Sunteți pe pagina 1din 159

CAPITOL I

NORME INTERNE DE SĂNĂTATE ŞI SECURITATE ÎN MUNCĂ ÎN


LABORATORUL DE CHIMIE ŞI BIOCHIMIE CLINICĂ

Laboratoarele de la disciplina Chimie şi Biochimie, precum şi


Biochimie şi Biologie moleculară sunt destinate activităţilor didactice,
ştiinţifice şi / sau aplicative (clinice, medicale, farmaceutice, etc.). În astfel
de laboratoare se execută o mare diversitate de lucrări care necesită
substanţe, sticlărie şi ustensile, dar şi aparatură şi instalaţii adaptate
scopurilor propuse.
Condiţiile variate în care se execută unele activităţi, dar şi utilizarea
unor substanţe agresive din punct de vedere chimic (inflamabile, explozibile
sau toxice) impun luarea de măsuri în vederea evitării diferitelor accidente.
Accidentele, de orice natură, pot fi evitate dacă se respectă cu stricteţe
condiţiile de lucru prescrise în metodele de lucru. În acest scop există norme
generale, cu caracter legislativ referitoare la securitatea şi sănătatea în
muncă, care trebuie să fie bine cunoscute de către persoanele care desfăşoară
activităţi în laboratoarele de profil.
Activitatea studenţilor în laborator începe printr-un instructaj cu
privire la normele metodologice privind sănătatea şi securitatea în muncă.
Acest instructaj este în concordanţă cu Hotărârea Guvernului nr. 1.425 din
11.10.2006 pentru aprobarea Normelor metodologice de aplicare a
prevederilor Legii securităţii şi sănătăţii în muncă nr. 319/2006, publicată în
Monitorul Oficial al României, Partea I, nr. 882 din 30.10.2006. Instructajul
este urmat de verificarea cunoştinţelor în acest domeniu şi întocmirea unei
fişe colective de instructaj, unde studenţii vor semna că au luat la cunoştinţă
noţiunile legislative prezentate şi se angajează să respecte toate aceste reguli
generale şi specifice laboratorului prezentate în prima şedinţă de laborator.

6
1.1. SĂNĂTATEA ŞI SECURITATEA ÎN MUNCĂ

Normele de sănătate şi securitate în muncă se referă la siguranţa


persoanelor care îşi desfăşoară activitatea în sectoare care pot afecta negativ
starea de sănătate. Aceste norme includ măsuri privind păstrarea şi
manipularea substanţelor, operaţiuni cu sticlărie, ustensile şi aparatură de
laborator, manipularea şi conservarea produselor biologice, dar şi a probelor
destinate analizelor.

1.2. PĂSTRAREA ŞI MANIPULAREA SUBSTANŢELOR CHIMICE


ÎN LABORATORUL DE CHIMIE ŞI BIOCHIMIE

Păstrarea şi manipularea substanţelor chimice are în vedere natura şi


specificul acestor substanţe chimice şi se bazează pe normele metodologice
specifice pentru laboratoarele de biochimie clinică şi analize fizico-chimice.
 substanţele chimice corozive (e.g.: baze alcaline: NaOH, KOH; acizi
concentraţi: HNO3, H2SO4, HCl, CCl3COOH,
HBr, etc şi alte substanţe: NH3, AgNO3, N2O2, Br2,
etc.), precum şi substanţe volatile şi inflamabile
(e.g.: peroxizi, nitroderivaţi, eteri, etc.) nu se
păstrează în incinta laboratorului. Pentru aceste
substanţe se asigură spaţii de depozitare special amenajate prevăzute
geam de aerisire. Alăturat se prezintă simbolul standard al Uniunii
Europene utilizat pentru substanţele corozive
 Buteliile cu gaze lichefiate (oxigen, acetilenă, etc.) se vor păstra, de

asemenea, în încăperi speciale, departe de surse de căldură şi cu


posibilităţi de ventilaţie. De asemenea, se procedează la ancorarea
acestora pe perete cu ajutorul unor coliere
metalice.
 Substanţele chimice cu acţiune toxică puternică
(e.g.: Hg, Pb, H2S, P, CO, CH, -OH, etc.) se
7
păstrează în dulapuri speciale sub cheie, dar şi substanţele corozive
şi toxice se manipulează cu circumspecţie, purtând halat şi
echipament de protecţie (halat, ochelari, mănuşi, etc.). De asemenea,
şi pentru aceste substanţe chimice Uniunea Europeană a propus un
simbol prin care să avertizeze persoanele care vin
în contact cu aceste substanţe cu privire la gradul
de toxicitate şi periculozitate.
 substanţele explozive (e.g.: peroxizi, nitroderivaţi,
cloraţi, percloraţi, etc.) vor fi manipulate cu
precauţie evitându-se loviturile şi apropierea de surse de căldură.
Simbolul pentru avertizarea persoanelor cu privire la substanţele
explozive propus de Uniunea Europeană este prezentat alăturat.
 Substanţele care degajă gaze sau vapori în contact cu aerul (e.g.:
solvenţii organici, etc.) nu vor fi deversate la canal. Se va proceda la
colectarea acestora în recipiente adecvate şi vor fi ferite de
apropierea surselor de foc deschis (bec de gaz, scântei electrice,
chibrituri, ţigări).
 Substanţele fotosensibile sunt manipulate în aparate şi vase acoperite
cu folie de aluminiu sau hârtie neagră sau în încăperi întunecoase.
Păstrarea se face în sticle brune.
 Transvazarea lichidelor din recipiente de volume mari se face cu
ajutorul sifoanelor din sticlă, amorsate cu ajutorul unei pare de
cauciuc.
 Soluţiile de substanţe care reacţionează violent cu apa se
transvazează doar în vase uscate şi termorezistente. În cazul acidului
sulfuric (H2SO4) concentrat se procedează la diluarea acestuia
turnând acid peste faza apoasă şi răcind continuu vasul la exterior cu
apă rece de la robinet. Nu se va turna apă în acid sulfuric deoarece
există pericolul de stropire datorită reacţiei extrem de exoterme şi
violente.

8
 În cazul substanţelor necunoscute se va proceda la identificarea
acestora, sau la distrugere. Se va evita cu desăvârşire controlul
organoleptic (gustativ, olfactiv).

1.3. OPERAŢIUNI CU STICLĂRIE DE LABORATOR, REAGENŢI


ŞI USTENSILE DE LABORATOR

În laboratorul de la disciplina Chimie şi Biochimie reagenţii


(reactivii), sticlăria şi ustensilele de laborator se manipulează şi se
întrebuinţează în funcţie de destinaţie:
 sticlăria de laborator trebuie spălată şi uscată înainte de
întrebuinţare. Dacă prin spălarea obişnuită cu apă şi detergent
sticlăria nu poate fi spălată, atunci se procedează la menţinerea
acesteia în amestec sulfo-cromic. Uscarea sticlăriei se poate face pe
suporturi cu destinaţie specială în acest sens, în etuve sau prin
folosirea unui suflător aeroterm. Îndepărtarea substanţelor organice
(ex. grăsimi) de pe pereţii vaselor de sticlă se poate face şi cu
ajutorul solvenţilor organici (e.g.: eter, benzen, alcool etc.), reziduul
fiind colectat în recipiente speciale pentru recuperare.
 sticlele care conţin substanţe chimice lichide sau solide trebuie să

fie etichetate corespunzător. Nu se lasă substanţe chimice sau


reagenţi în vase neetichetate. Etichetele pot fi acoperite cu un strat
fin de parafină pentru a proteja informaţiile de pe etichetă. Este
obligatoriu ca pe fiecare etichetă să se menţioneaze formula chimică
a substanţei, denumirea acesteia, date referitoare la puritate (pentru
solide) sau concentraţie (pentru lichide), factorul soluţiei – dacă este
cazul. Pe unele substanţe este necesară menţionarea datei la care a
fost preparat reactivul sau soluţia respectiv. Sticlele etichetate se

9
aşează pe reagenţar (raftul destinat reactivilor în laborator) aproape
de mesa de laborator la care se va lucra.
 reagenţii necesari lucrărilor experimentale se păstrează în sticle
speciale cu dop rodat (şlefuit), iar în cazul soluţiilor alcaline cu dop
de cauciuc. Reagenţii sensibili la lumină se păstrează în sticle de
laborator brune şi la întuneric. În timpul activităţii din laborator dacă
se folosesc mai mulţi reactivi trebuie să avem în vedere închiderea
sticlelor imediat după utilizare cu dopul propriu (a nu se schimba
dopurile sticlelor de substanţă sau reactivi). În timpul lucrărilor
dopul sticlelor de reactivi se va aşeza pe masa de laborator cu partea
care vine în contact indirect cu substanţa, pentru a proteja
suprafeţele de lucru.
 transvazarea reagenţilor din sticle se face pe
partea opusă etichetei, astfel încât eticheta să nu
se degradeze prin prelingerea conţinutului din
sticlă. În cazul deversării accidentale a unui
reagent acesta trebuie imediat îndepărtat şi locul
respectiv curăţat (dacă este necesar neutralizat)
pentru a nu rămâne urme de substanţe chimice.
După întrebuinţare sticlele cu substanţe se aşează pe reagenţar la
locul în care au fost găsite la începerea activităţii.
 substanţele solide din sticlele originale se scot doar cu spatule sau
instrumente curate. Reagenţii aflaţi în soluţie se transvazează cu
ajutorul pipetelor curate sau prin turnare. Se are în vedere ca odată
ce aceştia au fost transvazaţi în alte recipiente sau sticle de reactivi
să nu mai fie reintroduşi în sticla originală. Astfel se evită
contaminarea şi denaturarea compoziţiei substanţei sau reactivului
original.
 pipetele curate se aşează pe stative speciale verticale cu vârful în jos,
iar cel folosite vor fi colectate în locuri şi recipiente speciale.

10
1.4. NORME PRIVIND MANIPULAREA ŞI UTILIZAREA
APARATURII DIN LABORATORUL DE CHIMIE ŞI BIOCHIMIE

 Instrumentele de laborator şi aparatura din laborator se amplasează


astfel încât să poată fi folosită cu uşurinţă. La începutul şi finalul
determinărilor se va verifica sistemul de aclanşare-declanşare al
acestora şi se vor deconecta de la sistemul de electricitate dacă nu se
vor folosi pentru o bună perioadă de timp.
 Aparatele electrice din laborator (centrifuge, etuve, termostate, băi
de apă, reşouri, etc.) ca şi aparatele destinate lucrărilor analitice
(spectrofotometre, pH-metre, etc.) se vor conecta la prize cu
pământare. Fixarea şi scoaterea din priză se va face doar cu mâna
uscată. La scoaterea aparatului din priză se va ţine de corpul prizei
(respectiv de partea protejată a prizei), iar cu cealaltă mână se apucă
ştecherul, bineînţeles cu mâna uscată.
 În cazul executării unor lucrări speciale cu folosirea aparaturii pentru
raze X sau izotopi radioactivi se iau măsuri speciale de protecţie.
Scopul acestora este prevenirea iradierii persoanelor care
manipulează aparatul şi a celor care vin în contact cu mediul
ambiant respectiv.
 Motoarele electrice, vor fi prevăzute cu pământare. Similar se va
proceda pentru anihilarea electricităţii statice care apare la acţionarea
maşinilor cu curele de transmisie.
 În cazul utilizării centrifugelor se va face în prealabil echilibrarea
eprubetelor (sau recipientelor) care se introduc în lucru. Pornirea şi
oprirea centrifugei se va face treptat spre a evita trepidaţiile şi
pierderea conţinutului din eprubetele supuse operaţiei de
centrifugare.
 Se va evita manipularea aparatelor a căror mod de funcţionare şi
întreţinere nu sunt pe deplin cunoscute înainte de a fi folosite.

11
 Nu se va trage de cabluri, nu se vor folosi prize şi ştechere defecte
pentru a nu produce scurt circuite, incendii sau chiar electrocutări.

1.5. MANIPULAREA ŞI CONSERVAREA PROBELOR BIOLOGICE


ŞI A PROBELOR ANALITICE

 Manipularea produselor biologice are în vedere provenienţa acestora şi


predilect faptul că nu este exclusă prelevarea probelor de la animale care
pot reprezenta “cazuri patologice” (necunoscute analistului). Orice
analiză care presupune manipularea probelor biologice de va face
purtând mănuşi de protecţie de unică folosinţă.
 Măsurarea volumului probelor biologice se va face cu pipete automate
sau cu pipete la care, obligatoriu, se ataşează pară special destinată
aspirării de lichide. Această măsură este luată pentru a evita aspirarea
probelor biologice direct în cavitatea bucală. Astfel, se evită infectarea,
infestarea sau contaminarea cu diverşi viruşi, bacterii sau agenţi
patogeni.
 Se lucrează cu atenţie pentru a nu se deversa sau răsturna conţinutul
probelor biologice pe masa de lucru, pe mâini sau pe haine.
 Sticlăria şi ustensilele de laborator utilizate în operaţiunile cu produse
biologice la finea lucrărilor se vor elibera de resturile materiale cu apă
caldă, detergenţi şi peria de sârmă. Sticlăria se spală cu amestec sulfo-
cromic, apă de robinet şi în final cu apă distilată. De asemenea, dacă se
lucrează cu materiale biologice provenite de la cazuri de animale
necunoscute ustensilele şi sticlăria se vor steriliza.
 Conservarea produselor biologie degradabile, până la momentul analizei
biochimice se face prin menţinere la temperaturi scăzute (frigider,
congelator), conform indicaţiilor specifice fiecărei probe.

12
 În cursul manipulării sau a operaţiunilor cu produse biologice nu se
consumă alimente băuturi şi nu se fumează (măsuri valabile şi în cursul
lucrărilor cu substanţe toxice).
 După operaţiunile cu produse biologice se vor curăţi mesele de lucru, se
vor dezinfecta cu soluţii special destinate în acest scop şi se vor spăla
bine mâinile.

1.6. SECURITATEA ÎN MUNCĂ –


PREVENIREA ŞI STINGEREA INCENDIILOR

Cunoaşterea normelor privitoare la prevenirea şi stingerea


incendiilor (P.S.I.) în laboratoarele de interes didactic a fost reglementată
printr-un ordin al ministerului de resort (Ord. 712/1975).
Respectarea acestora constituie o obligaţie a tuturor persoanelor care
desfăşoară activitatea în aceste laboratoare.
Incendiile pot fi declanşate prin manipularea greşită a reţelei de
gaze, butelii cu gaze combustibile, tuburi sau recipienţi cu substanţe
inflamabile (e.g. eter, benzina, s.a.), la reţeaua electrică sau prin utilizarea de
aparate defecte. În vederea evitării incendiilor se impune cunoaşterea
prevederilor referitoare la prevenirea şi stingerea incendiilor.

1.7. MĂSURI PENTRU PREVENIREA ŞI LOCALIZAREA


INCENDIILOR

 În laboratoare se afişează planuri îndrumătoare cuprinzând măsurile


prevăzute pentru prevenirea incendiilor şi pentru gestionarea unor astfel
de situaţii. Se montează inscripţii şi indicatoare şi se menţionează echipa
de intervenţie (din personalul laboratorului) şi atribuţiile membrilor
acesteia.
 Laboratorul va fi asigurat cu extinctoare avizate şi verificate.

13
 Se va evita blocarea spaţiilor de acces şi de lucru, a uşilor şi ferestrelor
cu mobilier, aparatură, ghivece de flori, panouri, afişe, ş.a.
 Este interzis fumatul şi accesul cu materiale inflamabile în laborator.
 Lucrările cu produse inflamabile se vor executa sub nişe cu ventilaţie
bună, spre a se evita formarea unor amestecuri explozive şi degajarea
vaporilor de substanţe toxice în laborator.
 Buteliile sau tuburile cu gaze comprimate nu vor fi aşezate lângă surse
de căldură sau lângă calorifer.
 Becurile de gaze nu se ţin aprinse decât pe durata utilizării pentru
lucrarea de laborator. Starea robinetelor de gaz se verifică periodic prin
pensulare cu soluţie de săpun.
 Se va evita montarea instalaţiilor de laborator improvizate sau din
materiale care pot reacţiona cu substanţe utilizate, generând astfel
produse explozive.
 În cazul deversării accidentale a unor lichide combustibile sau volatile în
incinta laboratorului se va proceda la: stingerea becurilor de gaz şi
întreruperea surselor electrice; închiderea uşilor şi deschiderea
ferestrelor; ştergerea cu cârpe a suprafeţelor pe care se află lichidul
vărsat; reluarea activităţii după eliminarea completă a gazelor.
 După începerea activităţii de laborator se va proceda la: deconectarea
instalaţiilor electrice de la tensiune (exceptând frigiderele şi termostatele
destinate păstrării diferitelor materiale de laborator); se verifică
închiderea robinetelor de la reţeaua de distribuţie a gazelor; se curăţă
locul de muncă de resturile de materiale inflamabile; se sting becurile de
iluminat.
 În cazul declanşării unui incendiu se va proceda la localizarea şi stingerea
acestuia de către echipa desemnată în acest scop din personalul laboratorului
ajutat de persoanele prezente în laborator. Echipa desemnată pentru
intervenţii, formată din personalul laboratorului, va acţiona în conformitate
cu sarcinile pe care le are, în vederea alarmării, localizării şi stingerii
focului.
14
 Pentru stingerea focului produs de substanţe inflamabile se va acţiona cu
extinctoare şi se va acoperi suprafaţa incendiată cu nisip. Se va evita
utilizarea apei deoarece prin disociere termină a acesteia se formează
oxigen şi hidrogen (gaze combustibile).
 Acţiunile se vor desfăşura dinamic, urmărindu-se circumscrierea locului
incendiului şi stingerea acestuia. În cazul în care se constată că incendiul
se propagă şi riscul de extindere sau de explozie este mare, se va lua
legătura imediată cu serviciile de intervenţie ale unităţilor de pompieri
prin apelarea telefonică a serviciului de urgenţe 112.

1.8. ACCIDENTE POSIBILE –


MĂSURI DE PROTECŢIE ŞI SIGURANŢĂ

Posibilitatea producerii accidentelor apare datorită necunoaşterii


şi/sau nerespectării condiţiilor de lucru în laborator. Accidente pot fi grupate
în următoarele categorii: intoxicaţii, arsuri, traumatisme, electrocutări.
Intoxicaţiile sunt produse prin pătrunderea anumitor substanţe toxice
în organism, urmată fiind de dereglări metabolice şi în final de declanşarea
unor procese patologice. Pătrunderea substanţelor în organism se realizează
pe diverse căi: calea respiratorie (prin inspirarea aerului cu gaze, vapori,
pulberi); digestivă (odată cu apa şi alimentele); calea tegumentară şi / sau
mucosală (difuzând prin piele şi mucoase spre sânge). Odată intrate în
organism, substanţele toxice pot produce intoxicaţii acute sau cronice.
Intoxicaţiile acute se datorează pătrunderii substanţelor în organism într-o
perioadă relativ scurtă şi într-o cantitate care depăşeşte limitele admise.
Intoxicaţiile cronice se datorează pătrunderii într-o perioadă mai lungă de
timp, dar în cantităţi relativ reduse, care însă determină procese cumulative.
Arsurile sunt leziuni produse de agenţi fizici (temperatura: e.g. –
substanţe fierbinţi, aprinderea unor substanţe volatile şi radiaţii: e.g. – infraroşu),
sau agenţi chimici (substanţe caustice: e.g. acizi, baze, brom, etc). După
gravitate se disting arsuri de diferite grade: I – cu congestia tegumentului,
15
urmată de edem şi pigmentare trecătoare; II – cu apariţia de flictene (băşici) cu
lichid serocitrin sau sangvinolent ( în cazul leziunilor mai profunde); III – cu
distrugeri extinse de ţesuturi (epidem, derm, mergând mai în profunzime spre
facii musculare şi muşchi) necesitând tratamente în servicii medicale de
specialitate.
Traumatismele pot fi produse prin loviri, tăieri sau înţepături ca urmare
a manipulării greşite a sticlăriei, ustensilelor, instalaţiilor şi aparaturii din
laborator.
Electrocutarea poate fi determinată de contactul organismului cu
curentul electric din reţeaua obişnuită (120-220 V) sau de înaltă tensiune.
Cauzele electrocutării pot datorate montării defectuoasă a aparatelor
electrice, nelegarea reţelei la pământ, prize defecte, etc.
Măsurile de protecţie vizează protecţia personală pin manipularea
corectă a substanţelor chimice, sticlăriei, ustensilelor, aparaturii şi
instalaţiilor. În acest sens se menţionează necesitatea respectării
următoarelor reguli:
 Încălzirea soluţiilor în eprubete se face cu agitare continuă, evitându-se
“aruncarea” lichidului din eprubetă în cursul fierberii. Extremitatea
deschisă a eprubetei nu se ţine spre persoana care face operaţia, nici spre
vecini.
 În cazul operaţiunilor efectuate cu substanţe inflamabile nu este permisă
în apropierea surselor de căldură (creşterea presiunii din vasul de
păstrare poate fi cauza pericolului de explozie).
 Pentru operaţiuni de evaporare, distilare ş.a., se folosesc ca surse de
căldură băi de apă încălzite electric sau radiatoare cu raze infraroşii.
 În caz de incendiu în laborator se are în vedere faptul că lichidele
inflamabile şi nemiscibile cu apa (e.g. eterul, benzenul), nu pot fi stinse
cu apă. În aceste cazuri se folosesc extinctoare speciale.
 Manipularea acizilor şi bazelor tari se face cu atenţie mărită.
Operaţiunile efectuate cu acizi fumans şi substanţe gazoase toxice se

16
execută sub nişe. În cursul acestor timpi operatori ventilatorul nişei este
pus în funcţiune.
 În cazul prelevării şi dozării lichidelor caustice sau otrăvitoare, pipetarea
se face prin folosirea unei pompe aspiratoare, sau a unei pare de cauciuc
la pipetă. În laboratoarele de analize de chimie şi biochimie clinică se
utilizează pipete automate.
 Din considerente de igienă şi securitate personală este interzisă utilizarea

sticlăriei de laborator pentru băut şi păstrat alimente. În incinta


laboratorului este interzis consumul de alimente, băuturi şi fumatul în
incinta spaţiului destinat laboratorului.
 Este interzisă gustarea reactivilor, deoarece majoritatea substanţelor
chimice conţinute sunt toxice sau caustice. Mirosirea substanţelor
chimice nu se face prin apropierea nasului, se procedează la producerea
unui curent de aer care conţine vapori ai substanţelor cu ajutorul palmei
de la gâtul sticlei în apropierea nasului.
 După încheierea şedinţelor de laborator (lucrări practice sau de cercetare
ştiinţifică studenţească) se procedează la spălarea mâinilor, ca o măsură
de igienă personală.
Prin înţelegerea metodelor de analiză, prin însuşirea tuturor
cunoştinţelor privind activitatea de laborator şi prin respectarea normelor de
protecţie şi securitate în muncă, activitatea din laborator va determina
studenţii să rămână cu cunoştinţe reale dobândite în activitatea practică.

