GENETICA

MEDICINA DENTARA

CURS 2
13 octombrie 2014

AUTOR:
PROF.DR. EMILIA SEVERIN
UMF “Carol Davila”
Bucuresti
 EREDITATE

ADN
INFORMATIA GENETICA

STOCARE EXPRIMARE REPLICARE

CODON TRANSMITERE

TRANSCRIPTIE ARN

Diviziune celulara

TRANSLATIE PROTEINA

2  
Genetica MD CURS 2 - A nu se copia sau distribui fara copyright
 ADN-ul din celula somatică umană

- molecule
dublu-
catenare,

NUCLEU
liniare,
neramificate,
ADN
organizate in NUCLEAR
22 crz.
autozomi, X
si Y.

- molecule
dublu-
catenare,
circulare,
neramificate, ADN
organizate in
crz.
MITOCONDRIAL
MITOCONDRIE mitocondrial.
-o ADNmt
CELULA SOMATICA mitocondrie
are 2-10
Source: Getty Images, Dorling Kindersley molecule ADN.

3  
GENETICA MD CURS 2 - A nu se copia sau distribui fara copyright
 ADN-ul celulei somatice umane

ADN-ul mitocondrial ADN-ul nuclear

provine numai de
la mama.
provine de la ambii
părinți.

CELULELE COPILULUI

4  
GENETICA MD CURS 2 - A nu se copia sau distribui fara copyright
 CUM ESTE ORGANIZATĂ STRUCTURAL
molecula ADN PENTRU A INDEPLINI
URMĂTOARELE FUNCȚII?

1. STOCAREA 2. EXPRIMAREA
informației genetice informației genetice

3. REPLICAREA si
4. VARIATIA
TRANSMITEREA informației genetice
informației genetice

5  
GENETICA MD CURS 2 - A nu se copia sau distribui fara copyright
 1953 ISTORIA
F.CRICK si J.WATSON
Propun un model al
DESCOPERIRII STRUCTURII ADN :
structurii fizice si chimice evenimentele majore
molec. ADN (Double Helix).

1952/1953
WILKINS si FRANKLIN 1952 1952
arata ca molecula ADN are o E. CHARGAFF descopera A.HERSHEY si M.CHASE
structura regulata, helicala, principiul echivalentei si demonstreaza ca ADN
care se repeta. raportul de asimetrie. are rol in ereditate si nu
proteina.

1944
AVERY et al. explica
“Principiul transformarii”
si arata ca ADN este
material genetic.

1909 - 1929 1928

P.A.LEVENE identifica F.GRIFFITH descopera din
riboza si dezoxiriboza intamplare “fenomenul
afirmand ca ADN este un transformarii”.
polimer.

1869
F.MISCHER – izoleaza din
nucleu: NUCLEINA

GENETICA MD CURS 2 - A nu se copia sau distribui fara copyright

 DESCOPERIREA STRUCTURII ADN:
REGULILE LUI CHARGAFF
(utilizand cromatografia si spectrofotometria elaborează REGULILE IMPERECHERII
BAZELOR AZOTATE )
E.CHARGAFF arata ca, indiferent de specie, in molecula ADN:

Totalul bazelor purinice = Totalul bazelor pirimidinice

A + G = T + C
Raportul dintre suma adeninelor si suma timinelor este unitar;
Raportul dintre suma guaninelor si suma citozinelor este unitar;
(“PRINCIPIUL ECHIVALENTEI”)

A / T = G / C ADENINA TIMINA

Raportul de asimetrie :

GUANINA CITOZINA
A + T
G + C = 1*

*este diferit de la o specie la alta, dar caracteristic pentru fiecare specie.

La specia umana este ~ 1,6. 7  
Genetica MD
CURS 2 - A nu se copia sau distribui fara copyright
 DESCOPERIREA STRUCTURII ADN:
DIFRACȚIA CU RAZE X a MOLECULEI ADN

M.H.WILKINS si R.FRANKLIN
studiaza structura moleculelor ADN folosind o tehnica
bazata pe difractia cu raze X.

Concluzia:
Molecula ADN are o structura ordonata
care se repeta, elicoidala.

