Curs 6

Cromatografia de lichide de înaltă performanţă (HPLC)

Acestea sunt cele mai mult folosite dintre toate metodele de separare (fig. 1).

Fig.1 Faze in cromatografia lichida de inalta performanta HPLC

Fig. 2. Schema Bloc a HPLC

Pompe pentru HPLC
Pompa este considerată una dintre cele mai importante componente ale HPLC
deoarece permite realizarea unui debit constant al eluentului (solvent) prin întreg
sistemul: injector, coloană, detector mărind deosebit de mult viteza separării. Într-un
cromatograf de lichide pot exista una sau mai multe pompe, fiecare furnizând o

1
presiune care poate atinge 20mii kPa (cca. 200atm). Presiunea deosebită este necesară
deoarece coloana are o umplutură de fineţe mare şi, în lipsa presiunii, debitul ar fi
nepractic de mic.
Există două tipuri principale de pompe, clasificate astfel în funcţie de debit:
pompe cu presiune constantă (şi debit variabil) şi pompe cu debit constant.
Pompele cu presiune constantă sunt mai simple şi nu prezintă pulsaţii în
funcţionare (care nu ar permite obţinerea unei linii de bază netede). Acestea, prezintă
dezavantajul că debitul trebuie frecvent modificat pentru a se menţine cât mai constant,
ceea ce la separări de durată pune probleme, deoarece prin obturarea coloanelor debitul
se modifică continuu. Se înţelege că orice modificare de debit (datorită viscozităţii sau
temperaturii eluentului şi a structurii umpluturii) afectează timpul de retenţie şi totodată
semnalul detectorilor, în majoritate sensibili la concentraţie.
Pompele cu debit constant nu mai prezintă dezavantajele de mai sus. De-a lungul
timpului s-au selecţionat două variante: pompele cu piston (alternative) şi pompele de
tip seringă (cu deplasare pozitivă). La primele, cele mai utilizate, mişcarea du-te-vino a
pistoanelor şi a supapelor cu bilă permit o funcţionare indefinită dar presupun existenţa
unor atenuatoare de pulsaţii - dispozitive care să elimine micile variaţii de debit.
Acestea constau dintr-o alternanţă de mai multe rezistenţe, de exemplu tuburi subţiri şi
capacităţi - care pot fi incinte cu pereţi elastici, fie chiar manometre.
Pompele cu presiune constantă, asemănătoare cu o seringă dar având o capacitate mai
mare, pompează continuu pe toată durata separării, pistonul deplasându-se cu o viteză
liniară constantă dar după fiecare cursă este necesară oprirea debitului şi reumplerea cu
solvent a corpului pompei.
Deşi solvenţii utilizaţi se degazează pentru a se reduce efectele corozive ale
oxigenului, datorită presiunilor ridicate la care se lucrează, coroziunea este totuşi
deosebită.
De aceea aceste pompe (corpul, cilindrii, garniturile şi supapele) se execută din
materiale rezistente la coroziune: safir, agat, teflon sau aliaje speciale.
Coloanele în LC
Locul în care se petrece separarea propriu-zisă şi - în funcţie de calitatea acesteia – se
măreşte sau micşorează raportul semnal/zgomot, este coloana cromatografică.
Corpul coloanei şi mecanisme de separare
2
 Materialul din care se confecţionează corpul coloanei în LC trebuie să asigure
acesteia rezistenţa mecanică adecvată presiunilor înalte (20mii kPa) precum şi
rezistenţa la coroziune faţă de faza mobilă. În majoritatea cazurilor a fost preferat oţelul
inoxidabil 316 lucios. Acesta rezistă la majoritatea solvenţilor, excepţie făcând doar
sărurile halogenilor, în special în soluţie puternic acidă. Alte alternative o constituie
coloanele compozite: sticlă sau plastic în interior - oţel inoxidabil sau material plastic în
exterior.

