din organism conţin molecule identice de ADN. Astfel, sub acţiunea promoterilor
corecţi, celulele pot exprima orice antigen prezent în organism.
271
Figura 2. Răspunsul în urma interacţiunii celulelor sistemului imun aflate în diferite stadii de activare.
În lipsa unor semnale de activare date de inflamaţie, macrofagele şi limfocitele imature imunologic vor
conduce la toleranţă.Celulele APC mature sunt caracterizate de prezenţa pe membrana lor a ligandului
costimulator numit B7. Celulele LT mature prezintă pe membrană receptorul CD28, iar din interaţiunea
lor, se transmit semnale stimulatoare, rezultând în activarea şi proliferarea LT. În absenţa uneia dintre
cele două molecule, se induce anergia. LT imature prezintă, în loc de CD28, o moleculă inhibitoare,
numită CTLA4. Funcţia moleculei CTLA4 este de fosfatază, cu rolul fiziologic de a contra-regla răspunsul
imun.
273
intracelulare şi fragmentarea ADN.
Deşi caspazele pot induce apoptoza separat, cele doua mecanisme se autopotenţează. Caspaza 8
activează molecula Bid care activează şi calea mitocondrială de apoptoză. (Figura 3)
274
Figura 4. Schemă a mecanismelor implicate în toleranţa limfocitelor B, centrală şi periferică.
Scopul unui răspuns imun bine-reglementat este să apere gazda de patogeni, fără a cauza distrugeri
ţesuturilor organismului.
275
Aceste populaţii Treg revin la normal la scurt timp după încheierea sarcinii. Controlul acestui status imun
pare sistemic, întrucât pierderea sarcinii duce la revenirea la statusul imun normal [1]. Incubarea
culturilor splenice cu alo-antigeni, a dus la o activare slabă [2]. În timpul sarcinii, timusul produce
cantităţi mari de limfopoietină, ce face ca celulele dendritice placentare să transforme LT CD4+ în
fenotip CD25+ foxP3+, capabile de secreţia IL-10 [3].
276
întâlnite în cadrul limfoamelor, cu consecinţe grave.
În urma eliminării antigenelor, limfocitele suferă o fază de contracţie, în care majoritatea celulelor care
răspund la stimulul antigenic sunt pierdute. Faza de contracţie este în principal datorată morţii
programate a limfocitelor, care, în lipsa semnalelor de supravieţuire din mediu, activează un program
apoptotic. Antigenele, semnalele costimulatoarea şi citokinele dezvoltate în focarul inflamator au ca
funcţie blocarea semnalelor pro-apoptotice şi permit supravieţuirea limfocitelor atâta timp cât provocarea
antigenică există.
Se consideră că majoritatea clonelor generate în faza de expansiune sunt sortite a deveni limfocite-
efector, cu viaţă scurtă. Spre deosebire de limfocitele-efector, în cadrul răspunsului imun se generează
şi limfocitele-memorie. Acestea sunt silenţioase din punct de vedere funcţional şi au o viaţă lungă, fiind
capabile să răspundă repede în cazul întâlnirii antigenului faţă de care sunt sensibile.
CLTA-4 începe să fie exprimată în cantităţi mari după 3-4 zile de la activarea limfocitară. Astfel, este
posibil ca CTLA-4 să joace rolul unui stimul fiziologic de oprire a sistemului imun. Această moleculă
competiţionză direct cu CD28 pentru a se lega de B7 de pe APC (blocarea semnalului costimulator). Un
alt mecanism de acţiune îl reprezintă recrutarea de fosfataze, care defosforilează regiunile ITAM ale CD3
şi ζ, blocând semnalul TCR. Alte molecule de inhibare a răspunsului imun au fost descrise, dintre cele
mai studiate fiind PD-1. (Figura 6)
277
Figura 6. Inhibiţia semnalelor B7 şi TCR prin exprimarea în număr mare a CTLA4 la câteva zile de la
activarea limfocitară.
Antibody feedback
Anticorpii IgG inhibă activarea limfocitelor B prin formarea de complexe antigen-anticorp (CAA) cu
antigene polivalente. CAA se cuplează, prin porţiunea Fc a anticorpilor cu receptorul specific de pe
limfocite B, FcγRIIB (sau CD32). Aceşti receptori conţin secvenţe care, odată fosforilate, recrutează
fasfataze (SHIP). Prin legarea simultană
Una din consecinţele inflamaţiei este fibroza tisulară. În lipsa unei controlări judicioase a semnalelor
ce întreţin inflamaţia şi răspunsul imun, organismul ar suferi leziuni induse de aceste mecanisme de
apărare. Ca urmare a citokinelor secretate în focarul inflamator, fibroblastele devin active metabolic,
ducând la producţia şi secreţia de colagen. În cazul inflamaţiei moderate, ca cea întâlnită într-o stimulare
normale a sistemului imun de către un agent patogen comun, fibroza este minimă iar citoarhitechtura şi
fiziologia tisulară rămâne fără consecinţe – un astfel de grad de fibroză este fiziologică; în cazul
inflamaţiei severe sau cronice, fibroza este importantă şi duce la disfuncţii organice profunde. Unul din
mecanismele care rămân încă mult investigate sunt translaţia epitelio-mezenchimală prin care, tot sub
278
influenţa produşilor inflamatorii, celulele epiteliale trec în fibroblaşti sau miofibroblaşti care sunt
responsabile de fibroză [4]. Este lesne de înţeles că aceste modificări sunt cu atât mai importante în
organele parenchimatoase ca plămânul, rinichiul şi ficatul în care epiteliile înalt-specializate au rol foarte
important. Pierderea masei epiteliale induce disfuncţii severe ale funcţiei acestor organe.
În prima parte a manualului am prezentat datele de bază, necesare oricărui diagnostic microbiologic
(direct sau indirect).
Având la bază aceste cunoştinţe, în partea specială vom aborda fiecare gen în parte, urmărind o serie de
noţiuni pe o schemă asemănătoare (de menționat că acest stil poate fi util indiferent de etiologia
bacteriană, fungică, parazitară sau virală, cu anumite particularități).
Dorim să subliniem că în ”viața reală”, pe măsura acumulării cunoștințelor și experienței în practica de zi
cu zi, fiecare va putea să ajungă la o modalitate de abordare optimă.
În fiecare capitol vom exemplifica modul în care se poate face diagnosticul de laborator, folosind o
schemă generală de diagnostic (prezentată în capitolul 27) pentru infecţiile produse de principalele
microorganisme studiate.
Considerăm că utilizarea în mod repetat a unei scheme clare permite o mai bună fixare a cunoştinţelor
precum şi atingerea obiectivului stabilit: reţinerea unor principii utile, indiferent de specialitatea care a
fost / va fi aleasă ulterior.
Microbiologia este, după părerea noastră, o ştiinţă cu foarte mare aplicabilitate practică. Elementele
de bază ale microbiologiei sunt necesare şi utile pentru toţi cei implicaţi în sistemul sanitar; cunoaşterea
acestor elemente de bază ar putea preveni o serie de anomalii şi erori care uneori sunt dezastruoase
(aşa cum s-a întâmplat spre exemplu într-o maternitate în care o serie de nou-născuţi au decedat
datorită unor infecţii de spital/nosocomiale).
280
Dacă în urmă cu circa 40 de ani, la nivel internaţional a început să se considere (în mod absolut
eronat) că problemele legate de bolile infecţioase sunt din ce în ce mai puţin importante (eroare carea
creat şiîncă mai creează probleme în sănătatea publică la nivel naţional şi internaţional), în ultimii
13-14 ani (în special începând cu anul 1998) s-a dovedit, concret, că bolilor infecțioase trebuie să li se
re-acorde importanţa cuvenită.
Totuşi, dorim să subliniem faptul că prima încercare (reuşită) pentru reforma sistemului de
supraveghere a bolilor infecţioase a fost înregistrată în perioada 1990-1991. Echipa formată atunci,
echipă care a început adevărata supraveghere pentru sănătatea publică, a fost din păcate
distrusă în anul 1992, arătând încă o dată influenţa negativă a politicului în sănătate.
Din anul 1999 România face parte (ca membru fondator) din Reţeaua de supraveghere a bolilor
transmisibile în Balcani. În anul 2000, a fost organizată una dintre cele mai importante întâlniri cu scopul
armonizării supravegherii bolilor infecţioase în Europa (Consensus Meeting on Surveillance of Infectious
Diseases, Grottaferrata, Italia, 7 aprile 2000). Prezentarea pe care unul dintre coordonatorii prezentului
281
volum a făcut-o cu acest prilej, discuţiile care au urmat în „ateliere de lucru”, întâlnirile cu factori de
decizie ai Organizaţiei Mondiale a Sănătăţii, iniţiativa organizării unei reţele de supraveghere a bolilor
infecțioase/transmisibile în ţările din Europa Centrală şi de Est (întâlnire plenară pe care am organizat-o
în decembrie 2000, la Bucureşti, prima şi singura de acest nivel în perioada 1990-2007, neegalată până
în prezent) au dus la construirea unui proiect de reformă în domeniul supravegherii bolilor transmisibile
cu sprijin european (Phare) pe care l-am gândit în perioada mai-octombrie 2000, l-am scris în perioada
octombrie-noiembrie 2000 (ajutat pentru finalizare de colegii de la Direcţia de Integrare Europeană şi
Programe de Sănătate din Ministerul Sănătăţii) şi care a fost aprobat la „data istorică” de 14 noiembrie
2000.
Finanţarea a fost de circa 5 milioane EUR (circa 4 milioane EUR fonduri nerambursabile, Phare).
Implementarea fondurilor pe care le-am câştigat în anul 2000 a avut loc în perioada 2003-2004, după
opinia noastră mai târziu decât a fost cazul şi cu o performanţă mai scăzută în comparaţie cu cea care ar
fi fost atinsă de echipa condusă (în perioada 1999-2000) de unul dintre coordonatorii prezentului
manual, în acelaşi timp autorul proiectului.
Chiar dacă reprezintă măsuri pentru prevenirea unor maladii virale (şi nu bacteriene sau fungice),
vom mai aminti, dintre măsurile luate în ultimii ani, îmbunătăţirea programului de vaccinare împotriva
infecţiilor cu virusul hepatitei B, în anul 1999. Vaccinarea nou-născuţilor avea deja o „vechime” de 4 ani,
dar în 1999, prin politica dusă în domeniul sănătăţii publice, a fost inclusă şi vaccinarea copiilor din clasa
a III-a, vaccinarea tuturor elevilor din anul I de la şcolile sanitare postliceale şi respectiv a studenţilor din
anul I din facultăţile de medicină şi stomatologie. Ulterior, cohortele de copii vaccinaţi „apropiindu-se”, a
început vaccinarea tinerilor aflaţi în clasa a XII-a şi astfel, nu numai viitorii medici sau asistenţi medicali
au beneficiat şi beneficiază de această metodă profilactică. Politica de vaccinare a permis ca în numai
câţiva ani, un mare număr de generaţii de copii şi tineri să fie vaccinate faţă de o infecţie care devenise
endemică la nivelul anilor ’90.
Dacă până în anii 2000 au existat foarte bune relații de colaborare cu OMS și CDC, Atlanta, acum
principala colaborare are loc cu ECDC, Stockholm. Bazele relaţiilor cu ECDC au fost puse în perioada
2005-2007, atât în misiuni comune [investigarea izbucnirilor epidemice de gripă aviară, evaluarea
epidemiei de rujeolă (datorată acumulării de persoane susceptibile în perioada 2001-2004),
evaluarea sistemului de supraveghere al bolilor infecţioase în general şi al infecţiilor cu transmitere
sexuală în particular etc.], cât şi prin participarea experţilor români la întruniri internaţionale pe teme
microbiologice sau epidemiologice.
Odată cu integrarea României în UE a devenit posibilă şi pregătirea specialiştilor români, prin includerea
României în sistemul de pregătire în scopul supravegherii bolilor infecțioase la nivel european,
participarea (începând cu anul 2007) ca membru cu depline drepturi în reţelele europene privind
supravegherea bolilor infecţioase, în reţelele care discută viitorul microbiologiei sau epidemiologiei la
nivel european etc. Începând cu anul 2007, cetăţenii români pot participa şi participă la modulul complet
de pregătire în domeniul epidemiologiei, la nivel european (European Programme for Intervention
Epidemiology Training, EPIET).
282
Fiecare dintre aspectele menţionate are o strânsă legătură atât cu microbiologia, cât şi cu sănătatea
publică şi merită a fi cunoscute atât de către medicii cât şi de viitorii medici care activează în sistemul
sanitar românesc sau la nivel european.
Orice investigaţie de laborator este precedată de studierea elementelor clinice, ulterior discuţiei cu
pacientul sau aparţinătorii acestuia (anamneză). Fără un examen clinic aprofundat şi fără evaluarea
zilnică a evoluţiei din punct de vedere clinic şi paraclinic a bolii, nici laboratorul de microbiologie modern
nu poate fi utilizat la nivelul posibilităţilor actuale. Dorim să subliniem faptul că în scopul diagnosticării
bolilor infecţioase au fost puse la punct numeroase tehnici de laborator, metode paraclinice, precise şi
obiective, dar utilitatea lor este maximă atunci când rezultatele sunt interpretate în contextul clinic şi
epidemiologic.
283
de fiecare oră, câştigată sau pierdută. În cazul apariţiei unui caz de holeră, lipsa obţinerii informaţiilor
necesare (anamnestice), lipsa orientării către ipoteza diagnostică, lipsa recoltării, examinării
coprocitogramei (element esenţial = lipsa leucocitelor) şi însămânţării produsului patologic pe apă
peptonată alcalină vor putea crea probleme atât pentru pacientul respectiv (evoluţia putând fi severă în
lipsa instituirii rapide a măsurilor de re-echilibrare hidro-electrolitică) cât şi din punct de vedere al
diseminării infecţiei (1) (de ex. în cazul în care această situaţie ar apărea în Delta Dunării, în condiţii
igienico-sanitare precare).
2. Datele obţinute în vederea diagnosticului trebuie privite ca un tot unitar; diagnosticul de boală
infecţioasă trebuie să rezulte din totalitatea datelor clinice şi a celor de laborator considerate şi
interpretate unitar. Nu pot fi absolutizate nici posibilităţile clinice şi nici cele ale laboratorului. Metodele
de laborator, luate separat, nu permit punerea diagnosticului, dar executarea corectă a manoperelor de
laborator reprezintă o condiţie sine qua non pentru un diagnostic corect şi util.
Este deosebit de important ca, în momentul în care luăm în calcul un diagnostic din sfera bolilor
infecţioase, să nu excludem şi alte etiologii posibile. De exemplu, o pacientă în vârstă de 51 de ani se
prezintă pentru apariţia recentă a unor leziuni eritematoase (Figura nr. 1).
Date din anameză (tratament cu etoricoxib) corelate cu lipsa decelării altor leziuni similare la examenul
clinic obiectiv, au condus către diagnosticul de eritem fix – reacţie adversă rară la administrarea de
etoricoxib (2). Acest caz ilustrează ponderea datelor anamnestice în formularea unei ipoteze diagnostice.
3. Este indispensabil să se stabilească diagnosticul etiologic în toate maladiile infecţioase, însoţit
de testarea sensibilităţii la medicamentele antimicrobiene pentru tulpina izolată, având în vedere
utilitatea şi importanţa tratamentului antimicrobian, precum şi actualitatea problematicii referitoare la
rezistenţa la antibiotice şi chimioterapice (3). Anamneza trebuie realizată cu rigurozitate; aprecierea
statusului imunologic poate avea o contribuţie esenţială; efectuarea unui examen clinic minuţios
constituie o altă condiţie a unui diagnostic complet. Pentru medic (dar şi pentru pacient) contează toate
datele obţinute prin examenul obiectiv; nici un element nu trebuie neglijat:
- faciesul bolnavului (facies = aspect caracteristic, corelat cu boala de care suferă o anumită persoană),
postura şi unele aspecte particulare;
- febra/curba termică (cu toate caracteristicile ei); trebuie folosită termometrizarea şi nu „senzaţia de
febră” (vezi și subcapitolul 24.1.);
- modificările apărute la nivelul mucoaselor şi la nivel tegumentar;
- semnele de insuficienţă respiratorie acută;
- semnele care relevă un dezechilibru hidro-electrolitic şi acido-bazic;
- modificările neurologice şi psihice etc.
În interpretarea curbei termice, este important să evaluăm urmatoarele aspecte:
magnitudinea febrei,
frecvenţa şi durata episoadelor febrile,
recurenţa acestor episoade (cu/fără periodicitate),
relaţia dintre puls şi temperatură şi patternul de remisie a episoadelor febrile (4) etc.
Administrarea de antibiotice şi/sau antipiretice poate altera aspectul curbei termice (5), dar cu toate
acestea, în cazurile tipice, este important de decelat prezenţa unor pattern-uri febrile aşa-zise „clasice”.
284
De exemplu, febra terţiară se suprapune peste ciclul de reproducere asexuată al Plasmodium
falciparum, P. vivax, P. ovale pe când febra cuaternară este înalt sugestivă pentru P. malariae(6).
Totodată, febra continuă poate fi întâlnită în patologiile de etiologie rickettsiană iar un pattern bifazic
poate semnala febra Dengue (5).
4. Folosirea corectă a datelor care pot fi oferite de către laborator constituie un alt aspect foarte
important. Este necesar ca fiecare medic clinician să ştie ce analize să solicite, ce produse se recoltează
de la bolnav, când şi cum să le recolteze, cum să le expedieze / pregătească pentru expediere către
laborator. Sunt de menţionat şi reţinut următoarele reguli:
- produsele se recoltează înainte de administrarea tratamentului antimicrobian;
- se trimite laboratorului o cantitate suficientă de produs pentru examinat;
- produsul trimis trebuie să fie reprezentativ pentru boala respectivă (de exemplu, spută şi nu salivă în
infecţiile respiratorii inferioare);
- produsul trebuie recoltat în perioada în care probabilitatea decelării agentului etiopatogen este maximă
(de exemplu, recoltarea pentru hemoculturi se face, pe cât posibil, în timpul unui episod febril);
- produsul examinat nu trebuie contaminat cu alţi germeni în cursul recoltării sau al transportului
(recoltare şi transport în condiţii aseptice) (7);
- expedierea către laborator se face în condiţiile de conservare cerute pentru fiecare produs în parte
(trebuie să existe recomandări specifice, în detaliu, la îndemâna medicilor);
- se solicită examinarea imediată a produselor transmise către laborator;
- se urmăreşte, în timp, apariţia rezultatelor şi „se ţine legătura” cu colegii din laborator.
Însă, pentru ca datele de laborator să fie corecte este strict necesară respectarea unei anumite conduite
în laborator, utilizarea judicioasă a diferitelor aparate şi echipamente de laborator şi implementarea
controlului de calitate (intern şi extern) (a se vedea anexa nr. 5).
5. Trebuie să existe o colaborare strânsă şi continuă între clinician şi specialistul de laborator. Este
necesară o informare (care să includă aspecte rezultate în urma anamnezei şi elemente clinice) a
medicului de laborator făcută de către clinician (direct sau cel puţin prin telefon) pentru orientarea
cercetărilor în laborator şi pentru alegerea celor mai bune metode de identificare a agentului etiologic. În
acelaşi timp, laboratorul informează clinicianul pe parcurs în legătură cu datele preliminare obţinute.
1. Recoltarea şi transportul produsului patologic (cât mai aproape de debutul bolii, înainte ca
pacientului să i se fi administrat antibiotice sau chimioterapice, cât mai rapid şi corect din punct de
vedere al tehnicilor utilizate, respectând toate normele de asepsie şi antisepsie, prelevând un anumit
produs patologic în funcţie de manifestarea clinică în cazul respectiv, de exemplu urină în cazul unei
infecţii urinare, materii fecale în cazul dizenteriei, spută în cazul tuberculozei sau aspergilozei, scuame în
cazul unei micoze cutanate superficiale etc) (vezi anexa nr. 6).
286
Neelsen. Frotiurile se examinează la microscopul optic, iniţial cu obiectivul 40× pentru o analiză mai
generală, pentru stabilirea câmpului microscopic sau a zonei „de interes”, apoi cu obiectivul de imersie.
Se notează prezenţa diferitelor celule (eventual modificate faţă de normal, „burate” de microorganisme),
prezenţa celulelor inflamatorii (dovada reactivităţii organismului, ex. leucocite, surprinzând eventual
fenomenul de fagocitoză), precum şi eventuala prezenţă a microorganismelor (bacterii, levuri,
pseudofilamente, micelii), care va fi interpretată cu precauţie, în contextul dat. Chiar dacă examenul
microscopic este de cele mai multe ori un examen orientativ, trebuie realizat de fiecare dată, cu
rigurozitate, în anumite situaţii putând fi foarte important şi foarte util.
Atunci când produsul recoltat este reprezentat de sânge, urină sau materii fecale, de regulă nu se
realizează frotiuri fixate şi colorate. Spre exemplu, în cazul materiilor fecale, se va face o
coprocitogramă, un preparat proaspăt (nativ) între lamă şi lamelă, căutându-se în special prezenţa
leucocitelor (dar şi a unor structuri care pot da anumite informaţii cu privire la funcţionalitatea tractului
digestiv). În cazul suspicionării unei infecţii urinare, se va realiza un sediment urinar (după centrifugarea
urinei), care se va examina între lamă şi lamelă în vederea aprecierii numărului de leucocite pe câmp
microscopic, în cazul în care acestea există, în vederea aprecierii prezenţei unor cilindri leucocitari
precum şi a altor celule normale sau patologice, a prezenţei unor elemente fungice etc., date care pot fi
deosebit de utile în vederea unui diagnostic corect şi util pentru pacient.
În cazul suspicionării unei infecţii micotice sunt utile atât preparatele proaspete (ex. preparatul montat în
soluţie de KOH-glicerol 10-20%), frotiurile cu coloraţii „negative” (tuş de India, nigrozină), precum şi
frotiurile colorate May-Grünwald-Giemsa sau Gram.
287
spre exemplu în cazul diferenţierii enterobacteriilor (introducerea în practică a „mediilor multi-test”
permite evaluarea mai multor caractere simultan, ex. mediile TSI, MIU, sistemele API etc). În cazul
fungilor sunt utilizate auxanograma sau zimograma.
d) Caractere antigenice: caracterele antigenice vor fi examinate bazându-ne pe structura şi
antigenicitatea microorganismelor şi pe specificitatea reacţiilor antigen-anticorp. Vom utiliza anticorpi
cunoscuţi pentru a identifica antigenele microbiene necunoscute. Spre exemplu, prin reacţii de aglutinare
directă, pe lamă, se pot identifica antigenele şi respectiv speciile şi tulpinile din
genul Shigella, Salmonella, Vibrio etc). Reacţii de aglutinare indirectă se pot utiliza pentru detectarea în
p.p. a streptococilor de grup A sau B etc., pentru detectarea unor enterotoxine, pentru detectarea unor
fungi (Cryptococcus neoformans, Candida albicans, Aspergillus spp.) etc.
e) Caractere de patogenitate: putem examina capacitatea unui microorganism de a elabora anumite
substanţe cu rol în patogenitate (ex. coagulaza produsă de Staphylococcus aureus) sau infecţia
experimentală a unui animal de laborator (ex. izolarea pneumococilor de la un pacient cu pneumonie
după inocularea sputei la şoarecele alb; în cazul în care în spută există pneumococi, animalul va muri în
24-48 de ore, iar din sângele lui se va izola o „cultură pură” de Streptococcus pneumoniae).
f) Sensibilitatea la un anumit bacteriofag specific (lizotipie);
g) Alte caractere (identificate de ex. prin metode ale biologiei moleculare sau alte metode moderne)
(vezi anexa nr. 7).
Precocitatea diagnosticului este unul dintre factorii de care depinde prognosticul unei boli. Astfel, un
domeniu prioritar pentru cercetarea medicală este reprezentat de punerea la punct a unor noi teste
diagnostice, care să poată fi utilizate cât mai precoce după momentul pătrunderii agentului patogen la
nivelul organismului uman.De exemplu, un deziderat ar fi realizarea unui test urinar pentru identificarea
antigenelor specifice bolii Lyme (cauzate de Borrelia burgdorferi). Până de curând, acest lucru nu a fost
posibil din cauza concentraţiilor mici ale antigenelor la nivel urinar, sub limita de detecţie a testelor
clasice. Recent, Douglas şi colaboratorii au demarat un studiu asupra rolului unui nou biomaterial
(microparticule de tip hidrogel: N-izopropilacrilamida-acid acrilic) în capturarea şi implicit concentrarea
289
biomarkerului urinar pentru Borrelia burgdorferi. Rezultatele preliminare au arătat că aceste
microparticule au capacitatea de a concentra de 100 de ori biomarkerul de la nivel urinar, crescând
sensibilitatea testelor antigenice urinare (13).