“Photo 51” – difractograma moleculei ADN

8  
Genetica MD CURS 2 - A nu se copia sau distribui fara copyright
 DESCOPERIREA STRUCTURII ADN
MODELUL STRUCTURII MOLECULEI ADN
F.CRICK si J.WATSON propun un model al
structurii fizice si chimice a moleculei
ADN (“Double Helix” – Elicea vietii).

1962 – PREMIUL NOBEL in MEDICINA

"DNA makes RNA, RNA makes protein, and proteins make us."
Francis Crick

9  
Genetica MD CURS 2 - A nu se copia sau distribui fara copyright
 MODELUL WATSON&CRICK: “DUBLA ELICE”

CARACTERISTICILE MOLECULEI ADN

1. Molecula ADN este 3. Diametrul

alcatuita din 2 lanturi 2. Imperecherile
intre b.a. se moleculei ADN este
polinucleotidice legate
intre ele prin punti de realizeaza in mod de 2 nm.
H care se formeaza la complementar.
nivelul bazelor azotate
(b.a.).

10  
Genetica MD CURS 2 - A nu se copia sau distribui fara copyright
 MODELUL WATSON&CRICK: “DUBLA ELICE”

5 3
’ ’
CARACTERISTICI MOLECULEI
ADN

4. Catenele se infasoara una in jurul celeilalte

(plectonemic) printr-o rotatie spre dreapta ; intre
perechile de b.a. succesive exista o distanta de 0,34 nm,
iar un tur complet de spira (3600) are 3,4 nm (pasul
elicei), deci 10 b.a. /tur de spira.

5. Cele doua catene sunt antiparalele avand polaritati

opuse (directia in care molecula ADN este sintetizata,
citita 5 - 3.

6. Spatiul dintre coloana fosfoglucidca a unei catene si a

celeilalte catene nu este uniform ocupat de b.a., astfel
ca, prin rasucirea catenelor apar depresiuni (santuri)
5 3 inegale ca marime; la nivelul depresiunii mari se fixeaza
’ ’ factorii proteici implicati in transcriptie iar in
2 nm depresiunea mica se fixeaza histonele.

11  
Genetica MD CURS 2 - A nu se copia sau distribui fara copyright
 DEZOXIRIBONUCLEOTID
Unitatea structurală a moleculei ADN este
DEZOXIRIBONUCLEOTIDUL, format din
trei elemente distincte:

PO4 3.GRUP FOSFAT

1.BAZA AZOTATA BAZA

5
CH2 ’

1 4
2. PENTOZA ’ ’
(dezoxiriboza)

3
2 ’
’
OH

12  
Genetica MD CURS 2 - A nu se copia sau distribui fara copyright
 BAZELE AZOTATE

PIRIMIDINE

PURINE

13  
CURS 2 - A nu se copia sau distribui fara copyright
 DEZOXIRIBONUCLEOTID - nomenclatura

Cele 3 elemente distincte (b.a., pentoza si grupul fosfat) se

asambleaza intre ele prin legaturi covalente formand:l

BAZA AZOTATA + NUCLEOZID +

DEZOXIRIBOZA = GRUP FOSFAT =

NUCLEOZID NUCLEOTID

14  
Genetica MD CURS 2 - A nu se copia sau distribui fara copyright
 DEZOXIRIBONUCLEOTID

ADENOZINA ADENOZIN-
NUCLEOZID MONOFOSFAT (AMP)
NUCLEOTID

ADENOZIN- ADENOZIN-DIFOSFAT
(ADP)
MONOFOSFAT (AMP)
NUCLEOTID NUCLEOTID

15  
Genetica MD CURS 2 - A nu se copia sau distribui fara copyright
 CATENA (LANȚUL) ADN
(STRUCTURA PRIMARA)
Capatul 5’

Polimerizarea nucleotidelor prin T NUCLEOTID 1

legaturi 3’ – 5’ fosfodiester
formeaza o CATENA ADN (lant
polinucleotidic), liniara si
neramificata. Legatura
FOSFODIESTER