1.9. NORME DE COMPORTARE ÎN LABORATORUL DE


CHIMIE ŞI BIOCHIMIE

Fiecare student are obligaţia de a-şi însuşi cunoştinţele teoretice


înaintea fiecărei lucrări de laborator, respectiv problemele teoretice referitoare
la aspectele aplicative ale Chimiei şi Biochimiei, principiul metodei, reactivii
folosiţi şi modul de lucru, precum şi noţiunile referitoare la utilizarea
aparaturii de laborator. În timpul orelor de lucrări practice de la laborator
17
studenţii au obligaţia de a purta echipament de protecţie, respectiv halat alb, cu
mâneci lungi strânse cu manşetă. De asemenea, studenţii vor folosi laveta
pentru a şterge masa de lucru, special destinată pentru acest scop.
Masa de lucru se păstrează în ordine, iar reactivii se aşează pe
reagenţar în ordinea în care au fost aşezaţi la intrarea în laborator. Pe masa
de lucru din laborator nu se aşează poşete, genţi, mâncare, băuturi, haine, ci
doar materialele necesare desfăşurării lucrării practice programate.
În timpul desfăşurării lucrării programate nu se vor efectua deplasări
decât în scopul desfăşurării activităţii de laborator.
Lucrarea practică se va finaliza cu scrierea rezultatelor
experimentale, efectuarea calculelor dacă acestea sunt prezentate în lucrare,
precum şi concluziile rezultate în urma efectuării analizei (testului,
aplicaţiei) respective.
După terminarea lucrării de laborator reactivii şi aparatura se lasă în
curăţenie deplină şi în locul în care se aflau la intrarea în laborator. De
asemenea, sticlăria de laborator se va spăla şi aşeza la uscat pe dispozitivele
speciale din laborator, iar chiuveta se va spăla de eventualele precipitate,
reactivi, sticle sparte.
Activitatea de laborator implică şi curăţenia la locul desfăşurării
activităţii, astfel încât dacă pardoseala laboratorului a fost murdărită ca
urmare a activităţii desfăşurate în laborator, studenţii – respectiv persoanele
care au lucrat în laborator – se obligă să adune, măture şi chiar să spele
pardoseala – dacă se impune acest fapt.
Părăsirea laboratorului se va face doar după acordul cadrului
didactic şi locul ocupat se va lăsa în ordine (inclusiv ordine pe masa de lucru
şi scaunul de la masa de laborator).
La părăsirea laboratorului studentul trebuie să lase laboratorul în care
a efectuat lucrările aşa cum ar dori să găsească el însuşi laboratorul la venire!

18
19
CAPITOLUL II

PRINCIPII GENERALE DE PRELEVARE, TRANSPORT ŞI


DEPOZITARE A PROBELOR BIOLOGICE

Prelevarea, manipularea, transportul şi depozitarea probelor


biologice trebuie să păstreze calitatea acestora. Aceasta implică protecţia
persoanei care efectuează prelevarea, contenţionarea pacientului astfel încât
să se prevină reacţiile agresive ale acestuia, iar instrumentarul utilizat
trebuie să fie pregătit conform normelor de prevenire a contaminării. De
asemenea, toate procedurile de manipulare a probelor biologice până la
analiza efectivă trebuie să asigure păstrarea caracteristicilor probelor la
recoltare.

2.1. PRELEVAREA PROBELOR DE SÂNGE

Locul de elecţie, precum şi cantitatea de sânge prelevată de la animale


depinde de scopul pe care-l urmărim în analiza pe care dorim să o executăm.
Cantităţile mici de sânge se recoltează din ureche sau din bot prin
puncţie, iar cantităţile mai mari de sânge se obţin prin puncţie în vene sau
artere. Din vene se poate lua direct din ac în vasul de recoltare sau cu
ajutorul unei seringi sterile de unică folosinţă. Astfel, recoltarea de probe de
sânge la oaie, capră, câine – se face din vena safenă sau jugulară, la cal şi
bovine – se face din vena jugulară, iar la porc se face din vena marginală a
urechii sau din vena codală.
Acul şi seringa vor fi sterile, iar recipientele de prelevare a probelor
vor fi adecvate scopului biochimic (analizelor biochimice care se doresc).
Atât seringa cât şi acul şi recipientul de colectare a probei trebuie să fie
sterile şi dacă se poate de unică folosinţă, pentru că eventuale urmele de apă
sau alcool de pe pereţii acestora pot produce hemoliza sau pot da naştere la
erori provenite din variaţia concentraţiei sângelui.
20
Pentru sângele recoltat de la peşti, seringile şi eprubetele utilizate
trebuie să fie din material plastic, deoarece sângele peştelui în contact cu
sticla coagulează foarte repede.
Se recomandă ca prelevările de sânge să se efectueze dimineaţa;
eprubetele în care se recoltează trebuie să fie adecvate scopului, perfect
curate, uscate şi sterilizate. Eprubetele şi recipientele de recoltare şi colectare
a probelor biologice vor fi adecvate testelor biochimice care se doresc a fi
executate. În prezent pentru recoltarea probelor biochimice de sânge se
folosesc eprubete specifice pentru analiza biochimică, analiza hematologică,
pentru teste de coagulare, pentru determinarea vitezei de sedimentare a
hematiilor, etc. După recoltare eprubetele se vor eticheta corespunzător
pentru a se putea identifica individul de la care s-a recoltat sângele, data la
care s-a efectuat recoltarea şi analizele cerute de către laborator.
Analiza sângelui nu poate fi executată dacă recoltarea s-a făcut în
mod defectuos sau în recipiente (eprubete) necorespunzătoare.
Dozarea biochimică a diferiţilor constituenţi ai sângelui se efectuează
din sânge total, din plasmă sau din ser. În cazul când analiza se face din
sânge total sau din plasmă, pentru a evita coagularea sângelui, recoltarea se
face în eprubete care conţin substanţe anticoagulante.
În prezent, se utilizează fiole de sticlă sau de plastic cu dop ermetic de
cauciuc în care există vid (vacutainer), în care, cu ajutorul unui ac cu două
bizouri se pot preleva cantităţi precise de sânge (între 2-20 ml). Fiolele pot
conţine substanţe care să permită efectuarea analizelor morfologice şi
biochimice.
In funcţie de anticoagulantul utilizat, standardizarea internaţională
prevede următoarele culori ale dopurilor:
 verde – conţine heparinat de sodiu sau litiu şi se utilizează
pentru efectuarea determinărilor din plasmă,
 mov – conţine sarea de potasiu a EDTA şi se utilizează pentru
determinările pe sânge integral

21
 gri – conţine fluorură sau oxalat; fluorura acţionează pentru
inactivarea enzimelor asupra substratelor astfel că acestea din
urmă nu vor fi consumate în urma stocării probelor
 albastru deschis – conţine citrat şi se utilizează pentru
determinări ce necesită o coagulare ulterioară.
 albastru închis – conţine heparinat de sodiu dar poate conţine
şi EDTA ca aditiv – se utilizează pentru analiza
microelementelor din sânge
 roz – similar cu vacutainerele mov, conţin EDTA şi sunt
utilizate pentru stocarea sângelui
 roşu (sticlă) – nu conţin aditivi şi se utilizează în special
pentru determinarea parametrilor biochimici serici, teste
serologice, dar şi determinarea anticorpilor şi a prezenţei unor
medicamente
 galben – conţin ACD (acid- citrat- dextroză) şi se utilizează
pentru studii de fenotip, teste de paternitate, etc. ( "BD
Vacutainer® Venous Blood Collection - Tube Guide", 2007-
05-30)
Eprubetele pentru recoltare se vor alege în funcţie de parametrii care
vor fi determinaţi.
Coagularea sângelui este un proces fizico-chimic complex, care se
datorează unui număr relativ mare de factori: în momentul unei hemoragii
se produce activarea unei enzime numită protrombina sau trombogen
(inactivă în sângele circulant), care produce coagularea.
Protrombina inactivă se transformă în trombină activă sub influenţa
ionilor de calciu. Trombina acţionează asupra fibrinogenului şi îl transformă
în fibrină insolubilă. În interiorul vaselor sangvine, sângele nu coagulează
deoarece nu se produce trombina, activarea protrombinei fiind inhibată de
antitrombina. În momentul unei răniri, din ţesuturile lezate şi din plachetele
sanguine, se eliberează trombochinaza care se combină cu antitrombina.
Schematic procesul are loc în felul următor:
22
Protrombina + Trombochinaza + Calciu = Trombina
Trombina +Fibrinogen =Fibrina
În procesul coagulării sângele formează un cheag care apoi se retractă
punând în libertate un lichid gălbui care este serul. Acest fenomen poartă
numele de sinereză. Cheagul este format dintr-o reţea de fibrile care conţin
eritrocite, leucocite şi trombocite. Fibrilele sunt formate din fibrina rezultată
prin trecerea fibrinogenului din plasmă, din stare solubilă (hidrosol) în stare
insolubilă (hidrogel).
Plasma conţine fibrinogen şi poate coagula cu formarea de cheag de
fibrină. Prin centrifugare sângele tratat cu anticoagulant, depune elementele
figurate, iar soluţia obţinută este plasma.
Anticoagulanţii sunt substanţe care împiedică coagularea sângelui,
prin intervenţia acestora, într-o fază sau alta a procesului de coagulare.
Astfel, pentru inactivarea trombochinazei se poate întrebuinţa hirudina,
heparina sau germanina.
Pentru precipitarea ionilor de calciu se utilizează oxalatul de potasiu,
fluorura de sodiu sau citratul de sodiu.
Pentru împiedicarea coagulării fibrinogenului se folosesc bile de sticlă
care se agită în recipientul de recoltare.
Anticoagulantul folosit diferă după tipul analizei care se execută.
EDTA-ul (sarea disodică a acidului etilen diaminotetraacetic)
complexează ionii de calciu. În acest sens în eprubeta de recoltare şi
colectare a sângelui se utilizează 1mg EDTA/ 1cm3 sânge recoltat. Se
utilizează în special pentru determinarea hemogramei.
Fluorura de sodiu se foloseşte mai ales la recoltarea sângelui pentru
determinarea glicemiei şi a ureei utilizându-se în proporţie de 10 mg pentru
1cm3 sânge. Fluorura de sodiu precipită calciul şi inhibă formarea de
leucocite, blochează atât coagularea cât şi glicoliza.

23
Oxalatul de potasiu se foloseşte la recoltarea sângelui pentru
măsurarea pH-ului, rezervei alcaline şi dozarea clorului plasmatic şi
globular, în proporţie de 20mg la 10cm3 de sânge.
Oxalatul de potasiu se purifică prin recristalizare. Sarea recristalizată
se pulverizează bine şi se prepară o soluţie 20% care se neutralizează la
pH=7,4+0,2 cu soluţie de hidroxid de potasiu sau acid oxalic în prezenţa
roşului de fenol 0,02 % ca indicator.
Din această soluţie neutralizată se introduc 0,1cm3 (20mg) în eprubete
de recoltare şi se evaporă la etuvă la 105-1100C. Oxalatul de potasiu rămas
în eprubetă este suficient pentru a recolta 10cm3 sânge.
Citratul de sodiu: Acţionează în mod similar cu oxalatul de potasiu.
Se utilizează 5mg citrat pentru 1cm3 sânge recoltat, în special pentru
determinarea vitezei de sedimentare a hematiilor (VSH).
Heparina şi hirudina sunt anticoagulanţi ideali pentru că nu
modifică starea fiziologică a sângelui. Se folosesc în cantitate de 75 unităţi /
1cm3 de sânge (0.5cm3 heparină/1cm3 sânge), mai ales la recoltarea sângelui
pentru dozarea constituenţilor anorganici, pentru a nu introduce elemente
minerale care pot modifica repartizarea elementelor anorganice între
elementele figurate şi plasmă. Soluţia de heparină se evaporă la 100° C
direct în eprubetele de recoltare.
Serul sanguin este sângele lipsit de fibrinogen şi de elemente figurate.
Separarea serului. Pentru a obţine 5cm3 ser sunt necesari 10cm3
sânge. În timpul iernii retracţia cheagului este încetinită. Pentru a obţine
serul, sângele se păstrează imediat după recoltare la temperatura de 35-
370C până la formarea cheagului. Partea superioară a cheagului aderă la
pereţii vasului de recoltare, de care se detaşează cu o baghetă de sticlă şi apoi
se introduce în termostat la 370C unde are loc retractarea cheagului şi
separarea unui lichid galben pal care este serul.
După retracţia cheagului se decantează lichidul într-o eprubetă de
centrifugă, ce se echilibrează la balanţă şi apoi se centrifughează timp de 5
minute cu 1500 turaţii/ minut. Centrifuga trebuie pornită încetul cu încetul
24
pentru a evita hemoliza hematiilor (care însoţesc inevitabil serul) atunci când
viteza de centrifugare este prea mare, cât şi pentru a evita uzura centrifugii.
Serul obţinut trebuie să fie galben pal, suspensia de hematii
nehemolizate prin centrifugare se depune. În anumite condiţii aspectul
serului este diferit şi anume:
 Opalescent - în cazul când conţine particule de grăsime provenite
în mod normal într-un regim prea bogat în grăsimi. Opalescenţa apare în
cazuri patologice şi nefroza lipoidică. În acest caz serul se poate clarifica
prin agitare cu un amestec de alcool şi eter.
 Culoarea galben-brună se poate datora în mod normal unei
alimentaţii vegetariene, fiind însoţită şi de o pigmentare a tegumentelor, iar
în stare patologică această culoare indică faptul că serul conţine exces de
bilirubină. La aer, serul primeşte o culoare verzuie datorită faptului că
bilirubina se transformă în biliverdină.
 Culoarea roz până la roşu intens se datorează hemolizei. Hemoliza
serului se produce de obicei dintr-o greşeală de tehnică de recoltare a
sângelui (folosirea umedă a acului seringii şi vaselor de recoltare).
Presiunea osmotică a plasmei prin diluare devine mai mică decât a
eritrocitelor, acestea absorb apa, devin turgescente şi eliberează
hemoglobina, fenomen cunoscut sub denumirea de hemoliză.
Separarea plasmei. Se introduce într-o eprubetă cantitatea indicată
mai sus din anticoagulantul ales, potrivit cu scopul analizei ce se
efectuează, se recoltează sângele peste anticoagulant şi se agită timp de 30
secunde. Prin centrifugarea sângelui necoagulabil timp de 5-10 minute la
1500 turaţii/minut se depun elementele figurate pe fundul eprubetei şi se
obţine plasma.
Plasma este un lichid vâscos de culoare galbenă cu reacţie alcalină
având un conţinut de 78-80% proteine. Plasma astfel separată se păstrează
la temperatura de 7-100C timp de 10-12 zile.

25
Pentru împiedicarea coagulării fibrinogenului se folosesc bile de
sticlă, care se agită împreună cu sângele în recipientul de recoltare obţinând
astfel sângele defibrinat.

26
2.2. PRELEVAREA PROBELOR DE URINĂ

Recoltarea urinei se face în vase de sticlă sau plastic perfect curate şi


etanşe. În cazul când este necesar un examen bacteriologic, sticlăria şi
ustensilele trebuie să fie sterilizate.
Analiza completă a urinei se efectuează pe urina emisă în 24 ore.
Colectarea urinei se va face dimineaţa în recipiente sterile, de unică folosinţă
specil destinate acestui scop. Urina colectată se păstrează la rece fără
îngheţare. În cazul când este necesar să fie păstrată mai mult timp urina se
conservă prin adăugare de substanţe conservante.
Astfel, se adaugă formaldehidă (conservant care se utilizează în cazul
determinării sedimentului urinar) în cantitatea de 10cm3 la 100cm3 urină sau
se pot adăuga toluen, xilen sau cloroform, numai la suprafaţa urinei. Înainte
de a efectua analiza urinei, toluenul, xilenul sau cloroformul, sunt îndepărtaţi
cu ajutorul unei pâlnii de separare. Nu se utilizează cloroformul în
conservarea urinei în cazul determinărilor de glucide şi acetonă.
În cazul dozării de hormoni steroizi, la proba de urină se adaugă
soluţie de HCl 10n (50cm3 HCl la cantitatea de urină emisă în 24 ore).
Examenul complet al urinei cuprinde determinări fizice, chimice şi
bacteriologice. În mod curent se efectuează un examen sumar al urinei.
Examenul sumar al urinei constă în analiza caracteristicilor fizico-
chimice generale, identificarea componentelor patologice şi analizarea
sedimentului urinar.

2.3. PRELEVAREA PROBELOR DE LAPTE

2.3.1. Prelevarea laptelui crud

Pentru prelevarea laptelui crud se recoltează probe din cisterne, bazine si


tancuri, minimum 500 ml din fiecare, după o prealabilă omogenizare.

27
Prelevarea din bidoane presupune formarea unei probe medii recoltată
randomizat din 10% din bidoanele care constituie lotul.
Din proba medie bine omogenizată se recoltează 500 ml pentru
examen de laborator.

2.3.2. Prelevarea laptelui de consum

Se recoltează din ambalaje câte 2-3 unităţi din fiecare lot. Probele
recoltate trebuie să ajungă la laborator în maximum 4 ore de la recoltare,
transportul lor făcându-se în condiţii de refrigerare.
După recoltare, fiecare probă se va individualiza prin etichetare, se
ambalează separat în asa fel încât să nu se deterioreze în timpul
transportului. Probele trebuie transportate la laborator în timp util, în asa fel
încât acestea să îşi păstreze nemodificaţi parametrii de integritate.

2.4. PRELEVAREA PROBELOR DE SPERMĂ

În funcţie de specie, recoltarea spermei se realizează prin diverse


tehnici: electroejacularea (la berbec, taur, câine, păsări), masajul abdominal
(la păsări), masajul ampulelor canalelor deferente şi al glandelor seminale (la
taur) şi masturbaţia (la vier şi câine).
Recoltarea se efectuează într-un vas colector de sticlă steril, gradat
şi cu pereţi dublii, având posibilitatea de a menţine constantă temperatura la
37ºC cu ajutorul apei calde. Imediat după recoltare vasul de colectare se
aşează pe o suprafaţă termostată, fiind asigurată temperatura optimă pe tot
parcursul manipulării materialului seminal.
Separarea plasmei seminale se face prin centrifugare, utilizând
viteze de centrifugare care să nu lezeze membranele spermatozoizilor, ceea
ce ar conduce la eliberarea compuşilor din mediul intracelular. Transportul la
laborator şi stocarea până la analizare se face sub formă refrigerată sau
congelată în pelete introduse în recipiente cu azot lichid.
28
2.4.1. Conservarea spermei

Necesitatea conservării spermei un timp mai îndelungat, în afara


organismului – după prelevarea probelor, a apărut odată cu aplicarea în
practică a însămânţărilor artificiale la animale, practică realizată cu succes la
majoritatea speciilor.
Metodele de conservare a spermei se bazează pe următoarele principii:
1) Scăderea treptată a temperaturii spermei până în apropiere de 0oC
(între 0o şi 4o) şi crearea unui mediu anaerob pentru spermatozoizi.
Temperatura scăzută reduce metabolismul spermatozoizilor şi evită
epuizarea lor; împiedică de asemenea dezvoltarea florei bacteriene, care duce
la descompunerea lichidului spermatic şi scurtează durata de conservare.
Conservarea la această temperatură menţine spermatozoizii într-un fel de
moarte aparentă – anabioză – care este reversibilă în caz de schimbare a
acestor condiţii spermatozoizii îşi recapătă viabilitatea.
2) Micşorarea densităţii spermei prin folosirea unei substanţe diluate
care trebuie să îndeplinească următoarele condiţii:
- să nu fie toxică pentru spermatozoizi
- să neutralizeze secreţiile glandelor anexe abundente la unele specii
(armăsari, vieri, care conţin cantităţi mari de electroliţi: KCl, NaCl).
- să neutralizeze, de asemenea, produsele rezultate din metabolismul
spermatozoizilor (dioxid de carbon, acid lactic, etc.).
- să corecteze mediul natural al spermatozoizilor prin adăugarea unor
substanţe nutritive: glucoză, fructoză, etc.
- să mărească rezistenţa spermatozoizilor faţă de şocul termic, prin
conţinutul lor în substanţe lipoproteice.
3) pH-ul mediului diluant trebuie să fie favorabil menţinerii viabilităţii
spermatozoizilor. Mediul diluant pentru sperma de berbec şi taur trebuie să
aibă un pH de 6,2-6,8 iar pentru sperma de armăsar şi vier de 7-7,2, adică pe
cât se poate mai apropiat de pH-ul spermei respective. Aciditatea şi
alcalinitatea ridicată duc la moartea rapidă a spermatozoizilor.
29
4) Mediu diluant trebuie să fie izoterm cu sperma speciei respective.
5) Mediu diluant trebuie să fie uşor de preparat şi economic.
În concluzie, conservarea spermei se bazează pe 2 metode: diluarea şi
răcirea spermei. În vederea obţinerii unor conservări cât mai bune se
combină cele două metode. Atât diluarea cât şi răcirea spermei trebuie să fie
efectuate în prima jumătate de oră după recoltare.
Pentru conservarea spermei cei mai utilizaţi diluanţi sunt: diluantul cu
gălbenuş de ou şi citrat de sodiu şi laptele sterilizat şi ecremat. Diluantul cu
gălbenuş de ou - citrat prezintă avantajul că asigură o conservare bună a spermei.
Această calitate se datorează lecitinei din ou. Adăugându-se citrat de sodiu se
neutralizează aciditatea gălbenuşului de ou şi se separă vitelusul din gălbenuşul de
ou, permiţând efectuarea în bune condiţiuni a examinării spermatozoizilor.