290
un sfat, menţionând şi rezultatele obţinute la testarea sensibilităţii la antibiotice pentru tulpina de E.
coli (menţionate mai sus) şi cerând să îi recomandăm unul dintre antibioticele din listă pentru a începe
un nou tratament.
Aşa cum nici diagnosticul şi prescrierea tratamentului la telefon nu reprezintă un bun exemplu în
medicină, nici utilizarea „căii electronice” nu poate să substituie examenul clinic şi analizele de laborator.
Având în minte aceste recomandări pe care le-am învăţat, la rândul nostru, în vremea studenţiei sau în
timpul rezidenţiatului, singurul sfat pe care l-am putut exprima a fost: refacerea analizei de laborator, tot
la INCDMI „Cantacuzino”.
Sfatul a fost urmat iar diagnosticul a fost ITU cu Klebsiella pneumoniae, ceea ce a contrariat-o pe colega
noastră (totuşi, rezultatul nu a fost surprinzător).
Pentru că toată această discuţie se purta, din nou, pe „cale electronică” (colega noastră se întorsese în
localitatea de reşedinţă) şi pentru că nu ştiam unde fusese realizat ultimul examen de laborator, în
primul rând am solicitat această informaţie. Aflând atât laboratorul cât şi medicul care a pus
diagnosticul, aceasta a reprezentat pentru noi o certitudine că ultimul diagnostic este şi el corect şi, în
context, existau două posibilităţi „de primă intenţie”:
Recomandarea a fost de realizare a unui nou examen bacteriologic. Apelând la unul dintre cei mai
experimentaţi colegi, unul dintre puţinii şi adevăraţii profesori din catedra de microbiologie, în final a fost
dovedită o dublă infecţie, ITU şi la nivel genital, cu Klebsiella pneumoniae. Tratamentul infecţiei la
nivelul ambelor sedii a dus la vindecarea infecţiei, dispariţia semnelor şi simptomelor şi primirea
mulţumirilor de rigoare, „prin email”.
291
dureri foarte mari în zona articulaţiei coxo-femurale, după o lovitură aparent minoră, în cursul unui meci
de fotbal. Una dintre erori a fost, probabil, faptul că prima reacţie acasă a fost o „baie fierbinte” (dar
realmente fierbinte).
După 36-48 de ore durerile s-au intensificat foarte mult şi copilul (avea totuşi numai 15 ani) nu s-a mai
putut deplasa fără ajutorul unuia dintre părinţi sau a unui cadru metalic.
Au început peripluri prin unităţi sanitare, iniţial la un spital cu profil de „urgenţe copii”, ulterior la un
spital de urgenţă „pentru adulţi”, la o secţie de ortopedie (imaginile radiologice nu sugerau nimic, se
pare). La cel de al doilea spital s-au administrat medicamente calmante, s-au efectuat noi radiografii
plus recomandarea de a reveni luni, pentru noi analize.
În timpul weekend-ului durerile s-au intensificat şi a fost înregistrată febra (peste 38,5ºC); copilul nu mai
putea pune „pe pământ” membrul inferior drept.
La recomandarea unor cunoştinţe, familia s-a îndreptat iniţial către cel de al treilea spital (cu profil „de
copii”). La acest spital, în tot cursul dimineţii respective, nimeni nu a găsit timpul necesar pentru a îl
consulta pe copil care menţionează, din amintiri: „nimeni nu s-a uitat la mine, eu mă ţineam de pereţi şi
mama alerga...”, motiv pentru care au plecat de la al treilea spital şi s-au îndreptat spre cel de al doilea,
cel cu profil „de adulţi”. Analizele efectuate au fost remarcabile prin intensitatea inflamaţiei (tradusă prin
valorile înalte ale reactanţilor de fază acută) şi sugerarea unei infecţii. Medicul a luat legătura cu un
coleg de la un al patrulea spital (cu profil „de copii”), suspicionând, se pare, un proces tumoral localizat
osteo-articular.
Din amintirile de copil am putea remarca «între timp trecuseră cam 5 zile, poate chiar o săptămână,
urlam de durere când încercam să merg, abia mai puteam să mă dau jos din pat şi daca eram ajutat
urlam de durere pentru că nu mai suportam să fiu atins; devenise un chin să merg la baie pentru că
oricum dura mult şi acolo nu prea mai puteam să stau ... mi s-au făcut analize, radiografii; analizele
indicau o „infecţie care creştea" în comparaţie cu analizele trecute ... radiografiile nu spuneau nimic».
Medicii, după un timp, au indicat tratament cu oxacilină, 12g/zi, iar între diagnosticele diferenţiale luate
în discuţie s-au aflat: cancer osos (cel mai frecvent discutat), tuberculoză osoasă, reumatism şi ... în cel
mai bun caz, o infecţie (copilul, actualul nostru coleg, îşi aminteşte că după mult timp a aflat de la părinţi
că a existat şi suspiciunea de cancer, dar părinţii au ştiut acest lucru de la început; şi îşi mai aminteşte şi
alte aspecte, pe care nu le putem discuta în materialul de faţă).
După circa 1 săptămână de la internare, pacientul se deplasa cu mare greutate, circa 15 metri în 30 de
minute, ca să ajungă la baie („noroc cu nişte băieţi care stăteau cu mine în salon şi mă ajutau”). A primit
în continuare oxacilină 12 g/zi, a fost examinat repetat, radiologic (se pare că s-au executat 20-25 de
radiografii de bazin de la început şi până în timpul acestei internări), semnele de laborator (reactanţii de
fază acută) au început să stagneze sau să evolueze pozitiv; durerile au continuat, la fel şi impotenţa
funcţională.
La sfaturile unor prieteni, părinţii au decis să transfere pacientul în al cincilea spital, cu profil „de adulţi”,
transfer care nu a fost realizat cu foarte multă uşurinţă, dar se pare că acest ultim transfer a fost
salutar. Actualul nostru coleg poartă şi astăzi un deosebit respect celor care s-au ocupat de el în clinica
de ortopedie a spitalului, atât şefului de clinică dar şi unui coleg, care la acea vreme era mai tânăr şi pe
care avem plăcerea să îl cunoaştem şi noi. Datorită suspiciunii de cancer osos, au urmat alte analize, o
tomografie computerizată şi o scintigrafie osoasă (din fericire infirmând respectiva suspiciune);
tratamentul anti-infecţios a fost continuat iniţial cu oxacilină 2g/zi în asociere cu gentamicină
292
2mg/kg/corp (de 2 ori pe zi) timp de 2 săptămâni, urmat de tratament cu oxacilină 2g/zi.
Tânărul nostru coleg îşi mai aminteşte că, înainte de transferul la al cincilea spital tratamentul a fost
administrat intra-venos „când am plecat de la ... deja arătam ca un drogat; aveam pe mâini foarte multe
vene sparte, cheaguri pe branule ...” iar în momentul în care a auzit pentru prima dată că a existat
suspiciunea de cancer osos a slăbit circa 4 kg în 2 zile.
În final, pacientul a fost externat, vindecat, după o lungă perioadă de suferinţă.
Din discuţia cu tânărul nostru coleg şi din amintirile acestuia, nu am remarcat vreo încercare de
diagnostic microbiologic, vreo recoltare de produs patologic care să fie transmis spre analiză (înainte de
administrarea antibioticelor sau chimioterapicelor), vreo recoltare de sânge pentru hemoculturi.
Nu putem menţiona toate impresiile pe care copilul, pacientul, tânărul coleg le-a acumulat pe parcursul
acestei experienţe de viaţă. Totuşi, amintim o dorinţă exprimată de acesta „de fiecare dată când trebuie
să merg la spital, mă rog să dau de un OM”.
293
B. antibiograma nu mai este de actualitate în demersul diagnostic şi terapeutic în bolile infecţioase,
cazurile de rezistenţă la antibiotice şi chimoterapice fiind din ce în ce mai rare
C.recoltarea produselor patologice trebuie efectuată înainte de administrarea tratamentului antimicrobian
D. saliva poate înlocui cu succes sputa ca şi produs patologic recoltat în infecţiile respiratorii inferioare
E.în cadrul examenelor de laborator, diagnosticul microbiologic are doar semnificaţie istorică
3. În interpretarea curbei termice, este important să evaluăm următoarele aspecte:
A.periodicitatea episoadelor febrile
B.relaţia dintre puls şi temperatură
C.administrarea de antibiotice şi/sau antipiretice
D.pattern-ul de remisie a episoadelor febrile
E.frecvenţa şi durata episoadelor febrile
4. În recoltarea produselor patologice trebuie ţinut cont de următoarele elemente:
A.recoltarea pentru hemoculturi se face în timpul unui episod febril
B.se solicită examinarea produselor transmise către laborator în termen de 7-10 zile de la recoltare
C. este importantă alegerea momentului ideal pentru recoltare
D.diagnosticul microbiologic ocupă un loc prioritar în cadrul examenelor de laborator
E. în cursul recoltării, evitarea contaminării cu alţi germeni are doar caracter de recomandare, nefiind
criteriu indispensabil
5. Următoarele afirmaţii legate de examinarea microscopică a produsului patologic sunt adevărate, CU
EXCEPŢIA:
A. se vor realiza minim două frotiuri din produsul patologic, care se vor colora cu albastru de metilen
(AM) / Giemsa şi respectiv Gram
B. în cazul suspicionării unei infecţii urinare, sedimentul urinar se va examina între lamă şi lamelă
C. prezenţa celulelor inflamatorii este un element frecvent decelat şi ca atare poate fi trecut cu vederea
D. în cazul suspicionării unei infecţii mycobacteriene este necesară realizarea unui frotiu colorat Ziehl-
Neelsen
E.atunci când produsul recoltat este reprezentat de sânge, urină sau materii fecale, de regulă nu se
realizează frotiuri fixate şi colorate
În cazul în care un pacient se prezintă la medic şi afirmă că are o infecţie urinară, medicul va putea,
prin efectuarea în mod corect a anamnezei (ex. discuţia cu pacientul respectiv) şi a examenului clinic, să
realizeze un prim pas către diagnostic şi stabilirea tratamenului. Însă certitudinea diagnosticului şi
stabilirea tratamentului corect vor rezulta numai prin examenul de laborator.
Într-o suspiciune de infecţie urinară, urocultura cantitativă trebuie precedată de examenul microscopic al
sedimentului urinar care necesită o dotare minimă (eprubete, centrifugă fără pretenţii, lame, lamele,
microscop optic nesofisticat şi mai ales,dorinţa medicului de a face cât mai mult şi cât mai bine pentru
pacienţii săi). Urina recoltată corect (adică aşa cum se cunoaşte încă din facultate) trebuie examinată
macroscopic, centrifugată iar sedimentul urinar trebuie examinat microscopic. În circa 20 de minute (sau
mai puţin) se va putea observa eventuala prezenţă a leucocitelor în sediment, amănunt care va permite
(în contextul clinic respectiv) aprecierea corespunzătoare a situaţiei şi adoptarea atitudinii celei mai
potrivite. Utilizarea corectă a datelor de laborator va permite nu numai o diminuare a risipei de medii de
cultură şi reactivi (nu în ultimul rând a timpului celui / celor care procesează probele) ci şi o posibilă
direcţionare spre un alt diagnostic decât cel al unei eventuale infecţii urinare, interpretată în mod
mecanic sau la indicaţia / solicitarea pacientului. Un studiu pe care nu l-am publicat a arătat că într-unul
dintre spitalele din Bucureşti, din peste 10.000 de uroculturi efectuate, s-au pozitivat mai puţin de 20%;
examinarea sedimentului urinar ar fi putut contribui la selectarea situaţiilor în care urocultura „merita” să
fie făcută.
În cazul prezenţei unor dureri de cap intense (cefalee), a apariţiei fotofobiei, vărsăturilor fără efort,
poziţiei caracteristice (antalgice) se ridică ipoteza unei meningite a cărei etiologii nu se poate preciza
fără diagnosticul de laborator. Acest diagnostic va permite diferenţierea unor meningite în funcţie de
cauză [există meningite neinfecţioase şi meningite infecţioase (virale, bacteriene, parazitare sau
fungice), iar examenul biochimic la LCR împreună cu diagnosticul de laborator microbiologic vor putea
arăta care este etiologia]. Acest lucru este de maximă importanţă atât pentru evoluţia ulterioară, cât şi
295
pentru prognosticul pacientului implicat deoarece este bine cunoscut faptul că în cazul meningitei există
şi posibilitatea unei evoluţii nefavorabile, cu persistenţa unor sechele sau chiar apariţia decesului. În
cazul unei meningite (inclusiv a unei meningite meningococice), recoltarea şi transportul lichidului cefalo-
rahidian este esenţială. Este de preferat ca medicul să ştie care sunt manevrele necesare pentru a
procesa produsul patologic "la patul bolnavului". Realizarea şi examinarea corectă a frotiurilor va permite
nu numai ca în maxim 20 minute să se pună diagnosticul de meningită meningococică (prezenţa
leucocitelor şi a cocilor Gram-negativi intra şi extra-leucocitari) dar şi să se instituie tratamentul (de ex.
cu penicilină).
În cazul în care pacientul prezintă febră, tuse şi expectoraţie nu este recomandată administrarea
unor antibiotice doar pe baza existenţei acestor semne. Administrarea unui antibiotic cu spectru larg (ex.
tetraciclină) ar putea crea probleme suplimentare. Dacă dorim să procedăm corect, după anamneză
trebuie să urmeze examenul clinic complet, revenind cu minuţiozitate asupra examinării semnelor şi
simptomelor în relaţie cu aparatul respirator. Dintre examenele paraclinice se realizează de obicei
radiografia cardio-toraco-pulmonară. Alte examene de laborator (aşa cum am menţionat în capitolul
precedent) sunt necesare şi trebuie efectuate. Din punct de vedere microbiologic, recoltarea corectă şi
transportul sputei reprezintă elementul esenţial. În laborator sputa va fi prelucrată, vom realiza cel puţin
trei frotiuri pe care le fixăm şi colorăm cu AM / Giemsa, Gram şi Ziehl-Neelsen. Din momentul recoltării
produsului patologic şi până la obţinerea primelor informaţii prin examinarea frotiurilor, pot trece nu mai
mult de 20-30 minute. În cazul în care nu parcurgem aceste etape şi de ex. administrăm direct
tetraciclină, evoluţia pacientului ar putea fi nefavorabilă, chiar şi către deces, iar frotiurile realizate şi
examinate post-mortem (pe produse recoltate anatomo-patologic) ar putea demonstra prezenţa de hife
şi levuri, semnificând o infecţie fungică. Continuând cu etapa de identificare am putea stabili, de ex., că
a fost vorba de o pneumonie provocată de Candida albicans. Decesul a fost precipitat de utilizarea
iraţională a tetraciclinei, medicament care distrugând flora de asociaţie a permis multiplicarea „în voie” a
fungului respectiv. Dacă am fi examinat sputa recoltată de la bolnav am fi putut detecta prezenţa
elementelor fungice şi am fi ales medicaţia corespunzătoare.
Bacteriile studiate pot fi grupate după mai multe criterii, dar o variantă utilă este cea în care avem în
vedere structura peretelui bacterian şi respectiv afinitatea acestuia faţă de diferiţi coloranţi.
Un prim grup important este cel care include cocii cu importanţă medicală, Gram-pozitivi (stafilococi,
streptococi, pneumococi etc) şi respectiv Gram-negativi (meningococi, gonococi etc).
Între bacteriile Gram-negative care au dimensiuni pe baza cărora nu pot fi încadrate drept coci sau bacili
se află parvobacteriile,cocobacilii Gram-negativi (H. influenzae, B. pertussis, Brucella spp. etc).
Bacilii Gram-pozitivi care vor fi incluşi în prezentările din acest manual se pot grupa în bacili nesporulaţi
(Corynebacterium diphteriae, Listeria spp.) şi respectiv bacili Gram-pozitivi sporulaţi (Bacillus anthracis,
Clostridium spp.). Totuşi, nu trebuie să uităm că există şi alţi bacili Gram-pozitivi.
Bacilii Gram-negativi studiaţi fie aparţin familiei foarte numeroase a enterobacteriilor ( E. coli, Salmonella
spp., Shigella spp., Klebsiella pneumoniae, Proteus spp., Yersinia spp . etc), fie sunt incluşi în genuri
separate precum V. cholerae din genul Vibriosau Ps. aeruginosa din genul Pseudomonas.
Microorganismele din genul Mycobacterium se pot colora (cu destul de mare dificultate; uneori nu se
colorează şi apar sub aspectul unor zone necolorate, „fantome” bacteriene) prin metoda Gram, dar în
296
mod caracteristic se colorează prin metoda Ziehl-Neelsen. O adaptare a tehnicii Ziehl-Neelsen este
medoda de colorare Kinyoun. Specia principală studiată este M. tuberculosis. Există şi alte specii de
mycobacterii dar şi bacterii aparţinând altor specii şi genuri, care se pot colora prin aceste tehnici.
O serie de bacterii spiralate (Treponema pallidum, Leptospira spp., Borrelia spp .) nu se colorează prin
metoda Gram datorită structurii particulare a peretelui. Pot fi studiate microscopic fie în preparate
proaspete (utilizând tehnici microscopice speciale) fie utilizând coloraţii particulare (ex. impregnarea
argentică).
Până în urmă cu o perioadă de timp microorganismele aparţinând
genurilor Rickettsia, Chlamydia şi Mycoplasma erau incluse în categoria virusurilor. Totuşi, proprietăţile
lor fundamentale fac să le studiem astăzi între bacterii.
În obiectul de studiu sunt încadraţi şi fungii (ciupercile) care au o serie de caracteristici aparte.
Noţiunile legate de micologie sunt reluate în cadrul dermatologiei iar diagnosticul micologic este
prezentat mai pe larg în diferite tratate de specialitate.
Pentru fiecare microorganism studiat am abordat aspecte legate de încadrarea într-un anumit gen,
caracterele generale mai importante (habitat, caractere morfo-tinctoriale, caractere de cultură, caractere
biochimice, rezistenţa faţă de factori fizici şi chimici, structura antigenică şi răspunsul imun realizat în
organismul gazdă, precum şi caracterele de patogenitate).
297
informaţii (http://www.cdc.gov). Recomandăm, de asemenea, consultarea site-ului http://ecdc.eu.int,
site al Centrului European de Prevenire şi Control al Bolilor Infecţioase („communicable diseases”), mai
recent înfiinţat, dar cu o evoluţie rapidă şi pozitivă.
În ceea ce priveşte tratamentul, este util să reţinem că pentru majoritatea situaţiilor este necesară
izolarea microorganismului implicat, identificarea acestuia şi testarea sensibilităţii la antibiotice şi
chimioterapice (de ex. utilizând cel puţin antibiograma difuzimetrică).
Deoarece unele studii arată că circa 20% dintre persoanele sănătoase sunt purtătoare în mod
permanent de S. aureus iar în circa alte 50-60% dintre cazuri este discutată situaţia portajului temporar,
s-a intuit că există un anumit grad de influenţă genetică privind starea de purtător de S. aureus. Într-un
studiu transversal recent la care au participat în mod voluntar colegii tineri aflaţi în finalul anului 2 de
facultate (date nepublicate, 2007), 35,5% dintre studenţi au fost purtători de Staphylococcus aureus,
nazal şi/sau faringian. Un studiu similar, transversal, efectuat în 2010 în Brazilia, pe un lot comparabil de
voluntari (incluzând studenţi aflaţi în finalul anilor 1 şi 2 de facultate în domeniile: farmacie, medicină
dentară şi medicină generală), a decelat un procent de portaj nazal de 40,8% (102/250), un CMI (50) la
meticilină de 0,5 µg/mL şi un CMI (90) de 1 µg/mL. Datele obţinute de noi în România sunt comparabile
cu cele obţinute în Brazilia, cu atât mai mult cu cât există similitudini şi la nivelul loturilor de voluntari
incluse în studiu.
Stafilococii coaguloază-negativi (SCN) formează microcolonii la nivelul foliculilor piloşi (4) şi la nivelul
glandelor sebacee. Habitatul principal pentru S. epidermidis este reprezentat de vestibulul nazal.
Deoarece au un tropism special pentru derm, stafilococii pot fi implicaţi în infecţii la nivelul
tegumentelor şi anexelor pielii (infecţii însoţite de puroi), dar pot fi implicaţi şi în infecţii localizate la
nivelul oricărui alt ţesut sau organ.
299
29. 2. 4. Caractere biochimice
Stafilococii au un metabolism glucidic atât respirator cât şi fermentativ. Fermentează glucoza,
manitolul, xiloza, lactoza, zaharoza etc. cu producere de acid.
Capacitatea de acidifiere a mediului conţinând manită este utilizată ca test de diferenţiere între S.
aureus (manită-pozitiv) şi SCN (manită-negativ). Stafilococii sunt catalază-pozitivi.
300
foloseşte plasmă umană, rezultatul poate fi pozitiv şi pentru S. lugdunensis şi S.
schleiferi(subspecia schleiferi).
e). Adezinele sunt proteine de suprafaţă specifice, prin care stafilococii se fixează pe proteinele
matriciale de la suprafaţa celulelor gazdei (ex. laminină, fibronectină, elastină, colagen, proteina A etc).
Par a fi implicate în colonizarea matricei intercelulare, în invazia ţesuturilor şi în rezistenţa la fagocitoză.
1. a-hemolizina (a-toxina) este principala hemolizină produsă de S. aureus. Are activitate maximă
asupra hematiilor de iepure; hematiile de om nu sunt susceptibile. Afectează trombocitele şi celulele
umane în cultură. Are efect dermonecrotic asupra animalul de experienţă (injectată local) şi efect letal
301
(injectată intravenos). Efectul ei principal este reprezentat de producerea de spasme ale muşchilor
netezi vasculari. S-a identificat receptorul de pe suprafaţa membranei eritrocitului, o sialoglicoproteină.
Este secretată sub forma unui monomer hidrosolubil de 34.000 Da, care se rearanjează în contact cu un
receptor de membrană, formând un hexamer cilindric care străpunge membrana celulei şi proemină la
suprafaţa ei, generând un por cu un diametru de 23 nm (există asemănări cu complexul litic C5b-C9 al
C').
2. β-hemolizina este produsă de majoritatea stafilococilor identificaţi la animale, dar numai de 10-
20% dintre stafilococii umani. Produce o hemoliză de tip „cald-rece“. Este de fapt o sfingomielinază C,
activată de Mg2+, nu însă şi de Ca2+. Efectul (în ordine descrescătoare) se exercită asupra hematiilor de
oaie, om, cobai (ceea ce corespunde cu concentraţia de sfingomielină a hematiilor). Este citotoxică
pentru diferite culturi de celule. În doze mari, este toxică pentru animalele de experienţă.
3. g-hemolizina este un complex de două proteine bazice care acţionează în cooperare. Hematiile
susceptibile sunt cele de iepure, om, oaie, nu şi cele de cal sau pasăre. Efectul ei este inhibat de agar şi
de diferiţi polimeri sulfataţi. Nu are efect atunci când se utilizează plăci cu agar-sânge. Acţiunea este
inhibată de colesterol şi de alte lipide.
4. d-hemolizina este produsă de majoritatea tulpinilor umane de S. aureus. Constă din agregate
heterogene de subunităţi de circa 5.000 Da. Acţionează pe diferite celule (hematii, leucocite, celule de
mamifere cultivate) şi nu are specificitate de specie.
e). Stafilococii pot produce o serie de exotoxine piretogene, un grup de toxine cu mai multe
activităţi patogene, spre exemplu cu efecte imunosupresoare, cu un efect mitogen mai pronunţat la
nivelul limfocitelor T supresoare (au capacitatea de a activa policlonal toate celule T); cresc toxicitatea
endotoxinelor germenilor Gram-negativi (blochează funcţia de clearance a sistemului reticuloendotelial);
produc eritrodermie prin mecanisme de hipersensibilitate de tip întârziat. Efectul piretogen se realizează
cel puţin în parte prin stimularea producerii de IL-1. Din acest grup fac parte exotoxinele piretogene A şi
B, enterotoxinele stafilococice (cu cinci tipuri serologice) şi respectiv TSST-1, cauza sindromului de şoc
toxic stafilococic. Circa 50% din tulpinile de S. aureus izolate produc una sau mai multe enterotoxine.