Sensul de “citire” a informatiei A

genetice este determinat de
polaritatea 5’ – 3’ a catenei ADN: NUCLEOTID 2

C
NUCLEOTID 3

5’ TACG– 3’ Legatura
FOSFODIESTER

NUCLEOTID 4
Capatul
3’
16  
Genetica MD CURS 2 - A nu se copia sau distribui fara copyright
 CATENA (LANȚUL) ADN
(STRUCTURA PRIMARA)

COLOANA
FOSFOGLUCIDICA BAZELE AZOTATE
T asezate perpendicular pe coloana
fosfoglucidica

Grup fosfat NUCLEOTID

D-riboza
G

17  
Genetica MD CURS 2 - A nu se copia sau distribui fara copyright
 MOLECULA ADN
(STRUCTURA SECUNDARA)

5 3
Molecula ADN este ’ ’
formata din doua catene Punti de
polinucleotidice legate HIDROGEN
intre ele prin b.a., in mod
complementar.

Perechea de baza G – C se leaga prin trei

punti de hidrogen slabe.

Perechea de baza A – T se leaga prin doua 3 5

punti de hidrogen slabe.
’ ’ 18  
Genetica MD CURS 2 - A nu se copia sau distribui fara copyright
 STRUCTURA MOLECULEI ADN

DEZOXIRIBOZA

NUCLEOTIDE

GRUP FOSFAT

COMPLEMENTARITATEA
BAZELOR AZOTATE

Copyright © 2006 Pearson Prentice Hall, Inc.

19  
 MOLECULA ADN

Coloana
fosfoglucidica

Cele doua
catene se
Perechi de b.a. înfășoară una
complementare
în jurul
celeilalte și
impreună se
rotesc spre
dreapta în jurul
Șanț mare
unui ax central
imaginar.

Șanț mic

21  
Genetica MD CURS 2 - A nu se copia sau distribui fara copyright
 ALTERNATIVE STRUCTURALE ALE
MOLECULEI ADN

Molecula ADN poate avea conformatii diferite;

Conformatia - tipul de orientare 1. B-ADN

a rotatiei, spre
adoptata dreapta sau spre
(conformatia biologica
principala, caracteristica
depinde de: stanga celulelor vii)

- modificarea
- conditiile de pasului elicei si
umiditate nr.de baze/tura de 2. A-ADN
elice

3. Z-ADN
- concentratia - inclinarea bazelor
ionica azotate fata de ax ( coloana fosfo-glucidica in
zig-zag)

21  
Genetica MD CURS 2 - A nu se copia sau distribui fara copyright
 ALTERNATIVE STRUCTURALE
ALE MOLECULEI ADN
CONFORMAȚII STRUCTURALE ALE MOLECULEI ADN

CONFORMAȚIA

A B Z
Orientarea dublei spre dreapta spre dreapta spre stanga
elice (dextrogir) (dextrogir) (levogir)

Diametrul elicei 2,3 nm 2,0 nm 1,8 nm

Numarul de baze/
tura elice 11 10 12

Distanta intre p.b 0,26 nm 0,34 nm 0,38 nm

Pasul elicei 2,82 nm 3,32 nm 4,56 nm

Santul mare Ingust si foarte Larg si adanc Ingust si adanc

adanc (similar santului
mic)

Santul mic Larg si putin adanc Ingust si adanc Ingust si adanc

22  
Genetica MD CURS 2 - A nu se copia sau distribui fara copyright
 ALTERNATIVE STRUCTURALE ALE
MOLECULEI ADN

B-ADN A-ADN Z-ADN

Sant
mare

Sant
mic Sant

23  
Genetica MD CURS 2 - A nu se copia sau distribui fara copyright
 TRANZIȚIA conformațională a moleculei ADN

Molecula ADN
este flexibila,
dinamica.