Fig. 4. Aspectul coloanelor din LC: coloană analitică (stânga), semipreparativă

(dreapta)
Din punctul de vedere al geometriei (fig. 4), aceste coloane sunt cilindrice, iar
dimensiunile depind, în primul rând, de dimensiunea granulelor şi porozitatea
umpluturii. Astfel diametrul coloanelor variază între 0.3-5cm iar lungimea poate fi între
3-25cm. Pentru scopuri preparative, în cazul unor componente necunoscute, se
utilizează chiar diametre mai mari.
Cu cât umplutura este mai fină, cu atât coloana este mai scurtă. Pentru a se reţine
eventualele impurităţi sau componenţi care nu pot părăsi coloana (fiind reţinuţi practic
ireversibil) se folosesc adesea precoloane care, fiind de dimensiuni mai mici (acelaşi
diametru şi lungimi de 0.4-1cm), pot fi înlocuite mai des, evitându-se astfel scoaterea
prematură din funcţie a coloanei principale. Pentru a nu fi antrenată faza staţionară în
afara coloanei, aceasta este blocată la capete de două discuri metalice, poroase, având
diametrul porilor între 0.5- 10μm. Pentru a nu se lărgi prea mult prin coloană zona
cromatografică (cu diluarea ce are loc simultan), tot volumul mort ale acesteia (goluri
în coloană, tubul de aducţiune de la injector, tubul de evacuare spre detector) trebuie
redus la minim.
Faza staţionară
Silicagelul (SiO2) este considerat materialul cel mai important utilizat ca fază
staţionară. Acesta a devenit, în ultimii 20 de ani, doar suportul adevăratelor faze –
fazele chimic legate - ceea ce nu schimbă importanţa sa. Silicagelul s-a obţinut la
început în formă granulară, neregulată, apoi în formă sferică (fig. 5).

3
Fig. 5. Aspectul granulelor de silicagel folosite Fig.6. Aspectul schematic al
unei granule sferice
frecvent la umplerea coloanelor din HPLC cu fază staţionară chimic
legată pe suprafaţa suportului

Indiferent de formă, granulaţia trebuie să fie uniformă (se elimină partea fină)
pentru că astfel caracteristicile curgerii eluentului sunt mult îmbunătăţite.
Faza mobilă
Faza mobilă sau eluentul în LC nu reprezintă un mediu inert ca gazul purtător din
GC.
De aceea alegerea fazei mobile se face aici în perfectă concordanţă cu faza
staţionară. Astfel faza mobilă diferă destul de mult în funcţie de tipul interacţiunilor
componentelor separate cu faza staţionară din coloană. Singurele caracteristici
generale sunt următoarele: (1) faza mobilă trebuie să aibă o viscozitate coborâtă, (2)
aceasta trebuie să dizolve bine componentele, (3) nu trebuie să afecteze funcţionarea
coloanei şi (4) trebuie să permită funcţionarea detectorului.
Unii eluenţi (solventi) provoacă migrarea unui anumit component mai repede
prin coloană. Se spune că aceştia au o tărie relativă mai mare sau, altfel spus, au o
putere de eluţie mai ridicată. Această denumire provine de la faptul că factorul de
capacitate, k, este mai mare şi de aceea componentul migrează mai repede. Dar totul
depinde de trio-ul component – fază mobilă - fază staţionară. Astfel, pe o fază
staţionară polară, folosind o fază mobilă nepolară, se vorbeşte de cromatografie de
repartiţie normală (sau cu faze directe). Din contră, pe o fază staţionară nepolară
utilizându-se o fază mobilă polară se vorbeşte de cromatografie de repartiţie cu faze
inverse (sau inversate). În acest ultim caz au devenit uzuale fazele mobile formate din

4
amestecuri metanol - apă care în cromatografia de repartiţie sunt considerate printre
fazele mobile mai puţin tari.
Tabelul 3. Câteva faze mobile (monocomponente) utilizate în cromatografia de
repartiţie în ordinea tăriei lor relative în LC de repartiţie cu faze normale

Pe o fază staţionară polară, amestecul metanol-apă face parte dintre cei mai tari eluenţi
cunoscuţi. În tabelul 3 se prezintă câţiva dintre cei mai întâlniţi solvenţi şi ordinea în
care creşte tăria lor relativă, în cele două tipuri de cromatografie de repartiţie.
Detectori
Detectorii constituie acea parte a instrumentaţiei care permite să se observe
modul cum decurge separarea prin coloană fără a se vedea componenţii propriu zişi ci
doar semnalul lor.
Întrucât coloanele de separare performante au capacităţi de încărcare mici, sistemul de
detecţie trebuie să fie unul foarte sensibil.
Metode de prelucrare a informaţiei cromatografice
Metoda standardului intern furnizează cea mai mare precizie pentru
cromatografia cantitativă deoarece ea elimină incertitudinile introduse de simpla
injecţie. În această metodă, o cantitate exact măsurată de substanţă este adăugată
fiecărui standard sau probe. Standardul intern trebuie să fie ales astfel încât el să se
separe foarte bine de celelalte picuri componente ale probei. De asemenea, picul
standard trebuie să fie aproape de picul analitic. Cantitatea de substanţă din picul de
standard intern serveşte apoi ca parametru analitic.
Metoda normalizării ariilor este o altă aproximare utilizată pentru eliminarea
incertitudinilor asociate cu simpla injecţie. În această metodă, aria tuturor picurilor
complet eluate este calculată. Concentraţia analitică este găsită ca raport al ariei de pic
la aria totală a tuturor picurilor.
Lărgimea benzii în cromatografie