Aproximativ 15% produc TSST-1. Mai rare sunt tulpinile care produc exotoxine piretogene A şi B.
f). Leucocidina este produsă de majoritatea tulpinilor de S. aureus şi acţionează numai asupra
polinuclearelor şi macrofagelor de om şi iepure. Are două componente, F şi S. Componenta S se fixează
pe gangliozidul GM1 (receptor pentru toxina holerică) şi activează o fosfolipază endogenă, legată de
membrană. Produşii acesteia se fixează apoi pe componenta F, inducând apoi un canal ionic pentru K +şi
conducând astfel la citoliză.
g). Exfoliatina (toxina epidermolitică) produce o varietate de leziuni dermatologice. Este o proteină
termolabilă şi acid-labilă, cu greutatea moleculară de 24.000 Da, produsă de circa 5% din tulpinile de S.
aureus. S-au descris două variante antigenice, ETB (codificată de un plasmid) şi respectiv ETA (codificată
cromozomial). Multe tulpini produc ambele exfoliatine. Toxina acţionează prin clivarea stratului granular
al epidermului, probabil prin scindarea desmosomilor care unesc celulele acestui strat.
29. 2. 6. 3.Bacteriocine
S. epidermidisproduce epidermina (stafilococina 1580) şi Pep5, care sunt lantibiotice. S.
302
gallinarum produce galidermina. Aceste lantibiotice au efecte în special asupra bacteriilor Gram-pozitive,
chiar şi asupra unor tulpini de stafilococi din altă specie decât cea producătoare.
S. aureus are posibilitea de a îşi modifica fenotipul, prezentându-se sub forma de SCV (small colony
variants), pentru a scăpa sistemului imun şi pentru a genera o infecţie cronică. Un studiu pe modele
celulare a arătat că printre tehnicile de persistenţă se află modificarea expresiei factorilor de virulenţă,
auxotrofismul (inabilitatea unui microorganism de a sintetiza un compus organic necesar procesului de
creştere) dar şi această diversitate fenotipică, care s-a dovedit a fi un proces extrem de dinamic,
fenotipurile SCV transformându-se rapid înapoi în fenotipurile sălbatice complet virulente în momentul
părăsirii localizării intracelulare (7).
S. aureus apare mai frecvent implicat în producerea unor infecţii, de obicei la nivelul tegumentelor şi
mucoaselor, însoţite de formarea de puroi, dar cu potenţial de generalizare. Tulpinile de S. aureus au
capacitatea de a adera la mucoase, epitelii, endotelii, în special datorită prezenţei acidului lipoteichoic,
proteinei A şi altor adezine. După aderare şi multiplicare, în cursul infecţiilor pot fi produse o serie de
substanţe cu rol în patogenitate (enzimele şi toxinele elaborate au fost prezentate la punctul 29. 2. 6).
De menţionat şi faptul că stafilococii reprezintă unele dintre primele microorganisme pentru care s-a
descris fenomenul apariţiei rezistenţei la antibiotice. Rezistenţa la penicilină (mediată de o β-lactamază)
a fost evidenţiată încă din anul 1947. Ulterior, pe măsura utilizării în infecţiile stafilococice a unor diferite
antibiotice (inclusiv a „penicilinelor penicinilazo-rezistente“), s-au selectat tulpini rezistente la meticilină,
oxacilină, tetraciclină, cloramfenicol, macrolide, aminoglicozide etc.
303
Până în anul 1996, vancomicina reprezenta tratamentul de elecţie al infecţiilor cu S. aureus rezistent
la alte antibiotice şi chimioterapice. Au fost raportate tulpini stafilococice intermediare sau rezistente la
vancomicină. În privinţa sensibilităţii/rezistenţei la vancomicină au fost descrise trei variante de S.
aureus, respectiv:
În mod clasic era considerat că o tulpină de S. aureus intră în categoria VISA în cazul în care CMI
este ≥ 6 μg/ml (determinare prin „E test”) şi în categoria VRSA în cazul în care CMI este ≥ 32 μg/ml.
Conform EUCAST (2010), o tulpină de stafilococ este rezistentă la vancomicină în cazul în care CMI este
> 2 μg/ml.
Opţiunile de tratament în infecţiile cu VRSA sunt limitate. O clasă de antimicrobiene care poate fi utilizată
în tratamentul VRSA este reprezentată de streptogramine (quinupristin/dalfopristin, pristinamicina,
virginiamicina, NXL 103, etamycin).
Cu toate acestea, a fost identificată rezistenţă şi la streptogramine (9), existând totuşi posibilitatea
tratării S. aureus rezistent la streptogramina B cu lincosamide, prevalenţa acestui fenotip fiind însă
redusă, de 60,3%, spre deosebire de prevalenţa de 92,8% a tulpinilor rezistente constitutiv la macrolide,
lincosamide şi streptogramina B (10).
S. aureus este implicat ca agent etiologic într-o mare varietate de infecţii supurative (cu puroi),
începând cu infecţiile superficiale ale tegumentelor şi mucoaselor şi continuând cu panariţii, furuncule,
304
abcese profunde, infecţii ale diferitelor organe interne cu sau fără generalizarea infecţiei. Pe de altă
parte, ar fi de menţionat toxinozele (datorate în special toxinelor elaborate) şi anume toxiinfecţiile
alimentare, necroliza toxică a epidermului, sindromul de şoc toxic etc.
Toxiinfecţiile alimentare sunt provocate de exotoxinele preformate, existente în alimente în care s-au
multiplicat stafilococi enterotoxigeni. Simptomele principale sunt reprezentate de greţuri, crampe
abdominale, vărsături, diaree care apar la 1-4 (1-6) ore după ingestia alimentelor contaminate. Se
vindecă în general în circa 24 de ore. Alimentele sunt contaminate în general de către cei care le
manipulează (de exemplu bucătarul prezintă un panariţiu). Alimentele mai frecvent incriminate sunt
cremele, brânza, îngheţata, carnea şi produsele din carne (acestea pot constitui adevărate medii de
cultură pentru bacterii). Enterotoxinele stafilococice sunt termostabile (rezistă 30 minute la 100°C), ceea
ce impune păstrarea alimentelor la frigider, atât înainte cât şi după preparare.
Dermatitele exfoliative includ dermatita exfoliativă generalizată (boala Ritter) care poate apărea la nou
născut; epidermonecroza toxică (întâlnită la copii şi eventual la adulţi); impetigo bulos şi „scarlatina
stafilococică” (spre deosebire de cea streptococică, nu afectează limba şi palatul). Leziunile apărute sunt
extinse, de multe ori impresionante, dar este posibilă vindecarea fără cicatrici deoarece sediul leziunilor
este în stratul granular al pielii (sub ele rămânând un strat suficient de gros pentru evitarea unor pierderi
masive de lichid şi pentru a proteja straturile profunde de infecţii supraadăugate). În mod frecvent,
stafilococii care au produs toxinele implicare patogenic nu sunt izolaţi de la nivelul leziunii.
Sindromul de şoc toxic cuprinde un complex de simptome provocat ca urmare a unor infecţii locale cu S.
aureus producător de TSST-1 (toxina 1 a şocului toxic). Principalele semne şi simptome sunt
reprezentate de apariţia stării de şoc, febră mare, greţuri, vărsături, diaree, trombocitopenie, insuficienţă
renală şi hepatică acută, rash (erupţie) scarlatiniform urmat de descuamare (mai ales a palmelor şi
plantelor). Mortalitatea în cazurile necomplicate este de circa 2%. În formele complicate, mortalitatea
poate ajunge la 50%. Un procent important (circa 80%) dintre cazuri apar la femei. Unele mărci de
tampoane destinate igienei intime feminine s-au dovedit a stimula producţia de TSST-1 de către tulpini
„proprii“ de stafilococ. Deoarece s-a demonstrat că TSST-1 creşte toxicitatea endotoxinei germenilor
Gram-negativi, cazurile cele mai grave au apărut atunci când infecţia stafilococică locală s-a asociat cu o
infecţie cu germeni Gram-negativi.
305
patologic, de obicei reprezentat de puroi (fie dintr-o leziune deschisă, superficială, fie din leziuni închise,
profunde). Cultivarea în vederea obţinerii de colonii izolate se continuă cu identificarea în care pe lângă
caracterele morfologice, de cultură şi biochimice se face testul coagulazei pe lamă şi/sau în tub.
Antibiograma completează în mod necesar diagnosticul de laborator al unei infecţii stafilococice.
Pentru a discuta diagnosticul de laborator în infecţiile produse de stafilococi vom alege drept
reprezentative infecţiile purulente ale tegumentelor şi mucoaselor şi ne vom referi numai
la Staphylococcus aureus.
Diagnosticul de laborator este numai bacteriologic, direct, cu următoarele etape.
1. Recoltarea şi transportul produsului patologic trebuie să se realizeze respectând o serie de reguli (cât
mai aproape de debutul bolii, înainte ca pacientului să fi primit antibiotice, cât mai rapid şi corect din
punct de vedere al tehnicilor utilizate, respectând toate normele de asepsie şi antisepsie etc). În funcţie
de maladia provocată se pot recolta următoarele produse patologice: secreţii purulente (din foliculite,
abcese, celulite, fistule, infecţii ale plăgilor şi arsurilor), lichide (de puncţie sinusală, otică, mastoidiană,
articulară, peritoneală, pleurală, pericardică), exsudat nazal sau exsudat faringian, sânge, LCR, spută,
urină, secreţie vaginală, tampoane vaginale, lichid de vomă, materii fecale, alimente, prelevate de pe
suprafaţa cateterelor şi a inserţiilor iv. ale acestora. În continuare vom discuta cazul în care p.p. este
reprezentat de puroi (vezi anexa nr. 6; A. 6. 1.).
De menţionat că din anul 2002 a fost pusă la punct o tehnică PCR pentru identificarea S.
aureus rezistent la meticilină, direct în produsul patologic (vezi „Direcţii de cercetare”).
2. Examinarea microscopică a produsului patologic include realizarea a minim două frotiuri din produsul
patologic recoltat şi transportat corespunzător, care se vor colora cu albastru de metilen (AM) şi
respectiv Gram. Frotiurile se examinează la microscopul optic cu imersie şi se notează
prezenţa celulelor de la nivel tegumentar (eventual modificate faţă de normal), prezenţa celulelor
inflamatorii (ex. leucocite, piocite) şi prezenţa cocilor Gram-pozitivi, cu diametrul de 0,6-1,5 mm,
dispuşi în lanţuri scurte, perechi, izolaţi sau în grămezi neregulate. Cocii se pot situa intra sau
extraleucocitar. Se are în vedere locul de unde a fost recoltat p.p. (puroiul poate fi necontaminat, dacă
se recoltează de ex. prin puncţie-aspirare dintr-o colecţie purulentă profundă şi este foarte probabil
contaminat cu floră de asociaţie dacă a fost recoltat dintr-o leziune superficială).
3. Cultivarea pe medii de cultură a produsului patologic se realizează cât mai rapid (pentru a diminua
riscul modificărilor ce ar putea apărea în structura microbiană) şi în aşa fel încât să se poată
obţine colonii izolate şi respectiv o cultură pură, care se va identifica (vezi şi anexa nr. 2). Stafilococii
se dezvoltă în general pe medii de cultură obişnuite în 18-24 ore, la 35-37°C. Coloniile au aspect de tip
S, diametrul cuprins între 1-3 mm şi sunt pigmentate în funcţie de specia izolată (ex. pigment auriu). Pe
mediul geloză-sânge, în jurul coloniilor poate apărea o zonă de hemoliză clară. Stafilococii se pot
multiplica pe medii hiperclorurate, tolerând o concentraţie de 7-10% NaCl (ex. mediul Chapman). În
cazul în care produsul este recoltat de la nivel nazal (existând certitudinea că produsul conţine mai multe
specii de microorganisme) este recomandată utilizarea mediilor hiperclorurate.
4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor caractere:
Caractere morfotinctoriale: sunt coci Gram-pozitivi, cu diametrul de circa 0,6-1,5 mm, dispuşi în
lanţuri scurte, perechi, izolaţi sau în grămezi neregulate.
306
Caractere de cultură: produc colonii de tip S, pigmentate auriu; pe mediile cu sânge pot produce
hemoliză.
Caractere biochimice: stafilococii au un metabolism glucidic atât respirator cât şi fermentativ.
Fermentează glucoza, manitolul, xiloza, lactoza, zaharozaetc. cu producere de acid. Capacitatea de
acidifiere a mediului conţinând manită este utilizată ca test de diferenţiere între S. aureus (manită-
pozitiv) şi SCN (manită-negativ). S. aureus este catalază-pozitiv (vezi anexa nr. 2) (la fel ca și ceilalți
stafilococi). De importanță egală taxonomică și recomandat drept al doilea test de confirmare a
apartenenței la specia S. aureus este testul dezoxiribonucleazei termostabile. Se poate face şi testul
fosfatazei (poate fi pozitiv și la unele specii coagulază-negative). Există sisteme multitest care se pot
procura comercial (API, Micro Scan, Minitek, Vitek etc).
Caractere antigenice: Pentru diferențierea S. aureus de SCN se pot utiliza teste comerciale care
includ fibrinogen şi IgG care cuplează coagulaza legată şi proteina A (tehnici de aglutinare indirectă).
Se pot utiliza şi truse cu anticorpi monoclonali faţă de endo-β-N-acetil-glucozaminidazei stafilococice.
Caractere de patogenitate:
o Trebuie efectuat testul coagulazei (vezi anexa nr. 2); factorul care produce coagularea
pe lamă poate fi prezent la circa 10% dintre tulpinile de S. intermedius. În cazul în care în testul
coagulazei pe lamă se foloseşte plasmă umană, rezultatul poate fi pozitiv pentru S. lugdunensis şi S.
schleiferi (subspecia schleiferi).
o Pentru identificarea exotoxinelor se poate utiliza o tehnică de tip ELISA sau aglutinarea
pasivă inversată (vezi şi capitolele 20 şi 23).
Sensibilitatea la bacteriofagi: Susceptibilitatea la acţiunea litică a bacteriofagilor a fost
sistematizată pentru tulpinile de S. aureus într-un sistem care se poate utiliza la nivelul centrelor de
referinţă. Există un set de bază de bacteriofagi, care permit încadrarea S. aureus în unul din grupele I,
II, III sau V. Lizotipia este actualmente evaluată comparativ cu capacitatea „discriminatorie” a testelor
care au ca mecanism biologia moleculară (ex. ribotiparea).
Alte caractere / teste utilizate în identificare: Se pot utiliza (în centre de referinţă) teste care se
bazează pe proprietăţi fenotipice moleculare (studiul acizilor graşi celulari, al unor enzime sau al unor
polipeptide totale) sau genotipice (fragmente de restricţie ale materialului genetic, hibridarea
moleculară, ribotiparea etc.). S-au dezvoltat tehnici rapide utilizând truse de identificare şi
instrumenteautomatizate pentru evidenţierea unor elemente ale peretelui celular (proteina A, coagulaza
legată), a enzimelor elaborate în aliment sau lichidul de hemocultură (testul pentru termonuclează) şi a
toxinelor (enterotoxine, TSST1, exfoliatine). Există metode care utilizează markeri moleculari pentru
evidenţierea prezenţei MRSA (stafilococ rezistent la meticilină, de ex. amplificarea genică, PCR pentru
gena mecA, dar şi pentru genele femA, femB) şi/sau pentru diferenţierea intraspecifică la S. aureus şi
SCN.
307
PCR).
29. 5. Tratament
Multe persoane sunt purtătoare de stafilococi la nivel tegumentar, nazal sau faringian. Chiar dacă
stafilococii ar fi eliminaţi complet de la nivelul vestibulului nazal, recolonizarea s-ar produce foarte rapid
(4).
Totuşi, în anumite situaţii (ex. pacienţi supuşi dializei peritoneale sau hemodializei, pacienţi infectaţi cu
HIV sau la personalul medical care lucrează de ex. în secţii de arşi) încercarea de eliminare a stării de
purtător are justificare. Se poate utiliza tratamentul local cu mupirocină. Este încă în studiu utilizarea
lizostafinei în acest scop (lizostafina este o enzimă litică produsă de o tulpină de S. simulans; atacă
puntea pentaglicinică de la nivelul lanţurilor de peptidoglican ai S. aureus; au fost făcute experimente pe
animale de laborator obţinându-se rezultate promiţătoare) (11).
Principial, dacă un stafilococ este sensibil la penicilină (majoritatea tulpinilor au devenit rezistente
prin producerea de beta-lactamază, dar nu toate), atunci tratamentul ar trebui să includă acest
antibiotic. Din experiența centrului de referință din INCDMI ”Cantacuzino”, procentul tulpinilor sensibile
la penicilină este de circa 5%. Datorită rezistenței la penicilină au fost produse peniciline rezistente la
acțiunea beta-lactamazelor (penicilinele M – de la ”meticilină”), de ex. oxacilina, cloxacilina și derivații
acestora.
Tulpinile meticilino-rezistente pot deveni destul de rapid multi-rezistente.
În cazul colecţiilor purulente reamintim şi considerăm că este de reţinut ca fiind de primă importanţă
utilizarea inciziei şi drenajului, fără de care antibioterapia nu are nici un sens. De multe ori, incizia şi
drenajul sunt suficiente.
29. 6. Epidemiologie
Stafilococii sunt ubicuitari. Sursa de infecţie cea mai comună este reprezentată de leziunile
stafilococice de la nivelul tegumentului. De menţionat posibilitatea răspândirii infecţiei cu stafilococi
rezistenţi la antibiotice (de spital), atunci când persoanele purtătoare sunt reprezentate chiar de
308
personalul medical şi auxiliar.
Referitor la sindromul de şoc toxic stafilococic (SSTS), în SUA s-au raportat 157 de cazuri în 1997,
138 de cazuri în 1998 şi 113 cazuri în 1999, cu o incidenţă anuală de 0,05 0/0000. În anul 2005 au fost
raportate numai 90 de cazuri (incidenţa fiind 0,04 0/0000). Tot în anul 2005 s-au raportat 2 cazuri de
infecţie cu S. aureus cu sensibilitate intermediară la vancomicină (VISA) şi 3 cazuri de infecţie cu S.
aureusrezistent la vancomicină (VRSA).
În România nu sunt disponibile (la nivel naţional) date privind SSTS sau rezistenţa la vancomicină a
tulpinilor de S. aureus. Din datele laboratorului de referință pentru stafilococ din INCDMI ”Cantacuzino”,
inclusiv cele provenite din supravegherea microorganismelor izolate din infectii invazive pe baza
protocoalelor EARSS (2002-2009), respectiv EARS.Net (din 2010), în România nu au fost semnalate
tulpini de S. aureus rezistente la vancomicină.
Laboratorul de referință pentru stafilococ din INCDMI ”Cantacuzino” poate detecta prin metode
moleculare prezenţa genelor pentru enterotoxine, leucocidina Panton Valentine, TSST1, în culturi de S.
aureus.
29. 7. Profilaxie
Prevenirea transmiterii infecţiei are la bază metodele de igienă, asepsie şi antisepsie. În spital,
secţiile cu risc sunt cele de neonatologie, terapie intensivă, sălile operatorii şi saloanele unde se află
pacienţi cu cancer aflaţi sub chimioterapie / sau cu alte cauze de imunodepresie. În aceste situaţii,
personalul medical trebuie investigat prin metode de laborator şi este de preferat ca persoanele
purtătoare de stafilococi coagulază-pozitivi să nu aibă acces în aceste incinte şi să nu aibă contact direct
cu pacienţii în cauză. Ca alternativă trebuie să se pună accentul pe proceduri adecvate, care să evite
contaminarea pacienților.
Utilizarea substanţelor antiseptice şi încercarea de eradicare cu ajutorul antibioticelor a portajului nazal
(ex. lizostafină, mupirocină) ar putea fi utile. (11)
Utilizarea vaccinului stafilococic poate să amelioreze starea clinică în anumite situaţii, de ex. la pacienţi
care necesită hemodializă, prezenţa de catetere etc. Din păcate la nivel internaţional (EU) nu există un
vaccin stafilococic care să fi primit autorizaţie de utilizare. În ţara noastră vaccinul stafilococic produs de
INCDMI ”Cantacuzino” a avut autorizație de utilizare până în anul 2010.
Printre metodele de detecţie directă a rezistenţei la meticilină a S. aureus se numără şi testele de
latex aglutinare. Un tip particular de astfel de test a fost descris în 2010, de Qian et al. (14) în Journal of
Clinical Microbiology. Ei propun efectuarea acestui test de latex aglutinare (pe mediu de tip geloză-
sânge) prin utilizarea unei proteine de legare a penicilinei (Penicillin Binding Protein 2a).
Acest test (PBP-LA) şi-a demonstrat o sensibilitate de 94,1% şi o specificitate de 97,5%, valori doar cu
puţin mai scăzute faţă de sensibilitatea şi specificitatea efectuării tehnicii PCR. Dintre avantajele utilizării
acestei metode menţionăm: obţinerea de rezultate rapide, tehnică uşor de utilizat, preţuri scăzute ale
reactivilor utilizaţi. În vederea creşterii sensibilităţii testului, acesta poate fi utilizat în combinaţie cu alte
teste de identificare rapidă, precum: DNA-aza termostabilă, API Rapidec, şi FISH (peptide nucleic acid-
fluorescence in situ hybridization).
310
unităţile sanitare erau obligate să raporteze cazurile suspecte şi confirmate de infecţie cu Staphylococcus
aureus meticilino rezistent (MRSA), contribuind la stabilirea unui sistem activ de raportare, pentru a se
putea astfel demonstra care este evoluţia infecţiilor cu MRSA în contextul unei campanii speciale de
control a acestor infecţii.
Toate aceste reacţii, inclusiv măsura fără precedent de închidere a peste 20 de unităţi de învăţământ
pentru „dezinfecţie şi sterilizare” au fost instituite în contextul în care un tânăr de 17 ani a decedat prin
sepsis stafilococic. Decesul lui O.R. a condus la o campanie în care au participat în colaborare unităţile
de învăţământ, elevii din aceste unităţi, sistemul medical (inclusiv centrul de prevenire şi control al
bolilor, mass-media, reprezentanţii autorităţilor locale şi o serie de politicieni).
După cum am discutat în prezentul capitol, dar şi în alte capitole ale acestui manual, stafilococii sunt
prezenţi în mod normal pe tegumente şi mucoase. Totuşi, stafilococii pot fi implicaţi şi în patologie. Pot fi
vizate persoane imuno-competente, copii, adolescenţi, tineri.
De suficient de multe ori, cei care consideră că nu sunt vulnerabili sau cred că au un risc foarte scăzut
de îmbolnăvire, de ex. sportivii (mai ales cei care practică sporturile mai dure, însoţite de contact direct
şi care se consideră „indestructibili”) pot fi printre cei mai expuşi la infecţie şi chiar la o evoluţie gravă a
acesteia. La universitatea din Virginia, întreg lotul de lupte greco-romane s-a infectat venind în contact
cu o saltea de luptă contaminată de un coleg care s-a rănit în timpul antrenamentului.
De multe ori, simpla respectare a unor reguli de igienă generală şi personală pot contribui semnificativ la
prevenirea apariţiei infecţiilor stafilococice. Pentru restul cazurilor studiul individual, cercetarea bazelor
de date şi experienţa câştigată cu fiecare caz consultat, investigat, analizat şi discutat ne ajută să
ajungem la cea mai bună ipoteză diagnostică, la cel mai bun diagnostic diferenţial, la cel mai potrivit
tratament în vederea celui mai bun prognostic pentru pacientul sau pacienţii pe care îi vom examina de-
a lungul întregii cariere medicale sau medico-chirurgicale.
312
30. 1. 2. 3.Grupele C şi G. Aceşti streptococi sunt izolaţi uneori din nazofaringe şi pot cauza
sinuzită, bacteriemii sau endocardită. Deseori formează colonii asemănătoare cu cele ale streptococilor
piogeni şi sunt beta-hemolitici. Sunt identificaţi prin reacţii cu antiser specific pentru grupele C sau G.
30. 1. 2. 4.S bovis. Face parte din streptococii de grup D. Aparţine florei normale. Ocazional
produce endocardită sau bacteriemie la pacienţii cu carcinom de colon. Nu produce hemoliză şi dă o
reacţie pozitivă la bilă-esculină.
30. 1. 2. 5.S. pneumoniae.Pneumococii sunt alfa-hemolitici, creşterea lor este inhibată de
optochin iar coloniile sunt distruse de bilă şi săruri biliare (vezi capitolul 31). În continuare reprezintă o
cauză importantă de morbiditate și mortalitate (prin pneumonie comunitară).
30. 1. 2. 6.S. viridans. Fac parte din flora normală la nivelul tractului respirator superior. În mod
caracteristic sunt alfa-hemolitici, dar pot fi nonhemolitici. Creşterea lor nu este inhibată de optochin.
Pot ajunge în torentul sanguin ca urmare a unei traume şi reprezintă o cauză importantă a endocarditei
care survine la pacienţi cu valve cardiace patologice. Unii streptococi viridans (exemplu S. mutans)
sintetizează polizaharide care contribuie la geneza cariilor dentare.