B-ADN Z-ADN

24  
Genetica MD CURS 2 - A nu se copia sau distribui fara copyright
 ADN-ul nuclear uman

B-ADN A-ADN; 1. Structural este reprezentată

de forma B-ADN dar in anumite
conditii fiziologice isi poate
schimba conformatia
(modificari conformationale):
B-ADN Z-ADN;

2. Respectă regulile lui Chargaff

COMPOZITIA IN BAZE (%) RAPORTUL BAZELOR

ORGANISM
A G T C A/T G/C A+T/G+C
Homo sapiens 30,9 19,9 29,4 19,8 1,05 1,0 1,52

celula GAMETICA: celula SOMATICA:

3.Se gaseste in 3,5x 10-9mg ADN 7 x 10-9mg ADN
cantitate (C corespunde unui (2C corespunde celor
constanta in: set haploid de 2 seturi haploide de
cromozomi, adica 23 cromozomi, adica 46
crz.) crz.)

25  
GENETICA MD CURS 2 - A nu se copia sau distribui fara copyright
 MITOZA: redistribuie in mod egal cantitatea de ADN
nuclear in celulele fiice
CENTRIOL CENTRIOL 4. Cantitatea ADN per
celula/nucleu este
constanta:
4C
ADN C ADN= 3,5x10-9mg
MITOZA 2C
ANAFAZA
Separarea
cromatidelor
2C

2C 2C
ADN ADN
2C

4C
ANAFAZA
Migrarea cromatidelor
spre polii fusului

INTERFAZA
CANTITATEA ADN in timpul MITOZEI:
PROFAZA 4C
METAFAZA 4C
ANAFAZA 2C / 2C
TELOFAZA 2C / 2C

26  
GENETICA MD CURS 2 - A nu se copia sau distribui fara copyright
 ADN-ul nuclear uman

- pe parcursul ciclului celular cantitatea de ADN este

variabilă dar mitoza repartizeaza in mod egal cantitatea
4C ADN in celulele fiice.

4C
Cantitatea de ADN

4. Cantitatea ADN per

celula/nucleu este
2C constanta:

G1 S G2 M

27  
GENETICA MD CURS 2 - A nu se copia sau distribui fara copyright
 ADN-ul nuclear uman

Exprimata prin nr.de

Exprimata in mm
perechi de baze
este 106 mm / set
5. Dimensiunea: 6x109 p.b. pentru
haploid de
cele 46 molec. ADN
cromozomi
nuclear

0,34 x 10-9 m x 3 x 109

1nm= 10-9 m= 10-6 mm
= 1,02 m

6. Masa moleculara : 2x1012 daltoni / celula haploidă.

28  
GENETICA MD CURS 2 - A nu se copia sau distribui fara copyright
 ADN-ul nuclear uman

- expunerea ADN nativ

la temperaturi ridicate
(peste 800C) produce 7. DENATURARE -
ruperea leg. de H care
unesc p.b. RENATURARE:
complementare
generand doua catene.

ADN nativ ADN denaturat ADN renaturat

Racire lenta

t0

29  
GENETICA MD CURS 2 - A nu se copia sau distribui fara copyright
 DENATURAREA/RENATURAREA ADN

Dacă răcirea se
face brusc, cele 2
Prin denaturare catene disociate
(separarea
nu au la dispozitie Dacă racirea se
catenelor)
un timp suficient face lent catenele
molecula ADN iși
pentru a-si putea vor renatura.
pierde capacitatea
gasi secventele
de transformare.
complementare si
raman separate.

Denaturarea / Renaturarea
au loc in condiții naturale
(replicare, transcriere) si
experimentale.

30  
GENETICA MD CURS 2 - A nu se copia sau distribui fara copyright
 HIBRIDIZAREA MOLECULARA
(utilizată ca tehnică în genetica moleculară pentru măsurarea
gradului de asemănare genetică al secvențelor ADN provenite de la
specii diferite)

ADN
HOMO-
DUPLEX

ADN /ADN

DENATURARE RENATURARE

ADN ARN
HETERO-
DUPLEX

ADN /ARN

DENATURARE; RENATURARE
Adaugare de ARN

31  
GENETICA MD CURS 2 - A nu se copia sau distribui fara copyright
 ADN-ul mitocondrial uman (ADNmt)

1. Dimensiune:
~16,6Kb;

2. Număr molecule:
100 – 10.000 copii/celula;

3. Structura:
dublu-catenar, cu diferente de densitate
intre cele doua catene; catena grea
(H=heavy) bogata in guanina si catena
usoara (L=light) bogata in citozina.