Tabelul 1.1 Conservarea spermei prin folosirea unor diluanţi


Compoziţia diluantului Taur Berbec
Citrat de sodiu 1,5 g 2,8 g
Glucoză anhidră 3 g 0,8 g
Gălbenuş de ou 20 cm3 20 cm3
Apă distilată 100 cm3 100 cm3

Prepararea diluantului. Se dizolvă substanţele chimice (citrat, glucoză)


în cantitatea precisă de apă distilată - într-un pahar Berzelius, după tabel.
In alt pahar se introduce gălbenuşul de ou care se agită cu o baghetă
de sticlă peste care se toarnă în porţiuni mici soluţia preparată mai sus (sub
agitare continuă) care trebuie să aibă un pH ~6,8.
Diluantul trebuie să aibă temperatura camerei (18-250C). Soluţia
diluantă, preparată după această metodă se adaugă peste sperma ce urmează
a fi conservată în proporţie de 1:3, 1:5 sau 1: 20. Se păstrează la frigider. În
cazul când se foloseşte ca diluant laptele de vacă, acesta, dacă este proaspăt
muls, se filtrează printr-o hârtie de filtru sau tifon sterilizat, apoi se fierbe, se
răceşte şi se filtrează din nou. Diluţia cu lapte adus la temperatura camerei,
30
se va face în fiole, în proporţiile 1:1, 1: 3 , 1: 7 şi 1: 15. Conservarea se face
la frigider, efectuându-se o răcire treptată a probelor.

Observaţii:

31
32
CAPITOLUL III

NOŢIUNI DE ANALIZĂ CHIMICĂ ŞI BIOCHIMICĂ

3.1. DEFINIŢIA ŞI CLASIFICAREA METODELOR DE ANALIZĂ ŞI


SEPARARE CHIMICĂ ŞI BIOCHIMICĂ

Analiza chimică urmăreşte studiul compoziţiei chimice a substanţelor


(substanţe naturale, materii prime, intermediare sau finite în diferite procese
tehnologice etc.). Analiza biochimică se ocupă cu stabilirea compoziţiei
organismelor vii, animale, vegetale, microorganisme şi a produselor de
origine animală sau vegetală destinate consumului sau altor utilizări practice.
În medicina umană şi veterinară analiza biochimică ajută la
completarea tabloului clinic în vederea stabilirii diagnosticului şi
tratamentului, de aceea se utilizează şi termenul de analiză clinică.
Studiul compoziţiei chimice a substanţelor, formează obiectul unei
ramuri a chimiei numită chimia analitică.
După scopul urmărit, chimia analitică se împarte în:
1) Chimia analitică calitativă - care se ocupă cu identificarea
elementelor sau grupelor de elemente chimice ce alcătuiesc o substanţă.
2) Chimia analitică cantitativă - care determină raporturile cantitative
în care se găsesc aceste elemente într-o substanţă.
Metodele utilizate în scopul determinării exacte a cantităţii unui
element dintr-o substanţă sau a unei substanţe dintr-un amestec, sunt
metodele chimice (volumetrice sau gravimetrice) şi metodele fizico-chimice
(analiză instrumentală).
În analiza biochimică sunt folosite atât metodele de analiză
gravimetrică şi volumetrică cât şi metodele fizico-chimice de analiză.
Metodele fizico-chimice în special, au devenit metode de cercetare specifice
analizei biochimice ca de exemplu electroforeza pe hârtie şi în coloană de
lichid a preparatelor biochimice, metode radiochimice, electrochimice etc.
33
3.1.1.Analiza chimică volumetrică – generalităţi

Denumirea de volumetrie provine de la faptul că acest tip de analiză


se bazează pe măsurarea volumului de soluţie cu ajutorul biuretei. Întrucât
operaţia principală folosită în volumetrie este titrarea, această metodă mai
poartă denumirea şi de titrimetrie.
Analiza volumetrică se bazează pe măsurarea exactă a volumului
soluţiei de reactivi, de concentraţie exactă şi cunoscută, necesar pentru o
anumită determinare cantitativă.
Reacţiile chimice servesc ca bază în analiza volumetrică şi ele trebuie
să îndeplinească următoarele condiţii :
 să fie stoechiometrice - adică să fie exprimate printr-o ecuaţie chimică
exactă, respectând legea conservării masei;
 să fie practic totale, adică echilibrul să fie deplasat înspre formarea
produsului de reacţie;
 să fie rapide;
 sfârsitul reacţiei să fie marcat printr-o schimbare bruscă a uneia din
proprietăţile chimice ale sistemului.
Tipurile şi reacţiile utilizate în analiza volumetrică sunt:
1.Reacţii ionice de dublu schimb,care pot fi :
a) reacţii de neutralizare,de schimb de protoni
b) reacţii de precipitare(care decurg cu formare de produşi de reacţie
insolubili în solventul utilizat).
2.Reacţii de oxido - reducere sau de schimb de electroni.
În funcţie de tipul de reacţii folosit, metodele se pot clasifica în:
 Metode de neutralizare - care se bazează pe reacţii de neutralizare.
a) Acidimetria - foloseşte soluţie de acid tare de concentraţie
cunoscută pentru dozarea bazelor tari , bazelor slabe şi a sărurilor cu
hidroliză alcalină.
b) Alcalimetria - foloseşte soluţii de bază tare, de concentraţie
cunoscută pentru dozarea acizilor tari, slabi şi a sărurilor cu hidroliză acidă.
34
 Metode de precipitare - bazate pe reacţii de precipitare.
 Metode de oxido - reducere - bazate pe reacţii de oxido - reducere:
Manganometria - foloseşte ca oxidant soluţia de permanganat de
potasiu (KMnO4).
Iodometria - foloseşte ca oxidant soluţia de iod (I2).
Important în analiza volumetrică este sesizarea momentului în care
reacţia s-a petrecut total, moment numit punct de echivalenţă. Atingerea
punctului de echivalenţă se observă adăugând în mediul de reacţie substanţe
numite indicatori, care printr-un mijloc oarecare (schimbare sau apariţie de
culoare etc.) semnalează prezenţa excesului de reactiv.

Indicatorii
Indicatorii sunt substanţe care adăugate în mediul de reacţie indică
sfârşitul acestei reacţii (vezi anexa 1).
După tipurile de reacţii care stau la baza metodelor titrimetrice,
indicatorii se clasifică în:
 indicatori de neutralizare
 indicatori de oxido-reducere
 indicatori de precipitare

 indicatori de complexometrie
În unele cazuri când apariţia unei culori se datoreşte excesului de
reactivi care este el însuşi o substanţă colorată (cum este în cazul titrărilor
cu permanganat de potasiu), adăugarea de indicatori nu mai este necesară.
Indicatorii universali sunt amestecuri de indicatori care virează fiecare
în domenii diferite de pH.
Alegerea indicatorilor în reacţiile de neutralizare se face în aşa fel
încât punctul de echivalenţă al reacţiei să fie inclus în domeniul de viraj al
indicatorului.

35
3.1.2. Aparatura şi ustensilele folosite în analiza chimică
volumetrică

În efectuarea analizelor chimice se folosesc în mod curent ustensile


ca: eprubete, fiole conice (Erlenmeyer), pahare cilindrice (Berzelius), pâlnii,
creuzete, capsule de porţelan, cleşti de eprubete şi de creuzete, trepiede,
triunghiuri de porţelan, sită metalică cu azbest, becuri Teclu sau Bunsen etc.
Analiza cantitativă, necesită pe lângă aceste ustensile şi o serie de
vase şi obiecte de sticlă utilizate la măsurarea precisă a volumelor de soluţii
sau de gaze, balanţe analitice şi tehnice de laborator, densimetre pentru
măsurarea densităţii lichidelor, centrifugi etc.
Ca unitate de măsură pentru volume se foloseşte ml (1 ml = 0,001 l)
sau cm3 (1ml = 1 cm3) iar ca unitate de masă, gramul (g) (1 mg = 10-3g, 1g
= 10-9g).
Principalele ustensile de sticlă folosite pentru măsurarea volumelor de
lichide sunt: cilindrii gradaţi, baloane cotate, pipete, biurete (vezi anexa 2).
Cilindrii gradaţi sunt vase gradate în ml, care se folosesc în
măsurători aproximative de volum. Capacitatea cilindrilor gradaţi variază de
la 5 la 2000 cm3.
Baloane cotate - sunt vase cu fundul plat şi cu gât alungit pe care
există o marcă circulară (cotă), care indică limita de umplere a acestora.
Baloanele cotate sunt prevăzute cu câte un dop şlefuit pentru
închiderea etanşă. Au capacităţi variabile, de la 10 la 5000 cm3, şi se
utilizează la prepararea soluţiilor titrate.
Pipetele - după modul de calibrare pot fi: pipete cu bulă şi pipete
gradate. Pipetele cu volum sub 1 cm3 se numesc micropipete.
Pipete cu bulă - au marcat un singur semn sau două semne. Pe bulă se
găseşte gravată capacitatea şi temperatura de calibrare. Cu aceste pipete se
poate măsura numai volumul pentru care au fost calibrate. Capacitatea lor
poate fi între 1 - 100 cm3.

36
Pipete gradate - au formă cilindrică iar volumul pentru care sunt
marcate este împărţit în ml şi zecimi de ml. Au capacităţi între 1 - 25 cm3.
Micropipete - au volumul împărţit în sutimi de cm3 şi au capacităţi de
0,01 - 0,02 cm3.
Pipete automate - funcţionează pe principiul unei pompe de aspiraţie
cu piston, ele fiind calibrate pentru un volum fix sau reglabil.
Pipetele se folosesc la măsurarea precisă a unor volume mici de
lichide. Pentru măsurarea corectă a unui volum de soluţie se procedează
astfel: se introduce vârful pipetei în soluţie şi se aspiră cu gura sau cu para de
cauciuc, până când nivelul lichidului trece puţin peste marcă, apoi se închide
pipeta cu degetul arătător. Se scoate pipeta din lichid, se şterge vârful pipetei
şi apoi ridicând uşor degetul se lasă să se scurgă din lichid până ce meniscul
acestuia este tangent la gradaţia stabilită, apoi se trece în vasul de reacţie
volumul stabilit.
Biuretele sunt tuburi de sticlă gradate, prevăzute la partea inferioară cu
dispozitive pentru oprirea sau reglarea scurgerii lichidului (robinet sau tub de
cauciuc cu clemă Mohr). Biuretele au volume între 10 - 100 cm3, cu gradaţii
de 0,02 cm3 până la 0,2 cm3.
În biochimie se folosesc adesea biurete cu capacitatea de 1 - 5 cm3 şi
gradaţii de 0,01cm3 numite microbiurete. Biuretele se fixează în poziţie
verticală, pe stative de metal, cu ajutorul unor cleme cu mufă sau stative
speciale. Citirea volumelor la biurete, ca de altfel la toate vasele de măsurat
volume, se face privind cu ochiul perpendicular pe biuretă, la înălţimea
coloanei de lichid, pentru evitarea erorii de paralaxă.
Biuretele cu robinet de sticlă se utilizează când se lucrează cu soluţii
de acizi sau oxidanţi, iar cele cu tub de cauciuc şi clemă când se folosesc
hidroxizi alcalini. După folosire biuretele se spală cu apă de la robinet şi
apoi cu apă distilată, iar pentru evitarea depunerii de praf se acoperă partea
superioară cu un pahar mic sau o fiolă de plastic.

37
38
39
3.2. SOLUŢII

3.2.1. Mărimi folosite pentru prepararea soluţiilor

Masa atomică este un număr relativ care arată de câte ori masa
atomului unui element este mai mare decât a 12-a parte din masa atomului
de carbon, luată ca unitate şi căreia i-a fost atribuită denumirea de 1 Dalton.
Atomul gram este cantitatea exprimată în grame dintr-un element
chimic, numeric egală cu masa atomică a elementului.
Masa moleculară a unui element chimic sau a unei combinaţii, este
un număr relativ care arată de câte ori masa moleculei acelui element sau
substanţă este mai mare decât a 12-a parte din masa atomului de carbon,
luată ca unitate. Masa moleculară se exprimă, de asemenea, în Daltoni.
Molecula gram (mol) este cantitatea de substanţă exprimată în grame
ce corespunde masei moleculare.
Echivalentul chimic (masă echivalentă) este un număr care arată
câte părţi masă dintr-un element sau compus chimic se combină, înlocuiesc
sau pun în libertate 1,008 părţi de hidrogen sau opt părţi de oxigen.
Echivalentul gram (val) este cantitatea de substanţă exprimată în
grame, care poate să înlocuiască sau să se combine cu 1,008 g hidrogen sau
cu 8 g de oxigen.
Echivalentul gram se calculează astfel:
Elemente: echivalent gram = atom gram/valenţă
Exemple:
Echivalentul gram al atomului de oxigen = 16/ 2 = 8 g O
Echivalentul gram al atomului de carbon = 12,01/4 = 3,0025 g C
Echivalentul gram se calculează diferit în funcţie de substanţa folosită.
În calculul echivalentului gram al substanţelor compuse trebuie să
se ţină seama şi de reacţia chimică la care participă:
Acizi - echivalentul gram = molecula gram a acidului (M) / numărul
de hidrogeni ionizabili.
40
Sau, altfel spus, echivalentul gram (Eg) pentru acizi se calculează ca
fiind raportul dintre masa moleculară a acidului şi numărul de protoni cedaţi
(respectiv numărul de H+ din formula moleculară a acidului).

Exemple:
Echivalentul gram al HCl = 36,465/1 = 36,465 g
Echivalentul gram al H2SO4 = 98,076/2 = 49,038 g
Echivalentul gram al CH3COOH ═ 60,03/1 ═ 60,03 g

M HCl
Eg HCl   36,5
1

M H 2 SO4 98
Eg H 2 SO4    49
2 2

M H 3 PO4 3  15  16  3 66
Eg H 3 PO4     22
3 3 3

Baze - echivalentul gram = molecula gram a bazei / numărul de


grupări hidroxil (-OH) din moleculă care iau parte la reacţia respectivă.
Exemple:
Echivalentul gram al NaOH = 40,005/1 = 40,005 g
Echivalentul gram al Ca(OH)2 = 74/2 = 37 g

Altfel spus, Echivalentul gram pentru baze (Eg) se calculează ca fiind


raportul dintre masa moleculară a bazei şi valenţa metalului (respectiv
numărul de OH- din formula moleculară a bazei).

M NaOH
Eg NaOH   40
1

41
M Ca (OH ) 2 54
Eg Ca (OH ) 2    27
2 2

M Al(OH )3 13  3 (16  1) 64
Eg Al(OH )3     21,33
3 3 3

Săruri -echivalentul gram = molecula gram / numărul de hidrogeni


înlocuiţi de metal în formula acidului corespunzător.
Exemple:
Echivalentul gram al MgCO3 = 84,3/2 = 42,15g
Echivalentul gram NaCl = 58,55/1 = 58,55 g

Altfel spus, Echivalentul gram pentru săruri (Eg) se calculează ca fiind


raportul dintre masa moleculară a sării şi produsul dintre valenţa metalului şi
numărul de atomi de metal.

M NaCl 23  35,5
Eg NaCl    58,5 Na11Cl11
11 1

M Na 2 SO4 23  2  32  16  4 142
Eg Na 2 SO4     71 Na 21 ( SO4 )12
1 2 1 2 2
M Al 2( SO4 )3 13  2  3 (32  16  4) 26  3  96
Eg Al 2( SO4 )3     52,33
3 2 6 6

Al23 (SO4 )32

În reacţiile de oxido-reducere, echivalentul chimic al sărurilor


obţinute se calculează făcând raportul dintre molecula gram a sării şi
numărul de electroni primiţi sau cedaţi de substanţa respectivă, în reacţia ei
de formare.

42
Exemplu:
2KMn+7O4 +10Fe+2SO4 +8H2SO4 → 2Mn+2SO4 + 5Fe2+3(SO4)3+K2SO4 + 8H2O

Deci schimbul de electroni este următorul :


Mn7+ + 5e -  Mn2+(reducere) / x 2
2Fe+2 + 2e-  2Fe+3 (oxidare) / x 5
Echivalentul gram al KMnO4 va fi raportul dintre masa moleculară
(158,03) şi numărul de electroni schimbaţi (5)
E KMnO4 = 158,03 /5 = 31,606 g

Altfel spus, Echivalentul gram pentru substanţe participante la procese


redox (de oxido-reducere) (Eg) se calculează ca fiind raportul dintre masa
moleculară a substanţei şi numărul de electroni transferaţi.

M Cu 2 SO4 29  2  32  16  4 154
Eg Cu 2 SO4     77 Cu21 (SO4 )12
1 2 2 2

M CuSO4 29  32  16  4 125
Eg CuSO4     62,5 Cu12 ( SO4 )12
2 1 2 2

Miliechivalentul chimic (mE) reprezintă a mia parte din echivalentul


chimic
mE = E/1000.
Miliechivalentul gram reprezintă miliechivalentul chimic exprimat
în grame.

43
Soluţia este un amestec lichid omogen, format dintr-o substanţă
dispersată molecular sau ionic, numită solvit şi un mediu de dispersie sau
solvent.
Prepararea soluţiilor
Pentru a prepara soluţiile titrate se utilizează baloanele cotate.
Dacă prin cântărirea unei substanţe etalon se prepară o soluţie într-un
balon cotat la 200C şi temperatura de lucru este mai mică decât 200C, soluţia
va fi mai diluată, deoarece la 200C volumul ar fi mai mare; dacă se lucrează
la o temperatură mai ridicată decât 200C, soluţia va fi mai concentrată,
deoarece prin scăderea temperaturii la 200C, volumul soluţiei se va micşora.
Astfel, dacă se lucrează la o temperatură diferită de 200C, trebuie să se facă o
corecţie de volum.
La prepararea unei soluţii se cântăreşte cantitatea de substanţă uscată
sau se introduce un volum de lichid determinat, atunci când substanţa din
care se prepară soluţia este în stare lichidă, se introduce într-un balon cotat şi
se dizolvă substanţa în solventul corespunzător; solventul se adaugă treptat,
agitând conţinutul balonului, până ce semnul circular de pe gâtul balonului
devine tangent la meniscul lichidului; în cazul în care determinarea se face
la o temperatură diferită de 200C este necesară efectuarea corecţiei de volum
în funcţie de temperatura la care se lucrează .
Se omogenizează soluţia prin răsturnarea de câteva ori a
balonului, închis în prealabil cu dopul şlefuit.

3.2.2. Exprimarea concentraţiei soluţiilor

Concentraţia este cantitatea de substanţă dizolvată într-un anumit


volum de soluţie. Concentraţia reprezintă raportul dintre substanţa dizolvată
şi solvent. În funcţie de unitatea aleasă, concentraţia soluţiilor se poate
exprima în mai multe moduri:

44
Concentraţia procentuală - care reprezintă grame de substanţă
dizolvată în 100 cm3 soluţie(%). Soluţiile cu o astfel de concentraţie sunt
soluţii procentuale.
Exemplu : o soluţie de acid oxalic 1 % conţine 1 g de acid oxalic
dizolvat în 100 cm3 soluţie.

Problemă 1 – concentraţia procentuală (C%)


Să se calculeze concentraţia procentuală a 200g soluţie de clorură de
sodiu (NaCl) în care ştim că la prepararea soluţiei a fost dizolvată o cantitate
de 10g NaCl pur.

Ştim că pentru a stabili cocentraţia procentuală (C%) a unei soluţii


trebuie să calculăm cantitatea, exprimată în grame (g) de substanţă pură
dizolvată în 100g soluţie.

Astfel,

200g soluţie NaCl C% ……………………………..10g NaCl pur


100g soluţie NaCl C% ……………………………... x

100  10
C%   5 g NaCl pur
200

Deci concentraţia procentuală a soluţiei NaCl este 5%.