30. 1. 2. 7.Peptostreptococii. Cresc numai în condiţii anaerobe sau microaerofile şi produc în
mod variabil hemolizine. Fac parte din flora bucală normală, flora tractului respirator superior, intestinal
şi genital feminin. Participă, adesea în asociere cu alte specii bacteriene, în infecţiile anaerobe
polimicrobiene abdominale, pelviene, pulmonare sau cerebrale.
30. 2. 1.
Submitted by Mircea Ioan Popa on Mar, 2012-03-27 18:36.
30. 2. 1. Habitat
Streptococii piogeni se pot găsi la nivelul tractului respirator superior uman. Condiţiile în care ar trebui
eliminaţi se stabilesc de la caz la caz. O parte dintre speciile de streptococi colonizează exclusiv
suprafaţa dentară şi devin detectabile numai după erupţia dentară. Pentru alte specii de streptococi,
datele referitoare la habitat au fost prezentate mai sus.
Sunt coci Gram-pozitivi, sferici sau ovoidali, cu diametrul de circa 1µm, imobili, nesporulaţi. Se divid într-
un plan perpendicular pe axa lor lungă şi sunt aranjaţi în lanţuri (de până la 50 elemente bacteriene).
Lungimea lanţurilor variază şi este condiţionată de factori de mediu.
313
Unii streptococi elaborează o capsulă polizaharidică comparabilă cu cea pneumococică. Cele mai multe
din speciile de grup A, B şi C produc capsulă din acid hialuronic. Capsulele sunt mai evidente în culturile
tinere şi împiedică fagocitoza. Pilii streptococici sunt acoperiţi de acid lipoteichoic şi au rol în aderenţă.
Cei mai mulţi streptococi cresc pe medii solide şi formează colonii discoide, de tip S, cu diametrul de 1-2
mm. Streptococul piogen beta-hemolitic de grup A formează colonii punctiforme. Speciile care produc
material capsular adeseori dau naştere unor colonii mucoide (de tip M). Cei mai mulţi streptococi sunt
aerobi, facultativ anaerobi. Peptostreptococii sunt strict anaerobi.
Necesităţile nutritive variază mult în funcţie de specie. Streptococii implicaţi în patologia umană sunt în
general germeni pretenţioşi, necesitând o varietate de factori de creştere. Un mediu de cultură util (atât
ca mediu îmbogăţit cât şi ca mediu diferenţial) este mediul geloză-sânge. Pe acest mediu streptococii se
pot diferenţia în funcţie de capacitatea de a produce hemoliză. Distrugerea completă a eritrocitelor cu
eliberarea de hemoglobină poartă numele de beta-hemoliză şi reprezintă un caracter util în identificarea
streptococilor piogeni (colonii mici, de tip S, înconjurate de o zonă clară de hemoliză, cu un diametru
mult mai mare decât diametrul coloniei). Liza incompletă a eritrocitelor cu formarea de pigment verde se
numeşte alfa-hemoliză (sau hemoliză viridans). Hemoliza incompletă fără o nuanţă verzuie poartă
numele de hemoliză alfa prim. În cazul în care streptococii nu produc hemoliză sunt clasificaţi drept
streptococi gama.
În funcţie de producerea hemolizei, mai frecvent implicaţi în patologia umană sunt streptococii beta-
hemolitici, iar dintre aceştia în mod special streptococii beta-hemolitici din grupul A. Streptococul piogen
beta-hemolitic de grup A elaborează două hemolizine: 1) streptolizina O, o proteină antigenică având
greutatea moleculară de 60.000 Da, hemolitic activă în stare redusă (grupări –SH disponibile), dar
inactivată rapid în prezenţa oxigenului şi 2) streptolizina S care nu este imunogenă.
Unul dintre caracterele biochimice importante este reprezentat chiar de producerea hemolizei.
Streptococii piogeni sunt germeni pretenţioşi care necesită pentru dezvoltare adăugarea în mediul de
cultură a vitaminelor, aminoacizilor, glucozei sau cel puţin utilizarea ca mediu de cultură a gelozei-sânge
sau a bulionului nutritiv. Streptococii degradează glucoza pe calea glicolitică. O mare parte dintre specii
pot fermenta şi alte tipuri de zaharuri şi alcooli zaharaţi utilizând o serie de enzime inductibile (sintetizate
doar în prezenţa carbohidratului respectiv şi în absenţa glucozei). În mod uzual streptococii piogeni sunt
sensibili la bacitracină. Sunt catalază negativi.
Streptococul piogen este distrus în 30 de minute la 56ºC, dar poate supravieţui în secreţii uscate, la
temperatura camerei şi întuneric timp de câteva săptămâni. Deoarece nu este sensibil la acţiunea
coloranţilor de tipul trifenil-metan, cristalul violet poate fi utilizat în mediile de cultură selective.
314
30. 2. 6. Structură antigenică
Streptococii hemolitici pot fi divizaţi în grupe serologice (peste 18 grupe serologice notate cu literele mari
ale alfabetului, A-U), pe baza carbohidratului C, prezent în structura peretelui multor streptococi (grupele
Lancefield). Specificitatea serologică a carbohidratului specific de grup este determinată de un zahar
aminat, care pentru streptococii de grup A este ramnoză-N-acetil-glucozamină, pentru grupul B
ramnoză-glucozamină-polizaharid etc. Cele mai importante sunt grupele A, B, C, F şi G (includ
streptococi β-hemolitici).
Streptococii beta-hemolitici din grupul A prezintă la nivel parietal proteina M, cel mai important factor de
patogenitate pentru acest grup streptococic. Anticorpii faţă de proteina M conferă imunitate specifică de
tip. Deoarece există mai mult de 100 de tipuri de proteină M (dar nu toate au şi proprietăţi de prevenire
a fagocitozei), o persoană poate face infecţii repetate cu S. pyogenes de grup A, de diferite tipuri.
Proteina M a fost identificată şi la streptococi din grupul G.
Alte structuri antigenice sunt reprezentate de către:
- proteina asociată proteinei M (MAP);
- substanţa T care permite diferenţierea anumitor tipuri de streptococi prin aglutinarea cu antiser
specific;
- peptidaza C5a (care clivează fragmentul C5a al sistemului complement);
- proteina R, care este un antigen de suprafaţă;
- proteina F, cu rol de adezină, ce interacţionează cu fibronectina;
- nucleoproteine (substanţe P) care probabil alcătuiesc cea mai mare parte din corpul streptococic;
- diferite toxine şi enzime:
1. streptokinaza (fibrinolizina) care transformă plasminogenul în plasmină; poate fi utilă în tratamentul
administrat intravenos în embolia pulmonară, tromboza arterială şi venoasă şi în infarctul miocardic acut;
este o structură antigenică;
2. streptodornaza (dezoxiribonucleaza) depolimerizează ADN-ul; după infecţii streptococice, în special
după infecţii ale pielii, apar anticorpi anti-Dn-ază;
3. hialuronidaza scindează acidul hialuronic, o componentă importantă a substanţei fundamentale din
ţesutul conjunctiv;
4. toxina eritrogenă solubilă, distrusă prin fierbere într-o oră, stă la originea rash-ului (erupţiei
caracteristice) care apare în scarlatină; toxina eritrogenă este elaborată numai de streptococii
lizogenizaţi; există un singur tip de toxină eritrogenă;
5. difosfopiridin nucleotidaza este o enzimă elaborată şi eliberată în mediu de unii streptococi;
6. hemolizinele (streptolizinele); Semnificaţia biologică a streptolizinei O este încă neclară. Se ştie că
administrată intravenos duce la animalele de laborator la deces în câteva secunde prin acţiunea sa
directă la nivel cardiac. Totuși, nu este cert că streptolizina S ar fi produsă și in vivo. (2)
În momentul de faţă se studiază modul în care SGB activează sistemul imun pe o altă cale, cale
descoperită în ultimii ani şi încă insuficient studiată, inflamazomul NLRP3. S-a descoperit, prin studii
efectuate pe şoricei, că celulele dendritice răspund la SGB prin secreţia de IL-1β şi IL-18. IL-1β necesită
pentru a se forma pro- IL-1β şi clivaj proteolitic dependent de caspaza 1. Aici intervine inflamazomul.
Acesta, la rândul lui, pentru a fi activat are nevoie de secreţia de β-hemolizină de către SGB. S-a
315
determinat şi faptul că atunci când inflamazomul cu toate compomentele sale lipseşte, şoriceii sunt mai
susceptibili la infecţie. (Figura nr. 2) (3)
Rezistenţa împotriva infecţiei streptococice are specificitate de tip. Imunitatea faţă de infecţia cu
streptococi de grup A este legată de prezenţa anticorpilor specifici anti-proteină M. Pentru că există mai
mult de 80 de tipuri de proteină M, o persoană poate face infecţii repetate cu S. pyogenes de grup A, de
tipuri diferite. Structura şi funcţia proteinei M au fost mult studiate. Molecula are o structură de tijă
încolăcită care separă domeniile funcţionale, permiţând astfel schimbarea unui număr mare de secvenţe
în timp ce funcţia este menţinută. Au fost identificate două clase majore (I şi II) de proteină M.
Anticorpii anti-proteină M pot fi identificaţi serologic.
Deoarece există un singur tip de toxină eritrogenă, în cazul infecţiei streptococice care duce la scarlatină
imunitatea după boală este durabilă, menţinându-se eventual chiar şi pentru toată viaţa.
În cursul infecţiilor streptococice apar anticorpi anti-streptolizină O; aceştia pot fi identificaţi prin teste
serologice (ex. reacţia ASLO). Titrul anticorpilor poate fi util în diagnosticarea bolilor streptococice şi
poststreptococice.
Proteina F are rol de adezină (se leagă de fibronectina celulelor gazdei) şi are un rol în invazivitate.
Proteina M reprezintă cel mai important factor antigenic şi de patogenitate pentru streptococul beta-
hemolitic din grupul A. Proteina M apare ca o excrescenţă la nivelul peretelui celular. Proteina M
formează structuri fibrilare care se extind cu 50-60 nm în afara celulei bacteriene, fiind ancorate cu
cealaltă extremitate în membrana citoplasmatică (există un grad de omologie cu proteina A
stafilococică). S-a dovedit experimental că atunci când proteina M este prezentă, streptococii sunt
virulenţi. În absenţa anticorpilor specifici de tip anti-proteină M, streptococii sunt capabili să reziste
fagocitării de către leucocitele polimorfonucleare. Proteina M este implicată şi în aderarea la celulele
epiteliale ale gazdei. Streptococii de grup A lipsiţi de proteina M sunt avirulenţi.
Se pare că proteina M şi probabil şi alte antigene streptococice au un rol important în patogeneza „febrei
reumatice” (reumatismului articular acut). Domeniile antigenice conservate din proteinele de clasă M (în
special clasa I) reacţionează încrucişat cu structuri ale muşchiului cardiac uman. Alte tipuri M au
similarităţi cu miozina, keratina sau α-tropomiozina.
Unele tulpini de S. pyogenes formează o structură capsulară compusă din acid hialuronic şi produc
colonii mucoide pe geloză-sânge (materialul capsular nu este imunogenic); poate avea rol în virulenţa
anumitor tulpini.
Hialuronidaza facilitează răspândirea microorganismelor infectante.
Difosfopiridin nucleotidaza este o enzimă elaborată şi eliberată în mediu de unii streptococi; această
substanţă permite microorganismului să distrugă leucocitele.
Toţi streptococii piogeni produc C5a peptidază, o serin-protează care scindează componenta C5a
(rezultată în cascada sistemului C’). C5a este unul dintre principalii factori care atrag PMN la sediul
procesului infecţios.
316
Toxina eritrogenă, elaborată numai de către streptococii beta-hemolitici din grupul A lizogenizaţi, este
implicată în patogenia erupţiei din scarlatina streptococică.
Erizipelul- apare atunci când poarta de intrare este reprezentată de tegument (formă
particulară de celulită); este caracterizat prin leziuni „lucioase”, eritemtoase, indurate, sub forma unei
plăci cu margini distincte; adesea este cauzat de streptococii de grup A şi mai rar de grupurile C sau G.
(Fotografia nr. 2)
Febra puerperalăse dezvoltă în cazul unei infecţii streptococice intrauterine.
Sepsisul streptococic - în 1992, American College of Chest Physicians şi Society of Critical Care
Medicine (ACCP/SCCM) au elaborat câteva criterii care pot orienta medicul spre a pune diagnosticul de
sepsis, criterii care au fost revizuite în 2001. (Tabelul nr. 2) (4)
Infecţiile osoase şi articulare;
Fasciita necrotizantă- inocularea poate fi de la nivelul pielii sau de la nivel intestinal.
Prevalenţă este mai ridicată la persoanele ce folosesc droguri pe cale intravenoasă. Este cunoscută și
drept gangrena streptococică, streptococul primind (în mass-media) numele de „bacteria mâncătoare
de carte”. Această entitate clinică poate avea determinare polimicrobiană, cu floră aerobă şi anaerobă,
incluzând şi Clostridium perfringens, Bacteroides spp. Când infecţia se localizează la nivelul perineului
se numeşte gangrena Fournier. Tabloul clinic include: febră, durere foarte intensă, eritem, tromboză la
nivelul microvascularizației care conduce la necroză, gangrenă, şoc si insuficienţă renală. În multe
dintre cazuri evoluția este nefastă, spre exitus. (Fotografia nr. 3)
Meningita etc.
Faringita streptococică care este cea mai obişnuită infecţie datorată streptococilor beta-
hemolitici. Streptococii virulenţi de grup A aderă la epiteliul faringian prin intermediul acidului
lipoteichoic. Fibronectina glicoproteică de la nivelul celulelor epiteliale serveşte probabil ca ligand
317
pentru acidul lipoteichoic. Extinderea la nivel amigdalian şi eventual la nivelul altor structuri poartă
numele de angină streptococică. Boala se manifestă cu durere în gât, rinofaringită, amigdalită „roşie”
şi purulentă (pultacee), ganglioni limfatici cervicali măriţi şi dureroşi, febră (39-40°C). Poate avea loc
(în special la copiii mici) extinderea infecţiei către urechea mijlocie, mastoidă şi meninge. De menţionat
că circa 10-20% din infecţii pot fi asimptomatice. (Figura nr. 4)
Impetigo streptococic reprezintă o infecţie localizată la nivelul straturilor superficiale ale pielii,
în special la copii. La majoritatea pacienţilor nu se găseşte o leziune predispozantă. Totuşi, amintim ca
factori de risc generali mediul umed şi igiena deficitară. Clinic avem de-a face cu vezicule, pustule sau
bule ce se rup şi formează o crustă gălbuie, durere uşoara sau disconfort şi prurit. (Figura nr. 5)
Celulita streptococică (aşa cum știm, poate fi şi stafilococica) este o infecţie acută a pielii şi
ţesutului subcutan. Clinic, pacientul se prezintă cu durere, eritem ce se extinde rapid, edem, febră,
limfadenopatie regională. Cel mai adesea este cauzată de S. pyogenes (infecţie difuză, rapid progresivă
datorată enzimelor secretate) dar la pacienţii diabetici este întâlnit şi S. agalactiae. Infecţia apare mai
des la nivelul membrelor inferioare, tipic unilateral. Peteşiile sunt adesea întâlnite, se pot dezvolta
vezicule şi bule ce se pot rupe. (Figura nr. 6)
Pneumonia poate fi rapid progresivă şi severă; de obicei apare ca o complicaţie, în urma unei
infecţii virale (de exemplu gripă, pojar etc.; infecţia cu virusul sinciţial respirator la copilul mic poate fi
urmată de asemenea de o pneumonie streptococică).
Endocardita infecţioasă poate fi acută sau subacută. În cazul endocarditei acute, în cursul
bacteriemiei streptococii pot coloniza valvele cardiace normale sau lezate anterior. Distrugerea rapidă a
valvelor, în lipsa tratamentului antibiotic corespunzător şi uneori a protezării valvulare, evoluează
frecvent spre un deznodământ fatal în zile sau săptămâni. Endocardita subacută implică mai frecvent
valvele anormale (malformaţii congenitale, leziuni reumatice sau aterosclerotice).
318
Bolile poststreptococice includ reumatismul articular acut (RAA), cardita reumatismală şi
glomerulonefrita acută poststreptococică (GNA).
După o infecţie acută cu streptococi beta-hemolitici de grup A urmează o perioadă de latenţă (circa 1-4
săptămâni), după care se pot dezvolta bolile poststreptococice.
Perioada de latenţă sugerează faptul că boala poststreptococică nu se datorează efectului direct al
diseminării bacteriene, ci reprezintă un răspuns în cadrul unei stări de hipersensibilitate care urmează
unor infecţii repetate, netratate sau tratate necorespunzător, cu streptococi piogeni, beta-hemolitici, din
grupul A.
30. 3. 4. 1.Glomerulonefrita acută poate apărea la circa 3 săptămâni după infecţia streptococică
(adesea tegumentară), în special dată de tipurile 12, 4, 2, 49, 59-61.
Glomerulonefrita se datorează unui mecanism de hipersensibilitate de tip III, prin producerea în exces
de complexe imune antigen-anticorp, care circulă şi se depun la nivelul membranei bazale glomerulare.
Toţi glomerulii sunt afectaţi, mari şi infiltraţi cu PMN, monocite şi eozinofile. În nefrita acută apar
hematurie microscopică şi macroscopică, proteinurie pâna la sindrom nefrotic, edeme la nivelul feţei (ex.
periorbitale), hipertensiune arterială, retenţie de uree, oligurie şi anurie, ascită, congestie sistemică
(dispnee, tuse, stază în jugulare, cardiomegalie, galop, edeme); nivelul complementului seric este
scăzut.
30. 3. 4. 2.Reumatismul articular acut (RAA) reprezintă cea mai serioasă sechelă a infecţiei
streptococice (tegumentară dar mai ales respiratorie - la care par să fie predispuşi cei cu grupa de sânge
A II), deoarece duce la afectarea valvelor şi a muşchiului cardiac. Anumite tipuri de streptococi de grup
A conţin antigene care reacţionează încrucişat cu structuri din ţesutul cardiac uman sau cu structuri de la
nivelul ganglionilor bazali.
RAA este precedat de o infecţie streptococică.
În patogenia RAA sunt incluse toate tipurile de hipersensibilitate, în special cele de tip II (citotoxică) şi
de tip IV (mecanism celular / întârziat), dar şi fenomene autoimune. Semnele şi simptomele specifice din
RAA includ febră, poliartrită migratorie şi semne legate de inflamaţia la nivel cardiac (cardita
reumatismală). (Tabelul nr. 3)
Nu dorim să intrăm în toate detaliile care vor fi studiate în cadrul modulului de cardiologie, dar dorim să
punctăm câteva aspecte. RAA este o boală inflamatorie acută neinfecţioasă, nesupurativă. Apare în
comunităţi aglomerate, nivel economic scăzut, igienă precară, alimentaţie defectuoasă, tulburări de
imunitate. Incidenţa maximă a fost înregistrată la grupele de vârstă 5-15 ani. Nu există predispoziţie de
sex dar leziunile cardiace sunt diferite în funcţie de sex.
2. Examinarea microscopică a produsului patologic include realizarea a două frotiuri din produsul
patologic recoltat şi transportat corespunzător, care se vor colora cu albastru de metilen (AM) şi
respectiv Gram. Frotiurile se examinează la microscopul optic cu imersie şi se notează
prezenţa celulelor de la nivel faringian, prezenţa celulelor inflamatorii (ex. leucocite, piocite) şi
prezenţa cocilor Gram-pozitivi aşezaţi separat, în perechi sau în lanţuri, dar şi a altor tipuri de
microorganisme. Examenul microscopic al p.p. are doar un rol orientativ.
3. Cultivarea pe medii de cultură a produsului patologic se realizează în aşa fel încât să se poată
obţine colonii izolate şi respectiv o cultură pură, care se va identifica (vezi şi anexa nr. 2). Streptococii
piogeni sunt germeni pretenţioşi care nu se dezvoltă pe medii de cultură obişnuite. Mediul cel mai
frecvent folosit este agar-sânge, pe care cultura apare în 18-48 ore, la 35-37°C. În cazul în care nu
remarcăm apariţia de colonii caracteristice după 24 de ore, reincubăm placa Petri pentru încă o zi.
320
Coloniile au aspect de tip S cu diametrul de 0,5-1 mm, înconjurate de o zonă de β-hemoliză (zonă
clară de hemoliză, cu un diametru mult mai mare decât diametrul coloniei). În cursul însămânţării, pe cel
puţin una dintre laturile „poligonului” descris trebuie să realizăm şi o înţepare a mediului în aşa fel încât
inoculul să ajungă mai în profunzime. Această manevră (există şi alte variante tehnice) este necesară
pentru a permite activitatea hemolizinei O (hemolizina O este inactivată în prezenţa oxigenului). Speciile
care produc material capsular, din acid hialuronic, adeseori dau naştere unor colonii mucoide (de tip M).
Se pot folosi pentru cultivare şi medii selective (de ex. agar-sânge plus trimetoprim-sulfametoxazol).
Caractere morfotinctoriale: Sunt coci Gram-pozitivi, sferici sau ovoidali, cu diametrul de circa
1µm. Se divid într-un plan perpendicular pe axa lor lungă şi se pot dispune în lanţuri (de până la 50
elemente). Lungimea lanţurilor variază şi este condiţionată de factori de mediu.
Caractere de cultură: Produc colonii de tip S cu diametrul de 0,5-1 mm, înconjurate de o
zonă de β-hemoliză sau colonii de tip M.
Caractere biochimice:
Caractere antigenice:
o Se pot utiliza teste comerciale pentru detectarea rapidă a polizaharidului specific de grup
A al streptococilor piogeni în p.p., după extracţie chimică sau enzimatică (ex. cu pronază). Tehnicile
utilizate pot fi aglutinarea indirectă (latex-aglutinare), coaglutinarea sau ELISA.
o Prin reacţii de aglutinare (latexaglutinare, coaglutinare) pe lamă, sau precipitare se pot
determina antigenele streptococice de grup (Lancefield) sau de tip.
o S. pyogenes este împărţit în serotipuri pe baza antigenelor proteice M (peste 100 de
serotipuri) prin reacţia de precipitare în tuburi capilare şi T (peste 28 serotipuri) prin reacţia de
aglutinare pe lamă. Aceste testări se fac în centre de referinţă.
Alte teste utilizate în identificare:
o Se pot utiliza sondele nucleotidice pentru detectarea directă a streptococilor de grup A în
exsudatul faringian.
o După amplificare genică (PCR) pot fi identificate secvenţele genetice care codifică pentru
diferitele tipuri de proteină M (genele enm). Au fost descoperite peste 120 de secvenţe genetice
diferite, această metodă fiind mai discriminativă în comparaţie cu metoda clasică, de tipizare a S.
pyogenesşi tinde să completeze şi eventual să înlocuiască această metodă.
321
o Relativ recent a fost propusă tehnica MLST (multilocus sequence typing), accesibilă
unorcentre de referinţă.
5. Streptococii piogeni îşi menţin sensibilitatea cunoscută la penicilină (au fost identificate în ultima
perioadă tulpini „tolerante”, care sunt inhibate dar nu distruse de către penicilină, 2003).
Pentru pacienţii cu hipersensibilitate ("alergici") la beta-lactamine se poate alege pentru tratament
eritromicina, dar au fost identificate tulpini rezistente la acest medicament antimicrobian şi în acest caz
antibiograma devine necesară. În general antibiograma se realizează în scop epidemiologic, pentru
supraveghere şi cercetare.
Diagnosticul serologic este util pentru certificarea etiologiei bolilor poststreptococice (RAA, GNA),
identificarea unei eventuale stări de hipersensibilitate, diagnosticul retrospectiv al unei infecţii
streptococice, evaluarea evoluţiei clinice şi eficacităţii tratamentului.
Pentru stabilirea diagnosticului pozitiv al RAA sau al GNA, criteriile de diagnostic sunt mai complexe,
dar includ dovedireaprin metode de laborator a unei infecţii streptococice în antecedente.
Diagnosticul serologic se realizează de obicei, în România, prin reacţia ASLO, care identifică titruri ale
anticorpilor anti-streptolizină O (vezi şi capitolul 22). Testarea se face în dinamică, pe seruri recoltate la
interval de 7-10 zile.
Pentru zona noastră geografică se acceptă ca normal un titru de 200 (maxim 250) unităţi ASLO.
Este strict necesară realizarea controlului intern şi extern de calitate.
Tot strict necesară este evaluarea rezultatelor în contextul clinic.
Există teste serologice pentru determinarea prezenţei şi titrului anticorpilor faţă de alte structuri
antigenice (streptodornază, hialuronidază, streptokinază). Titrul anticorpilor anti-streptodornază este
crescut la pacienţii cu infecţii tegumentare şi trebuie investigat dacă se suspicionează prezenţa unei
glomerulonefrite acute. Se pot determina şi anticorpii anticarbohidrat (hemaglutinare pasivă) sau anti-
MAP (prin latex aglutinare).