5
O cromatogramă:
• ilustrează răspunsul detectorului la un compus de analizat din probă la ieşirea acestuia
din coloană ca funcţie de timp sau de volum de fază mobilă adăugată;
• este utilă atât pentru determinările cantitative cât şi calitative;
• furnizează o serie de picuri, unde aria de sub picuri furnizează informaţia cantitativă
despre cantitatea de component iar poziţia picului serveşte pentru identificarea
compusului din probă;
Câteva forme de bandă pe cromatogramă este posibil să depindă de concentraţia
compusului de analizat în fazele mobilă şi staţionară şi de comportamentul fiecărui
compus în parte (fig. 10).

a) b) c)
Fig. 10. Forme de picuri - (a) Gaussian; (b) deplasat dreapta; (c) deplasat stânga
Un peak Gaussian este ideal (a). Mai mult, oricum peak-urile pot avea o creştere
progresivă urmată de o scădere abruptă datorată supraîncărcării coloanei (b) sau o
formă cu coadă care rezultă din faptul că unele lăcaşe ale coloanei reţin solutul mai
mult decât altele (c). Lărgimea benzii poate fi explicată din punct de vedere cantitativ.
O particulă individuală suportă multe transformări în timpul migrării, în consecinţă,
timpul de staţionare în coloană este extrem de diferit precum şi migrarea particulelor
de-a lungul coloanei este neregulată. Odată cu creşterea timpului, lăţimea benzii creşte
în timp ce se parcurge coloana, timpul de staţionare în coloană va fi mai mare, iar
viteza de curgere a fazei mobile scade .
Există patru parametri care caracterizează în viteza de migrare: timpul de
retenţie, coeficientul de partiţie, factorul de capacitate şi factorul de separare. Aceşti
parametri descriu echilibrul de distribuţie care există şi, transferul soluţiei în cele două
faze (fig.7).
a) Timpul tR la care apare maximul unui pic, măsurat din momentul introducerii
probei se numeşte timp de reţinere sau retenţie şi este o caracteristică calitativă a
componentului respectiv. Înălţimea picului h sau aria lui, A, sunt caracteristici
6
cantitative, proporţionale cu cantitatea componentului din probă. Se notează cu t M
timpul în care eluentul şi componentele care nu interacţionează cu faza staţionară
parcurg distanţa până la detector.
Viteza componentului din faza staţionară (v) şi a eluentului (u) se exprima prin
următoarele ecuaţii:
v = L/tR (1)
u = L/tM (2)
unde L este lungimea coloanei.
b) Coeficientul de partiţie K reprezintă raportul dintre concentraţia molară (c S) a
substanţei în faza staţionară şi concentraţia în faza mobilă (c M):
K = cS/cM. (3)
Fracţiunea din timpul de reţinere în care o moleculă se găseşte în faza mobilă se
notează cu R şi reprezintă probabilitatea ca molecula să se găsească în faza mobilă,
respectiv fracţiunea din totalul moleculelor care se află în faza mobilă. 1 – R reprezintă
restul moleculelor care se găsesc în faza staţionară. La echilibru putem scrie:
R c V
 M M
1  R cSVS
VM 1 1
R   (4)
VM  KVS VS 1 k
1 K
VM
R = v/u = tM/tR (5)
u (6)
v
V
1 K S
VM

unde :
VM - reprezintă volumul fazei mobile
VS - reprezintă volumul fazei staţionare
k = KVS/VM - reprezintă raportul dintre cantitatea totală de substanţă aflată în
fază staţionară şi cantitatea totală de substanţă aflată în faza mobilă şi se numeşte
factor de capacitate.

7
 Fig. 7. Elementele unei cromatograme [2]
W - valoarea segmentului pe abscisă rezultat din intersecţia celor două tangente
prin punctele de inflexiune ale picului.