Problemă 2 – concentraţia procentuală (C%)


Să se prepare o cantitate de 500g soluţie de hidroxid de sodiu
(NaOH) de concentraţie 10%. Cum se procedează la prepararea soluţiei?

45
Concentraţia de 10% ne spune că dacă în 100g soluţie NaOH avem
dizolvaţe 10g NaOH pur, în 500g soluţie NaOH 10% câte g de NaOH pur
avem, adică:

100g soluţie NaOH 10% …………………………… 10g NaOH pur


500g soluţie NaOH 10% ……………………………x

500  10
x  50 g NaOH pur
100

Pentru prepararea soluţiei se cântăresc într-un pahar Berzelius 50g


NaOH pur. Se transvazează cantitatea cântărită de NaOH într-un pahar de
laborator mai mare, peste care se adaugă 200-250g H2O distilată, se
omogenizează soluţia, după care se completează cu apă distilată până la
500g soluţie (respectând proporţia de 50g NaOH în 500g soluţie). Se
omogenizează şi soluţia este preparată!

Concentraţia molară - reprezintă moli de substanţă dizolvaţi în 1000


cm soluţie. Soluţiile a căror concentraţii se exprimă prin molarităţi se
3

numesc soluţii molare.


Aceste soluţii se notează cu M sau m. Se utilizează şi multiplii sau
submultiplii acestora şi în acest caz simbolul M (sau m) va însoţi cifra care
reprezintă multiplii sau submultiplii molilor, astfel: soluţii molare (M),
bimolare (2M), decimolare (0,1M), milimolare (0,001M) etc.
Exemple:
o soluţie 2M de acid oxalic va conţine 2 moli de acid oxalic la 1000cm3
soluţie, adică 2 x 126,068 = 252,135 g
o soluţie 0,1 M de HCl va conţine o,1 moli HCl, deci, masa moleculară este
de 36,5g, deci în 1000cm3 soluţie se vor găsi 3,65 g HCl.

46
Problemă 1 – concentraţia molară (CM)
Să se calculeze ce concentraţie molară (CM) are un volum de 500ml de
soluţie acid clorhidric (HCl) în care se găsesc 35g HCl pur.

1 cm3 = 1 ml
1 L = 1000 ml = 1000 cm3

500 ml HCl = 0,5 L HCl

0,5 L soluţie HCl CM …………………………… 35g HCl pur


1 L soluţie HCl CM ……………………………… x

1000 x 35
CM = ------------------ = 70g HCl pur
500

MHCl = 1 + 35,5 = 36,5

1 mol HCl …………………………………….36,5g HCl pur


x moli HCl …………………………………… 70g HCl pur

1  70
x  1,92 moli HCl pur în 1 L solutie
36,5

CM = nr de moli dizolvaţi în 1 L soluţie

CM a soluţiei HCl = 1,92

47
Problemă 2 – concentraţia molară (CM)
Să se calculeze cantitatea de substanţă necesară preparării a 250cm3
soluţie MgCl2 de concentraţie 0,2M. Explicaţi cum se prepară soluţia.

1 cm3 = 1 ml
1 l = 1000 ml = 1000 cm3

250 ml MgCl2 = 0,25 l MgCl2

1 L soluţie MgCl2 0,2M …………………… 0,2 moli MgCl2


0,25 L soluţie MgCl2 0,2M ………………… x moli MgCl2 pur

0,25  0,2
x  0,05 moli MgCl2
1

MMg = 12; MCl = 35,5


MMgCl2 = 12 + 35,5 x 2 = 83

1 mol MgCl2 …………………………………….83g MgCl2 pur


0,05 moli MgCl2 ……………………………….. x g MgCl2 pur

0,05  83
x  4,15 g MgCl2 pur
1

Pentru a prepara 250 ml soluţie MgCl2 de concentraţie 0,2M trebuie


să cântărim 4,15g MgCl2 pur, care se transvazează cantitativ într-un balon
cotat de 250 ml, peste care se adaugă cca 150ml apă distilată la temperatura
camerei, se omogenizează soluţia pentru dizolvarea substanţei solide, după
care se completează până la semn (250ml) cu apă distilată. Soluţia se
omogenizează astefel încât să nu mai existe substanţă solidă nedizolvată,

48
după care se păstrează în sticle închise pentru a nu permite contaminarea şi
evaporarea soluţiei.

Concentraţia normală - se exprimă prin numărul de echivalenţi gram


dintr-o substanţă dizolvată în 1000 cm3 soluţie. O soluţie normală conţine,
deci, un echivalent gram de substanţă la 1000 cm3.
Soluţiile a căror concentraţie se exprimă prin normalităţi se numesc
soluţii normale. Se notează cu N (sau n) care însoţesc cifra care indică
numărul de multipli echivalenţi din soluţie, adică tocmai ceea ce se cheamă
normalitatea soluţiei. Cunoscând echivalentul gram al unei substanţe, se pot
prepara soluţii de orice normalitate.
Exemple:
Pentru prepararea a 1000 cm3 soluţie 1 N NaOH se calculează în primul
rând echivalentul gram al NaOH.
ENaOH = 40,005/1 = 40,005g.
Cantitatea corespunzătoare echivalentului gram, se dizolvă într-un
volum de apă, astfel ca împreună să formeze un volum de 1000cm3 soluţie.
O soluţie de 0,3 N de NaOH va conţine în 1000cm3 soluţie 0,3 x 40,005g,
adică 0,3 echivalenţi gram de NaOH.
O soluţie 4 N de NaOH va conţine 4 x 40,005 g.

Sau, ca metodă mai rapidă, cu formule matematice, pentru a calcula


cantitatea de substanţă necesară preparării unor volume de 1000 cm3
soluţie, de diferite normalităţi, se înmulţeşte echivalentul gram (E) cu
normalitatea (N).
G=ExN

Volumul de soluţie necesar poate fi însă mai mare sau mai mic decât
1000 cm3.

49
Pentru a calcula cantitatea de substanţă necesară preparării unui
anumit volum de soluţie (v), de o anumită normalitate (N) se înmulţeşte
echivalentul gram, cu normalitatea şi cu volumul ( exprimat în litri):
G=ExNxv

Exemple:
pentru a prepara 300 cm3 de soluţie 0,5 N de H2SO4, se va calcula în
primul rând echivalentul gram al H2SO4 apoi se aplică regula de
mai sus:
N = 0.5
V = 0,300 l
G = 49,04 x 0,3 x 0,5 = 7,256 g

Problemă 1 – concentraţia normală (CN)

Să se calculeze cantitatea de substanţă necesară preparării a 500cm3


soluţie MgCl2 de concentraţie 0,2N. Explicaţi cum se prepară soluţia.

1 cm3 = 1 ml
1 l = 1000 ml = 1000 cm3

500 ml MgCl2 = 0,5 l MgCl2

1 L soluţie MgCl2 0,2N …………………… 0,2 EgMgCl2 pur


0,5 L soluţie MgCl2 0,2N ………………… x EgMgCl2 pur

0,5  0,2
x  0,1 Eg MgCl2
1

MMg = 12; MCl = 35,5


MMgCl2 = 12 + 35,5 x 2 = 83
50
M MgCl2 83
Eg MgCl2   41,5
2 2

1 EgMgCl2 …………………………………….41,5g MgCl2 pur


0,1 EgMgCl2 ………………………………….. x g MgCl2 pur

0,1  41,5
x  4,15 g MgCl2 pur
1

Pentru a prepara 500 ml soluţie MgCl2 de concentraţie 0,2N trebuie


să cântărim 4,15g MgCl2 pur, care se transvazează cantitativ într-un balon
cotat de 500 ml, peste care se adaugă cca 150ml apă distilată la temperatura
camerei, se omogenizează soluţia pentru dizolvarea substanţei solide, după
care se completează până la semn (500ml) cu apă distilată. Soluţia se
omogenizează astefel încât să nu mai existe substanţă solidă nedizolvată,
după care se păstrează în sticle închise pentru a nu permite contaminarea şi
evaporarea soluţiei.

Problemă – reacţie de precipitare:


Să se calculeze cantitatea de precipitat care se obţine prin
reacţia a 500 ml soluţie clorură de bariu (BaCl2) de concentraţie 0,1N
cu acid sulfuric (H2SO4).

BaCl2 + H2SO4 -------- BaSO4 ↓ + 2HCl


500ml 0,1N ? g BaSO4

1 L sol BaCl2 0,1N ………………………… 0,1 Eg BaCl2


0,5 L sol BaCl2 0,1 N ………………………. X

51
0,5  0,1
X   0,05 Eg BaCl2
1

MBa = 4; MCl = 35,5


MBaCl2 = 4 + 35,5 x 2 = 75

M BaCl2 4  35,5  2 75
Eg BaCl2     37,5
valenţa Ba  nr atomilor de Ba 2 1 2

1 Eg BaCl2 ………………………………….37,5 g BaCl2 pur


0,5 Eg BaCl2 ……………………………….. x

0,5  37,5
x  18,75 g BaCl2 pur
1

75 g BaCl2 pur ………………………….. 4 g Ba pur


18,75 g BaCl2 pur ……………………..... x

18,75  4
x  1 g Ba pur
75

? g BaSO4

MBaSO4 = 4 + 32 + 16 x 4 = 100

100 g BaSO4 ……………………………. 4 g Ba


X g BaSO4 ……………………………….1 g Ba

1  100
x  25 g BaSO4 pur
4
52
În reacţia a 500 ml soluţie BaCl2 0,1N cu H2SO4 se obţine o
cantitate de 25 g BaSO4 pur.

Observaţii:

53
54
3.2.3. Soluţii titrate. Factor şi normalitate

Titrul unei soluţii reprezintă cantitatea de substanţă exprimată în


grame dintr-un cm3 de soluţie. Se notează cu T. Soluţiile a căror titru se
cunoaşte se numesc soluţii titrate.
Exemple:
titrul unei soluţii exact 0,1 n de NaOH este 0,0040005 g/cm3
(echivalentul gram al NaOH este de 40,005).
titrul unei soluţii exact normale de H2SO4 este de 0,049 g /cm3
(echivalentul gram al H2SO4 este de 49 g).

Titrul teoretic al unei soluţii se poate calcula prin raportul

Tt = echivalentul gram x normalitate / 1000

Titrul unei soluţii se exprimă cu 4 cifre semnificative.


Substanţele de la care prin simplă cântărire şi dizolvare în balon
cotat la volum cunoscut, se pot obţine soluţii cu titrul cunoscut, se numesc
substanţe etalon titrimetrice sau titrosubstanţe.
Din aceste substanţe se pot prepara soluţii de normalitate exactă, iar
titrul unei astfel de soluţii este egal cu titrul teoretic (Tt).
Substanţele etalon trebuie să îndeplinească următoarele condiţii:
 să fie suficient de pure;
 să aibă formula bine stabilită şi stabilă în condiţiile de
lucru;
 să se poată obţine uşor în gradul de puritate necesar.
Exemple de titrosubstanţe:
 acidul oxalic - folosit în alcalimetrie şi manganometrie;

 carbonatul de sodiu anhidru - în acidimetrie;


 clorura de sodiu - în argentometrie;
 tiosulfatul de sodiu - în iodometrie;

55
 carbonatul de calciu şi sulfatul sau carbonatul de magneziu
- în complexometrie.
Întrucât puţine substanţe îndeplinesc aceste condiţii, în practică se
prepară soluţii de normalitate aproximativă, prin cântărirea unei cantităţi de
substanţă apropiată de aceea teoretic necesară. Titrul acestor soluţii se
numeşte titrul real şi se notează Tr .
În acest caz este necesară cunoaşterea factorului de normalitate
pentru trecerea de la un anumit volum, din soluţia de normalitate
aproximativă, la soluţia de normalitate exactă.
Pentru soluţia titrată de normalitate dată a unei substanţe între titrul
teoretic şi titrul real există următoarea relaţie:

Tr
F 
Tt

unde: Tr = titrul real al soluţiei; Tt = titrul teoretic;F = factor de normalitate.

Factorul de normalitate ne arată de câte ori soluţia de normalitate


aproximativă este mai concentrată sau mai diluată decât soluţia de
normalitate exactă.
Soluţiile de normalitate exactă au Tt = Tr, deci ele vor avea F = 1.
Soluţiile de normalitate aproximativă au factorul în jurul valorii 1;
dacă factorul este mai mic decât 1 soluţiile sunt mai diluate iar dacă factorul
de normalitate este mai mare ca 1, atunci soluţiile sunt mai concentrate.

Limitele de variaţie admise în practică sunt:

0,9 < F < 1,1

Factorul de normalitate permite transformarea volumului soluţiei


aproximativ normală (Vr ) în volum de soluţie exactă (Ve).

56
V e= Vr xF

Soluţiile normale se utilizează în volumetrie deoarece prezintă


proprietatea numită legea echivalenţei soluţiilor de aceeaşi normalitate
care se enunţă astfel : volume egale de soluţii de substanţe diferite dar de
aceeaşi normalitate sunt echivalente între ele.
Pe această proprietate se bazează calculul concentraţiilor necunoscute
a unor soluţii, prin măsurarea volumului soluţiei de reactiv, de aceeaşi
normalitate, cu care reacţionează cantitativ, şi a cărei concentraţie este
cunoscută.
Formula ce se poate aplica acestei legi, este:

F1xV1 =V2xF2
unde:
F1, F2 = factorii de normalitate corespunzători soluţiilor utilizate la
titrare;
V1,V2 = volumele utilizate la titrare.

3.2.4. Regula amestecurilor (regula dreptunghiului)

Pentru prepararea soluţiilor de anumite concentraţii se foloseşte regula


amestecurilor.
Pentru a prepara din două soluţii de concentraţii diferite a % şi b %
( a > b ) o soluţie de concentraţie intermediară c % ( a > c > b), se
procedează astfel :
În colţurile de sus ale unui dreptunghi se trec cifrele ce reprezintă
concentraţiile (în procente greutate) soluţiilor iniţiale (a % şi b %), în
mijlocul dreptunghiului, la intersecţia celor 2 diagonale, se trece concentraţia
c% la care dorim să ajungem.

57
În colţurile de jos se notează diferenţa dintre concentraţia soluţiilor
iniţiale a % şi b % şi concentraţia c %, scăzând cifra cea mai mică din cea
mai mare de-a lungul diagonalelor dreptunghiului.
Diferenţele obţinute reprezintă volume de soluţii, în grame, ce trebuie
amestecate pentru a obţine soluţia de concentraţie dorită.
Exemple :
1. Să se prepară o soluţie de H2SO4 cu densitatea 1,24 de 32,28 % din
două soluţii de H2SO4, una cu densitatea de 1,84 adică 95,6% şi alta cu
densitatea de 1,15 adică 20,91 %.
În rezolvare se aplică regula amestecurilor :

Părţi greutate 11,37 H2SO4 95,60 % 63,32 H2SO4 20,91 %

Pentru a calcula în părţi volumul, se împart părţile greutate cu densitatea:

11,37
 6,179 parti volum H 2 SO4 95,60 %
1,84
63,32
 55,60 parti volum H 2 SO4 20,91 %
1,15

total părţi volume 61,239

Pentru 1000 cm3soluţie se calculează :


61,239 părţi volum ……….6,179 părţi volume H2SO4 95,60 %
1000………………………….X
58
6,179  1000
x  100 ,9 cm 3 H 2 SO4 95,6%
61,239

61,239 părţi volume…………..66,060 părţi volume H2SO4 20,91 %


1000…………………………….y

55,060  1000
x  899 ,1 cm 3 H 2 SO4 20,91 %
61,239

Deci: 100,9 cm3 H2SO4 95,6 % + 899,1 cm3 H2SO4 formează 1000
cm3 soluţie 32,28 % H2SO4

2. Să se prepare 1000 cm3 soluţie de HCl 10 % din HCl cu densitatea


1,19 deci de concentraţie 37,23 %.
În acest caz diluarea se face cu apă deionizată, astfel că în colţul din
dreapta al dreptunghiului , trecem cifra zero.
Deci, amestecul pe care îl preparăm va avea 10 părţi greutate acid
clorhidric şi 27,23 părţi greutate apă.
Întrucât se măsoară volume şi nu se cântăresc lichide, se vor calcula
părţi volum, împărţind părţile în greutate prin densităţile respective.

10/1,19 = 8,403 părţi volume HCl


27,23/1 = 27,23 părţi volume H2O

total părţi volume 35,633

35,633 părţi volume……………………8,403 părţi volume HCl


1000………………………………………x

59
8,403  1000
x  235 ,8 cm 3 HCl
35,633

Deci, în balonul cotat de 1000 cm3 se introduc 235,8 cm3 HCl 37,23 %
măsuraţi cu cilindrul gradat, se amestecă cu apă deionizată şi se completează
la semn după răcire.

Observaţii:

60
61
62
63
3.3.METODE VOLUMETRICE BAZATE PE REACŢII DE
NEUTRALIZARE

Metodele volumetrice de analiză bazate pe reacţii protolitice (de


neutralizare) sau de schimb de protoni includ alcalimetria şi acidimetria care
folosesc ca soluţii titrate, soluţia unei baze sau a unui acid.
Alcalimetria - este partea din titrimetrie care cuprinde metodele de
dozare a bazelor sau a substanţelor cu reacţie alcalină prin titrarea soluţiilor
acestora cu o soluţie titrată de acid.
Acidimetria - cuprinde metodele de dozare a acizilor tari sau a
substanţelor cu reacţie acidă, prin titrarea soluţiilor acestora cu o soluţie
titrată de bază.
Alcalimetria şi acidimetria formează împreună titrimetria prin reacţii
protolitice sau de neutralizare la baza cărora stă reacţia generală :
H+ + HO- H2O

3.3.1. Alcalimetrie

3.3.1.1. Stabilirea titrului şi factorului unei soluţii de NaOH ~0,1n


cu o soluţie de acid oxalic 0,1n de normalitate exactă

Principiul metodei:
La baza acestei metode stă reacţia de neutralizare între acidul
oxalic şi hidroxidul de sodiu:

COOH COONa
+ 2 NaOH + 2 H2O
COOH COONa

64
Reactivi
 Hidroxid de sodiu NaOH p.a.
 Acid oxalic H2C2O4 x H2O p.a.
 Fenolftaleină ( soluţie alcoolică 1%)

Modul de lucru
 se pipetează 10 cm3 H2C2O4~ 0,1 n şi se introduc într-o fiolă

conică;
 se spală peretele fiolei conice cu apă distilată;
 se adaugă 2-3 picături de fenolftaleină;

 se titrează cu NaOH 0,1n, adăugând picătură cu picătură


această soluţie şi agitând continuu fiola conică, până când
coloraţia roz care apare la adăugarea fiecărei picături nu mai
dispare.
 se încălzeşte soluţia la 70 - 80 oC (pentru îndepărtarea CO2 din
soluţie); soluţia din fiolă se va decolora;
 se continuă titrarea până la apariţia din nou a coloraţiei roz -
pal, care va persista 30 de secunde;
 se notează cu V cm3 volumul de NaOH folosit la titrare;

 pentru obţinerea de rezultate precise, se execută 2-3 probe


paralele.

Calcul:
Ţinând cont de proprietatea soluţiilor de aceeaşi normalitate se poate
scrie:
V NaOH ~ 0,1n cm3 x F NaOH ~ 0,1n = 10 cm3 H2C2O4 x F H2C2O4~ 0.1 n
H2C2O4 este o titrosubstanţă , deci F H2C2O4~ 0.1 n = 1,000
rezultă că :

65
10 cm3 H2C2O4
F NaOH ~ 0,1n = 
V NaOH ~ 0,1n cm3
din relaţia F = Tr / Tt rezultă
T real NaOH ~ 0,1n = T teoretic NaOH ~ 0,1n x F NaOH ~ 0,1n

Observaţii:

66
3.3.2. Acidimetria

3.3.2.1.Determinarea factorului şi titrului unei soluţii de H2SO4 ~ 0,1n


cu o soluţie de NaOH ~ 0,1n cu factor cunoscut

Principiul metodei:
Metoda se bazează pe reacţia de neutralizare între soluţia de
H2SO4~0,1n şi soluţia de NaOH ~ 0,1n de normalitate cunoscută.
H2SO4 + 2 NaOH = Na2SO4 + H2O

Reactivi
 Hidroxid de sodiu NaOH ~ 0,1n cu factor cunoscut
 Acid sulfuric H2SO4~0,1 n (într-un balon cotat de 1000 cm3, se introduc
cca. 400 cm3 apă distilată, peste care se adaugă cu atenţie 2,8 cm3 H2SO4
concentrat, cu densitatea = 1,84 g/cm3 măsurat cu cilindrul gradat. Se
agită conţinutul balonului şi se completează la semn cu apă distilată,
după răcire) ;
 Indicator Roşu de metil (0,1 g roşu de metil în 100 cm3 apă distilată).

Modul de lucru
 se pipetează 10 cm3 soluţie de NaOH ~ 0,1 n cu factor
cunoscut şi se introduc într-o fiolă conică ;
 se spală peretele interior al fiolei cu apă distilată, pentru ca

eventualele picături ce s-ar găsi pe pereţi să fie aduse în soluţie;


 se adaugă 2-3 picături roşu de metil (indicator);
 se titrează cu H2SO4 ~ 0,1n până la virajul indicatorului la

portocaliu (roşu de metil în mediu bazic are culoarea galbenă,


în mediu acid roşu, deci la echivalenţă culoarea portocalie);
 se fierbe 2 minute pentru îndepărtarea CO2;
67
 se răceşte, apoi se continuă titrarea până la trecerea culorii de
la galben la portocaliu;
 se notează volumul final V de reactiv consumat.