322
31. Streptococcus pneumoniae
31. 1. Definiţie. Încadrare
Streptococcus pneumoniae se prezintă sub formă de coci Gram-pozitivi, alungiţi, lanceolaţi, dispuşi
în general în diplo pe axul longitudinal, încapsulaţi, nesporulaţi, imobili. Pneumococii sunt aerobi,
facultativ anaerobi. Pe geloză-sânge determină a-hemoliză, la fel ca Streptococcus viridans. Creşterea îi
este favorizată în atmosferă de 5% CO2 la o temperatură de 37°C.Streptococcus pneumoniae este unul
dintre principalele microorganisme implicate în etiologia otitei medii şi în alte infecţii respiratorii,
incluzând pneumonia. Meningita pneumococică reprezintă însă o entitate nosologică redutabilă.
Una dintre marile probleme terapeutice decurgând din dezvoltarea rezistenţei la antibiotice o
reprezintă apariţia pneumococilor rezistenţi la penicilină şi alte medicamente antimicrobiene. Gravitatea
acestei situaţii rezultă din incidenţa crescută a pneumoniilor pneumococice (40 - 50% din etiologia
pneumoniilor comunitare) şi din valorile extrem de alarmante ale incidenţei tulpinilor de pneumococi
penicilino - rezistenţi (20-40% din tulpinile izolate în Europa Occidentală sau în America de Nord), uneori
cu multirezistenţă la antibiotice.
324
- hemolizina intracelulară (pneumolizina), eliberată prin autoliză (inhibă chemotactismul pentru PMN,
inhibă proliferarea limfocitelor şi sinteza de anticorpi);
- proteinele de suprafaţă (PspA) care au unele asemănări cu proteina M de la S. pyogenes;
- neuraminidazele (NanA şi NanB) şi hialuronidaza.
Deoarece circa 30-70% din oameni pot fi la un moment dat purtători de pneumococi, mucoasa
respiratorie normală are un grad important de rezistenţă naturală faţă de aceste microorganisme. Printre
factorii care predispun la infecţie ar fi de menţionat:
- anomalii constituţionale sau dobândite ale tractului respirator (infecţii virale, alergii locale,
obstrucţii bronşice, afectări ale tractului respirator datorate unor substanţe iritante etc.);
- intoxicaţia cu alcool sau droguri, care deprimă activitatea fagocitară şi reflexul de tuse;
- consumul de tutun (fumatul);
- malnutriţia, debilitatea generală, hiposplenismul sau deficienţele sistemului complement.
325
bacilliformis etc. Există şi o specie (N. elongata) în care tulpinile au aspect cocobacilar şi sunt oxidază-
negative (1).
Pe baza studiilor filogenetice, speciile Neisseria au fost clasificate în cinci grupe şi anume: N.
meningitidis, N. flavescens, N. cinerea, N. pharyngis şi N. elongata (12 specii în total).
326
N. gonorrhoeaese poate găsi la nivelul mucoaselor genitale la gazdele infectate (indiferent dacă
infecţia este sau nu simptomatică). A fost remarcată pentru prima dată de Albert Neisser (1879): coci
intra-leucocitari la examenul secreţiei purulente din uretra masculină, la pacienţi cu gonoree. Cultivarea
a fost realizată cu 3 ani mai târziu. Cea mai recent definită subspecie de N. gonorrhoeae a fost
identificată în secreţii conjunctivale (N. gonorrhoeae subspecia kochii).
Nivele crescute de Lactobacillus, genul dominant în microbiota vaginală, au fost evidenţiate în
strânsă legătură cu un risc scăzut de infectare în urma expunerii la N. gonorrhoeae. Lactobacillus scade
aderenţa N. gonorrhoeae cu până la 50% şi inhibă invazia celulelor epiteliale cu până la 60%. Mai mult
decât atât, lactobacilii au posibilitatea să disloce gonococii aderaţi ceea ce ne poate conduce cu la ideea
că ar putea ajuta la profilaxia postexpunere. (5)
N. meningitidis a fost izolată la persoane sănătoase de la nivel nazal sau faringian. La pacienţii cu
meningită meningococică, germenul se multiplică în lichidul cefalorahidian (LCR). A fost izolată pentru
prima dată în anul 1887 din LCR de la un pacient cu meningită acută.
În prima decadă a secolului 20 meningita meningococică netratatată avea o rată a mortalitaţii de
75-80%. În 1913, Simon Flexner a fost primul care a gândit o formă de terapie folosind serul
antimeningococic cabalin intratecal. Mortalitatea a fost redusă la 31% pe un lot de 1.300 pacienţi. În
perioada 1928-1936 169 de copii au fost trataţi în acest fel la spitalul Bellevue din New York iar
mortalitatea a scăzut la 20%. În 1930 odată cu introducerea sulfonamidelor mortalitatea a scăzut la 5-
15%. Totuşi, odata cu ”era antibioticelor” a început şi ”era rezistenţei la antibiotice”. (6)
Atât adulţii cât şi copiii pot fi colonizaţi de mai multe specii de Neisserii, în acelaşi timp (de
ex. Neisseria spp. nepatogene şiN. meningitidis). Neiseriile saprofite / comensale au fost descrise pentru
prima dată în 1906, purtând iniţial alte denumiri. Ceea ce este relativ interesant, N. flavescens (1930)
şi N. lactamica (1969) au fost izolate din LCR, motiv pentru care se presupune că pot determina
meningită. Ultima specie de Neisseria a fost definită în 1993, drept N. weaweri (numele iniţial fiind
grupul CDC M-5; de origine canină şi rar izolată din rănile pacienţilor muşcaţi de câini).
În continuare vor fi prezentate doar două dintre speciile enumerate, respectiv N. gonorrhoeae şi N.
meningitidis, microorganisme cu necesităţi nutritive complexe şi care se pot dezvolta doar la 35-37ºC.
32. 2. 2. Caractere morfotinctoriale
Atât meningococul cât şi gonococul sunt diplococi Gram-negativi, reniformi, imobili, înconjuraţi de o
structură capsulară comună, cu o structură de polifosfat sau polizaharid-polifosfat (în cazul
meningococului), situaţie în care capsula este mai evidentă. (Figura nr. 1 și Figura nr. 2) În funcţie de
structura capsulei există mai multe serogrupuri.
32. 2. 3. Caractere de cultură
Ambele microorganisme au nevoie în vederea izolării de utilizarea unor medii de cultură îmbogăţite,
necesităţile nutritive fiind mult mai mari în cazul gonococului (există tulpini de meningococ care se pot
dezvolta pe medii simple, cu săruri minerale, lactat şi aminoacizi). Principial se pot multiplica în cazul
folosirii mediului Mueller-Hinton (amintit şi la antibiograma difuzimetrică), la o temperatură de incubare
de 35-37ºC şi în condiţiile unei atmosfere de 3-10% CO 2. (Figura nr. 3, exsicatorul) Gonococul nu se
multiplică în lipsa unor surse energetice (glucoză, piruvat, lactat). Coloniile apar în 24-48 de ore, mai
rapid în cazul meningococului.
Gonococul produce colonii de tip S, cu dimensiuni de 0,5-1 mm sau colonii de tip M, nepigmentate,
transparente sau opace. Este de remarcat faptul că în aceeaşi placă pot apărea până la cinci tipuri de
327
colonii (T1-T5), ceea ce poate facilita identificarea. Placa este eliminată în cazul în care nu se dezvoltă
colonii după 72 de ore.
Coloniile de meningococ sunt de tip S, cu dimensiuni de circa 1 mm. Tulpinile încapsulate (A, C) pot
conduce la apariţia unor colonii de tip M.
32. 2. 4. Caractere biochimice
Metabolizează diferiţi carbohidraţi, activitate care poate fi utilă în identificare. Spre exemplu,
gonococul poate metaboliza glucoza (nu şi maltoza), în timp ce meningococul metabolizează ambele
zaharuri menţionate. (Figura nr. 4)
Produc citocrom-oxidază, ceea ce reprezintă un test cheie în identificare; se utilizează de exemplu
benzi de hârtie de filtru îmbibată cu reactiv, respectiv tetrametil-p-fenilendiamină. Reacţia pozitivă apare
în circa 10 secunde (vezi şi anexa nr. 2). (Figura nr. 5)
32. 2. 5. Rezistenţa faţă de factori fizici şi chimici
Neisseriile implicate în patologia umană sunt foarte sensibile la uscăciune, lumină solară şi la variaţii
de temperatură, precum şi la majoritatea antisepticelor şi dezinfectantelor. Produc enzime autolitice.
32. 2. 6. Structură antigenică
În cazul germenilor Gram-negativi, la nivelul membranei externe se găseşte lipopolizaharidul
(endotoxina). Spre deosebire de lipopolizaharidul (LPZ) din structura enterobacteriilor, care conţine
multiple unităţi repetitive, neisseriile au lanţuri zaharidice scurte, motiv pentru care denumirea corectă ar
fi cea de lipooligozaharid (LOZ). În funcţie de structura lipooligozaharidului există mai multe serotipuri,
6 în cazul gonococului şi 12 în cazul meningococului. Gonococii pot exprima simultan mai multe structuri
antigenic diferite.
Lipopolizaharidul (lipooligozaharidul) a fost denumit şi endotoxină, deoarece este eliberat din perete
după distrugerea germenilor. Lipooligozaharidul se fragmentează în lipidul A (responsabil pentru
toxicitate) şi respectiv în polizaharidul (oligozaharidul) O.
Neisseria gonorrhoeae
În cazul gonococului heterogenitatea antigenică este remarcabilă. Acest microorganism este capabil
să îşi modifice structurile de suprafaţă „in vitro” (probabil şi „in vivo”), evitând mecanismele de apărare
ale gazdei. Ar fi de menţionat şi următoarele structuri antigenice:
- pilii, cu rol în ataşarea de celulele gazdei, care protejează gonococul faţă de fagocitoză şi au o
structură proteică. Capătul C-terminal are o structură variabilă. Pilinele diferă de la o tulpină la alta şi
chiar în cazul aceleaşi tulpini (există sute de tipuri de piline posibile). Există şi pili cu rol în procesul de
conjugare genetică;
- mai multe tipuri de proteine, spre exemplu porinele (proteina I), care formează pori la suprafaţa
celulei bacteriene. Fiecare tulpină prezintă un tip de porină, dar porinele diferă de la o tulpină la alta.
Această structură este utilă pentru serotiparea gonococilor. Proteina II (OPA) este identificată la tulpinile
care produc colonii opace şi este utilă pentru aderarea gonococului.
- proteina care leagă fierul (iron binding protein) este similară ca greutate cu porinele; se exprimă
atunci când aportul de Fe este insuficient;
- adezina cu greutate moleculară 36 kDa;
328
- proteina Rmp, o proteină localizată la suprafaţa membranei externe; are secvenţe care prezintă
omologie parţială cu proteine identificate la Shigella dysenteriae sau E. coli; anticorpii anti-Rmp pot fi
puşi în evidenţă la pacienţi sau convalescenţi cu gonoree, la nivel sanguin sau în secreţiile genitale;
- IgA1 proteaza;
- pseudo-capsula din polifosfat;
- proteine de stres asemănătoare proteinelor de şoc termic Hsp60.
Variaţia antigenică este importantă, cu o valoare de circa 10 -3 (pentru OPA, LOZ, piline) şi este utilă
pentru eludarea mecanismelor de apărare ale gazdei. De menţionat prezenţa anumitor plasmide
implicate în rezistenţa la antibioticele beta-lactamice.
Gonoreea apare adesea în cadrul coinfecţiei cu HIV. LOZ induce imunitatea înnăscută legându-se de
TLR4. S-au investigat efectele LOZ din 5 tulpini diferite de Neisseria gonorrhoeae asupra infecţiei HIV şi
a provirusului din macrofage. Macrofagele care conţineau LOZ au devenit rezistente la infecţia HIV şi la
provirus. (7)
Neisseria meningitidis
În cazul meningococului, pe lângă LOZ mai este important de menţionat structura capsulară, care
permite subdivizarea speciei în 13 serogrupuri. Dintre aceste grupuri serologice (notate cu litere), mai
importante datorită implicării în patologie sunt grupele: 29E, A, B, C, H, I, K, L, X, Y, Z şi W-135.
Vaccinurile conţin numai o parte dintre aceste antigene.
Atât pilii, cât şi tipurile de proteine menţionate mai sus sunt prezente şi în cazul meningococului
(piline de clasa I şi II, porine de clasa 1, 2 şi 3, proteina Rmp, proteina OPA de clasă 5 etc), însă fără
fenomenele de variaţie antigenică (genetică) menţionate.
32. 2. 7. Răspuns imun
În infecţiile cu gonococ apare un răspuns imun, dar datorită fenomenelor prezentate mai sus,
practic nu există imunitate postinfecţioasă; aceeaşi persoană poate face infecţii repetate.
În cazul meningococului, imunitatea este asociată cu prezenţa serică a anticorpilor anti-capsulari,
anti-lipooligozaharid şi anti-membrană externă, care apar după infecţii subclinice. Nou-născuţii sunt în
general protejaţi datorită anticorpilor de tip IgG proveniţi de la mamă. Infecţiile meningococice
reprezintă o problemă în special pentru persoanele care au un deficit al sistemului complement (mai ales
componentele C6-C9).
LCR conţine molecule implicate în imunitatea înnăscută (ex. sistemul complement), molecule
esenţiale în controlul infecţiei şi în activarea infiltrării cu fagocite (neutrofile, monocite). Totuşi, celulele
epiteliale ale stratului ependimal care intră în structura tubului neural sau ale plexului coroid ar putea fi
foarte vulnerabile la atacul citotoxic şi citolitic al componentelor complementului. Un studiu publicat în
2006 (8) a arătat capacitatea celulelor epiteliale cerebrale de a exprima la nivelul membranei receptori
pentru reglarea activității complementare (CD35, CD46, CD55, CD59). Prin studii de dublă
imunofluorescenţă pentru markeri ai celulelor ependimale (GFAp, S100, ZO-I) şi ai receptorilor pentru
reglarea complementului s-a ajuns la concluzia că aceste celule au o cantitate mare de CD55 şi CD59 şi
mai mică de CD46 şi CD35. La nivel tisular s-a observat că CD55 era slab exprimat la nivelul plexurilor
coroide şi celulelor ependimale de control dar exprimarea era crescută în meningită. Anti-CD59 era
prezent la nivelul ambelor epitelii în timp ce CD59 a fost identificat doar la nivelul plexurilor coroide
inflamate. CD46 şi CD35 nu au fost identificate în ţesuturile de control. Pe de altă parte, în meningită
329
aceste molecule erau puternic exprimate. Acest studiu arată posibilitatea structurilor cerebrale de a
raspunde şi susţine imunitatea înnăscută mediată de complement. (8)
Anumite defecte ale sistemului complement au fost asociate cu o creştere a incidenței infecţiilor
cu Neisseria meningitidis.S-au făcut teste în acest sens şi s-a recoltat sâange şi ser de la pacienţi adulţi
care aveau deficit complet de C2 sau C5. Pacienţii aveau de asemenea deficit de mannose-binding lectin
(MBL). Proliferarea meningococilor introduşi în sânge a fost evaluată prin numărul de CFU ( colony-
forming unit) şi prin Real-time PCR. S-a investigat activitatea bactericidă serică şi cea opsono-fagocitică
a granulocitelor incluzând ser inactivat termic postvaccinare pentru a evalua influenţa anticorpilor
antimeningococici. Proliferarea meningococică a fost de 2log 10 pentru CFU şi 4 sau 5log10 copii ADN.
Proliferarea a scăzut moderat după corectarea deficitului de C2, dar după corectarea deficitului de C5
toţi meningococii au fost distruși (remarcându-se și un titru mare de anticorpi). Activitatea opsono-
fagocitică a fost strict dependentă de C2, a apărut în serul normal şi a crescut în serul postvaccinare.
Activitatea bactericidă serică a depins doar de C2, C5 şi titrul anticorpilor. MBL nu a influenţat în nici un
fel aceşti parametri. (9)
Imunitatea adaptativă este pilonul cel mai important. Ţesutul limfoid asociat nazofaringelui (NALT)
este locul principal al răspunsului imun. LTCD4+ interacţionează în cele din urmă cu LB şi duc la secreţie
de IgA şi IgG. IgA facilitează clearance-ul microciliar, aglutinarea patogenilor şi împiedicarea adeziunii
epiteliale precum şi neutralizarea toxinelor secretate. (10)
32. 2. 8. Caractere de patogenitate
În cazul ambelor microorganisme, patogenitatea se datorează existenţei factorilor care permit
ataşarea de celulele gazdei, multiplicării la poarta de intrare şi respectiv capacităţii de invazivitate.
Prezenţa capsulei şi a lipooligozaharidului contribuie în mod diferenţiat (mai important în cazul
meningococului) în patogenia bolilor produse.
Pentru câteva detalii, luăm în discuție Neisseria meningitidis unde aderarea are loc la nivelul
nazofaringelui. Acest prim pas este mediat de pili. Aceştia se pare că se leagă de o proteină reglatoare a
complementului de pe membrana celulară, CD46. Pilii duc la modificări post-transcripţionale în cele din
urmă glicozilarea acestora poate accelera detaşarea bacteriană de pe suprafaţa celulei unde deja s-au
format colonii. Prin alterearea acestui mecanism, de adeziune, bacteriile scapă din agregate şi pot
disemina şi forma noi agregate în noi locuri. (11)
Pentru a particulariza doar o parte din fenomenele desfășurate în cursul procesului infecțios, vom
lua drept exemplu infecția cu N. meningitidis. În timpul invaziei, meningococul se localizează preferenţial
în capilarele cerebrale unde viteza de curgere a sângelui este redusă, la fel ca în capilarele din
nazofaringe, viteza căreia trebuie sa îi reziste în timpul colonizării. De asemenea, el trebuie să reziste şi
forţelor mecanice, mucusului, răspunsului inflamator şi tusei. Prin intermediul anumitor structuri pe care
le deține, meningococul duce la polimerizarea actinei şi auto-protecţie (formarea unor structuri de
protecție). În plus, meningococii formează la suprafaţa celulei biofilme alcătuite din lipide şi polizaharide
(evitând astfel contactul cu sistemul imun). Procesul poate continua pe 2 căi: transcelulară sau
paracelulară.
Nu doar LOZ este util în aderare, dar şi de proteinele Opa şi Opc. Opc se leagă de proteinele
matrixului extracelular, precum vibronectina. Opa se leagă de moleculele de adeziune celulară a
antigenului carcinoembrionar, de heparan sulfat şi integrine.
330
O altă moleculă cu o importanţă foarte mare este TspA (T-cell stimulating protein A) care duce la
proliferarea LT și LB. Nu este cunoscut bine mecanismul de acțiune.
Luând în discuție capsula, portajul este favorizat de pierderea capsulei (aceasta inhibă aderenţa şi
formarea biofilmului), în schimb, în cursul procesului infecțios prezența capsulei este necesară (11).
331
32. 4. Diagnostic de laborator
Diagnosticul de laborator este bacteriologic (direct) atât în gonoree cât şi în meningita
meningococică, dar trebuie să fie orientat de examenul clinic. În cazul meningitei, de mare importanţă
este utilizarea unor examene paraclinice complementare.
32. 4. 1. În gonoree, recoltarea produsului patologic se realizează diferenţiat (într-o oarecare
măsură) în funcţie de vârstă, sex şi de practicile sexuale ale individului infectat. În cazul gonoreei la
femei, recoltarea se va face de la nivelului colului uterin. La bărbaţi, recoltarea se va face de la nivelul
uretrei, eventual utilizând un tampon steril uretral, introdus cu blândeţe circa 2 cm în uretra anterioară.
Transportul trebuie realizat foarte rapid (şi în condiţii care să permită supravieţuirea microorganismului)
sau pe medii speciale de transport, dar ar fi de preferat inocularea imediată pe mediul de cultură.
Diagnosticul de laborator este bacteriologic (direct).
1. Recoltarea şi transportul produsului patologic trebuie să se realizeze respectând regulile
cunoscute (cât mai aproape de debutul bolii, înainte ca pacientului să fi primit antibiotice, cât mai rapid
şi corect din punct de vedere al tehnicilor utilizate, respectând toate normele de asepsie şi antisepsie
etc). La bărbat se prelevează secreţia uretrală (eventual „picătura matinală”), iar la femeie recoltarea
trebuie efectuată pe masă ginecologică de la nivelul colului uterin şi glandelor Bartholin (vezi şi
anexa nr. 2, A. 6. 1.). Secreţiile au de obicei un aspect purulent. Este de preferat cultivarea imediat, pe
medii de cultură potrivite şi în atmosferă de CO2. În cazul în care p.p. urmează a fi transportat către
laborator, transportul trebuie realizat fără întârziere (la o temperatură apropiată de 37°C). Chiar şi în
cazul utilizării mediilor de transport (ex. mediul Amies plus cărbune activat), acesta nu ar trebui să
dureze mai mult de 6 ore. Gonococul ar putea fi izolat şi prin hemocultură, cultivarea secreţiilor
conjunctivale, faringiene, cultivarea urinei etc. În cazul în care nu există nici o secreţie, se poate utiliza
urina care trebuie centrifugată şi însămânţată imediat pe medii de cultură.
2. Examinarea microscopică a produsului patologic include realizarea a minim două frotiuri din
produsul patologic recoltat şi transportat corespunzător, care se vor colora cu albastru de metilen (AM)
şi respectiv Gram. Frotiurile se examinează la microscopul optic cu imersie şi se notează prezenţa
celulelor, a celulelor inflamatorii (ex. leucocite) şi prezenţa cocilor Gram-negativi, dispuşi în diplo,
reniformi, imobili, înconjuraţi de o structură capsulară comună, situaţi intra sau extraleucocitar. Aspectul
microscopic este acelaşi ca şi în urmă cu aproape 130 de ani.
3. Cultivarea pe medii de cultură a produsului patologic se realizează în aşa fel încât să se poată
obţine colonii izolate şi respectiv o cultură pură, care se va identifica (vezi şi anexa nr. 2). Gonococii
sunt germeni pretenţioşi, care nu se dezvoltă pe medii simple, sunt aerobi, facultativ anaerobi. Se pot
utiliza medii selective (ex. medii în care se include vancomicină, colistin, trimetoprim şi nistatin) sau
neselective (ex. mediul GC, geloză-sânge sau geloză-chocolate cu diferite suplimente nutritive; se
recomandă utilizarea pulberii de hemoglobină şi nu a sângelui proaspăt). Este preferată cultivarea „în
dublu”, pe medii selective şi neselective; în cazul în care p.p. este reprezentat de secreţie de la nivelul
rectului sau de secreţie faringiană se vor folosi numai medii selective. Este necesară o atmosferă de 3-
10% CO2, la o temperatură de 35-37°C. Coloniile apar în 24-48 de ore. Gonococul produce colonii de tip
S, cu dimensiuni de 0,5-1 mm sau colonii de tip M, nepigmentate, transparente sau opace. Este de
remarcat faptul că în aceeaşi placă pot apărea până la cinci tipuri de colonii (T1-T5), ceea ce poate
facilita identificarea. Placa este eliminată în cazul în care nu se dezvoltă colonii, după 72 de ore.
332
4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor caractere:
333
preferat realizarea unei cultivări „la patul bolnavului”, chiar dacă pentru concentrarea germenilor este
necesară centrifugarea LCR. Analiza citologică şi biochimică a LCR este utilă în stabilirea etiologiei.
Diagnosticul de laborator este bacteriologic (direct).
1. Recoltarea şi transportul produsului patologic trebuie să se realizeze respectând regulile
cunoscute (cât mai aproape de debutul bolii, înainte ca pacientului să fi primit antibiotice, cât mai rapid
şi corect din punct de vedere al tehnicilor utilizate, respectând toate normele de asepsie şi antisepsie
etc). Aşa cum am menţionat, recoltarea LCR prin puncţie (după verificarea presiunii din artera centrală
a retinei prin examinarea fundului de ochi) trebuie făcută pe cât posibil la patul bolnavului, având la
dispoziţie tot ce este necesar pentru pregătirea frotiurilor, cultivarea pe diferite medii de cultură,
repartizarea unei cantităţi de LCR pentru examenul citologic şi biochimic (vezi şi anexa nr. 6). LCR poate
fi purulent. În cazul în care p.p. urmează a fi transportat către laborator, transportul trebuie realizat fără
întârziere (la o temperatură apropiată de 37°C). Meningococul ar putea fi izolat şi prin hemocultură,
cultivarea secreţiilor nazale sau faringiene etc. Prezenţa meningococului poate fi detectată direct în
produsul patologic prin latex aglutinare, coaglutinare sau contraimunoelectroforeză utilizând seruri
polivalente anti - A, C, Y, W-135 şi respectiv seruri monovalente anti - B (care pot fi utile şi în
identificarea „încrucişată” a antigenului K1 al E. coli).