32  
GENETICA MD CURS 2 - A nu se copia sau distribui fara copyright
Experimentele de identificare si descriere a materialului
genetic la Ek au demonstrat rolul genetic al ADN:

ADN este molecula EREDITĂȚII

Principiul transformarii
genetice si transferul
experimental de material
genetic intre specii diferite
stau la baza unei
BIOTEHNOLOGII
denumită:

TEHNOLOGIA ADN RECOMBINANT

Ansamblul de metode si mijloace folosit pentru obtinerea
moleculelor de ADN recombinant.
(ADN in VITRO si “era ingineriei genetice”)
33  
 TEHNOLOGIA ADN RECOMBINANT

ADN RECOMBINANT
(rDNA)

Este o
Se obtine prin molecula ADN
utilizarea care rezulta
tehnicilor de din unirea unor
laborator, fragmente ADN
tehnici prin cu origini
care se diferite
“manipuleaza” (o molecula ADN,
informatia artificial creata,
care poate modifica
genetica. genomul si schimba
fenotipul unui
organism).

CURS 2 - A nu se copia sau distribui fara copyright 34  

GENETICA MD
 CONSTRUCȚIA moleculelor de
ADN RECOMBINANT
ETAPE

1. Obtinerea fragmentelor
2. Inserarea fragmentului
ADN de interes (gene) prin
ADN de interes intr-un
sectionarea moleculei ADN
VECTOR pentru a fi
cu enzime de RESTRICTIE
introdus in celula gazda
(endonucleaza) la nivelul
unde va fi multiplicat;
situsului de recunoastere;

3. Fragmentele ADN sunt

legate intre ele pentru a
forma o secventa continua
cu ajutorul enzimei
LIGAZA.

35  
GENETICA MD CURS 2 - A nu se copia sau distribui fara copyright
 Constructia moleculelor de
ADN RECOMBINANT - ETAPE
SITUS de RESTRICTIE

ADN
specia A

SECTIONARE
enzima de
restrictie

Capete “adezive”

ADAUGAREA
FRAGMENTULUI ADN
ADN
de la specia B
specia B

UNIREA celor doua enzima

fragmente ADN LIGAZA

Molecula de ADN RECOMBINANT 36  

GENETICA MD CURS 2 - A nu se copia sau distribui fara copyright
 CONSTRUCȚIA moleculelor de
ADN RECOMBINANT

Enzime de ADN exogen

RESTRICTIE

Fragmente ADN Enzime de

RESTRICTIE

Unirea capetelor cu LIGAZE

ADN
recombinant

PLASMID

37  
Genetica MD CURS 2 - A nu se copia sau distribui fara copyright
 CELULA BACTERIANA

ADN bacterian PLASMIDA

PLASMIDA = molecula ADN circulara,

extracromozomiala, prezenta in mod natural in
celula bacteriana; se replica autonom; utilizată în
ingineria genetică.
Genetica MD CURS 2 - A nu se copia sau distribui fara copyright 38  
 ADN RECOMBINANT

Molecula de ADN RECOMBINANT este

introdusa in celule gazda:
- celule vii in culturi celulare
(E.coli, Drojdia de bere, celule de mamifer)
- in zigoți
- in celule stem embrionare
SCOP: transfer de caractere noi, peste
barierele naturale, celulelor sau
organismelor.

Genetica MD CURS 2 - A nu se copia sau distribui fara copyright 39  

 ADN RECOMBINANT

Molecula de ADN RECOMBINANT

incorporata in celula gazda este capabila
sa se replice si sa se exprime;
De regulă, ADN RECOMBINANT este
inserat intr-un VECTOR .
Vectorul este o molecula naturala de ADN utilizata pentru:
- transportul secventelor ADN exogen intr-o celula gazda;
- abilitatea de a se replica independent, formand clone
moleculare.