Calcul:
V H2SO4 ~ 0,1 n ml x FH2SO4~ 0,1n = 10 cm3 NaOH ~ 0,1 n x F NaOH ~ 0,1 n
F H2SO4 ~ 0,1 n = 10 cm3 NaOH ~ 0,1 n x F NaOH ~ 0,1n /V H2SO4 ~ 0,1n cm3
Treal H2SO4~ 0,1n = T teoretic H2SO4~ 0,1n x F H2SO4~ 0,1n

Observaţii:

68
3.3.2.2. Dozarea acidului acetic

Principiul metodei:
La baza dozării stă reacţia de neutralizare a acidului acetic cu o bază:
CH3COOH +NaOH = CH3 COONa + H2O

Reactivi
 Acid acetic CH3COOH
 Fenolftaleină - sol 1%
 Hidroxid de sodiu NaOH sol ~0,1N cu Factor cunoscut

Modul de lucru
 se pipetează 10 cm3 din soluţia de acid acetic de concentraţie
necunoscută şi se introduce într-o fiolă conică;
 se spală peretele interior al fiolei cu puţină apă distilată;
 se adaugă 2-3 picături de fenolftaleină;
 se titrează cu o soluţie de NaOH ~ 0,1n cu factor cunoscut până la
apariţia culorii roz, persistentă 30 secunde;
 se notează cu “a”cm3 Na OH ~ 0,1n utilizaţi la titrare .

Calcul:
Ştiind că 1val NaOH (40g) neutralizează 1 val CH3 COOH (60g) se
poate calcula cantitatea de acid acetic neutralizată de 1 cm3 NaOH~ 0,1n
de normalitate exactă, care conţine o cantitate de NaOH egală cu titrul
teoretic (0,004 g)
40 g NaOH neutralizează …………..60 g CH3COOH
0,004 g NaOH ……………………….X
X = 0,006 g CH3COOH

69
Pentru a calcula câte grame de CH3COOH au fost neutralizate de
volumul de soluţie de NaOH~0,1n utilizat la titrare, este necesar în primul
rând să se calculeze volumul corespunzător de NaOH de normalitate exactă,
prin înmulţire cu factorul de normalitate .
Deci :
a cm3 NaOH ~ 0,1n x F NaOH~ 0,1n reprezintă cm3 de normalitate
exactă.
Dacă 1 cm3 NaOH de normalitate exactă neutralizează 0,006g
CH3COOH, volumul utilizat la titrare va neutraliza
a cm3 NaOH ~ 0,1n x F NaOH ~ 0,1n x 0,006 g CH3COOH
Această cantitate de acid acetic a fost neutralizată dintr-un volum de
10cm soluţie de acid acetic.
3

Pentru a exprima cantitatea de acid acetic în procente trebuie să se


facă raportatea la 1000 cm3 soluţie.
10 cm3CH3COOH……a cm3NaOH~0,1x FNaOH ~ 0,1n x 0,006g CH3COOH
100 cm3 CH3COOH …………x
a x F x 0,006 x 100
X = 
10
3
% CH3COOH= a cm NaOH~ 0,1n x FNaOH ~ 0,1n x 0,006x10

Observaţii:

70
3.4. METODE VOLUMETRICE BAZATE PE
REACŢII DE OXIDO-REDUCERE

Metodele de oxido-reducere sunt metode volumetrice ce se bazează pe


reacţii ce se petrec cu transfer de electroni între substanţele care
reacţionează.
Mecanismul intim al reacţiilor de oxido-reducere constă deci, în
pierderea sau captarea de electroni.
Pierderea de electroni se numeşte oxidare, iar reducerea se realizează
prin câştig de electroni.
Dozările bazate pe reacţiile de oxido-reducere se efectuează cu soluţii
titrate de oxidanţi sau cu soluţii titrate de reducători.
După tipul de oxidant utilizat, se definesc diferite metode de
oxidimetrie.

3.4.1. Manganometria

Metoda de dozare se numeşte manganometrică deoarece oxidantul


folosit este permanganatul de potasiu.
Permanganatul de potasiu este un oxidant puternic atât în soluţii acide
cât şi în soluţii neutre sau chiar bazice.
Tehnica volumetrică de dozare cu KMnO4 utilizează reacţiile de
oxidare în mediu puternic acid. Reacţia de bază a manganometriei este:

2 KMnO4 + 3 H2SO4 = 2 MnSO4 + 3 H2O + 5 O

Din această ecuaţie se observă că manganul se reduce de la valenţa


+7 la +2, acceptând 5 e-, deci echivalentul gram al KMnO4 se va calcula
raportând masa sa moleculară la 5.
Oxigenul pus în libertate în această reacţie, serveşte la oxidarea
substanţelor care pot reacţiona cu el.
71
În reacţiile de oxidare cu KMnO4, nu se foloseşte indicator, sfârşitul
reacţiei se sesizează datorită culorii soluţiei de permanganat în exces.
Pentru asigurarea unui mediu puternic acid se adaugă în soluţie un
acid mineral puternic (H2SO4 ,4n).

3.4.1.1. Determinarea titrului şi factorului unei soluţii de KMnO4~ 0,1n


cu ajutorul unei soluţii de acid oxalic 0,1n

Principiul metodei:
Reacţia care stă la baza determinării, se poate exprima prin ecuaţia :
5 H2C2O4 + 2 KMnO4+ 3H2SO4 = K2SO4 + 2 MnSO4+ 10 CO2 + 8H2O
În reacţia permanganatului de potasiu cu acidul sulfuric este pus în
libertate oxigenul.
2 KMnO4 + 3 H2SO4 = 2 MnSO4 + 3 H2O + 5 O
Acesta va reacţiona cu acidul oxalic conform ecuaţiei:
(Acidul oxalic = HOOC – COOH)

5 (COOH)2 + 5 O = 10 CO2 + 5 H2O

Schimbul de electroni este deci următorul :

Mn +7 + 5 e-  Mn2+ (reducere) / x2

COO-
 - 2 e-  2 CO2 (oxidare) / x 5
COO-

Reactivi
 Soluţie de permanganat de potasiu – KMnO4 ~ 0,1 n ( se dizolvă 3,2 g
KMnO4 în apă distilată şi se aduce la semn, la un volum de 1000
cm3;după 8-10 zile se filtrează şi se determină factorul)

72
 Acid oxalic – H2C2O4 x 2 H2O cristale;
 Acid sulfuric – H2SO4 4 n ( 112 cm3 acid sulfuric conc. ; d = 1,84 se
adaugă treptat în cca 400 cm3 apă distilată, iar după răcire se
completează până la 1000 cm3.

Modul de lucru
 se pipetează 10 cm3 de acid oxalic 0,1n într-o fiolă conică ;
 se spală peretele interior al fiolei cu apă distilată ;
 se adaugă 15 cm3 acid sulfuric 4n ;
 se încălzeşte conţinutul fiolei la 70 - 800 C
 se titrează cu soluţie de KMnO4 ~ 0,1n , până la apariţia coloraţiei slab
roz, persistentă 1 minut ;
 se notează cu V volumul de KMnO4 ~ 0,1 n consumat.

Calcul:
10 cm 3 soluţie de H2C2O4 0,1n conţine 0,063 g substanţă. Un
echivalent gram de H2C2H4 (63,034), reacţionează cu un echivalent gram de
KMnO4 (31,606).
Dacă 63,034 g H2C2O4 x H2O ………..31,060 g KMnO4
atunci a g H2C2O4 x H2O ………………V cm3KMnO4 x T real
a x 31,606
T KMnO4 o,1n = 
63,034 x V
FKMnO4 = Treal / T teoretic
unde a = grame de acid oxalic cântărite.

Observaţii:

73
74
3.4.2. Iodometria

Iodometria se bazează pe reacţii de oxidoreducere de tipul:

(1) I2 + 2 e -  2 I-
(2) 2I- - 2e-  I2

În prima reacţie, iodul (I2) se comportă ca oxidant, iar în cea de a


doua, ionul iodură (I-) se comportă ca reducător.
Metodele iodometrice de dozare pot utiliza doi reactivi volumetrici:
soluţie de I2 sau soluţie de KI.
Determinarea iodului (I2) în cazul folosirii primei soluţii, sau a
ionului (I-) în cazul folosirii celei de a doua soluţii, se face prin titrarea cu o
soluţie de tiosulfat de sodiu. Ca indicator în iodometrie se foloseşte
amidonul, care în prezenţa iodului formează un compus de absorbţie intens
colorat în albastru.

3.4.2.1. Stabilirea titrului şi factorului unei soluţii de iod~ 0,1N


cu ajutorul unei soluţii de tiosulfat de sodiu~ 0,1 n cu factor cunoscut.

Principiul metodei:

2Na2S2O3 + I2 = 2NaI + Na2S4O6

Produsul de reacţie este tetrationatul de sodiu. Din reacţie se observă


că 2 molecule de tiosulfat de sodiu reacţionează cu o moleculă de iod.
Echivalentul gram al tiosulfatului de sodiu este egal tocmai cu masa
moleculară (248,19g) iar a iodului cu masa atomică (126,92) deoarece:
2S2O32 - - 2e_- = S4O62-
2 I0 + 2e- = 2I-

75
Evoluţia reacţiei este în funcţie de pH-ul mediului. În mediul alcalin
reacţia decurge cu formarea de hipoiodit şi iodat şi oxidarea tiosulfatului la
sulfat:

Na2S2O3 + 4I2 + 10 NaOH = 2 Na2SO4 + 8NaI + 5 H2O

Reacţia se va efectua deci în mediu acid.


Amidonul se adaugă atunci când, soluţia brună de iod ajunge în timpul
titrării cu tiosulfat, la culoare galben deschis, deoarece în caz contrar o parte
din iod va fi reţinut de amidon într-un compus stabil de culoare albastră, ce
necesită timp mai îndelungat pentru reducerea cu tiosulfat, deci consumul
de reactiv va fi mai mare.

Reactivi
 Soluţie de iod ~ 0,1n. Se cântăresc la balanţa analitică 12,692 g iod
resublimat, se introduce în balon cotat 1 dm3. Se dizolvă într-o soluţie
de KI (25g KI în 35 cm3 apă distilată). După dizolvare se completează la
semn cu apă distilată;
 Soluţia de tiosulfat de sodiu Na2S2O3 0,1N. Se cântăresc cu precizie
24,82 g de tiosulfat de sodiu, se introduc în balon cotat de 1 dm3. Se
dizolvă în apă distilată şi se completează la semn cu apă distilată
 Amidon 0,2%. Se amestecă 2g amidon solubil cu 10 mg HgI2 şi se
adaugă puţină apă distilată amestecând pentru a obţine un amestec
omogen. Se aduce la volum de 1000 cm3 cu apă distilată.

Modul de lucru
 se pipetează 10 cm3 soluţie de iod ~ 0,1n (V1) care se diluează cu
aproximativ 50 cm3 apă distilată;

76
 se titrează cu soluţie de Na2S2O3 ~ 0,1 n cu factor cunoscut (F2) până la
culoarea galben pai;
 se adaugă 1 cm3 soluţie de 0,2% amidon, cu rol de indicator;
 se continuă titrarea până când soluţia de culoare albastră se
decolorează
 se notează cu V2 volumul soluţiei de tiosulfat de sodiu 0,1n în cm3,
folosit la titrare.

Calcul:
Se aplică proprietatea echivalenţei soluţiilor de aceeaşi normalitate:
V1 x F I2~ 0,1 n = F Na2S2O3~ 0,1n x V2
V2 x F Na2S2O3~ 0,1n
F I2~ 0,1n = 
V1
TrI2~ 0,1n = F I2~ 0,1n x Tt = F I2~ 0,1n x 0,012692

Observaţii:

77
78
3.5. METODE VOLUMETRICE BAZATE PE REACŢII
CU FORMARE DE COMPLECŞI
(COMPLEXOMETRIA SAU CHELATOMETRIA)

La baza acestor metode volumetrice stă reacţia de formare a


complecşilor interni numiţi şi chelaţi, de aceea determinările se numesc
determinări complexometrice sau chelatometrice.
Compleşii interni sunt combinaţii coordinative cu structură specială.
Acizii amino-policarboxilici au mare putere de complexare şi de aceea
au fost denumiţi “ complexoni”.
Complexonul III (sarea disodică a acidului etilendiaminotetraacetic
sau EDTA) este cel mai mult utilizat ca reactiv în reacţiile
complexometrice.
Complexonul III se notează Na2H2Y şi are următoarea formulă:

HOOC CH2 CH2 COOH


N CH2 CH2 N
NaOOC CH2 CH2 COONa

Punctul de echivalenţă se determină cu ajutorul indicatorilor de


complexometrie.
Indicatorii de complexometrie sunt complexoni, coloranţi, care au
capacitate de complexare mai mică decât complexonii folosiţi la titrare.
În prezenţa ionilor metalici liberi, ei formează compuşi coloraţi, iar la
titrare eliberează ionii metalici şi soluţia îşi schimbă culoarea, ceea ce indică
sfârşitul titrării.
Principalii indicatori complexometrici sunt: murexidul, negrul
eriocrom T, acidul sulfosalicilic, titronul, violetul de pirocatechină, ftalein
complexonul etc.
Indicatorii de complexometrie îşi modifică culoarea şi la variaţiile
pH-ului.

79
3.5.1. Determinarea titrului şi factorului unei soluţii de complexon III

Principiul metodei:
Stabilirea titrului unei soluţii de complexon se face folosind drept
titrosubstanţe săruri ale unor ioni metalici, cu care complexonul dă un
complexonat stabil. Cele mai utilizate sunt : CaCO3, MgSO4 x 7 H2O, ZnO,
Cu, Zn, Bi etc.
Deoarece în reacţie rezultă ioni de hidrogen, care duc la micşorarea
stabilităţii complexonatului şi poate influenţa asupra culorii indicatorului
prin modificarea pH-ului, titrările se execută în soluţii tampon.
Reacţia de bază este următoarea:

NaOOC CH2 CH2 COONa


N CH2 CH2 N + Me 2+
O C CH2 CH2 C O
O- O-

NaOOC CH2 CH2 COONa


N CH2 CH2 N
O C CH2 CH2 C O

O Me 2+ O

Reactivi
 soluţie de complexon III. Se cântăresc 9,34 g N2H2Y x 2 H2O, se
introduc în balon cotat de 1000 cm3, se dizolvă în apă distilată şi se
complectează la semn cu apă distilată;
 soluţie de hidroxid de sodiu NaOH 1% ;
 soluţie tampon clorură de amoniu şi amoniac – NH4Cl + NH3. Se
cântăresc 70 g NH4Cl, se introduc în balon cotat de 1000 cm3 , se adaugă

80
570 cm3 soluţie NH3 cu d = 0,90 şi se completează la cotă cu apă
distilată;
 amestec eriocrom negru T p.a. + NaCl p.a. (în raport 1:500);
 se cântăresc 6,162 g sulfat de magneziu heptahidratat MgSO4 x 7 H2O
(înainte de întrebuinţare se păstrează în exicator timp de 24 ore), se
introduc în balon cotat de 1000 cm3, se dizolvă în apă distilată şi se
completează la semn cu apă distilată;

Modul de lucru
 se pipetează 10 cm3 soluţie MgSO4 0,05n într-o fiolă conică;
 se adaugă soluţia de NaOH până la pH = 7;
 se adaugă soluţie tampon NH4Cl + NH3 până la pH = 10, pH -ul se
controlează cu hârtia indicatoare;
 se adaugă un vârf de spatulă de amestec eriocrom negru T + NaCl ( în
proporţie de 1:500);
 se titrează cu soluţie de complexon III 0,05 n până la virajul culorii de la
roşu la albastru;
 se notează volumul soluţiei de complexon III consumat la titrare cu V2.

Calcul:
Având în vedere proprietatea soluţiilor de aceeaşi normalitate putem scrie:
V 2 cm3 x F complexon ~ 0,05n = 10 cm3 MgSO4 0.05n x F MgSO4 0.05n
MgSO4 este o titrosubstanţă , deci F MgSO4 0.05n = 1,000
rezultă că :
10 cm3 MgSO4 0.05n
F complexon ~ 0,05n = 
V 2 cm3
din relaţia F = Tr / Tt rezultă
T real complexon ~ 0,05n = T teoretic complexon ~ 0,05n x F complexon ~ 0,05n

81
1 Eg complexon III = 186,2g
T teoretic complexon ~ 0,05n = 186,2 x 0,05 = 0.009325 g/cm3
T real complexon ~ 0,05n = 0,009325g/cm3 x F complexon ~ 0,05n

Observaţii:

82
83
84
CAPITOLUL IV

METODE FIZICO - CHIMICE DE ANALIZĂ BIOCHIMICĂ

4.1. NOŢIUNEA DE pH – GENERALITĂŢI

pH-ul este o noţiune fizico-chimică prin care se caracterizează reacţia


unui mediu (acidă, bazică sau neutră) şi reprezintă numărul ionilor de
hidrogen prezenţi.
Concentraţia ionilor de hidrogen dintr-o soluţie poate varia între
limitele 1-10-14, fiind corelată cu concentraţia ionilor de hidroxil, conform
relaţiei produsului ionic al apei:
[ H+] . [OH-] = 10-14
Întrucât limitele de variaţie ale acestor concentraţii sunt foarte largi,
se foloseşte termenul de pH, introdus de Sorensen, care reprezintă logaritmul
zecimal negativ al concentraţiei ionilor de hidrogen adică exponentul sau
puterea la care trebuie ridicat numărul 10 (baza logaritmului zecimal), pentru
a exprima valoarea concentraţiei în echivalenţi gram de ioni de hidrogen.
1
pH = -lg[H ]= lg 
+

[H+]

Legătura dintre pH şi [H+]este dată de relaţiile:


1
[H ]= 10 = 
+ -pH

10pH

pH-ul poate varia între limitele 0-14.


Soluţiile cu pH =7 sunt neutre, cele cu pH< 7 sunt acide iar cele cu
pH > 7 sunt alcaline.

85
În lichidele biologice pH-ul are valori relativ constante, care pot însă
varia între limite strânse, de exemplu:
 în sânge pH = 7,3 - 7,5 media fiind de 7,36
 în stomac pH = 1,5- 2,5
 în intestin pH= 7,8 - 8,7
În cazuri patologice se pot produce modificări ale valorilor normale
ale pH-ului. Astfel, în sânge scăderea pH-ului sub limitele normale se
numeşte acidoză (în caz de diabet, de acumulare de corpi cetonici sau acid
lactic), iar creşterea pH-ului sanguin peste limitele normale se numeşte
alcaloză.
Determinarea pH-ului se poate face prin două metode: colorimetrice şi
potenţiometrice.

4.1.1. Determinarea pH-ului cu hârtie indicatoare

Principiul metodei:
Determinarea pH-ului se bazează pe proprietatea indicatorilor de a-şi
modifica culoarea în funcţie de concentraţia ionilor de hidrogen. Hârtia
indicatoare de pH este impregnată cu diferiţi indicatori (indicatori
universali). Este o metodă colorimetrică.
Hârtia indicatoare de pH se prezintă fie sub forma unor carnete sau
pliante, fie sub forma unor discuri închise într-o cutie de material plastic pe
al cărei capac sunt indicate nuanţele de culori etalon corespunzătoare
diferitelor valori de pH.

Fig.1. Hârtie indicatoare de pH (mod de prezentare)

86
Modul de lucru
Dintr-o bandă de hârtie indicatoare de pH se taie cu o foarfecă mai
multe porţiuni mici. Cu o pensetă se ia o bandă şi se umectează în soluţia a
cărui pH vrem să-l determinăm. Banda se va colora şi apoi se compară
culoarea benzii cu culoarea de pe scala etalon de culori. Identitatea de
culoare înseamnă identitatea de pH.

4.1.2. Metoda potenţiometrică de determinare a pH-ului

Principiul metodei:
Determinarea pH-ului pe cale potenţiometrică este o metodă
electrochimică şi se bazează pe măsurarea diferenţei de potenţial electric
care se stabileşte între doi electrozi introduşi în soluţia de analizat. Unul
dintre electrozi, cel negativ, este electrodul indicator, cel mai utilizat fiind
electrodul de sticlă sau de măsură (figura 2).

Fig.2. Electrod de sticlă Fig. 3. pH- metru


Al doilea electrod, cel pozitiv este un electrod de referinţă (electrod
de calomel sau electrod de AgCl) al cărui potenţial este întotdeauna constant.
Cei doi electrozi se leagă la bornele + şi - ale unui aparat numit
potenţiometru sau pH-metru, care este un milivoltmetru electronic. Valoarea
intensităţii curentului de măsurat este astfel foarte mică împiedicând

87
descărcarea pilei galvanice formată din cei doi electrozi, în timpul
măsurării.