2. Examinarea microscopică a produsului patologic include realizarea a minim două frotiuri din
produsul patologic recoltat şi transportat corespunzător, care se vor colora cu albastru de metilen (AM)
şi respectiv Gram. Dacă LCR este franc purulent, frotiurile se pot executa direct din p.p., în caz contrar
realizăm iniţial centrifugarea LCR. Frotiurile se examinează la microscopul optic cu imersie şi se notează
prezenţa celulelor inflamatorii (ex. leucocite) şi prezenţa cocilor Gram-negativi, dispuşi în diplo,
reniformi, imobili, înconjuraţi de o structură capsulară comună, situaţi intra sau extraleucocitar.
3. Cultivarea pe medii de cultură a produsului patologic se realizează în aşa fel încât să se poată
obţine colonii izolate şi respectiv o cultură pură, care se va identifica (vezi şi anexa nr. 2).
Meningococii sunt germeni pretenţioşi, care nu se dezvoltă pe medii simple, sunt aerobi, facultativ
anaerobi. Se pot utiliza medii selective (ex. medii în care se include vancomicină, colistin, trimetoprim şi
nistatin) sau neselective (ex. Mueller-Hinton, geloză-sânge sau geloză-chocolate) pe care formează
colonii de tip S sau de tip M. Este necesară o atmosferă de 3-5% CO2, la o temperatură de 37°C.
4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor caractere:
· Caractere morfotinctoriale: Sunt coci Gram-negativi, dispuşi în diplo, reniformi, imobili,
înconjuraţi de o structură capsulară comună, nesporulaţi.
· Caractere de cultură: Coloniile de meningococ sunt de tip S, cu dimensiuni de circa 1-2 mm.
Tulpinile încapsulate (ex. grupele A, C) pot conduce la apariţia unor colonii de tip M.
· Caractere biochimice:
Metabolizează diferiţi carbohidraţi, activitate care poate fi utilă în identificare. Spre exemplu meningococul
metabolizează atât glucoza cât şi maltoza.
Produc citocrom-oxidază, un test cheie în identificare (vezi anexa nr. 2)
Există o serie de sisteme comerciale pentru identificare exoenzimatică a Neisseriilor (ex. Quad Ferm+, RIM,
Minitek etc).
· Caractere antigenice: În funcţie de structura lipooligozaharidului există 12 serotipuri. Cel mai
important determinant antigenic este capsula polizaharidică. Structura capsulară permite subdivizarea
speciei în 13 serogrupuri. Dintre acestea mai importante sunt grupele: A, B, C, Y şi W-135.
334
Prezenţa meningococului poate fi detectată direct în produsul patologic prin latex aglutinare,
coaglutinare sau contraimunoelectroforeză utilizând seruri polivalente anti -A, C, Y, W-135 şi respectiv
seruri monovalente anti-B (se pot detecta 0,02-0,05 mg de Ag / ml). De notat posibilitatea unei
reactivităţi încrucişate faţă de Ag grupului B, respectiv Ag K1 de la E. coli.
Tehnici similare se pot utiliza pentru identificarea tulpinilor de meningococ izolate în cultură.
· Caractere utilizate în tiparea (tipizarea) tulpinilor izolate: Există diferite tehnici (imunologice,
electroforetice, de biologie moleculară) care sunt practicate numai în centre de referinţă. Utilizarea PCR
are o sensibilitate şi specificitate de circa 91%; foarte utilă la pacienţii pentru care s-a iniţiat deja
antibioticoterapia.
5. Antibiograma (testarea sensibilităţii tulpinilor izolate în vederea stabilirii tratamentului) este
recomandată şi se realizează de obicei prin metode difuzimetrice. Majoritatea tulpinilor de meningococ
au rămas sensibile la penicilină. Totuşi, realizarea antibiogramei poate fi utilă, orientând continuarea
tratamentului. În cazul unor infecţii grave antibiograma trebuie să fie însoţită de alte determinări (vezi
capitolul 14).
32. 5. Tratament
Pentru tulpinile de gonococ sensibile se putea utiliza penicilina, având ca alternativă spectinomicina
sau ceftriaxona. În momentul actual unica atitudine corectă este izolarea tulpinii și tratamentul conform
antibiogramei. Ca o regulă generală este de reţinut că este strict necesar ca tratamentul să fie aplicat
tuturor partenerilor sexuali.
În meningita cu meningococ pot fi utile penicilina G, ceftriaxona sau cloramfenicolul, dar nu trebuie
neglijată utilitatea antibiogramei. Foarte recent (2007-2008), au fost identificate în SUA tulpini de
meningococ rezistente la ciprofloxacină. În meningită tratamentul este mai complex, avându-se în
vedere posibilele complicaţii.
335
discuţie cu circa 3 secole înainte de Hristos. Salmonella typhi a fost descrisă în 1884, iar Yersinia pestis,
după încă 10 ani.
Dacă în 1974, familia includea 12 genuri şi 36 de specii, iar în 1994, 30 de genuri şi 107 specii, în
momentul de faţă familiaEnterobacteriaceae cuprinde peste 40 de genuri de microorganisme
semnificative din punct de vedere medical şi peste 150 de specii (în cazul în care nu luăm în considerare
clasificarea genului Salmonella în peste 2.390 de specii) (vezi şi A.6.5.1. şi capitolele 37-42).
33. 2. Caractere generale
33. 2. 1. Habitat
Enterobacteriile se pot găsi în apă, pe sol, pe plante sau pot coloniza în mod normal intestinul
omului şi animalelor. Totuşi trebuie reţinut că peste 90% din flora intestinală normală umană este
formată de germeni anaerobi.
Unele dintre genuri (Shigella, Salmonella, Yersinia) cuprind specii patogene pentru om, în timp ce
altele (Escherichia,Enterobacter, Klebsiella, Proteus etc) cuprind specii saprofite sau condiţionat
patogene (cu excepţia anumitor tulpini, patogene) şi se găsesc în flora normală gastrointestinală, sau de
ex. în flora tractului respirator superior.
Când se utilizează termenul de „bacterii enterice”, unii autori includ şi alte genuri
precum Pseudomonas sau Vibrio, care nu fac parte din familia Enterobacteriaceae.
33. 2. 2. Caractere morfotinctoriale
Sunt bacili Gram-negativi (multe dintre specii având o dimensiune de aproximativ 2-3 / 0,6μm), cu
capete rotunjite, care nu se pot diferenţia prin microscopie optică, mobili cu cili peritrichi
(ex. Salmonella spp, Proteus spp.), sau imobili (ex.Shigella spp., Yersinia pestis, Klebsiella spp.),
nesporulaţi; unele specii pot prezenta capsulă (ex. Klebsiella pneumoniae).
33. 2. 3. Caractere biochimice şi caractere de cultură
Sunt germeni nepretenţioşi care se pot multiplica pe medii simple, aerobi facultativ anaerobi,
utilizează fermentativ glucoza cu sau fără producere de gaz, sunt oxidază-negativi, catalază-pozitivi,
reduc nitraţii la nitriţi, se pot cultiva pe medii obişnuite formând colonii de tip S, R („vechi”) sau M
(pentru speciile capsulate), pot fermenta (ex. Escherichia coli, Klebsiella spp.) sau nu lactoza
(ex. Salmonella spp., Shigella spp.). De altfel, caracterele biochimice sunt foarte importante în
identificarea enterobacteriilor. În Tratatul de Microbiologie şi Infecţii Microbiene (Topley and Wilson’s,
2005), nu mai puţin de 11 pagini de tabele (1.319-1.329) sunt dedicate caracterelor biochimice ale
enterobacteriilor (de menţionat că această prezentare reprezintă o simplificare şi prescurtare privind
acest subiect).
33. 2. 4. Structura antigenică
33. 2. 4. 1. Lipopolizaharidul (LPZ) caracteristic microorganismelor Gram-negative este format din:
- lipidul A, responsabil pentru activitatea toxică, format din unităţi dizaharidice de glucozamină
fosforilată de care se ataşează acizi graşi cu lanţ lung de atomi de carbon (ex. acidul β-hidroximiristic cu
14 atomi de carbon), care este prezent la toate enterobacteriile şi care se găseşte în natură numai în
această structură particulară, lipidul A. De lipidul A se ataşează:
- polizaharidul format dintr-un miez (core) similar la toate bacteriile Gram-negative şi o serie de
unităţi terminale repetitive care diferă de la specie la specie (antigenul O). Antigenul O este termostabil,
rezistent la alcool. Poate fi detectat prin reacţii de aglutinare cu antiseruri specifice. Antigenul O este
336
asimilat cu termenul de endotoxină. Formele „R” sintetizează un LPZ care nu conţine elementele
repetitive ale polizaharidului O, caracteristice culturilor „S”.
Faţă de antigenul O apar în special anticorpi din clasa IgM. Fiecare gen cuprinde antigene O
specifice, dar un microb poate avea mai multe structuri antigenice diferite, de exemplu:
- pot exista antigene O comune la E. coli, Shigella;
- pot exista reacţii încrucişate între E. coli, Klebsiella, Providencia, Salmonella;
- anumite structuri antigenice O de la E. coli reacţionează încrucişat cu structuri antigenice izolate de
la genul Vibrio, cu structuri antigenice de grup sangvin sau alte antigene de suprafaţă de la celulele
animale.
33. 2. 4. 4. La Salmonella typhi există în mod suplimentar antigenul Vi (de virulenţă) care face
parte din antigenele „de înveliş” ale acestei bacterii, are structură polizaharidică şi este implicat în
scăderea complementului seric, leucopenie, capacitatea de multiplicare intramacrofagică. Poate „masca”
antigenul O, acoperindu-l. Antigenul Vi se poate identifica prin reacţii de aglutinare cu antiseruri
specifice.
Clasificarea antigenică a enterobacteriilor indică adesea prezenţa fiecărui antigen specific, de
exemplu E. coli O55:K5:H21 etc.
Toxinele
337
a). Exotoxinele: toxina Shiga (Shigella shiga), toxina Shiga-like (la Shigella şi la unele tulpini de E.
coli), toxina LT (termic labilă) la E. coli (asemănătoare cu exotoxina vibrionului holeric) etc. Ar mai fi de
menţionat existenţa unor citotoxine produse de E. coli care sunt alfa-hemolizine (exotoxine); beta-
hemolizinele rămân legate de celulă şi inhibă fagocitoza şi chemotaxia leucocitelor.
b). Endotoxinele (Antigen O) sunt incluse în peretele tuturor germenilor Gram-negativi, putând
determina în cazul unei eliberări masive (distrugerea brutală a unui număr mare de bacterii) şocul
endotoxic. Administrarea experimentală a lipopolizaharidului la animal determină febră, leucopenie,
trombocitopenie, CID (coagulare intravasculară diseminată), activarea sistemului complement şi
eliberarea de substanţe vasoactive proinflamatorii.
Achiziţia de fier
O serie de enterobacterii sintetizează o componentă care are capacitatea de a chela fierul
(siderofor), complexul format fiind apoi recaptat de către bacterie (de exemplu, aerobactina de la E.
coli).
Structurile capsulare
Antigenele de tip K ale E. coli au structură proteică şi sunt importante în colonizare; diminuă
opsonizarea şi fagocitoza. Antigenul K1 este un polimer al acidului N-acetil-neuraminic. Este similar cu
structuri proprii gazdei şi este slab imunogen.
Klebsiella prezintă un antigen K (şi respectiv o capsulă) bine reprezentat.
Antigenul Vi de la Salmonella typhi acoperă (maschează) antigenul O şi are importanţă în
invazivitate.
Plasmidele
Sunt importante pentru faptul că transmit atât informaţii genetice legate de rezistenţa la antibiotice
(factor R) cât şi pentru virulenţă.
33. 3. Povestire adevărată
Un pacient de sex masculin, în vârstă de 33 ani, este cunoscut cu diagnosticul de leucemie acută
promielocitară de circa 1,5 ani; se internează pentru administrarea tratamentului chimioterapic şi pentru
realizarea unui transplant de celule stem.
La circa 3 ore de la administrarea profilactică de imunoglobuline pe cale i.v., pe un cateter fixat
anterior, pacientul devine febril (temperatură 39,5ºC).
S-a recoltat sânge pentru hemoculturi şi după aceasta s-a administrat o asociere între o
cefalosporină de generaţia a 3-a şi gentamicină. Sângele a fost însămânţat în bulion sânge, cu trecere
„oarbă” după 18 ore, pe geloză-sânge şi pe un mediu care conţinea eozină şi albastru de metilen. După
încă 24 ore, apar culturi (de tip „S/M”) pe ambele medii, se apreciază că este vorba de colonii lactoză-
pozitive, iar examenul microscopic al coloniilor izolate relevă prezenţa unor bacili Gram-negativi.
Se realizează teste biochimice pe „medii multi test”, microorganismul fiind glucoză-pozitiv şi lactoză-
pozitiv, hidrogen sulfurat-negativ, citrat-pozitiv, imobil, indol-negativ, urează-negativ. Analiza preliminară
orientează spre o enterobacterie, dar, se face testul oxidazei care este pozitiv. Efectuând şi alte testări,
diagnosticul final a fost: infecţie cu Agrobacterium radiobacterla un pacient cu imunodepresie. Testarea
sensibilităţii la antibiotice şi chimioterapice a recomandat continuarea tratamentului cu imipenem.
338
Evoluţia a fost favorabilă, iar la 3 săptămâni de la episodul acut s-a putut realiza tratamentul
chimioterapic şi pacientul a fost pregătit pentru transplantul cu celule stem.
Discuţie
Nu orice bacil Gram-negativ, glucoză-pozitiv şi lactoză-pozitiv este o enterobacterie. Testarea
sensibilităţii la antibiotice şi chimioterapice a revelat o tulpină rezistentă la majoritatea medicamentelor
testate, prezentând sensibilitate numai la ticarcilină, imipenem şi ciprofloxacină. Având în vedere faptul
că a fost vorba de o infecţie la o gazdă imunodeprimată, diagnosticul bacteriologic şi testarea
sensibilităţii le medicamentele antibacteriene sunt strict necesare.
Sunt grupați în şase specii: E. coli, E. blattae, E. fergusonii, E. hermannii, E. vulneris și E. albertii. Cu
excepţia speciei E. blattae, izolată de la insecte, toate celelalte specii de Escherichia au fost izolate din
prelevate umane.
Specia tip, reprezentată de Escherichia coli, şi-a căpătat numele în 1919, în memoria lui Theodor
Escherich care, studiind flora intestinala copilului, a izolat-o din materii fecale denumind-o Bacterium
coli commune.
339
sunt mobili, prin prezența flagelilor (în preparatele native). Unele tulpini prezintă capsulă (antigene
capsulare de tip K).
34. 2. 3. Caractere de cultură
Se dezvoltă bine pe medii simple de cultură; pe geloză se pot dezvolta colonii de tip S, lactoză
pozitive, convexe, umede, cu suprafaţă lucioasă, margini netede, uşor emulsionabile în soluţie salină
fiziologică sau colonii de tip R, uscate, cu marginile crenelate, care se emulsionează greu şi neuniform în
soluţie salină fiziologică; există forme intermediare între coloniile S şi R, după cum există şi colonii
mucoide de tip M.
34. 2. 4. Caractere biochimice
Germenii sunt aerobi, facultativ anaerobi, se dezvoltă în limite largi de temperatură şi pH. Asemenea
celorlalte enterobacterii, specia E. coli este catalază pozitivă, oxidază negativă şi fermentează glucoza.
Capacitatea majorităţii tulpinilor deE. coli de a fermenta lactoza este utilă în diferenţierea de alte
enterobacterii (ex. Salmonella, Shigella). Tipic, tulpinile de E. colitestate pe medii de identificare
biochimica precum TSI, MIU si/sau MILF nu produc H2S, produc indol şi lizindecarboxilază, dar nu urează
si fenilalanindezaminază. În plus, E. coli nu poate creşte pe un mediu care are ca unică sursă de carbon
citratul (caracter metabolic important pentru diferenţierea de alte enterobacterii).
Tulpinile EHEC/VTEC, de regulă, nu fermentează sorbitolul.
34. 2. 5. Rezistenţa faţă de factori fizici şi chimici
Germenii supravieţuiesc în mediul extern (sol, apă) luni de zile. E. coli este distrus prin expunere la
60ºC în 30 minute. Este sensibil la acţiunea antisepticelor şi dezinfectantelor uzuale.
34. 2. 6. Structură antigenică
Ca şi în cazul celorlalte enterobacterii, diversele structuri antigenice situate la suprafața tulpinilor
de E. coli servesc aşa numitei serotipizări, metodă utilă în epidemiologia infecţiilor cauzate de aceste
microorganisme. Cele trei tipuri de antigene detectate prin reacţii serologice antigen-anticorp (ex. reacţia
de aglutinare) sunt: antigenul O (somatic), antigenul H (flagelar) și antigenul K (capsular). Antigenul O
(LPZ) a fost descris la caracterele generale ale enterobacteriilor şi defineşte serogrupul (numerotarea
grupului antigenic este de utilitate epidemiologică; ex. serotipurile O55 şi O111 sunt implicate în izbucniri
epidemice de meningită neonatală). Există peste 170 de variante de Ag O.
În cadrul unui serogrup O, pe baza diversităţii antigenelor H (prezente numai la tulpinile mobile,
care posedă flageli) şi K (prezente la tulpinile care posedă capsulă) se definesc serotipuri. Serogrupurile
şi serotipurile se noteazţ printr-o combinaţie de litere şi cifre (ex. O55:K59:H6). Structurile de suprafaţă
pot masca prezenţa antigenului somatic O.
În majoritatea cazurilor, tipizarea serologică a tulpinilor de E. coli se rezumă la identificarea
antigenelor O şi H (ex. O157:H7).
Anumite serotipuri sunt asociate frecvent cu sindroame clinice bine definite, dar trebuie menţionat
că nu antigenele de suprafaţă conferă virulenţă bacteriei. Cu toate acestea, definirea serotipului poate fi
sugestivă pentru identificarea unor clone virulente (ex. serotipul E. coli O157:H7, marker pentru
subgrupul EHEC din patotipul VTEC).
Datorită faptului că au fost identificate peste 170 de variante de antigen O, peste 50 de tipuri de
antigen H, peste 90 de tipuri de antigen de tip K şi o serie de tipuri antigenice fimbriale (antigene F),
prin combinaţiile acestora rezultă peste 1.000 de tipuri antigenice de Escherichia coli.
340
Unele dintre tulpinile de E. coli elaborează exotoxine (vezi 37.2.8 şi 37.3). Acestea pot fi, la rândul
lor, structuri antigenice identificate in vitro prin reacţii antigen-anticorp.
34. 2. 7. Răspuns imun
Apare un răspuns imun umoral care nu are semnificaţie nici în ceea ce priveşte protecţia faţă de
boală şi cel mai adesea nici în diagnostic. De reţinut însă că, un titru înalt al anticorpilor anti O157,
detectat la pacienţii cu sindrom hemolitico-uremic (SHU), poate fi util pentru diagnosticul indirect
(imunologic) al infecţiei cu E. coli O157:H7 (3).
34. 2. 8. Caractere de patogenitate
Tulpinile de E. coli domină microflora facultativ anaerobă a colonului la individul sănătos, marea
majoritate întreţinând cu aceasta relaţii de simbioză benefice ambilor. Ele pot produce infecţii în
condiţiile în care gazda este imunodeprimată sau când depăşesc bariera intestinală şi ajung în zone
normal sterile.
Există însă şi tulpini de E. coli care au o virulenţa intrinsecă, putând declanşa variate procese
infecţioase la indivizii imunocompetenţi. Tulpinile patogene de E. coli sunt clasificate în aşa
numite patotipuri. Ele generează simptomatologii similare prin mecanisme de patogenitate comune.
În prezent sunt descrise şase patotipuri de E. coli implicate în sindromul diareic (patotipuri
intestinale) (4) şi un patotip implicat în infecţii extraintestinale (ex. infecţiile tractului urinar, meningite,
septicemii, etc.) şi denumit E. coli cu patogenitate extraintestinală (ExPEC) (5). Patotipurile
intestinale sunt: E. coli enteropatogen (EPEC), E. coli enterotoxigen (ETEC), E. colienteroinvaziv
(EIEC), E. coli producător de verotoxine (VTEC), E. coli enteroagregativ (EAEC) și E. coli cu aderenţă
difuză (DAEC). În cadrul patotipului VTEC se distinge, pentru a se sublinia în principal asocierea cu
manifestări clinice severe (ex. colita hemoragică), subgrupul de tulpini de E. coli enterohemoragic
(EHEC), care are ca prototip serotipul O157:H7.
Tulpinile patogene de E. coli produc factori de virulenţă, care afecteaza variatele procese
desfăşurate la nivelul celulelor gazdei (ex. sinteza de proteine, funcţia citoscheletului, diviziunea celulară,
secreţia de ioni, funcţia mitocondriilor, apoptoza etc.). Aceşti factori de virulenţă sunt codificaţi de
structuri genetice localizate în cromozom sau pe plasmide şi intervin în mecanismele de patogenitate
folosite de bacterie pentru a învinge sistemele de apărare ale gazdei.
Adezinele sunt structuri de aderenţă aflate pe fimbrii/pili (ex. fimbriile P din tulpinile de E.
coli uropatogene, factorii de colonizare CFA din tulpinile de ETEC, etc.) sau la suprafaţa membranei
externe (ex. adezinele afimbriale Afa din tulpinile de DAEC) bacteriene. Ele reprezintă factori de virulenţa
importanţi, care permit bacteriei să colonizeze zone din organismul uman (ex. intestin subţire, tract
urinar, vagin), in care nu rezidă în mod normal.
Toxinele sunt o altă categorie de factori de virulenţă. Endotoxinele fac parte din structura
membranei externe (lipidul A din complexul LPZ) şi sunt invariabil prezente la toate bacteriile Gram
negative, nu numai la E. coli, indiferent de potenţialul lor de patogenitate. Eliberate în urma distrucţiei
peretelui bacterian îşi manifestă efectele toxice, fiind implicate în apariţia febrei şi şocului toxic din
341
septicemii. Exotoxinele sunt sintetizate şi secretate în cursul metabolismului bacterian, fiind specifice nu
numai speciei, ci diverselor patotipuri de E. coli. În prezent se cunosc structura si funcţiile a numeroase
toxine responsabile de patogenitatea tulpinilor de E. coli (ex. enterotoxina termolabilă şi termostabilă
produse de tulpinile ETEC, verotoxinele 1 şi 2 sintetizate de tulpinile VTEC, enterotoxina termostabilă
enteroagregativă 1 a tulpinilor EAEC, etc.).
Multe dintre tulpinile ExPEC implicate în producerea meningitei neonatale sau a infecţiilor urinare
prezintă capsulă, o altă componentă importantă pentru patogenitatea speciei. Rolul principal al capsulei
este de a inhiba acţiunea complementului seric şi fagocitoza, conferind astfel rezistenţă bacteriei.
Antigenul polizaharidic capsular K1 este prezent în 80% din tulpinile de E. coli izolate din cazuri de
meningită neonatală (6).
Există mai multe specii de exemplu K. pneumoniae, K. ozaenae, K. rhinoscleromatis şiK. oxytoca,
aceste tulpini fiind şi cele mai des implicate în patologia umană. În ultima perioadă se consideră K.
ozaenae şi K. rhinoscleromatis drept subspecii ale K. pneumoniae.
342
Mai multe studii au urmărit „pattern-ul” de colonizare cu cu Klebsiella pneumoniaea indivizilor, cu
scopul de a determina factorii de risc pentru infecţii. S-a demonstrat astfel că aproximativ o treime din
persoanele testate prezintă portaj de Klebsiellaîn fecale. Spitalizarea şi folosirea de antibiotice a crescut
numărul celor colonizaţi de bacterii din genul Klebsiella, cât şi numărul acestor bacterii per gram de
fecale. Personalul medical prezintă Klebsiella pe mâini după ce îngrijesc pacienţi (într-un studiu, 17% din
asistentele unei secţii de terapie intensivă; rate şi mai mari au fost înregistrate în cursul unui focar
epidemiologic activ – 30 % [2]).
35. 2. 2. Caractere morfotinctoriale
Klebsiella pneumoniae cuprinde bacili Gram-negativi, capsulaţi (capsula are dimensiuni de 2-3 ori
mai mari decât diametrul bacteriei), imobili, nesporulaţi. Se pot dispune în diplo, în special în organismul
uman.