Genetica MD CURS 2 - A nu se copia sau distribui fara copyright 40  

 ADN RECOMBINANT
Aplicații practice in MEDICINA

PROTEINE
TERAPEUTICE
Produse de ANIMALE
TRANSGENICE

VACCINURI

MEDICAMENTE
Obtinute prin sinteza
bacteriana

ANIMALE KNOCK-OUT
utilizate pentru studiul
functiei unor gene umane
si modelarea unor boli
umane

Genetica MD CURS 2 - A nu se copia sau distribui fara copyright 41  

 ADN RECOMBINANT: Aplicații practice in MEDICINA

ADN uman donor

VECTOR (gena insulinei) ADN
(plasmid) recombinant

Plasmid Insulina obtinuta

incorporat de pe cale
celula gazda biosintetica
(E.coli)

Cromozom
bacterian
Bacteria produce insulina umana
Celula se divide si replica moleculele de ADN recombinant
formandu-se o clona

Extractia de insulina umana pura din bacteriile

modificate

Genetica MD 42  
 ANIMALE TRANSGENICE
(modificate genetic)

Sunt organisme
transformate genetic prin
introducerea in momentul
fertilizarii a unei noi
informatii genetice (gena);

Animalul transgenic
exprima fenotipic noua
informatie genetica si o
transmite descendentilor
sai.

SOARECELE
URECHE*
*Sunt respectate drepturile animalelor ??

Genetica MD CURS 2 - A nu se copia sau distribui fara copyright 43  

 ANIMALE TRANSGENICE

Obtinerea animalelor transgenice 1.  Secventa de

ADN exogen
(transgena)
2.  Zigot recent
fertilizat
3.  Microinjectia in
pronucleul
masculin al
unui zigot
recent fertilizat
4.  Animal
A transgenic cu
un mozaic de
D celule
N transformate/
netransformate
5.  Animal
transgenic
complet:
celulele
transformate
contribuie la
formarea liniei
germinale si
transgena este
transmisa in
generatia
urmatoare
44  
Genetica MD
CURS 2 - A nu se copia sau distribui fara copyright
 ADN RECOMBINANT - Aplicatii practice in MEDICINA

Antitrombina III

ADN
de la
capra
Gena
umana*
ADN
de la ZIGOT
capra
ADN recombinant Microinjectia in celula gazda Selectarea descendentilor Prezenta proteinei umane
(in nucleul ZIGOTULUI) modificati (antitrombina) in laptele de capra
implantata in uterul unei (animale transgenice)
femele gestante
Gena umana* a anti-trombinei III :
determina sinteza unei proteine care previne si regleaza coagularea excesiva a sangelui.
Necesara persoanelor cu deficienta ereditara de anti-trombina.

SURSA: GTC BIOTHERAPEUTICS

Genetica MD CURS 2 - A nu se copia sau distribui fara copyright 45  

 ANIMALE KNOCK OUT

ANIMAL KNOCKOUT – animal

model de laborator, obținut
prin introducerea in celulele
stem embrionare a unei
informații genetice (gena)
modificata (se inactiveaza
expresia acelei gene, gena
knockout sau KO).

Genetica MD CURS 2 - A nu se copia sau distribui fara copyright 46  

 REFERINȚE ELECTRONICE

Pentru ilusrarea experimentelor si a mecanismelor

moleculare prezentate s-au preluat imagini din
domeniul public (internet).
SURSE
http://images.google.com
www.google.com
http://www.juliantrubin.com/bigten/dnaexperiments.html
http://nucleus.cshl.org/CSHLlib/DNAinNY/Case5/Case_5.htm
http://www.allometric.com/tom/courses/bil255/bil255goods/09_dna.html
https://wikispaces.psu.edu/display/230/DNA+and+Chromosomes
https://deltawire.delta.ncsu.edu/around-campus/making-metabolism-easier-to-digest/
http://www.stolaf.edu/people/giannini/flashanimat/molgenetics/transcription.swf
http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2060/BIOL2060-19/CB19.html
Pentru clarificarea unor probleme legate de
tematica predata la curs se pot trimite intrebari
la adresa:
geneticaintrebari@gmail.com

47  
Genetica MD CURS 2 - A nu se copia sau distribui fara copyright
 NE REVEDEM PESTE 2 SĂPTĂMÂNI !
LUNI 20 octombrie intre orele 10-12
se ține cursul de MICROBIOLOGIE

LUNI  
27  octombrie  
1000  a.m.