Modul de lucru
 Se spală electrozii în paharul Berzelius cu apă distilată şi se clăteşte cu
soluţie tampon de etalonare cu pH cunoscut.
 Electrozii se introduc într-o soluţie tampon cu pH cunoscut. Cu un
termometru se măsoară temperatura soluţiei. Butonul compensator de
temperatură se aduce la valoarea temperaturii de lucru.
 Se conectează electrodul de calomel la borna (+) şi electrodul de sticlă la
borna (-) a aparatului.
 Se verifică dacă aparatul este potrivit la tensiunea de alimentare în priza
stabilizatorului.
 Se conectează stabilizatorul la reţea şi după 5 minute se aduce
întrerupătorul 1 în poziţia de funcţionare. Becul roşu semnalizator
trebuie să se aprindă.
 După 5-10 minute (timpul de încălzire al aparatului), comutatorul se
aduce de pe poziţia de zero pe poziţia de lucru dorită (pe domeniul de
pH de la 0-7 sau de la 7-14).
 Acul indicator al instrumentului de măsurat se aduce prin rotirea
butonului de fixare a pH-ului, la pH-ul soluţiei tampon.
 Se verifică buna funcţionare a aparatului cu cel puţin o soluţie tampon
etalon. Aparatul trebuie să indice pH-ul soluţiei. În felul acesta aparatul
este gata pentru lucru.
 Se introduc electrozii în soluţia a cărui pH vrem să-l determinăm şi se
aduce comutatorul pe poziţia 0-7 pH. Dacă acul se opreşte în acest
interval, pH-ul soluţiei cercetate se găseşte în domeniul acid şi se citeşte
pe scala aparatului. Dacă acul depăşeşte valoarea 7, se mută comutatorul
pe domeniul 7-14 de pH. Se citeşte valoarea căutată pe scala aparatului
care în acest caz se găseşte în domeniul alcalin.

88
Observaţii:

89
Observaţii:

90
4.2. SISTEMELE TAMPON

Sistemele tampon sunt amestecuri de soluţii care au proprietatea de a


menţine practic constant pH-ul soluţiei la adăugarea de cantităţi mici de acizi
sau de baze tari.
Sistemele tampon pot fi constituite din:
1) Acizi slabi şi sărurile lor cu baze tari;
2) Baze slabe şi sărurile lor cu acizii tari;
3) Săruri primare şi secundare ale acizilor polibazici.
Valoarea pH-ului unui sistem tampon este dată de ecuaţia Henderson-
Hasselbach:
[ A-]
pH = pK + log 
[ AH ]

Exemplul din prima categorie este amestecul de acetat de sodiu


(CH3-COONa) şi acid acetic (CH3COOH). Mecanismul de acţiune al acestui
sistem tampon la adăugarea de acizi tari este următorul:
CH3COO-+ Na+ + CH3-COOH + H+ Cl- = Na+ Cl - + 2CH3COOH
În locul fiecărui echivalent gram de acid clorhidric se va forma un
echivalent gram de acid acetic care fiind un acid slab, practic nu disociază şi
pH-ul soluţiei se modifică foarte puţin în urma blocării ionilor de hidrogen
introduşi în soluţie prin formarea acidului slab, nedisociat.
Mecanismul de acţiune al aceluiaşi sistem tampon la adăugarea de
baze tari va fi în acest caz:
CH3-COO- + Na+ + CH3COOH + Na+ + OH-= 2 CH3COO- + 2Na+
+H2O
Ionii de hidroxil introduşi în soluţie prin baza tare vor provoca
disocierea acidului acetic cu formarea unei molecule de apă, de asemenea,
practic nedisociată. pH-ul soluţiei nu se va modifica nici în acest caz
deoarece nici ionii de hidroxil nu rămân liberi în soluţie.
91
Sistemul tampon descris va avea acţiunea de tamponare maximă la
valori pH = pKa şi intervalul de tamponare va fi pKa  1,7.
Pentru a obţine un efect de tamponare într-un interval mai mare de pH
se folosesc sisteme tampon universale care conţin acizi polibazici şi sărurile
primare şi secundare ale acestora.

4.2.1.Prepararea unui sistem tampon universal

Modul de lucru
Se iau 9 eprubete curate şi uscate numerotate de la 1 până la 9, şi se
introduce cu ajutorul unei pipete volume de amestec de acid citric 0,1 M şi
acid boric 0,1 M în raport de 1/1(25 ml acid boric 0,1M + 25 ml acid citric
0,1M) şi soluţie de NaOH 0,1 N în cantităţile prevăzute în tabelul nr.1.

Tabel nr. 1 Sistem tampon universal


Nr.
1 2 3 4 5 6 7 8 9
eprubetă
amestec
7,7 6,1 4,8 3,9 3,7 3,55 3,3 2,9 2,1
acizi
NaOH 2,3
3,9 5,2 6,1 6,3 6,45 6,7 7,1 7,9
0.1M
pH 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Culoarea roşu-
porto- verde albas- violet
Indica- roşu porto- galben verde violet
caliu gălbui tru roşcat
torului caliu

În fiecare eprubetă se mai introduc cu ajutorul unei pipete picurătoare


câte 6 picături de indicator universal şi se agită. Se obţin soluţii cu valori de
pH cuprinse între 3 şi 11 (coloana a 4-a), iar culoarea soluţiei după
introducerea indicatorului universal variază între roşu şi violet roşcat
92
(coloana a 5-a din tabel).Sistemul tampon va avea acţiunea de tamponare în
tot intervalul de pH menţionat, deoarece fiecare dintre cele 3 constante de
aciditate ale acizilor folosiţi (acidul citric şi acidul boric) vor acţiona ca
sisteme tampon independente în intervalul de tamponare de pKa  1,7.
H2C COOH
HO CH COOH OH
HO C COOH
CH COOH B OH
HCH COOH OH
2 C 2 COOH
Acid citric Acid boric

Interval de tamponare Interval de tamponare


acid citric acid boric
pKa1 = 3,06 1,36 - 4,76 pKa1 = 9,14 7,44 - 10,84
pKa2 = 4,74 3,04 - 6,44 pKa2 = 11,74 10,04- 13,4
pKa3 = 5,40 3,70 - 7,10 pKa3 = 13,80 12,10- 14

4.2.2.Punerea în evidenţă a acţiunii de tamponare


a sistemului tampon

Experienţa 1
Una dintre soluţiile sistemului tampon se împarte în 3 fracţiuni. Se
toarnă încă în două eprubete câte 1/3 din conţinutul eprubetei nr.5 care are
pH =7.
Într-una din eprubete se adaugă 2 - 3 picături de HCl 0,1n, iar în alta
2-3 picături de NaOH 0,1n. Se compară nuanţa celor două eprubete cu cea a
eprubetei în care nu s-a introdus nici acid nici bază. Se constată că în nici o
eprubetă culoarea nu s-a modificat ceea ce înseamnă că pH-ul soluţiilor a
rămas constant datorită acţiunii sistemului tampon.

93
Experienţa 2
Se iau 3 eprubete curate şi se introduc în fiecare câte 10cm3 apă
distilată (sau deionizată) şi 6 picături de indicator universal.
În prima eprubetă de introduc 2-3 picături de HCl 0,1n şi în cea de-a
doua eprubetă 2-3 picături de NaOH 0,1n. Se compară culoarea eprubetelor
cu cea de a treia eprubetă în care nu s-a introdus acid sau bază.
Se constată în prima eprubetă virarea culorii indicatorului spre roşu iar
în cea de-a doua culoarea virează spre albastru, ceea ce înseamnă că pH-ul
apei distilate a fost influenţat prin adăugarea de H+ sau de HO-, ca urmare a
absenţei sistemelor de tamponare.

Experienţa 3
Se iau 3 eprubete curate şi uscate şi se introduc în fiecare câte 10 cm3
de apă de robinet şi 6 picături de indicator universal.
Se introduc în prima eprubetă 2-3 picături de HCl 0,1n şi în cea de a
doua eprubetă 2-3 picături de NaOH 0,1n. Se compară culorile primelor
două eprubete cu cea de a treia eprubetă, constatându-se că pH-ul primelor
două eprubete se modifică foarte puţin datorită prezenţei în apa de robinet a
sistemelor tampon datorate acizilor carbonic şi fosforic precum şi a sărurilor
acestora.

4.2.3. Măsurarea puterii de tamponare a sângelui şi a urinii

Puterea de tamponare reprezintă cantitatea de acid sau bază necesară


pentru a schimba valoarea pH-ului cu o unitate.

Principiul metodei:
Pentru determinarea puterii de tamponare a serului sanguin sau a
urinii este necesar să se determine în prealabil pH-ul acestora. Se adaugă
apoi o cantitate mică de soluţie de HCl 0,1 n şi se determină din nou pH-ul.

94
Raportul dintre numărul de cm3 de acid adăugat şi variaţia pH-ului ce s-a
produs reprezintă puterea de tamponare a lichidului biologic de determinat.

Reactivi
 Soluţie de acid citric 0,1M ( 21,014g C6H8O7 x H2O se dizolvă în apă
deionizată fiartă şi se completează la 1 dm3).
 Soluţie de acid boric 0,1M ( 6,184 g H3BO3 se dizolvă în apă deionizată
fiartă şi se completează la 1 dm3).
 Indicatorul universal. Se dizolvă în 100 cm3 amestec format din 60 cm3
alcool etilic şi 40 cm3 apă deionizată, următoarele cantităţi de indicator
0,02 g roşu de metil, 0,04g albastru de bromtimol, 0,04 g albastru de
timol şi 0,02 g fenolftaleină.

Modul de lucru
Se determină pH-ul serului sanguin sau al urinii cu pH-metrul.
Se introduc într-o eprubetă 2 cm3 ser sanguin sau urină şi se adaugă cu
ajutorul unei pipete 0,2 cm3 de HCl 0,1n. Se determină din nou pH-ul soluţiei
astfel obţinute.

Calcul:
Se calculează diferenţa dintre cele două valori ale pH-ului şi se face
apoi raportul dintre numărul de cm3 de HCl 0,1n adăugaţi şi această
diferenţă.
Exemplu de calcul: considerăm că pH-ul iniţial al urinii alcaline este
egal cu 8, iar după adăugare de HCl 0,1n pH-ul este egal cu 7,8. Diferenţa
dintre cele două determinări este de 0,2. Puterea de tamponare va fi de
0,2/0,2 =1.

95
Sistemele tampon din organismele animale
Sistemele tampon din sânge sunt următoarele:
1) Acidul carbonic - carbonat acid de sodiu în raport 1/20.
-în plasmă H2CO3 : NaHCO3 (bicarbonat de sodiu)
2) Fosfat primar de sodiu - fosfat secundar de sodiu în raport 1/5
-NaH2PO4 : Na2HPO4
3)Proteine plasmatice - Proteinaţi de sodiu
4)Oxihemoglobină - Oxihemoglobinat de potasiu
-în eritrocite (HbO2)H : (HbO2)K
5) Hemoglobină - Hemoglobinat de potasiu
-în eritrocite (Hb)H : (Hb)K
Aproximativ 50% din capacitatea totală de tamponare a sângelui
revine sistemului acid carbonic - bicarbonat, care se formează în cea mai
mare parte din CO2 rezultat din metabolism.
Acidul carbonic rezultă din CO2 sub influenţa enzimei anhidraza
carbonică conform reacţiei:
CO2 + H2O  H2CO3  H+ + HCO3-
Logaritmul negativ al primei constante de ionizare a acidului carbonic
este pKa = 6,1 şi conform ecuaţiei lui Henderson - Hasselbach, pH-ul
sângelui va fi dat de relaţia:

HCO3-
pH = pK + lg  = 6,1 + log 20 = 7,4
H2CO3

Sistemele tampon asigură, deci, reglarea echilibrului acido-bazic al


mediilor biologice.
În urină reglarea echilibrului acido-bazic este determinată în special
de proporţia dintre fosfatul primar NaH2PO4 şi fosfatul secundar Na2HPO4 al
cărui raport este de 9/1, mult inversat faţă de cel al sângelui care este de 1/5.

96
În celule, sistemul tampon al fosfaţilor are un rol predominant în
menţinerea pH-ului. Aminoacizii şi proteinele prin caracterul lor amfoter
contribuie, de asemenea, în măsură însemnată la acţiunea de tamponare.

Observaţii:

97
Observaţii:

98
4.3.ANALIZA CROMATOGRAFICĂ

4.3.1.Consideraţii generale

Cromatografia este o metodă fizico-chimică de separare şi de dozare a


componenţilor (molecule sau ioni) unui amestec. Prin cromatografie pot fi
separate substanţe care au proprietăţi chimice comune (dau aceleaşi reacţii)
dar diferă prin proprietăţile lor fizice.
Separarea cromatografică se bazează pe viteza de deplasare (sau
migrare) diferită a substanţelor printr-un mediu poros sau material suport sub
acţiunea unui fluid purtător (lichid sau gaz) numit developant.
Metodele cromatografice pot fi clasificate în funcţie de principiul care
stă la baza fenomenului fizic de separare în: cromatografie de absorbţie,
repartiţie, schimb ionic, excluziune sterică şi de afinitate
Alte clasificări pot fi făcute în funcţie de mai multe criterii cum sunt:
a) natura sau modul de aşezare a materialului suport în: cromatografie
pe hârtie, în coloană, în strat subţire;
b) natura fluidului purtător în : cromatografie de lichide, de gaze;
c) de direcţia şi sensul de migrare în: cromatografie în ascendenţă,
radială, bidimensională;
Dintre metodele cromatografice folosite în analiza biochimică, cea
mai răspândită este cromatografia de repartiţie.

4.3.2.Separarea aminoacizilor prin cromatografia de repartiţie

La baza cromatografiei de repartiţie stă diferenţa de solubilitate dintre


substanţe asemănătoare în privinţa structurii lor chimice (de exemplu
aminoacizi, glucide, acizi graşi etc.), în două lichide nemiscibile, care
formează un sistem developant. Un exemplu de sistem developant este apa şi
butanolul, la care se adaugă acid acetic pentru mărirea miscibilităţii lor
reciproce. Cele două lichide se separă pe baza diferenţei de densitate în două

99
straturi, numite faze, unul superior I (butanol saturat cu apă) şi altul inferior
II alcătuit din soluţie de acid acetic saturată cu butanol şi formează un sistem
numit developant.
O substanţă dizolvată în acest amestec se va repartiza diferit între cele
două faze în funcţie de caracterul său polar (hidrofil) sau nepolar (lipofil).
Raportul concentraţiilor de echilibru între cele două faze se numeşte
coeficient de repartiţie şi se notează cu  .

CI

C II
Se calculează cu formula :
unde: CI = concentraţia în stratul nepolar;
CII= concentraţia în stratul polar
Coeficientul de repartiţie () este o constantă caracteristică pentru
fiecare substanţă în parte, fiind acelaşi într-un sistem de solvenţi dat, la o
anumită temperatură, presiune sau pH.
Pentru o serie de substanţe asemănatoare ca structură chimică,
coeficienţii de repartiţie într-un developant, vor varia în funcţie de raportul
între caracterul lor lipofil şi hidrofil.
Astfel, pentru amestecul de aminoacizi:
COOH COOH COOH COOH

CH 2 NH 2 CH NH 2 CH NH 2 CH NH2

CH3 CH CH3 CH2

CH 3 CH CH3

CH3

glicinã alaninã valinã leucinã


1 2 3 4
1 < 2 < 3<4

100
Caracterul lipofil creşte de la glicocol spre leucină din cauza creşterii
catenei laterale cu caracter nepolar, iar caracterul hidrofil se accentuează de
la leucină spre glicocol.
Pentru a efectua o separare cromatografică se foloseşte un sistem de
separare format dintr-un material suport (de exemplu o panglică de hârtie
alungită numită cromatogramă şi un sistem developant n-butanol-acid acetic-
apă în raport de 4:1:5) .

Fig.4 Sistem pentru cromatografia pe hârtie

Modul de lucru
La circa 3 cm de unul dintre capetele cromatogramei se însemnează
cu creionul o linie orizontală, numită linie de start, în centrul căreia se
aplică cu ajutorul unei micropipete capilare 2-5 l din soluţia amestecului
de substanţe de separat.

101
Camera de cromatografie conţine amestecul developant, iar pe pereţii
laterali se aplică două fâşii de hârtie de filtru îmbibate cu acelaşi developant
pentru a asigura saturarea atmosferei interioare cu vaporii de solvent.

Migrarea sau developarea cromatogramei.


Când developantul alcătuit din cele două faze (staţionară şi mobilă)
ajunge la linia de start, începe repartiţia între cele două faze a componentelor
amestecului de separat aplicat pe linia de start (în cazul nostru cei 4
aminoacizi).
Componentul cel mai hidrofil, glicocolul având coeficientul de
repartiţie cel mai mic va migra la o distanţă mai mică de linia de start, el
fiind mai solubil în faza staţionară. Leucina, componentul cel mai lipofil şi
cu coeficientul de repartiţie cel mai mare, se va depărta cel mai mult de linia
de start, întrucât este cel mai solubil în faza mobilă.

Fig.5 Cromatograme

Migrarea cromatogramei se consideră terminată atunci când frontul


developantului, adică linia care desparte zona umedă a cromatogramei de
zona uscată ajunge cu 1 - 2 cm mai jos de orificiile în care sunt introduse

102
cârligele de susţinere. Atunci se scoate cromatograma din camera de
developare, se însemnează cu un creion (negru de grafit) poziţia frontului
developantului şi se introduce în etuvă pentru uscare.

Revelarea cromatogramei
În cazul cromatografierii aminoacizilor reactivul de revelare este
ninhidrina în soluţia alcoolică.Tratarea se poate face fie prin pulverizarea cu
un pulverizator (spray – vezi figura 6), fie prin scufundarea timp de 20-30
minute a cromatogramei într-o baie cu soluţie de ninhidrină (0,2% în alcool
etilic). După acest interval de timp hârtia se usucă în etuvă timp de 15-30
minute la 60°C. După uscare, pe cromatogramă apar pete (spoturi) colorate
în roz-violaceu de formă simetrică.

Figura 6. Revelarea cromatogramei prin pulverizare cu ninhdrină

Identificarea componenţilor
Raportul dintre distanţa de migrare a aminoacidului şi distanţa de
deplasare a frontului developantului este constant pentru fiecare component
în parte şi se notează cu Rf (factor de retenţie).

103
Valoarea lui Rf se calculează cu formula:

a dis tan ta de migrare a spotului (mm )


Rf  
b dis tan ta de migrare a frontului developantului (mm )
Se calculează valorile Rf pentru fiecare cromatogramă de etalonare,
iar la cromatograma cu probă se calculează valorile Rf pentru fiecare spot în
parte.

1,4 cm
Spot 1 : R f   0,18
7,7 cm

6,0 cm
Spot 2 : R f   0,78
7,7 cm

4,1 cm
Spot 3 : R f   0,53
7,7 cm

Valorile se înscriu într-un tabel :

Tabelul nr.2. Valorile obţinute în urma analizei cromatografice


Cromatograma de a b
Rf
etalonare mm mm
Etalon alanină 0,284
Etalon valină 0,472
Etalon leucină 0,645
Proba spot 1
Proba spot 2
Proba spot 3
După finalizarea lucrării şi obţinerea cromatogramei cu spoturile
identificate şi analizate se face interpretarea rezultatelor obţinute.

104
Observaţii:

105
Observaţii:

106
CAPITOLUL V

ANALIZA CALITATIVA A PRINCIPALELOR GRUPE DE


BIOMOLECULE

5.1. PROTIDE

Protidele sunt componente primordiale ale materiei vii. Ele sunt


substanţe organice ce conţin în mod obligatoriu cel puţin patru elemente: C,
H, O şi N, putând conţine şi S şi P. Sunt macromolecule alcătuite din
aminoacizi, legaţi între ei prin legături peptidice (-CO-NH-), alcătuind
catene polipeptidice.
Protidele pot fi hidrolizate în mediul acid, bazic sau enzimatic.
Produşii obţinuţi la hidroliză pot fi clasificaţi astfel :
 Aminoacizi
Protide   Peptide   oligopeptide
 polipeptide
Proteide -  holoproteide (proteine)
 heteroproteide
Proteidele dau reacţii de culoare şi de precipitare caracteristice.

5.1.1. Reacţii de culoare

Reacţiile de culoare ale proteidelor se datoresc prezenţei unor


aminoacizi care reacţionează în mod specific cu diferiţi reactivi.

Reacţia Biuretului

Principiul metodei:
Reacţia biuretului se datoreşte prezenţei în molecula proteidelor a
legăturilor peptidice -CO - NH -. Reacţia biuretului este pozitivă pentru toate

107
substanţele care au în structură cel puţin 2 legături peptidice. Proteidele
reacţionează cu sărurile de cupru în mediul alcalin, producând o culoare violetă.
Această reacţie se numeşte reacţia biuretului, deoarece biuretul
(substanţa obţinută prin eliminarea unei molecule de amoniac din 2 molecule
de uree) dă şi el această reacţie, prezentând 2 legături peptidice.
NH2
O C
NH
O C
NH2
Biuret

Reacţia biuretului este utilizată şi pentru dozarea proteidelor .

Reactivi
 soluţie de proteide (ser, albuş diluat în apă distilată)
 sulfat de cupru soluţie 5%
 hidroxid de sodiu soluţie 20-30%

Modul de lucru
Se pune într-o eprubetă un cm3 soluţie de cercetat (proteidă), se
adaugă un volum egal cu hidroxid de sodiu 20 - 30% şi apoi 3-5 picături de
sulfat de cupru 5%. Se observă apariţia unei coloraţii albastru violet.

Reacţia ninhidrinei

Principiul metodei:
Aminoacizii, peptidele şi proteidele dau prin tratarea cu o soluţie de
ninhidrină la cald o culoare albastru-violet care se datoreşte grupărilor -
NH2 libere.
108
Reactivi
 soluţie de glicocol 1%
 soluţie de proteidă
 soluţie de ninhidrină 0,1% în alcool etilic

Modul de lucru
Într-o eprubetă se introduc 2 cm3 soluţie de glicocol, iar în alta 2 cm3
soluţie de proteidă (ser, albumină). În ambele eprubete se adaugă 0,5 cm3
soluţie de ninhidrină şi se încălzeşte la fierbere. Se observă apariţia culorii
albastru violet .
Reacţia ninhidrinei este utilizată pentru evidenţierea aminoacizilor
separaţi prin cromatografie pe hârtie.