35. 2. 3. Caractere de cultură
Se cultivă cu uşurinţă pe medii uzuale fără cerinţe nutritive speciale. Pe medii gelozate s-au descris
mai multe tipuri de colonii cel mai frecvent fiind tipul mucos (M): colonii mari, opalescente, uneori
cenuşii, cu suprafaţa umedă care după o incubare prelungită prezintă tendinţă la confluare şi „curgere”
pe suprafaţa mediului. Pe medii lactozate sunt lactoză-pozitive. Klebsiella pneumoniae nu se dezvoltă pe
medii înalt selective şi este parţial inhibată pe cele moderat selective. S-a raportat apariţia unor tulpini ce
dezvolta colonii hipermucoide, aceste tulpini având şi o virulenţă crescută [3].
35. 2. 4. Caractere biochimice
Pe mediile multitest germenii au următorul comportament enzimatic: pe mediul TSI sunt glucoză-
pozitivi şi uneori fermentează glucoza cu producere de gaz, sunt lactoză-pozitivi, nu produc hidrogen
sulfurat; pe mediul MIU sunt imobili, indol-negativi şi urează-pozitivi; pot creşte pe medii având citratul
drept unică sursă de carbon. Sunt germeni catalază pozitivi, oxidază negativi.
35. 2. 5. Rezistenţa faţă de factori fizici şi chimici
Sunt puţin rezistenţi la căldură (distruşi în 5-7 minute la 100°C); pe sol, în alimente rezistă un mare
număr de zile. Dezinfectantele obişnuite îi distrug în intervale de timp cuprinse între 30 de minute şi 2
ore.
35. 2. 6. Structură antigenică
Particularităţile morfologice ale klebsiellelor se reflectă în structura antigenică. Au fost descrise
antigene somatice O (LPZ) specifice de grup şi antigene capsulare polizaharidice K, specifice de tip.
Există peste 80 de tipuri antigenice, identificabile de ex. prin reacţia de umflare a capsulei şi (prin analize
serologice sau de microbiologie moleculară).
35. 2. 7. Caractere de patogenitate
Klebsiella pneumoniae este un microorganism condiţionat patogen, care poate fi implicat în
patologia umană prin multiplicare şi invazivitate.
Factorii de patogenitate sunt reprezentaţi de capsula (antigenul K) care îi conferă rezistenţă faţă de
fagocitoză şi de endotoxina (antigenul O) eliberată după distrugerea bacteriei.
Sideroforii membranari sechestrează Fe2+ în focarul infecţios, pentru a asigura un nivel adecvat
creşterii bacteriene. Deşi nu reprezintă un rol central în patogenitate, într-un model murin de peritonită,
s-a demonstrat creşterea virulenţei tulpinilor de Klebsiella prin introducerea genei care codifică sideroforul
aerobactin.
343
Biofilmul reprezintă o matrice extrem de bine organizata ce înconjoară bacteriile. Ele favorizează
aderarea bacteriană pe suprafaţa cateterelor.
Adezinele cele mai întâlnite la tulpinile de Klebsiella pneumoniae sunt fimbriile de tipul 1 şi 3. Există
o interrelaţie între adezinele exprimate şi cantitatea de biofilm produs [4].
344
Cu toate că nu este cea mai reprezentativă entitate clinică pentru acest gen, vom discuta în
continuare diagnosticul pneumoniei produse de Klebsiella pneumoniae. Diagnosticul complet include
elemente clinice, paraclinice (ex. examenul radiologic) şi de laborator; diagnosticul bacteriologic fiind util
în stabilirea etiologiei şi tratamentului antibiotic corespunzător.
Diagnosticul bacteriologic (direct) include etapele cunoscute.
1. Recoltarea şi transportul produsului patologic trebuie să se realizeze respectând o serie de reguli
(cât mai aproape de debutul bolii, înainte ca pacientul să fi primit antibiotice, cât mai rapid şi corect din
punct de vedere al tehnicilor utilizate, respectând toate normele de asepsie şi antisepsie, etc.). În
infecţiile produse de Klebsiella pneumoniae se pot recolta materii fecale, urină, sânge, puroi, etc. În
continuare vom discuta cazul în care p.p. este reprezentat de spută (vezi şi anexa nr. 6). Din punct de
vedere macroscopic, sputa poate avea un aspect mucoid, de culoare roşu închis, „în jeleu de coacăze”.
2. Examinarea microscopică a produsului patologic include realizarea a minim două frotiuri din
produsul patologic recoltat şi transportat corespunzător, care se vor colora cu albastru de metilen (AM)
şi respectiv Gram. Frotiurile se examinează la microscopul optic cu imersie şi se notează
prezenţa celulelor de la nivel alveolar (ex. macrofage alveolare), prezenţa celulelor inflamatorii (ex.
leucocite) şi prezenţa bacililor Gram-negativi, de dimensiuni relativ mari, încapsulaţi (înconjuraţi de
o capsulă voluminoasă). Examinarea microscopică trebuie să demonstreze calitatea produsului
patologic şi să realizeze o identificare prezumtivă a microorganismului implicat (vezi şi anexa nr. 6). În
coloraţia cu albastru de metilen, capsula apare ca un halou în jurul klebsielelor. Utilizând anticorpi anti-
capsulari, se poate realiza o identificare rapidă inclusiv direct, pe produsul patologic, prin reacţia de
umflare a capsulei (vezi şi anexa nr. 2).
3. Cultivarea pe medii de cultură a produsului patologic se realizează în aşa fel încât să se poată
obţine colonii izolate şi respectiv o cultură pură, care se va identifica (vezi şi anexa nr. 2). Klebsiella
pneumoniae se poate dezvolta pe medii de cultură obişnuite în 18-24 ore, la 35-37°C. Se preferă
utilizarea unor medii de cultură slab selective (ex. MacConkey). Klebsiella pneumoniae nu se dezvoltă pe
medii înalt selective şi este parţial inhibată pe cele moderat selective. Pe mediile solide Klebsiella
pneumoniae formează colonii lactoză-pozitive, mari, de tip M bombate, cremoase, în „picătură de
miere”, care dau aspectul de „curgere” pe suprafaţa mediului de cultură, cu tendinţă de confluare. Se
poate realiza şi inocularea la animale de laborator sensibile, şoarecele alb (vezi şi anexa nr. 2).
Există medii de cultură selective/diferenţiale care pot ajuta în diagnosticul rapid al infecţiilor
cu Klebsiella sau aducând informaţii epidemiologice de valoare (izolarea de tulpini producătoare de ESBL,
datorită rezistenţei la o doză de antibiotic inclusă în mediu). Valorile de sensibitilitate şi specificitate a
acestor metode sunt foarte bune, dar trebuie să fie folosite cu prudenţă, pentru a nu oferi rezultate fals-
negative prin limitarea altor germeni posibili implicaţi în procesul patogenic. [11]
4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor caractere:
346
36. 2. Caractere generale
36. 2. 1. Habitat
Germenii din genul Proteus sunt răspândiţi în natură ubicvitar, se pot identifica în materiile organice
în putrefacţie, în alimente. Fac parte din flora intestinală umană.
36. 2. 2. Caractere morfotinctoriale
Sunt bacili Gram-negativi cu un accentuat polimorfism (de unde şi numele, derivat din mitologia
antică), pe frotiu putându-se observa bacili, cocobacili, forme filamentoase de până la 50-80 µm.
Prezintă un mare număr de cili peritrichi care le conferă mobilitatea caracteristică (dar există şi tulpini
aciliate). Sunt necapsulaţi şi nesporulaţi.
36. 2. 3. Caractere de cultură
Cresc pe medii simple, inclusiv pe medii peptonate lichide, cu degajarea unui miros caracteristic de
putrefacţie. Suportă mari variaţii de temperatură şi de pH. Pe mediile diferenţiale (cu lactoză) nu se pot
obţine colonii izolate, descriindu-se fenomenul de invazie (migrare). Cultura se întinde pe toată suprafaţa
plăcii (sau tubului) în strat continuu sub forma unor valuri succesive. Fenomenul de invazie poate fi
inhibat prin incorporarea în mediu de săruri biliare, tiosulfat de sodiu, sulfit de bismut, sulfonamide,
neomicină, cărbune activat etc.
Dacă pe o placă cu mediu solid se cultivă 2 tulpini diferite, în 2 puncte opuse, acestea se vor
dezvolta invadând până la un punct în apropierea liniei de întâlnire, unde se va crea o linie de
demarcaţie între cele 2 tulpini (fenomenul liniei de demarcaţie).
Cultivarea unui produs patologic în lichidul de condens al unui tub cu geloză înclinată incubat în
poziţie verticală, va conduce (în cazul în care în produsul patologic există o tulpină de Proteus spp.) la
obţinerea în 24 ore a unei culturi pure de Proteus, datorită mobilităţii acestor microorganisme
(fenomenul de „căţărare”).
36. 2. 4. Caractere biochimice
Sunt aerobi, facultiv anaerobi. Pe medii slab şi moderat selective pe care fenomenul de migrare a
fost inhibat, speciile deProteus dezvoltă colonii de tip S, lactoză-negative (vezi 36. 4.). Microorganismele
din genul Proteus sunt glucoză-pozitive, lactoză-negative, produc H 2S, sunt urează-pozitive, indol-
pozitive (exceptând P. mirabilis şi P. myxofaciens) iar pe mediul MIU se poate constata mobilitatea.
36. 2. 5. Rezistenţa faţă de factori fizici şi chimici
Are o rezistenţă relativ crescută în mediu, în alimente etc şi poate rezista în soluţii antiseptice sau în
detergenţi, ceea ce poate crea probleme deosebite în mediul de spital. Rezistă mai multe luni la
temperaturi joase, inclusiv în alimentele congelate. Rezistenţa la antibiotice şi chimioterapice este
considerabilă.
36. 2. 6. Structură antigenică
Prezintă antigenul O (LPZ, endotoxina) specific de grup. După constatarea că serul bolnavilor de
tifos exantematic aglutinează cu o tulpină de proteus s-a demonstrat că genul include o serie de tulpini
(OX-2, OX-19, OX-K) care au înrudiri antigenice cu microorganisme aparţinând genului Rickettsia.
Antigenul flagelar, proteic, H este comun la mai multe tipuri.
36. 2. 7. Răspuns imun
Postinfecţios apare un răspuns imun umoral care însă nu are utilitate practică.
347
36. 2. 8. Caractere de patogenitate
Proteus poate deveni patogen prin multiplicare şi invazivitate, în condiţii speciale (părăsirea
habitatului natural, colonizarea unor gazde cu deficienţe ale sistemului imunitar).
La fel ca şi ceilalţi germeni Gram-negativi, eliberează de la nivel parietal, după distrugere,
endotoxina (antigenul O, LPZ).
Mobilitatea deosebită îi permite invadarea tractului urinar.
Producerea de urează alcalinizează urina şi favorizează formarea de calculi (de ex. de struvită).
Existenţa calculilor favorizează apariţia altor infecţii urinare sau cronicizarea acestora.
Rezistenţa la antibiotice şi chimioterapice este remarcabilă.
348
siguranţă al conductelor de apă, dar relativ de curând a apărut „rolul” ei în a onora o persoană publică
cum ar fi S. mjordan (cu referire la baschetbalistul american).
349
Antigenul H este de natură proteică, se găseşte la nivelul cililor peritrichi, este determinant de tip, cu
posibilitatea unei variaţii de fază. Majoritatea serotipurilor de Salmonella pot exprima alternativ două
tipuri de flageli cu specificităţi antigenice diferite. Din 1986 s-a văzut că unele tulpini de Salmonella pot
exprima trei sau mai multe tipuri de flageli cu antigenicitate distinctă.
Variaţia antigenică se poate realiza de ex. prin transducţie existând mai multe posibilităţi: pot pierde
antigenul H şi devin imobile; pot pierde antigenul O, coloniile S se „transformă” în colonii R; pot pierde
parţial sau total antigenul Vi (homopolimer de acid N acetil-galactosaminuronic).
Există antigene şi la nivelul fimbriilor. Apariţia anticorpilor anti fimbrii de tipul 1 la pacienţi cu febră
tifoidă sau la persoane care au fost vaccinate, poate duce la apariţia unor reacţii fals-pozitive în cadrul
analizei serice cantitative (reacţia de aglutinare în tuburi).
Schema de clasificare Ewing a fost prezentată anterior. Schema de identificare serologică
Kaufmann-White subîmparte genul Salmonella în foarte multe grupe şi „specii”, spre ex. în grupul A, S.
paratyphi A; în grupul B, S. paratyphi B, S. typhimurium; în grupul C, S. paratyphi C; în grupul D, S.
typhi, S. enteritidis etc. Conform schemei Kaufman-White există S. dublin, care în schema Ewing poartă
numele de S. enteritidis serotipul dublin. Există şi alte scheme de clasificare.
39. 2. 7. Răspuns imun
Apare răspuns imun umoral detectabil în special după infecţiile extraintestinale. Este certă apariţia
răspunsului imun după infecţii produse de S. typhi şi paratyphi (Paratyphi), cu punerea în evidenţă a
anticorpilor circulanţi anti O, anti H şi anti Vi. Anticorpii anti O şi anti Vi au rol protector. Apariţia
anticorpilor din clasa IgA secretorii pot împiedica ataşarea la nivelul epiteliului intestinal.
39. 2. 8. Caractere de patogenitate
Salmonella spp., devine patogenă prin multiplicare şi invazivitate. Primul pas, obligatoriu, este
reprezentat de colonizare, realizată cu ajutorul unor structuri de aderare, adezinele şi fimbriile, care
induc modificări la nivelul membranei celulare. Studii de fiziopatologie fundamentală au reprezentat
prima dovadă a existenţei unui receptor hormonal afectat prin ataşare şi invazie bacteriană.
De menţionat faptul că la genul Salmonella a fost pus în evidenţă un grup de gene (genele de
invazivitate), unele din ele fiind asemănătoare cu gene identificate la genul Yersinia.
Salmonella spp., supravieţuieşte intrafagocitar datorită prezenţei unor structuri de suprafaţă precum
şi prin sinteza unor proteine (peste 40 de proteine diferite) care apar ca răspuns la fagocitare. Antigenul
Vi contribuie (pentru S. typhi şi SalmonellaParatyphi C la rezistenţa la fagocitoză şi rezistenţa după
fagocitoză).
Endotoxina (antigenul O, LPZ) eliberat după distrugerea germenilor, are un rol important în
patogenitate.
Tulpinile care produc toxiinfecţii alimentare secretă „enterotoxine” cu proprietăţi antigenice şi
biologice asemănătoare toxinei holerice.
350
Enterocolita (gastroenterita, toxiinfecţia alimentară de tip infecţios, salmoneloza) apare după
ingestia a 105-108 salmonele. După ingestie are loc ataşarea şi adsorbţia la nivelul celulelor epiteliale în
porţiunea terminală a intestinului subţire, apoi penetrarea prin celule şi migrarea în lamina propria, în
regiunea ileocecală. La acest nivel are loc multiplicarea în foliculii limfoizi determinând hipertrofia şi
hiperplazia SRE (sistemului reticulo-endotelial). Acumularea de PMN determină o reacţie inflamatorie cu
eliberare de prostaglandine care duc la stimularea secreţiei intestinale, urmată de diaree
(nesanguinolentă), greaţă, vărsături; mai pot apărea febră, dureri abdominale, mialgii, dureri de cap
(cefalee). Persoana infectată poate fi contagioasă timp de circa 3 luni. Simptomele sunt mai severe la
copiii mai mici de 10 ani şi la bolnavii imunocompromişi (ex. infectaţi cu HIV / SIDA).
Febra tifoidă (febra enterală) poate apărea după ingerarea a circa 10 3 salmonele. După ingestie are
loc ataşarea şi trecerea S. typhi prin şi printre celulele epiteliale de la nivelul ansei ileocecale, urmată de
multiplicarea activă în submucoasă şi de fagocitarea de către macrofage. Aici bacilii rămân vii şi se
multiplică (în macrofagele din formaţiunile limfoide intestinale), apoi trec în ganglionii mezenterici, apoi
în canalul toracic, producând bacteriemia iniţială (care reprezintă debutul clinic al bolii), urmată de
invadarea altor organe şi formaţiuni limfatice.
Multiplicarea crescută mai ales în organele SRE (ficat, splină) este urmată de o a doua bacteriemie
masivă şi de eliminarea prin bilă şi / sau urină. La sfârşitul primei săptămâni de boală, salmonella se
elimină din foliculii intestinali şi prin bilă în materiile fecale, excreţia prelungindu-se mult timp în
convalescenţă. Pot apărea angiocolită, colecistită; bolnavul poate deveni purtător (portaj de Salmonella)
după vindecare.
Simptomatologia generală (afectarea stării generale, febră, stare de şoc) este determinată în special
de endotoxină care activează diferite cascade inflamatorii şi producerea de citokine, iar simptomatologia
digestivă (anorexie, dureri, constipaţie sau diaree) este consecinţa agresiunii intestinale, hepatice şi
asupra vezicii biliare.
351
Germenii se pot găsi în intestinul şi scaunul omului bolnav. În funcţie de anumite condiţii, shigellele
se pot izola din apă, alimente sau de pe obiecte. Pot fi transmise prin intermediul muştelor.
40. 2. 2. Caractere morfotinctoriale
Sunt bacili Gram-negativi, imobili, cu dimensiuni de 2-3 µm / 0,5-0,8 µm, necapsulaţi, nesporulaţi.
40. 2. 3. Caractere de cultură
Cresc pe medii simple şi produc colonii de tip S. Pe mediile cu lactoză (ex. ADCL, AABTL) formează
colonii de tip S, lactoză-negative. Pentru izolare din materiile fecale sunt utilizate medii diferenţiale (cu
lactoză şi indicator de pH) şi / sau medii selective (mediul Shigella-Salmonella cu săruri biliare etc).
40. 2. 4. Caractere biochimice
Sunt germeni aerobi facultativ anaerobi, glucoză-pozitivi fără producere de gaz, lactoză-negativi, nu
produc H2S, urează-negativi, indol-negativi, imobili. Subgrupele A-D se pot diferenţia pe baza fermentării
manitei (subgrupul A este manită-negativ).
40. 2. 5. Rezistenţa faţă de factori fizici şi chimici
Shigellele sunt inactivate în 10 minute la 50-60ºC. ÎN PRAF USCAT REZISTĂ CIRCA 10 ZILE, PE
LENJERIE POT SUPRAVIEŢUI PESTE 2 SĂPTĂMÂNI. ÎN APE, LA O TEMPERATURĂ DE 7-10ºC POT
SUPRAVIEŢUI CIRCA 9 ZILE, ÎN ALIMENTE CIRCA 1-2 SĂPTĂMÂNI, IAR ÎN GHEAŢĂ PÂNĂ LA 2 LUNI.
40. 2. 6. Structură antigenică
Subgrupele sunt divizate pe baza structurii antigenului O (LPZ). Subgrupul A ( Sh. dysenteriae)
include 10 serotipuri dintre care cel mai patogen este tipul 1, Shigella shiga. Subgrupul B (Sh. flexneri)
include mai multe tipuri şi subtipuri serologice. Subgrupul C (Sh. boydii) cuprinde 15 serotipuri iar
subgrupul D (Sh. sonnei) cuprinde o singură specie în 2 faze distincte antigenic (S şi R).
Există tulpini care prezintă la suprafaţă structuri antigenice de tip K.
Sh. shiga elaborează şi o exotoxină termolabilă, cu structură proteică.
40. 2. 7. Răspuns imun
Infecţia cu Shigella spp. duce la stimularea răspunsului imun umoral, cu apariţia de anticorpi care
însă nu conferă protecţie. Apariţia de anticorpi locali de tip IgA (eventual după administrarea de
vaccinuri vii atenuate) ar putea avea o utilitate în prevenirea infecţiei.
40. 2. 8. Caractere de patogenitate
Shigella este patogenă prin multiplicare şi invazivitate. În cazul serotipului 1 din subgrupul A ( Sh.
shiga) este implicată şi toxigeneza.
La fel ca toate microorganismele Gram-negative, shigellele elaborează lipopolizaharidul parietal, care
se eliberează ca endotoxină, după distrugerea bacteriei. Endotoxina (antigenul O) este implicată în
patogenia dizenteriei, având o acţiune iritativă la nivel intestinal.
Exotoxina shiga afectează atât intestinul (fiind implicată în mecanismul de producere al diareei), cât
şi sistemul nervos central (putând conduce la apariţia unor fenomene de meningism sau chiar pierderea
stării de conştienţă, comă). Faţă de animalele de experienţă are efect letal.
353
Aerob facultativ anaerob, se dezvoltă mai rapid pe medii ce conţin sânge sau fluide organice şi la
30°C dar se poate multiplica şi pe medii simple. În culturi pe geloză-sânge la 37°C coloniile pot fi foarte
mici şi apar după circa 24 ore. O inoculare a unor microorganisme virulente recoltate direct din ţesutul
infectat conduce la apariţia unor colonii de tip S, sau cu aspect mucoid, vâscoase şi colorate alb-gri.
După realizarea unor pasaje în laborator, coloniile devin neregulate şi aspre (de tip R); capsula dispare.
41. 2. 4. Caractere biochimice
Yersinia pestis are o activitate biochimică relativ scăzută şi cu un grad de variabilitate. Este un
germen aerob, facultativ anaerob, fermentează glucoza şi în mod variabil fermentează lactoza. Y.
pestis şi Y. pseudotuberculosis au caractere biochimice similare.
41. 2. 5. Rezistenţa faţă de factori fizici şi chimici
Sunt germeni puţin rezistenţi faţă de agenţii fizici şi chimici, dar în mediul extern pot supravieţui
până la circa 2 săptămâni în puroi sau în spută şi câteva luni în cadavre.
41. 2. 6. Structură antigenică
Yersiniile, la fel ca toate microorganismele Gram-negative, prezintă la nivelul peretelui antigenul O
(LPZ, endotoxina).
Y. pestis produce mai multe antigene şi toxine care acţionează ca factori de virulenţă.
Anvelopa conţine o proteină (fracţiunea I, F-1) care este produsă în principal la 37°C, conferă
proprietăţi antifagocitare şi activează complementul. Tipul virulent sălbatic de Y. pestis elaborează
antigenele proteice V şi W care sunt codificate cromozomial sau plasmidic. Dintre toxinele produse, una
este letală pentru animalele de laborator. Toxina (exotoxină) are structură proteică.
Y. pestis produce şi o bacteriocină (pesticină).
Câteva dintre antigenele Y. pestis reacţionează încrucişat cu antigene ale altor yersinii.
41. 2. 7. Răspuns imun
Există imunitate postinfecţioasă. Se pot utiliza vaccinuri pentru prevenirea îmbolnăvirii (protecţia nu
este absolută).
41. 2. 8. Caractere de patogenitate
Yersinia pestis este un microorganism patogen în special prin multiplicare şi prin invazivitate, rolul
patogenic al diferitelor structuri sintetizate în cursul metabolismului nefiind complet elucidat. Doza
infectantă este foarte redusă, 1-10 bacili sunt suficienţi pentru producerea bolii.
Rolul esenţial pare a reveni structurilor care conferă proprietăţile de rezistenţă la fagocitoză, spre ex.
fracţiunea I, proteică, de la nivelul suprafeţei celulare, şi respectiv structurii pseudocapsulare (virulenţa
scade în lipsa pseudocapsulei).
Structurile cu rol în virulenţă (rol dovedit in vitro şi pe animalele de experienţă) sunt codificate
plasmidic sau cromozomial. S-a dovedit implicarea esenţială a unor astfel de structuri genetice, care nu
au fost identificate în cazul tulpinilor avirulente. Aceste tulpini pot fi utile în producerea unor vaccinuri.
Dintre toxinele menţionate mai sus, una este letală pentru animalele de laborator (doză de numai
1 mg în cazul şoarecelui). Această proteină cu GM de 74.000Da, produce blocade β-adrenergice şi este
cardiotoxică la animale. Rolul său în infecţiile umane nu a fost elucidat.
354
41. 3. Patogenie şi patologie.
Principalele afecţiuni produse
În cursul „prânzului”, vectorul se hrăneşte dintr-o rozătoare infectată cu Y. pestis, microorganismul
ajunge în intestinul puricelui şi prin intermediul unei coagulaze blochează peristaltismul la nivel gastric.
Bacteriile se multiplică. Masa bacteriană şi structura fibrinoasă blochează tranzitul intestinal, puricele
înfometat muşcă din nou şi regurgitează microorganismele în animalul muşcat. Datorită blocajului
intestinal, cu toate că aspiră sânge, puricele nu se poate hrăni, devine şi mai înfometat şi pierde
selectivitatea naturală pentru rozătoarele respective; astfel ajunge să muşte gazda umană.
Microorganismul inoculat la om este fagocitat, dar se poate multiplica atât intra cât şi extracelular. În
scurt timp ajunge la nivel limfatic şi apare o inflamaţie hemoragică la nivelul ganglionilor care se
hipertrofiază, suferi o necroză şi devin fluctuenţi. În cursul invaziei, Y. pestis poate ajunge în torentul
sanguin şi infecţia se poate generaliza. Se dezvoltă leziuni hemoragice şi necrotice în toate organele (ex.
meningite, pneumonii şi pleuropericardite serosangvinolente). Aceasta este forma de pestă bubonică, în
care letalitatea în lipsa tratamentului este de peste 50%.