Pentru o specie oarecare A aflată în amestec, factorul de capacitate k A va fi:

K A VS t R  t M k K t t
kA   ,   B  B  R ( B) M (7)
VM tM k A K A t R (A)  t M

Factorul de capacitate k este o funcţie de parametri de solubilitate, în cazul

cromatografiei de separaţie lichid-lichid. Practic, în vederea obţinerii unei rezoluţii
maxime pe unitatea de timp, trebuie ca valoarea lui k să fie cuprinsă între 2 şi 5.
Factorul de separare α pentru o anumită coloană de separare este un parametru utilizat
pentru descrierea diferenţelor ce apar între vitezele de migrare a componenţilor. Se
defineşte ca fiind raportul dintre factorii de capacitate k A şi kB, ai componentului B (care
trece mai greu prin coloană) şi A (componentul care se eluează mai repede) aflaţi în
amestec. Una dintre cele mai importante caracteristici ale unui sistem cromatografic
este eficienţa sau numărul de talere teoretice. Cu cât o coloană va avea mai multe talere
pe unitatea de lungime cu atât eficacitatea ei de separare va fi mai bună. Numărul de
talere N poate fi definit din cromatograma unui singur pic astfel:
2 2
t   t 
2
t 
N =  R   16 R   5,54 R  (8)
 t  W  W1 / 2 

unde:
tR - timpul de retenţie;  2t - dispersia aceleiaşi benzi în unităţi de timp; W -
valoarea segmentului pe abscisă rezultat din intersecţia celor două tangente prin
punctele de inflexiune ale picului.
8
 N este un număr adimensional. Aceeaşi valoare a lui N poate fi obţinută din
volumul de retenţie VR şi dispersia  2V exprimată în unităţi de volum. Numărul de talere
N este o măsură a eficienţei întregului suport al coloanei. O altă măsură a eficienţei
coloanei, folosită curent în cromatografie este dată de înălţimea unui taler H (înălţimea
echivalentă a unui taler teoretic):
 2t R ( A )
2
V  L L 2
2
LW 2 2t
N =  R     , H   ,H= , R = R ( B) (9)
 V   WA  WB
2
N L 16t R

unde:
L este lungimea coloanei cu umplutură.
Pentru caracterizarea separabilităţii a doi componenţi s-a introdus noţiunea de
rezoluţie, notată RS. În expresia rezoluţiei s-a căutat să se lege mărimile care
caracterizează proprietăţile termodinamice ale fazelor şi componenţilor precum şi
mărimile care caracterizează dinamica proceselor din coloană. Rezoluţia este o noţiune
mai cuprinzătoare, conţinând şi mărimile care caracterizează eficacitatea coloanei
precum şi selectivitatea ei.
Rezoluţia
Pentru caracterizarea separabilităţii a doi componenţi s-a introdus noţiunea de
rezoluţie, notată RS. În expresia rezoluţiei s-a căutat să se lege mărimile care
caracterizează proprietăţile termodinamice ale fazelor şi componenţilor precum şi
mărimile care caracterizează dinamica proceselor din coloană. Rezoluţia este o noţiune
mai cuprinzătoare, conţinând şi mărimile care caracterizează eficacitatea precum şi
selectivitatea coloanei.
2t R ( B )  2t R ( A) 2t R
RS   (10)
W A  WB W A  WB

Dacă cele două picuri sunt apropiate având suprafeţele egale şi simetrice, atunci
şi W1 = W2 = W. Ecuaţia (10) se poate scrie astfel:
t R
RS  (11)
W
Dacă diferenţa dintre coeficienţii de repartiţie a componenţilor creşte, atunci
selectivitatea coloanei s-a îmbunătăţit. Aceasta se realizează prin alegerea
corespunzătoare a fazelor staţionară şi mobilă. Un alt mod de mărire a rezoluţiei este
9
acela de a acţiona în sensul reducerii lărgimii zonei, adică de a realiza coloane mai
eficace, cu un număr de talere mai mare pe unitatea de lungime. Rezoluţia este
influenţată atât de proprietăţile termodinamice ale sistemului, prin intermediul
coeficienţilor de capacitate, respectiv de repartiţie, precum şi de eficacitatea de separare
a coloanei, prin intermediul termenilor N şi H. Cu ajutorul ecuaţiei (9), (11) rezultă:
L
RS  N  (12)
H

10