Reacţia xantoproteică

Principiul metodei:
Reacţia se datoreşte prezenţei în moleculele proteidelor a
aminoacizilor cu nuclee aromatice: fenilalanina, tirozina şi triptofanul.

109
Prin tratarea proteidelor cu acid azotic concentrat la cald se obţine un
precipitat galben datorită nitroderivaţilor formaţi.

Reactivi
soluţie de proteidă
HNO3 conc.
NH4OH diluat

Modul de lucru
se introduce într-o eprubetă 1 cm3 soluţie de proteidă
se adaugă 0,2-0,3 ml HNO3 conc., apare un precipitat alb
se încălzeşte la fierbere, iar precipitatul devine galben
se răceşte eprubeta în curent de apă
se alcalinizează mediul (1ml NH4OH) - se observă apariţia culorii portocalie.

Reacţia Millon

Principiul metodei:
Reacţia se datoreşte aminoacizilor cu structură fenolică - respectiv
tirozinei care, tratată cu azotat mercuric în acid azotic, formează
nitrozoderivaţi - precipitat de culoare roşie - cărămizie

110
Reactivi
soluţie de proteidă
reactiv Millon (se dizolvă o parte mercur metalic în 2 părţi acid azotic conc.,
încălzind amestecul. După dizolvarea mercurului, se adaugă un volum dublu
de apă distilată).

Modul de lucru
într-o eprubetă se introduce 1 cm3 soluţie de proteidă
se adaugă un volum egal de reactiv Millon
se încălzeşte uşor fără a aduce amestecul la fierbere
precipitatul format se strânge, devine spongios şi capătă o culoare roşie -
cărămizie.

Reacţia Sakaguchi

Principiul metodei:
Derivaţii guanidinici (arginina) dau în mediul alcalin, în prezenţa
naftolului şi hipobromitului de sodiu, combinaţii colorate în roşu.
NH NH2
CH2 NH C NH2 OH CH2 NH C O
CH2 CH2
CH2 + CH2
CH NH2 CH NH2
COOH H COOH
arginina naftol produs de condensare

Reactivi
soluţie de proteidă
soluţie de NaOH 10%

111
reactiv Mollisch ( 0,1 g -naftol se dizolvă în 25 cm3 alcool şi se diluează la 100
cm3 cu apă distilată).
soluţie de hipobromit de sodiu (12 picături de brom la 6 cm3 NaOH 30%).

Modul de lucru
într-o eprubetă se introduc 2 cm3 soluţie de proteidă
se alcalinizează cu 2 cm3soluţie de NaOH 10 %
se adaugă 2 cm3 naftol şi 5 -7 picături de hipobromit de sodiu
în prezenţa argininei apare o coloraţie roşie

Reacţia cu acetatul de plumb

Principiul metodei:
Proteidele care conţin tioaminoacizi (cisteina, cistina, metionina etc.)
prin încălzire în mediu puternic alcalin, eliberează sulful sub formă de ioni
de sulf (S2-).
R-SH+ 2NaOH Na2S+ R-OH +H2O
Anionul de sulfură S2- se pune în evidenţă prin tratare cu acetat de
plumb, cu care formează un precipitat negru de sulfură de plumb (PbS),
conform reacţiei:
Na2S + (CH3-COO)2Pb PbS +2CH3COONa

Reactivi
NaOH soluţie 10%
soluţie de proteidă
acetat de plumb soluţie 0,5%

Modul de lucru
se introduc 2cm 3 soluţie de proteină într-o eprubetă
se adaugă acelaşi volum de NaOH 10% şi se fierbe timp de 5 minute
se adaugă 2-3 cm3 acetat de plumb 0,5% şi se încălzeşte
112
se obţine un precipitat de culoare brună neagră

5.1.2. Reacţii de precipitare

Reacţiile de precipitare a proteidelor pot fi grupate în: reversibile şi


ireversibile.
În reacţiile reversibile proteidele îşi păstrează structura moleculară
nativă, modificările fiind numai de natură fizică (trecerea din stare de
solvat în starea de precipitat). La îndepărtarea agentului de precipitare,
proteidele revin la starea iniţială.
Salifierea proteidelor constă în deshidratarea parţială a proteidelor.
Grupările polare din moleculele proteidelor reţin prin legături de
hidrogen, sau prin atracţie electrostatică o cantitate de apă. Sarurile
metalelor uşoare Na+, Mg2+, NH4+, deshidratează parţial proteidele,
datorită tendinţei pronunţate a cationilor de a se hidrata, moleculele de
proteide pierzând apa se aglomerează şi astfel precipită.
În reacţiile ireversibile, are loc denaturarea proteidelor datorită
modificărilor structurale ale moleculelor. Datorită modificărilor structurale
proteidele nu-şi mai recapătă proprietăţile iniţiale nici la îndepărtarea
agentului de precipitare.

5.1.2.1. Reacţii de precipitare reversibile

Reacţia de precipitare cu sulfat de amoniu

Principiul metodei:
Proteidele din soluţiile apoase pot precipita prin adăugare de săruri
(sulfaţi) de sodiu, magneziu şi amoniu. Globulinele, având molecula mare,
precipită la semisaturaţie (soluţie semisaturată), albuminele, având molecula
mai mică precipită la saturaţie (soluţie saturată).

113
Reactivi
soluţie de proteidă(ser diluat )
soluţie saturată de sulfat de amoniu proaspătă.

Modul de lucru
într-o eprubetă se introduc 3cm 3 soluţie de proteidă (ser diluat)
se adaugă un volum egal de soluţie saturată de sulfat de amoniu
se agită conţinutul eprubetei şi se observă apariţia unui precipitat (globulinele)
se filtrează
peste filtratul obţinut se adaugă cristale fine de sulfat de amoniu pînă la saturare
se observă formarea precipitatului de albumine
la adăugare de apă precipitatul se dizolvă
Metoda serveşte pentru separarea albuminelor de globuline.

Precipitarea proteidelor cu alcool

Principiul metodei:
Proteidele pot fi deshidratate cu alcool, datorită deshidratării ele se
aglomerează şi precipită. Prin adăugare de apă precipitatul proteic se
dizolvă.
Metoda serveşte la separarea diferitelor fracţiuni proteice, variind
concentraţia alcoolului, pH-ul şi temperatura. La acţiunea îndelungată a
alcoolului asupra proteidelor, acestea se denaturează.

Reactivi
soluţie de proteidă
alcool etilic 95%

114
Modul de lucru
se introduce într-o eprubetă 1 cm 3 soluţie de proteidă
se adaugă 1 cm3 alcool etilic
se observă formarea unui precipitat
se împarte precipitatul în două eprubete
în prima eprubetă se încearcă dizolvarea precipitatului imediat
se observă că se dizolvă
în eprubeta adoua se încearcă dizolvarea precipitatului după 2-3 ore

5.1.2.2. Reacţii de precipitare ireversibile

Precipitarea cu acizi minerali

Principiul metodei:
Acizii minerali concentraţi precipită ireversibil proteidele în soluţie
apoasă, datorită denaturării lor.

Reactivi
soluţie de proteidă
HCl conc., HNO3 conc.

Modul de lucru
se iau două eprubete în care se introduc câte 1cm 3 soluţie de proteidă
în prima eprubetă se adaugă 1cm 3HCl conc.
în zona de separaţie a celor două lichide se formează un inel alb (precipită
proteidele)
prin agitare , inelul dispare, se dizolvă datorită excesului de HCl
în eprubeta a doua se adaugă 1 cm3 HNO3 conc.
se observă formarea unui inel alb la zona de separare a celor două lichide
115
prin agitare, precipitatul nu se dizolvă (inelul nu dispare )

Precipitarea cu acizi organici

Principiul metodei:
Acizii organici ca: acidul tricloracetic, acidul sulfosalicilic, picric şi
citric (reactiv Essbach), precipită proteidele. Excesul de acid, nu dizolvă
precipitatul. Precipitarea cu acid tricloracetic se foloseşte pentru
deproteinizarea unor lichide biologice. Precipitarea cu acid sulfosalicilic este
foarte sensibilă şi serveşte pentru identificarea proteidelor.
COOH
OH
H2C COOH O2N
OH CH2 COOH NO2
CCl3COOH HO CH
C COOH
COOH
HO CH COOH
H2 C COOH
SO 3 H NO2

ac.tricloracetic ac.sulfosalicilic ac.citric ac.picric

Reactivi
soluţie de proteidă
soluţie de acid tricloradcetic 5 %
soluţie de acid sulfosalicilic 20%
reactiv Essbach ( 10 g acid picric şi 20 g acid citric se solubilizează în apă distilată
şi se aduce la 1 dm3 soluţie)

Modul de lucru
se iau trei eprubete în care se introduc câte 1 cm3 soluţie de proteidă.
în prima eprubetă se adaugă 1 cm3 soluţie de acid tricloracetic. Se observă
formarea unui precipitat alb abundent.

116
în eprubeta a doua se adaugă câteva picături de acid sulfosalicilic 20 %. Se
observă formarea unui nouraş de precipitat
în eprubeta a treia se adaugă câteva picături de reactiv Essbach. Se observă
formarea unui precipitat galben.

Precipitarea cu săruri ale metalelor grele

Principiul metodei:
Proteidele formează cu ionii metalelor grele ( Cu2+, Pb2+, Mg2+, Ag+)
precipitate greu solubile.

Reactivi
soluţie de proteidă
soluţie de Cu SO43%
soluţie de Pb (CH3-COO)2 0,5%

Modul de lucru
se iau două eprubete în care se introduc câte 1 cm3 soluţie de proteidă
se adaugă în prima eprubetă 0,5cm3 soluţie de Cu SO4 3%
în eprubeta a doua se adaugă 0,5 cm3 soluţie de acetat de plumb (CH3 -COO)2 Pb
0,5%
se observă apariţia unor precipitate abundente

Precipitarea proteidelor prin încălzire

Principiul metodei:

117
Proteidele, sub acţiunea căldurii, în mediu acid şi în prezenţa unor
electroliţi, precipită datorită fenomenului de denaturare. Precipitarea este
maximă în apropierea punctului izoelectric. Acţiunea denaturantă a
căldurii poate fi anulată în totalitate, în mediu puternic acid sau bazic.
În asemenea medii, stabilitatea proteidelor este maximă, deoarece pH-
ul este foarte îndepărtat de punctul izoelectric.

Reactivi
soluţie de proteidă
soluţie de CH3COOH 0,1%
soluţie de CH3COOH 1 %
soluţie de NaOH 1%

Modul de lucru
se iau 4 eprubete care se numerotează de la 1la 4 şi se introduce în fiecare 1cm3
soluţie de proteidă
eprubeta 1 se încălzeşte la fierbere şi se observă că majoritatea proteidelor
precipită
în eprubeta 2 se adaugă 1-2 picăturide acid acetic 0,1% şi se încălzeşte la fierbere
precipitatul format este în cantitate mai mare faţă de eprubeta 1, ceea ce denotă
că proteida se află într-un mediu cu un pH foarte apropiat de punctul
izoelectric
în eprubeta 3 se adaugă 1-2 picături de acid acetic 1 % şi se încălzeşte.
nu se formează precipitat din cauză că pH-ul este foarte îndepărtat de punctul
izoelectric
în eprubeta 4 se adaugă 1-2 picături de soluţie de NaOH 1 % şi se încălzeşte.
nu se formează precipitat din cauza mediului puternic bazic (îndepărtat de punctul
izoelectric)

5.1.2. Determinarea proteinelor din lapte prin metoda Sörensen

118
Principiul metodei:
Se neutralizează aciditatea liberă a laptelui prin titrare cu NaOH
soluţie 0,143 N în prezenţă de fenolftaleină.
Se adaugă formaldehidă care blochează grupările aminice (-NH2) ale
aminoacizilor constituienţi ai proteinei, rămânând libere grupările acide
(-COOH) care se titrează cu NaOH 0,143 n. Culoarea obţinută la titrare se
compară cu cea obţinută în fiola în care la 50 cm3 lapte s-a adăugat pe lângă
oxalat de potasiu şi 1 cm 3 soluţie de sulfat de cobalt.
R CH COOH H R CH COOH
+ OC
NH2 H N CH2
H2O
protida baza Schiff

Reactivi
 soluţie hidroxid de sodiu - NaOH 0,143 n lipsită de CO2 (într-un dm 3 de
apă fiartă şi răcită se dizolvă 5,75 g NaOH p.a. Titrul soluţiei se
stabileşte cu ajutorul unei soluţii de acid oxalic 0,143 n = 9 g de acid
oxalic la dm3.)
 soluţia alcoolică de fenolftaleină 2%
 soluţie de sulfat de cobalt – CoSO4 5%
 soluţie de oxalat de potasiu neutru – K2C2O4 28%
 soluţie de formaldehidă 37% ( cantitatea de formaldehidă necesară
pentru determinările zilnice se neutralizează cu o soluţie de hidroxid de
sodiu 0,1 n).

Modul de lucru

119
În două fiole conice se introduc cu o pipetă câte 50cm3 lapte şi câte 2cm3
soluţie de oxalat de potasiu şi apoi se agită. Intr-una din fiole ce constituie proba
martor, se introduce 1 cm3 soluţie de sulfat de cobalt şi apoi se agită.
Apare o coloraţie roz. În cea de a doua fiolă conică se introduce 1 cm3
soluţie de fenolftaleină şi se adaugă picătură cu picătură dintr-o biuretă
hidroxid de sodiu, pentru a neutraliza aciditatea liberă, până se obţine o
coloraţie roz de aceeaşi intensitate ca a probei martor. În proba de analizat se
adaugă 10 cm3 formaldehidă şi se agită. Se constată că coloraţia roz dispare.
Se lasă 30 secunde în repaos, se agită şi se titrează din nou până la coloraţia
roz de aceiaşi intensitate cu proba martor.

Calcul:
Titrul protidic = V x F / 2 unde:
V= volumul de hidroxid de sodiu 0,143 n utilizat la cea de a doua
titrare exprimat în cm3.

5.1.3. Determinarea punctului izoelectric al proteinelor

La o anumită valoare a pH-ului, moleculele de proteină pot disocia


astfel încât suma sarcinilor pozitive este egală cu suma sarcinilor negative.
Această valoare de pH poartă numele de punct izoelectric şi se notează
cu pHi. Disocierea aminoacizilor în anioni sau cationi are loc conform
reacţiilor:

H2 N CH COOH H2 N CH COO- + H +
R R
aminoacid anion

+
H2N CH COOH + H2O H3N CH COO- + HO -
R R
aminoacid cation
120
La valori de pH mai mic decât pHi , proteinele sunt cationi, iar la
valori de pH mai mare decât pHi proteinele se comportă ca anioni. Punctul
izoelectric este o constantă fizico-chimică ce caracterizează fiecare tip de
proteină.
La punctul izoelectric unele proprietăţi fizice ale proteinelor se
modifică. Astfel solubilitatea proteinelor este minimă, stabilitatea este de
asemenea minimă (precipită uşor), nu migrează în câmp electric deoarece
sarcinile de semn contrar se compensează reciproc, atracţia celor doi poli
devenind egală.
La punctul izoelectric grupările încărcate pozitiv şi grupările încărcate
negativ din moleculele proteidei se compensează în aşa fel încât încărcarea
electrică a moleculei devine egală cu zero şi molecula nu mai migrează în
câmpul electric.

Determinarea punctului izoelectric al cazeinei

Principiul metodei:
Soluţia de cazeină este stabilă doar într-un domeniu bine determinat
de pH, când particulele coloidale au o anumită sarcină electrică. Pe măsură
ce pH-ul se apropie de punctul izoelectric, soluţia de cazeină devine din ce în
ce mai puţin stabil şi coagulează. Coagularea maximă apare la punctul
izoelectric.

Reactivi
 apă distilată
 soluţie acid acetic – CH3COOH 0,01N
 soluţie acid acetic – CH3COOH 0,1N
 soluţie cazeină în acetat de sodiu – CH3COONa 0,1N

121
Modul de lucru
Se introduc cu ajutorul unei microbiurete sau a unei pipete, apă
distilată şi soluţie de acid acetic 0,01n, 0,1n şi 1n într-o serie de 9 eprubete,
în cantităţile specificate în tabelul 10, în care este indicat şi pH-ul
corespunzător soluţiei. În fiecare eprubetă se mai adaugă câte 1 cm3 soluţie
de cazeină în acetat de sodiu 0,1n.
Soluţiile se amestecă şi după 5 minute se observă o tulbureală în una
dintre eprubete care se notează cu +, iar în cea care s-a produs coagularea
se notează cu x. Coagularea cea mai intensă apare la punctul izoelectric. Se
determină din tabel la ce pH corespunde punctul izoelectric al cazeinei.

Tabelul 5.1. Determinarea punctului izoelectric al cazeinei


Nr. eprubetă
Reactivi [cm3]
1 2 3 4 5 6 7 8 9
apă distilată 8,38 7,75 8,75 8,50 8,0 7,0 5,0 1,0 -
acid acetic 0,01N 0,62 1,25 - - - - - - -
acid acetic 0,1N - - 0,25 0,5 1,0 2,0 4,0 8,0 -
cazeină în 1 1 1 1 1 1 1 1 1
acetat de Na
pH 5,9 5,6 5,3 5,0 4,6 4,4 4,1 3,8 3,5
grad de floculare - - + +++ xxx xx ++ + -

Observaţii:

122
123
Observaţii:

124
Observaţii:

5.2. GLUCIDE
125
Glucidele sunt componente ternare ale materiei vii care conţin:
carbon, hidrogen şi oxigen. Proprietăţile lor chimice sunt determinate de
prezenţa în moleculă a unei grupări carbonilice şi a mai multor grupări
funcţionale hidroxilice (OH).
Glucidele se clasifică în două grupe principale: glucide simple şi
glucide compuse.
Glucide : Glucide simple (oze) : -monoglucide
Glucide compuse (ozide) : --oligoglucide
-- poliglucide
Monoglucidele se deosebesc între ele după numărul de atomi de
carbon ce intră în molecula lor şi după funcţiunea carbonil, pe care o conţin.
Glucidele compuse sunt constituite din glucide simple (monoglucide),
Oligoglucidele sunt compuse din 2-6 monoglucide iar poliglucidele
dintr-un număr mare de monoglucide.

5.2.1. Reacţii specifice pentru monoglucide

Monoglucidele dau următoarele tipuri de reacţii :


1) Reacţii de solubilitate 2) Reacţii de culoare
3) Reacţii de oxido-reducere 4) Reacţii de condensare

5.2.1.1. Reacţii de solubilitate

Principiul metodei:
Monoglucidele sunt solubile în apă şi sunt insolubile în solvenţi
organici.

Reactivi

126
 glucoză, fructoză
 alcool etilic – C2H5-OH, soluţie concentrată
 apă distilată

Modul de lucru
Se introduc în două eprubete 0,2 g glucoză şi 0,2 g fructoză şi apoi se
adaugă în fiecare eprubetă câte 2 cm 3 apă distilată. Se agită şi se observă
solubilizarea lor.
Se iau alte 2 eprubete şi se introduce în fiecare câte 0,2 g glucoză şi
0,2 g fructoză şi câte 2 cm3 alcool etilic, se agită şi se constată că atât
glucoza cât şi fructoza rămân nesolubilizate.

5.2.1.2. Reacţii de culoare

Reacţia Schiff.

Principiul metodei:
Monoglucidele datorită prezenţei în molecula lor a grupărilor
aldehidice sau cetonice mascate (semiacetalizate) dau foarte încet reacţia
Schiff, spre deosebire de aldehidele libere care recolorează imediat fucsina
decolorată.

Reactivi
glucoză 2%
aldehidă formică 5%
acid fucsin sulfonic (reactivul Schiff)

Modul de lucru

127
Se introduce într-o eprubetă 1 cm3soluţie de glucoză 2%, iar într-o altă
eprubetă 1 cm3 soluţie de formaldehidă. Se adaugă în fiecare eprubetă 2-3
picături din reactivul Schiff (acidul fucsin sulfonic). Se observă că în
eprubeta cu soluţia de glucoză, culoarea roşie apare mult mai încet decât în
eprubeta care conţine aldehidă formică.

Reactia Selivanoff

Principiul metodei:
Reacţia Selivanoff permite o diferenţiere între aldoze şi cetoze.
Hexozele sub acţiunea acidului clorhidric, se transformă în oximetilfurfurol.
Viteza de trecere a cetozelor în oximetil furfurol este de 20 de ori mai mare
decât a aldozelor. Oximetilfurfurolul format reacţionează cu rezorcina, dând
o coloraţie roşie. Această reacţie permite identificarea cetozelor atât libere
cât şi combinate. Coloraţia este datorată structurii chinoidice a produsului de
oxidare obţinut în faza finală.
HOHC CHOH H CH
H C C OH 3 H 2O C C C O
O O
HOH2C CH2OH HOH2C H

fructozã hidroximetilfurfurol

OH OH

HC CH HC CH
+ - -2 H2O
C C H OH C C HC O
O O
HOH2C C O
H OH HOH2C
H

OH OH

Reactivi

128
fructoză soluţie
soluţie glucoză 2%
soluţie zaharoză 2%
reactiv Selivanoff (0,5 g rezorcină în 100 cm3 HCl 20 %)

Modul de lucru
Se iau trei eprubete, în care se introduc câte 1 cm3 de soluţie de
fructoză, glucoză şi zaharoză şi apoi câte 2cm3 de reactiv Selivanoff proaspăt
preparat. Se introduc eprubetele într-o baie de apă fierbinte timp de 2
minute. În eprubeta în care am introdus fructoza şi zaharoza,se formează o
coloraţie roşie.