Pesta pneumonică primară (forma pulmonară) poate apare prin inhalarea de nuclei de picătură (de
obicei de la un pacient care tuşeşte) sau prin embolizări septice la nivel pulmonar; se manifestă prin
pneumonie hemoragică, septicemie şi deces în peste 90% din cazuri.
355
43. Genul Pseudomonas. Pseudomonas
aeruginosa
43. 1. Definiţie. Încadrare
Familia Pseudomonodaceae are patru genuri, dintre care numai genul Pseudomonas include specii
importante din punct de vedere medical. Genul Pseudomonas cuprinde pe baza omologiei ARNr cinci
grupuri, o parte din speciile incluse anterior în acest gen aparţinând actualmente
genului Burkholderia (B. mallei, B. pseudomallei etc). Pseudomonas maltophilia a fost
redenumităXanthomonas maltophilia şi a devenit actualmente Stenotrophomonas maltophilia. Cea mai
importantă specie a genului estePseudomonas aeruginosa (bacilul piocianic, „bacilul puroiului albastru”),
specie implicată relativ frecvent în infecţii la persoane cu reactivitate scăzută, precum şi în infecţii
nosocomiale (infecţii „de spital”). Pseudomonas aeruginosa reprezintă una din principalele bacterii
oportuniste.
În anul 1981 se considera că există circa 800 de specii de Pseudomonas, contaminând în special
plantele.
Genul cuprinde bacili aerobi, facultativ anaerobi, nesporulaţi, Gram-negativi, cu dimensiuni de 1-5 /
0,5-1mm, mobili datorită prezenţei unuia sau mai multor flageli (polari).
356
43. 2. 4. Caractere biochimice
Produce diferiţi pigmenţi, dintre care mai importanţi sunt piocianina (albastru) şi pioverdina (galben-
verzui fluorescent). Este un germen catalază-pozitiv, degradează oxidativ glucoza, nu fermentează
lactoza şi este oxidază-pozitiv.
43. 2. 5. Rezistenţa faţă de factori chimici şi fizici
Este sensibil la căldură, fenol, alcool de 80°, dar rezistent la acţiunea compuşilor cuaternari de
amoniu.
În spital se selectează tulpini rezistente la antiseptice, dezinfectante, antibiotice, tulpini care pot fi
implicate în infecţii de spital.
43. 2. 6. Structură antigenică
Pseudomonas aeruginosa posedă antigenul flagelar H (proteic) şi antigenul somatic O
(lipopolizaharidic). Pe baza existenţei mai multor factori antigenici O şi H, s-au descris mai multe
serotipuri în cadrul speciei, utile în special în investigaţii epidemiologice.
43. 2. 7. Răspuns imun
Există un răspuns imun umoral, manifestat prin formarea de anticorpi (opsonine, aglutinine), însă cu
titruri nesemnificative şi fără eficacitate protectivă.
43. 2. 8. Caractere de patogenitate
Speciile genului Pseudomonas sunt ubicuitare (întâlnite în apă, pe sol, pe plante etc, sau fac parte
din flora microbiană umană). Pseudomonas aeruginosa a fost identificat în diferite soluţii apoase, inclusiv
soluţii dezinfectante sau chiar soluţii de antibiotice, având o deosebită capacitate de a supravieţui în
medii umede. Pseudomonas aeruginosa este un microorganism oportunist, condiţionat patogen.
Dintre factorii de virulenţă ai bacilului piocianic am putea aminti prezenţa pililor (care mediază
ataşarea bacteriană la celulele epiteliale), producerea unor proteaze (cu efecte histotoxice), a unei
lipaze, sinteza de hemolizine, exotoxine (exemplu exotoxina A, de circa 20.000 de ori mai toxică decât
endotoxina), precum şi existenţa endotoxinei (lipopolizaharidul din structura peretelui).
Tulpinile de Pseudomonas aeruginosa izolate de la pacienţi cu fibroză chistică deţin un glicocalix
foarte dezvoltat care mediază aderenţa la nivelul mucoaselor respiratorii şi împiedică opsonizarea. În
infecţiile cronice, la aceşti pacienţi, a fost demonstrată trecerea tulpinilor din forme S în forme de tip M,
datorită unor mutaţii care au fost identificate recent (2008).
357
gangrenosum), asemănător cu patologia întâlnită la pacienţii neutropenici la care infecţia poate fi
produsă şi de alte microorganisme.
La persoanele spitalizate, cu reactivitate diminuată şi supuse unor manevre medico-chirurgicale
invazive (intubaţii, cateterizări etc), precum şi la persoanele cu arsuri, P. aeruginosa poate produce
infecţii localizate, dar potenţialul diseminării şi apariţiei unor complicaţii grave (bacteriemie, osteomielită,
meningită, endocardită, septicemie) este foarte important. În lipsa tratamentului adecvat (dificil datorită
rezistenţei la antibiotice), evoluţia procesului infecţios poate fi gravă sau deosebit de gravă (80% din
septicemiile cu piocianic au evoluţie letală). Infecţia pulmonară cronică la pacienţii cu fibroză chistică
(mucoviscidoză) este produsă de un fenotip particularal speciei Pseudomonas aeruginosa.
358
V. cholerae produce pe mediile de cultură solide colonii convexe, rotunde, de tip S cu un aspect
opac. Se dezvoltă foarte bine la 37°C pe multe tipuri de medii, inclusiv pe medii ce conţin săruri minerale
şi asparagină ca surse de carbon şi azot. Creşte bine pe TCBS (tiosulfat-citrat-bilă-sucroză-agar), pe care
produce colonii galbene.
44. 2. 4. Caractere biochimice
V. cholerae fermentează de obicei sucroza şi manoza. Fermentează glucoza. În funcţie de
fermentarea zaharurilor vibrionii se pot subîmpărţi în grupe. Au metabolism respirator şi fermentativ.
Sunt aerobi, facultativ anaerobi.
Testul oxidazei (pozitiv în cazul vibrionului holeric) este un test cheie în identificarea preliminară.
Majoritateavibrionilor sunt halotoleranţi şi adesea prezenţa NaCl le stimulează creşterea prin alcalinizarea
mediului.
44. 2. 5. Rezistenţa faţă de factori fizici şi chimici
Vibrionii holerici sunt foarte sensibili la lumina solară şi la acţiunea căldurii (la 100° sunt distruşi
aproape instantaneu); sunt sensibili la antiseptice. ÎN ALIMENTE TRĂIESC (CU UNELE EXCEPŢII) PÂNĂ
LA 7 ZILE. ÎN APĂ SUPRAVIEŢUIESC UN NUMĂR DE ZILE, ÎN FUNCŢIE DE EFICACITATEA
TRATAMENTULUI APLICAT APELOR UZATE. ÎN INTESTINUL BOLNAVILOR NETRATAŢI SE POT MENŢINE
CÂTEVA SĂPTĂMÂNI.
44. 2. 6. Structură antigenică
Vibrionul holeric prezintă la nivel parietal antigenul O (lipopolizaharid). În funcţie de structura
antigenului somatic de grup O, vibrionii holerici au fost împărţiţi în 6 serogrupe; vibrionul holeric clasic şi
biotipul El Tor fac parte din grupul O:1, ceilalţi vibrioni fiind non-O:1NAG (non-aglutinabili cu seruri anti-
O:1); aceste microorganisme nu pot fi distinse biochimic de vibrionul holeric O:1. Abordări taxonomice
au demonstrat că Vibrio cholerae O:1 şi non-O:1 reprezintă de fapt aceleaşi specii. Antigenul
serogrupului O:1 are determinanţi care fac posibilă diferenţierea serotipurilor. ÎMPĂRŢIREA
VIBRIONULUI HOLERIC ÎN SEROTIPURI ŞI BIOTIPURI ESTE UTILĂ ÎN STUDII EPIDEMIOLOGICE, DAR
TESTELE SE FAC NUMAI ÎN LABORATOARE SPECIALIZATE.
Există antigene la nivelul pililor.
Fiind mobil, vibrionul prezintă antigenul H la nivel ciliar.
Vibrionul holeric şi vibrionii înrudiţi produc o enterotoxină labilă faţă de căldură, cu masa moleculară
de 84.000 Da, alcătuită din două subunităţi A şi B (activă şi de legare).
44. 2. 7. Răspuns imun
Aciditatea gastrică furnizează o oarecare protecţie în cazul ingerării unui număr mic de vibrioni.
După holeră apare imunitate faţă de reinfecţie, dar durata şi gradul acesteia nu sunt cunoscute. La
animalele de experienţă apar anticorpi specifici de tip IgA în lumenul intestinal. Anticorpii faţă de
antigenul O protejează animalele de laborator faţă de infectare. Anticorpi similari apar în serul uman
după infecţie şi se consideră că sunt asociaţi (într-o oarecare măsură) cu protecţia faţă de colonizarea cu
vibrioni patogeni. Prezenţa anticorpilor antitoxină nu se asociază cu protecţia.
44. 2. 8. Caractere de patogenitate
Microbiologia medicală este interesată în cunoaşterea următorilor vibrioni patogeni sau cu
patogenitate condiţionată, potenţial periculoşi pentru sănătatea omului: Vibrio cholerae O:1, cu
359
biotipurile cholerae şi El Tor (fiecare din aceste biotipuri putând fi clasificat în serotipurile Inaba, Ogawa,
Hikojima); Vibrio cholerae grup non O:1; Vibrio mimicus; Vibrio parahemolyticus; V. damsela; V.
furnissii; Vibrio vulnificus; V. fluvialis.
Mecanismul patogen al germenilor din familia Vibrionaceae constă în aderarea la epiteliul celular
(adezine/pili), urmează colonizarea şi apoi invadarea mucoasei, care permit infiltrarea germenilor cu
producerea unor variate substanţe biologic active, incluzând enzime extracelulare, enterotoxine,
citotoxine, hemolizine, factori asociaţi cu virulenţa bacteriană.
Capacitatea chemotactică faţă de epiteliile mucoase este mai evidentă la formele monotriche,
depinzând şi de cantitatea şi calitatea mucusului.
Majoritatea germenilor ce colonizează ţesutul uman posedă pe suprafaţă componente proteice
numite ²adezine² care se leagă stereochimic de structurile moleculare complementare tisulare. Aceşti
factori de adezivitate par a fi asociaţi cu fimbriile sau pilii. Factorii de virulenţă implicaţi în colonizare sunt
sintetizaţi în paralel cu producerea enterotoxinei în cazul Vibrio cholerae(toxina holerică) şi sunt sub
coordonarea aceleiaşi gene. Se presupune că pilii (proprietate importantă asociată virulenţei germenilor
din mediu) se pierd o dată cu instituirea infecţiei.
Prin observarea tulpinilor virulente la microscopul electronic s-a observat existenţa unui strat
adiţional S extern faţă de peretele celular, care oferă protecţie faţă de agenţii litici (bacteriofagi, proteine
serice).
Enterotoxina holerică este principala cauză a diareei secretorii din holeră. De exemplu, la voluntarii
care au ingerat mai puţin de 10μg de toxină purificată, în 2 zile a apărut diareea, cu un volum de peste
20 l, cu caracter „exploziv”.
Toxina holerică (la fel ca şi enterotoxina produsă de E. coli) este compusă dintr-o subunitate A şi 5
subunităţi B, totalizând aproximativ 84.000 daltoni. Subunităţile B au o mare afinitate pentru receptorii
gangliozidici GM de pe suprafaţa celulelor ţintă. După legare, subunităţile A intră în citoplasmă şi
catalizează transferul ADP-ribozei la NAD, fiind astfel activată o proteină reglatoare asociată membranei,
numită Gs. Rezultatul este un nivel crescut al AMPc în celulele mucoase ale intestinului subţire, urmat de
hipersecreţia clorurilor şi bicarbonatului care va determina un eflux important de apă.
Fiind germeni Gram-negativi, după distrugerea acestora din peretele celular se eliberează
endotoxina.
2. Lipooligozaharidul are rol în aderența la celula epitelială și în invazivitate. Unele componente ale sale,
datorită asemănarii structurale cu părti ale mielinei, declanșează un răspuns imun încrucișat cu acestea.
A se vedea 45. 2. 2. pentru detalii.
3. Flagelul: motilitatea este importantă pentru colonizarea gazdei de către bacterie. C. jejuni prezintă
chemotaxie pentru aminoacizii și alte componente ale mucusului tractului intestinal.
4. Toxina CDT (Cytolethal Distending Toxin) este produsă și de alte bacterii (E. coli, Haemophilus
ducreyi, Helicobacter hepaticus). Aceasta cauzează oprirea ciclului celular în celulele-gazdă. Mecanismele
precise prin care CDT ajunge la nivelul nucleului sunt încă în studiu.
5. Molecule de adezivitate: sunt utilizate diferite proteine de adezivitate cum ar fi CadF, JlpA, Peb1.
362
Ultimele 2 specii se comportă din punct de vedere clinic asemănător cu Campylobacter jejuni.
363
O dată colonizat stomacul unui individ, întrebarea care se impune este: cum este realizată
persistența acestei infecții? De ce sistemul imun al individului respectiv nu reușește să combată infecția?
Răspunsul este că de-a lungul timpului, H. pylori a reușit să evite sistemul imun prin mai multe
mecanisme care vor fi detaliate în continuare.
În primul rând, după cum am mai subliniat, H. pylori stă sub stratul de mucus, fără a invada epiteliul
gastric, dincolo de “locul de acțiune” al celulelor sistemului imun. Cu toate acestea, răspunsul imun al
gazdei este activat de atașarea bacteriei de celulele epiteliale. H. pylori se poate atașa de MHC II
(complexul major de histocompatibilitate) de pe suprafața celulelor epiteliale, declanșând apoptoza
acestora. O metodă importantă de activare a sistemului imun este descrisă în documentul suplimentar
(Anexa nr. 1) mai precis stimularea secreției de IL8 de către acidul diaminopimelic.
Pentru a evita răspunsul imun înnăscut, este necesară “neutralizarea” receptorilor Toll-like
(prescurtați în continuare TLR). Aceștia recunosc PAMPs (pathogen associated molecular patterns),
adică recunosc anumite molecule specifice pentru o mare varietate de agenți patogeni care sunt diferite
din punct de vedere structural de moleculele organismului gazdă. Astfel, receptorii TLR-5 recunosc
flagelina caracteristică mai multor specii bacteriene, însă nu și pe cea conținută de H. pylori. TLR-9
recunosc ADN nemetilat al majorității bacteriilor, dar H. pylori are un ADN puternic metilat. LPS
(lipopolizaharid) a suferit modificări, astfel încât este recunoscut doar de TLR-4 de pe macrofage, nu
însă și de receptorii aflați pe celulele epiteliale gastrice. Unul din puținele mecanisme ale imunității
înnăscute care încă este activat de catre H. pylori este calea acid diaminopimelic→NOD1→stimularea
NFkB→secreție IL8→neutrofile (NOD like receptors sunt un alt tip de pattern recognition receptors,
receptori care recunosc PAMPs).
Pentru imunitatea dobândită sunt necesare prezentarea antigenelor și proliferarea LT, evenimente
inhibate de către vacA, după am prezentat în Anexa nr. 1.
În timpul răspunsului imun dobândit, limfocitele Th0 (naive) se pot diferenția fie în Th1 (care
secretă IL2 și IFNγ), fie în Th2 (care secretă IL4, 5 și 10). Th2 stimulează LB care produc anticorpi
împotriva patogenilor extracelulari, în timp ce Th1 stimulează răspunsul imun celular, caracteristic pentru
infecțiile cu microbi intracelulari. În mod paradoxal H. pylori generează un răspuns predominant Th1.
Studiile pe șoareci au arătat ca acest raspuns predominant Th1 este asociat cu apariția gastritei, în timp
ce un răspuns Th2 este protector față de inflamația gastrică (gastrita se pare că este cauzată de secreția
de IFNγ, o citokină caracteristică răspunsului imun tip Th1). Studiile epidemiologice la om au arătat o
polarizare mai puțin pronunțată a răspunsului imun. (Tabelul nr. 3 și Figura nr. 4)
45. 3. 1. 8. Caractere de patogenitate
H. pylori prezintă structuri cu rol în patogenitate, respectiv antigenul de suprafaţă (de colonizare,
aderare), antigenul somatic O (endotoxina), toxina citotoxică care iniţiază inflamaţia locală acţionând
asupra celulelor din epiteliul gastric şi duodenal şi toxina care inhibă secreţia acidului clorhidric la nivelul
celulelor parietale gastrice (Anexa nr. 1)
Se pare că un rol destul de important în patogenitate îl au ureaza, ca şi prezenţa cililor.
În acest moment, devine importantă localizarea infecției cu H. pylori, și implicit localizarea răspunsului
inflamator. În cazul gastritei, răspunsul inflamator de la nivelul celulelor parietale inhibă funcția acestora
cu suprimarea producției de acid, iar secreția gastrică este caracterizată de nivele crescute ale pH-ului.
Hipoacidemia crește suplimentar gastrina care reprezintă un stimul proliferativ pentru epiteliile gastrice.
Inflamația și proliferarea continuă duc la pierderea glandelor gastrice și instalarea gastritei atrofice.
Atrofia gastrică reprezintă unul dintre cei mai importanți factori de risc pentru cancerul gastric, mai multe
ipoteze fiind formulate pentru a explica trecerea de la atrofie la cancer. Cea mai cunoscută dintre acestea
cuprinde secvența atrofie→metaplazie intestinală→displazie→adenocarcinom. (Figura nr. 6)
Gastrita predominant antrală se caracterizează prin hipergastrinemie care de această dată acționează
prin stimularea celulelor parietale care vor crește secreția de acid, răspunsul final fiind reprezentat de
ulcerul duodenal. Ulcerul duodenal este asociat cu scăderea pH-ului secreției gastrice, în timp ce ulcerul
gastric este asociat cu scăderea mijloacelor de apărare ale mucoasei stomacului. (Figura nr. 7)
365
acest motiv acest tip de testare nu va fi utilizat pentru evaluarea post-tratament, deși este un test care
poate fi util în screeningul inițial al infecției cu Helicobacter pylori.
B. Testul respirator la uree: reprezintă standardul în testarea non-invazivă a infecției cu H. pylori.
Pacientul va bea un lichid care conține uree marcată cu C 13 (izotop nonradioactiv) sau cu C14 (utilizat mai
rar din cauza radioactivității). Ureaza produsă de H. pylori va descompune ureea în amoniac și
CO2 marcat care va fi măsurat din aerul expirat de pacient. Cantitatea de CO 2 din aerul expirat este un
indicator al cantității de uree aflata în stomac. Testul respirator la uree poate fi folosit atât pentru
diagnosticarea inițială, cât și pentru monitorizarea răspunsului la tratament.
C. Testul antigenelor din materiile fecale: se utilizează tot un test de tip ELISA, însă spre
deosebire de cel de la punctul 1 suntem în situația inversă: în kit avem anticorpii, ceea ce trebuie să
determinăm este prezența sau absența antigenelor din fecale. Testul antigenelor din fecale este unul
care certifică infecția activă (daca nu mai sunt microorganisme în stomac, acestea nu vor mai fi eliminate
pe cale digestivă), deci reprezintă un test eficace atât pentru screeningul inițial, cât și pentru evaluarea
post-terapie.
45. 3. 3. 2. Teste endoscopice
Cu ajutorul endoscopiei se prelevează biopsii de țesut gastric care vor fi analizate prin una din
modalitățile următoare:
A. Metode bazate pe urează: țesutul biopsiat se plasează într-o soluție de uree și un indicator de
pH. Prezența ureazei va descompune ureea și va crește pH-ul ceea ce va determina virarea culorii
indicatorului de pH.
B. Teste care țin de diagnosticul de laborator microbiologic: fragmentele bioptice obținute
din corpul și antrul stomacului sunt strivite pe o lamă (amprentare), fixate cu alcool metilic timp de 1
minut, uscate și apoi colorate timp de 20 de minute cu soluție Giemsa1/10 preparată extemporaneu. Se
poate utiliza și impregnarea argentică Warthin-Starry (aceasta a fost metoda orginală de evidențiere
a Helicobacter de către Warren și Marshall în 1983) Apare morfologia caracteristică de vibrioni sau spirili.
(Figura nr 8)
Cultivarea, deși reprezintă o modalitate foarte specifică și prezintă în plus avantajul de a putea
permite testarea sensibilității la antibiotice nu se realizează în mod curent din cauza unor dificultăți
tehnice și a sensibilității reduse (un număr relativ mare de infecții cu H. pylori nu au fost validate
utilizând această modalitate de diagnostic). H. pylori este un microorganism pretențios, cu creștere
lentă, care are nevoie de condiții speciale pentru a se dezvolta. Totuși, considerăm că ar fi necesare mai
multe eforturi în acest sens.
367
În cursul diagnosticului unei infecţii cu bacil difteric este necesară utilizarea mediului de îmbogăţire
OCST (ou-cisteină-ser-telurit), un mediu lichid.
46. 2. 4. Caractere biochimice
Deşi se poate multiplica pe medii simple, bacilul difteric are o dezvoltare mai favorabilă pe medii
îmbogăţite cu proteine animale (de exemplu ou, ser de bou).
Capacitatea de fermentare a mono şi dizaharidelor permite identificarea speciei în cadrul genului, iar
fermentarea polizaharidelor permite stabilirea tipului (gravis) în cadrul speciei.
Bacilul difteric produce cistinază (care descompune cistina, eliberând H 2S), reduce sărurile de telur şi
elaborează bacteriocine.
46. 2. 5. Rezistenţa faţă de factori fizici şi chimici
Poate rezista în fragmente din „falsele membrane”. Este distrus de căldura umedă (10 minute la
60º), alcool sau antiseptice uzuale, precum şi de antibiotice (eritromicină, penicilină etc).
46. 2. 6. Structură antigenică
Există diferenţe serologice între diferitele tulpini de Corynebacterium diphtheriae, dar nu s-a putut
elabora o clasificare serologică satisfăcătoare. În diagnostic nu se folosesc identificările serologice.
Cea mai importantă structură antigenică este reprezentată de toxina difterică, un polipeptid
termolabil cu greutatea moleculară de 62.000 Da, care conţine cel puţin patru determinanţi antigenici
diferiţi.
46. 2. 7. Răspuns imun
Determină un răspuns imun umoral. Anticorpii antimicrobieni pot fi identificaţi, dar nu oferă
protecţie (sunt specifici de tip). Anticorpii antitoxină (care este identică la toţi bacilii difterici toxigeni)
oferă protecţie (neutralizează toxina). Titrul protector trebuie să fie mai mare de 0,03 UA / ml.
46. 2. 8. Caractere de patogenitate
Bacilul difteric poate fi patogen prin multiplicare (la poarta de intrare) şi toxinogeneză (tulpinile
lizogenizate). Toxina (exotoxină) este aceeaşi pentru toate tulpinile toxigene. Infectarea cu bacteriofagul
temperat poate duce la starea de lizogenizare. Deoarece există fagi tox+ şi fagi tox-, există tulpini
lizogene care produc şi tulpini lizogene care nu produc toxină difterică.
În cazul producerii toxinei, s-a dovedit faptul că prezenţa fierului este esenţială, producţia optimă
realizându-se la concentraţii care variază între 0,14-0,50 mg Fe / ml.
Toxina difterică este alcătuită din două fragmente legate prin punţi disulfidice. Fragmentul B
(greutate moleculară 38.000 Da), reprezintă fragmentul de legare pe receptorii specifici ai celulelor
susceptibile şi facilitează pătrunderea fragmentului A. Fragmentul A este activ şi inhibă elongarea
lanţurilor polipeptidice în curs de formare, catalizând inactivarea translocazei ARN t(numit factor de
elongare 2) prezentă numai în celulele eucariote. Factorul de elongare 2 este necesar pentru
translocarea polipeptidil-ARNt de pe situsul acceptor pe situsul donor al ribozomului celulei eucariote;
prin inactivarea lui nu mai are loc interacţia ARN m-ARNt şi se stopează adăugarea a noi aminoacizi
lanţului polipeptidic în curs de formare.
În mod practic, toxina difterică (fragmentul A) catalizează o reacţie prin care se eliberează
nicotinamidă şi adenozin difosfat riboză, care cuplându-se cu factorul de elongare 2 formează un
complex inactiv (o toxină asemănătoare ca mod de acţiune poate fi produsă de unele tulpini de P.
368
aeruginosa). O moleculă de toxină opreşte sinteza proteică în celulă pentru mai multe ore. Doza letală
este de 0,1 mg / kg.
369