Reacţia Molisch

Principiul metodei:
Monoglucidele în mediul de acid sulfuric concentrat la cald se
deshidratează şi se transformă în furfurol, în cazul pentozelor şi în oximetil
furfurol în cazul hexozelor. Furfurolul şi oximetil furfurolul dau cu -
naftolul, o coloraţie violetă caracteristică. Această reacţie o dau şi oligo şi
poliglucidele, deoarece sub acţiunea acizilor minerali are loc o hidroliză
parţială până la monoglucide.

Reactivi
soluţie de glucoză 2%
acid sulfuric concentrat
reactiv Molisch (soluţie alcoolică de -naftol 0,5%)

Modul de lucru
129
Se introduce într-o eprubetă 1 cm3 soluţie de glucoză şi 2-3 picături de
soluţie alcoolică de -naftol (reactiv Molisch), se adaugă apoi 1cm3 H2SO4 conc.
în aşa fel încât să se prelingă pe marginea eprubetei. Se formează două straturi
de lichid. La suprafaţa lor de contact, apare un inel violet.

5.2.1.3. Reacţii de oxidoreducere

Datorită prezenţei în molecula monoglucidelor a grupărilor


funcţionale carbonil ele prezintă un caracter reducător. Ele reduc în mediu
alcalin şi la cald, sărurile metalelor grele Ag, Cu, Bi etc. Caracterul
reducător este mai pronunţat la monoglucide şi scade cu creşterea greutăţii
moleculare a glucidelor.

Reacţia Trommer

Principiul metodei:
Hidroxidul de cupru format sub acţiunea NaOH asupra CuSO4, este
redus de către glucidele reducătoare mai întâi la hidroxid cupros şi apoi la
oxid cupros roşu.
OH
HC O C O
+ 2Cu(OH) + 2 CuOH + H2O
(CHOH)4 2 (CHOH)4

CH2OH CH2OH

2CuOH Cu2O + H2O

Reactivi
soluţie de glucoză 2%
soluţie de sulfat de cupru diluat 1 %
soluţie hidroxid de sodiu 10%

130
Modul de lucru
Se introduc într-o eprubetă soluţie de glucoză cu câteva picături de
CuSO4 diluat şi NaOH iar apoi se fierbe. Se observă formarea unui precipitat
galben care apoi trece în roşu.

Reacţia Fehling

Principiul metodei:
Glucidele reducătoare reduc complexul cuprotartric format prin
amestecarea soluţiilor Fehling I şi II , până la oxid cupros roşu, iar gruparea
aldehidică se oxidează la carboxil.
Reacţiile caracteristice glucidelor reducătoare (ex. glucoza -
aldohexoză) sunt prezentate în cele ce urmează:

CuSO4 + 2NaOH = Cu(OH)2 + Na2SO4

HO CH COONa O CH COONa

Cu(OH)2 + Cu +2H2O

HO CH COOK O CH COOK
sare Seignette complex cupro tartric

O CH COONa HO CH COONa COOH


HC O
+
Cu +2H2O 2 + (CHOH)4
(CHOH)4
O CH COOK HO CH COOK
CH2OH Cu2O CH2OH

hexozã complex cupro tartric sare Seignette acid aldonic

Reactivi
131
soluţie de glucoză 2%
soluţie Fehling I( 3,5 g CuSO4 se dizolvă în 50 cm3 apă distilată)
soluţie Fehling II (17,3 g sare Seignette şi 6 g hidroxid de sodiu se dizolvă în 50
cm3 apă distilată).

Modul de lucru
Se introduce într-o eprubetă 1 cm3 soluţie diluată de glucoză şi se
adaugă apoi 1 cm3 reactiv Fehling I şi 1 cm3 reactiv Fehling II. Se
încălzeşte eprubeta la flacăra unui bec timp de 3 min, se observă formarea
unui precipitat roşu de oxid cupros.

Reacţia Benedict

Principiul metodei:
Metoda se bazează pe reducerea cuprului din soluţia Benedict (sulfat
cupric) de către glucoză la oxid cupros – care colorează soluţia în roşu.
Culoarea obţinută poate varia de la verde la roşu în funcţie de cantitatea de
oxid cupros formată.
2 CuSO4 x 5 H2O + C6H12O6 → C6H12O7 + Cu2O + 2 H2SO4 + 8 H2O
(Cu2+) (Cu1+)

Reactivi
soluţie de cercetat
reactiv Benedict.
Se solubilizează 173g citrat de sodiu anhidru şi 90 g carbonat de sodiu anhidru în
600 cm3 apă distilată la cald. Se filtrează, se completează cu apă distilată până
la 850 cm3.

132
Se solubilizează 17,3 g sulfat de cupru (CuSO4 x H2O) în 100 cm3 apă distilată şi
se completează la 150 cm3.
Soluţia “a” se toarnă sub agitare în soluţia “b”.

Modul de lucru
Se introduce într-o eprubetă 1,5 cm3 reactiv Benedict şi se adaugă 3
picături de soluţie de cercetat, apoi se lasă timp de 2 minute pe baia de apă
la fierbere şi apoi se răceşte. Se poate obţine o coloraţie verde sau un
precipitat de culoare verde, portocaliu sau roşu. Culoarea depinde de
cantitatea de glucide conţinută în proba de cercetat.
După tabelul de mai jos, vom putea aprecia concentraţia aproximativă
în glucide, în funcţie de culoarea obţinută.

Tabelul 5.2. Aprecierea concentraţiei glucidelor după culoarea


obţinută în urma reacţiei Benedict
Concentraţia aproximativ
Culoarea Notaţia
%
Neschimbat - 0
Verde fără precipitat  0,1-0,3
Verde cu precipitat + 0,5
Verde oliv ++ 1,0
Portocaliu +++ 1,5
Roşu deschis ++++ 2,0 şi peste

Reducerea sărurilor de argint (Reacţia Tollens)

Principiul metodei:
133
Azotatul de argint prin tratare cu hidroxid de amoniu diluat precipită
oxidul de argint, care se dizolvă în exces de reactiv cu formarea hidroxidului
diamoniacoargentic. Acesta este redus de către glucidele reducătoare, până la
argint metalic, care se depune pe pereţii eprubetei sub formă de oglindă.

2 AgNO3 +2 NH4OH = Ag2O + 2 NH4NO3+H2O

Ag2O+ 4 NH4OH = 2 Ag(NH3)2OH + 3H2O

HC O HO C O

(CHOH)4+2Ag(NH3)2OH = (CHOH)4+ 2Ag + 4NH3 + H2O

CH2OH CH2OH

glucoză acid gluconic

Reactivi
soluţie de glucoză 2%
soluţie de AgNO3 1%
soluţie diluată NH4OH

Modul de lucru
Se introduce într-o eprubetă 1 cm3 soluţie AgNO3 şi se tratează cu
NH4OH diluat, până la dizolvarea precipitatului format iniţial (se va evita
adăugarea unui exces de NH4OH). Soluţia obţinută se tratează cu un volum
egal de soluţie de glucoză. Se încălzeşte conţinutul eprubetei uşor şi se
constată formarea unei oglinzi pe pereţii eprubetei.
5.2.1.4. Reacţii de condensare

Reacţia osazonelor

134
Principiul metodei:
Monoglucidele datorită prezenţei grupării funcţionale carbonilice în
moleculă dau reacţii de condensare cu fenilhidrazina formând la rece
fenilhidrazona, care în exces de fenil hidrazină la cald trec în osazone.
Osazonele sunt substanţe cristaline insolubile în apă. Osazona fiecărei
monoglucide prezintă forme cristaline caracteristice. Glucoza şi fructoza dau
aceeaşi osazonă care privită la microscop apare sub formă de spice colorate
în galben-verzui iar lactosazona sub formă de cristale galbene dispuse
radial.

Reactivi
soluţie de glucoză 5 %
soluţie de lactoză 2%
clorhidrat de fenilhidrazină (cristalizat pur)
acetat de sodiu cristalizat

Modul de lucru
Se amestecă două părţi clorhidrat de fenilhidrazină cu 3 părţi azotat de
sodiu şi se freacă bine într-un mojar. Se iau 4 cm3 din soluţia de glucoză şi se
adaugă 1 g din amestecul pregătit mai sus. Se încălzeşte pe o baie de apă la
fierbere timp de 5-10 minute, agitând continuu. Se repetă experienţa pentru
soluţia de lactoză. Când încep să apară cristalele galbene de osazonă se lasă
eprubeta să se răcească pe stativ, se vor forma cristale mari care se
examinează pe o lamă de microscop.

135
Fig.5.1. Cristale de osazonă

În figura 5.1. se prezintă câteva structuri de cristale care se pot forma


prin reacţia de obţinerea a osazonelor. Astel, la obţinerea unor cristale sub
formă de spice colorate galben-verzui avem osdezone formate din glucoză şi
fructoză, iar lactosazona apare sub formă de cristale dispuse radial de
culoare galbenă.

5.2.2. Reacţii specifice pentru diglucide

Diglucidele se formează din 2 molecule de monoglucide care se unesc


între ele prin eliminarea unei molecule de apă.
Proprietăţile diglucidelor depind de modul cum a avut loc eliminarea
moleculei de apă, fiind două tipuri de diglucide.
a)Tipul nereducător numit şi tip trehalozic, în care eliminarea
moleculei de apă se realizează între cele două grupări hidroxilice glicozidice
a moleculelor de monoglucide. Acest tip de diglucide nereducătoare nu dau
reacţiile de reducere caracteristice grupării carbonilice, numai după
scindarea diglucidei în monoglucidele componente,ceea ce se realizează prin
hidroliză acidă sau enzimatică. Zaharoza face parte din acest tip de
diglucide.
b)Tipul reducător denumit şi tip maltozic, în care eliminarea moleculei
de apă se realizează între hidroxidul glicozidic al unei molecule de
monoglucidă cu oricare dintre hidroxilii alcoolici ai celeilalte molecule de

136
monoglucidă. Diglucida formată este reducătoare întrucât are una din
grupările glicozidice libere, care-şi păstrează caracterul reducător. Din acest
tip face parte maltoza.

5.2.2.1. Reacţii a diglucidelor nereducătoare

Zaharoza este o diglucidă formată dintr-o moleculă de -D-


glucopiranoză şi una de -D-fructofuranoză legate 1-2 diglicozidic prin
eliminarea unei molecule de apă. La formarea acestei legături participând
grupările OH glicozidice de la ambele molecule, zaharoza nu are proprietăţi
reducătoare.
Reacţia de formare a zaharozei din -D-glucopiranoză şi -D-fructo-
furanoză este prezentată în cele ce urmează:

HO CH 2 HO H C
O 2
O
H O H HO CH 2 OH H O H CH 2 OH
H + H
OH H1 2 OH
H - H2O OH H1 O 2 OH H
HO OH HO H2C H HO H
HO H2C
H OH H OH H OH H OH
-D-glucopiranoza -D-fructofuranoza 2-[ D-glucopiranozil D-fructofuranoza
(zaharoza)

Reactivi
soluţie de zaharoză 2%
soluţie Fehling I şi II

Modul de lucru
Se introduce într-o eprubetă 1 cm3 soluţie de zaharoză şi se
adaugă câte 0,5 cm3 soluţie Fehling I şi II. Se încălzeşte eprubeta până
la fierbere. Se constată că nu apare nici un precipitat ceea ce denotă
lipsa grupărilor funcţionale cu proprietăţi reducătoare.

137
5.2.2.2. Reacţii a diglucidelor reducătoare

Maltoza este diglucidă formată din 2 molecule de D-glucopiranoză


legate 1-4 glicozidic prin eliminarea unei molecule de apă. În cea de a
doua moleculă de glucoză este prezent hidroxilul glicozidic cu proprietăţi
reducătoare, ceea ce imprimă întregii molecule de maltoză caracterul
reducător. Reacţia de formare a maltozei este următoarea:

HO CH2 HO CH2 HO CH2 HO CH2


H O H H O H H O H H O H
H + H H H
OH H OH H - H2O OH H OH H
O
HO OH HO OH HO OH
H OH H OH H OH H OH

-D-glucopiranoza -D-glucopiranoza 4-[-D-glucopiranozil]--D-glucopiranoza


(maltoza)

Reactivi
soluţie de maltoză 2 %.
Reactiv Fehling I şi II

Modul de lucru
Se introduce într-o eprubetă 1 cm3 soluţie de maltoză şi câte 0,5 cm3
soluţie Fehling I şi II. Se încălzeşte la fierbere şi se constată formarea unui
precipitat roşu de oxid cupros.

5.2.2.3.Hidroliza zaharozei

Principiul metodei:
Zaharoza (-D-Glucopiranozil-1→2--D-fructofunaroza) prin fierbere
cu acizi minerali, hidrolizează şi formează o moleculă de glucoză

138
(-D-Glucopiranoză) şi una de fructoză (-D-fructofuranoză), prezenţa
cărora imprimă soluţiei un caracter reducător.

HO H2C HO CH 2
O O
H O H CH 2 OH H O H HO CH 2 OH
H O H +
OH H OH H - H2O OH H OH H
HO HO H2C H HO OH HO H2C H
H OH H OH H OH H OH
2-[ D-glucopiranozil D-fructofuranoza -D-glucopiranoza -D-fructofuranoza
(zaharoza)

Reactivi
soluţie de zaharoză 2%
acid clorhidric diluat
Reactiv Fehling I şi II
soluţie de NaOH

Modul de lucru
Se introduce într-o eprubetă 1 cm3 soluţie de zaharoză şi se tratează cu
0,5 HCl diluat. Se încălzeşte conţinutul eprubetei până la fierbere şi se
continuă fierberea încă 5 minute. După răcire se alcalinizează soluţia din
eprubetă cu o soluţie de NaOH şi se adaugă 0,5 cm3 soluţie Fehling I şi II.
Prin fierbere se formează un precipitat roşu de oxid cupros.

5.2.2.4. Invertirea zaharozei

Zaharoza este dextrogiră, rotaţia specifică a zaharozei este de + 66,50


prin tratare cu acizi tari rezultă un amestec echimolecular de glucoză şi
fructoză, levogir. Aceasta datorită faptului că glucoza este dextrogiră, rotind
planul luminii polarizate spre dreapta cu un unghi de + 520 iar fructoza este
levogiră, rotind planul luminii polarizate spre stânga cu un unghi de - 920.

139
Reactivi
Soluţie de zaharoză (20g zaharoză se solubilizează în 100 cm3 apă, se filtrează şi
se adaugă un mic cristal de timol sau camfor, ca agent de conservare)
Soluţie de HCl 1n (se măsoară exact cu cilindrul gradat 82 cm3HCl conc ( = 1,19
care se aduce cu apă distilată la volumul de 1 dm3).

Modul de lucru
Se introduc cu o pipetă 25 ml de soluţie de zaharoză într-o fiolă conică
de 50 ml şi se aşează în termostat la 25 0C. Într-o altă fiolă conică se introduc
circa 30 ml de HCl 1n. Înainte de utilizare fiolele conice trebuiesc bine
spălate şi uscate. După uniformizarea temperaturii, se scot cu pipeta 25 cm3
de acid şi se introduc în fiola cu soluţie de zaharoză. Se agită bine conţinutul
fiolei şi se introduce în tubul polarimetric a cărui temperatură trebuie să fie
de 250C. Se vor efectua 5-6 citiri, se calculează media citirilor şi se notează
timpul. Unghiul de rotaţie citit “0” va fi unghiul de rotaţie iniţial.
Măsurătorile ulterioare de efectuează din 15 minute în 15 minute şi apoi la
intervale mai lungi. Soluţia se păstrează în termostat şi după 48 de ore se
măsoară rotaţia finală .
Se va ţine seama ca unghiul de rotaţie să fie luat cu semnul corect,la
dreapta cu plus, la stânga cu minus. Rezultatele măsurătorilor se vor trece în
tabelul de mai jos:

T (minute) t1 t2 t3 t4 t5 t…
Unghiul de
rotaţie 

5.2.3.Reacţii specifice poliglucidelor

140
Poliglucidele sunt formate din lanţuri de molecule de monoglucide.
Cele mai importante poliglucide sunt: amidonul,celuloza şi glicogenul. Toate
trei sunt formate din molecule de glucoză unite între ele prin legături de tip
glicozidic; se deosebesc între ele atât prin modul cum se leagă între ele
monoglucidele, cât şi prin mărimea şi forma catenelor. Poliglucidele nu au
un caracter reducător întrucât toate grupările hidroxilice glicozidice, cu
excepţia celor terminale, au fost blocate. Amidonul şi glicogenul sunt
formate din lanţuri de -glucoză legate între ele glucozidic, unitatea de bază
fiind diglucida maltoza.
Amidonul este format din două componente, amiloza şi amilopectina.
Amiloza este formată dintr-un lanţ lung de molecule de -D- glucoză legate
1-4 glicozidic, unitatea structurală fiind diglucida maltoza.
Amilopectina este formată, de asemenea, din molecule de D glucoză
care sunt legate 1-4  glicozidic şi 1-6  glicozidic la catenele laterale.
Amiloza dă culoare albastră cu iodul. Amilopectina dă o coloraţie roşie
violacee, iar glicogenul o coloraţie roşie brună.
Glicogenul are o structură asemănătoare cu cea a amilopectinei
însă mult mai ramificată.

5.2.3.1. Reacţia amidonului cu iodul

Principiul metodei:
Soluţia coloidală de amidon se colorează în albastru cu iodul, datorită
formării unui produs de absorbţie.

CH2OH CH2OH CH2OH CH2OH


O O O O

O O O

n
amiloza

141
Reactivi
Soluţie de amidon 1%( 10g amidon solubil se agită într-un pahar Berzelius cu apă
distilată rece şi apoi se toarnă într-un dm3 de apă distilată la fierbere, se
adaugă soluţiei 10 mg HgI2 pentru conservare.
Soluţie de glicogen 0,3 %.
Soluţie de iod în iodură de potasiu (2g iod şi 5g KI se dizolvă în 100 cm3 apă
distilată).

Modul de lucru
Se introduce într-o eprubetă 1 cm3 soluţie de amidon şi se
adaugă 2-3 picături din soluţia de iod în soluţie de iodură de potasiu.
Se observă apariţia unei coloraţii albastre. Se încălzeşte şi se constată
dispariţia culorii, care reapare prin răcire. În cazul reacţiei cu
glicogenul se obţine o culoare roşie -brună.

5.2.3.2 . Hidroliza amidonului

Principiul metodei:
Prin fierberea amidonului cu acizi minerai tari acesta hidrolizează
treptat, rezultând amilodextrine, apoi eritrodextrine, acrodextrine,
maltodextrine, maltoză şi în final glucoză. Aceşti produşi intermediari dau
coloraţii diferite cu soluţia de iod în iodură de potasiu.

Reactivi
Soluţie de amidon 2%(20 g de amidon solubil se agită într-un pahar Berzelius cu
apă distilată rece şi apoi se toarnă într-un dm3 de apă distilată în fierbere şi se
adaugă soluţiei 10 mg HgI2 pentru conservare).
HCl 10%
142
I2+ KI

Modul de lucru
Se introduc într-o eprubetă 5 cm3 soluţie de amidon 2% şi se adaugă
0,5 cm3 soluţie de HCl. Se încălzeşte la fierbere pentru efectuarea
hidrolizei.În decursul hidrolizei se scoate din timp în timp cu ajutorul unei
pipete câte 0,5 cm3 din soluţia de amidon care se introduc în alte eprubete.
Se adaugă în fiecare eprubetă o picătură din soluţia de iod. Se constată că la
începutul fierberii soluţia se colorează în albastru,apoi violet şi roşu. După
10 minute de fierbere soluţia nu mai dă coloraţie cu iod.
În continuare, dăm mai jos sub formă de tabel, modul de urmărire a
procesului de hidroliză a amidonului :

Tabel 5.3. Produşii de hiroliză ai amidonului


Timpul (min.) Produsul de hidroliză Culoarea obţinută
0 minute amidon albastru
2 minute amilodextrine violetă
8 minute eritrodextrine roşie
15 minute acrodextrine fără culoare
20 minute maltodextrine fără culoare
25 minute maltoză fără culoare
30 minute glucoză fără culoare

5.2.3.3. Reacţia glicogenului cu iodul

Principiul metodei:
Soluţia coloidală de glicogen în reacţie cu iodul prezintă o
coloraţie roşie-brună sau albastră, datorită formării unui produs de
absorbţie. În stuctura glicogenului se evidenţiază prezenţa resturilor de -

143
D-glucopiranoză, cu legături intermoleculare de tip 1-4 şi 1-6 conform
fragmentului de moleculă prezentat mai jos:

HO CH 2 HO CH 2
H O H H O H
H 1 4 H 1
OH H OH H
HO 3 O 3

H OH H OH
O

HO CH 2 HO CH 2 HO CH 2 CH 2 HO CH 2
H O H H O H H O H H O H H O H
H 1 4 H 1 H 1 4 H 1 4 H 1
OH H OH H OH H OH H OH H
HO 3 O 3 O 3 O 3 O 3
OH
H OH H OH H OH H OH H OH

Glicogen

Reactivi
 glicogen soluţie 0,3 %
 iod (I) în iodură de potasiu (KI) soluţie

Modul de lucru
Se introduce într-o eprubetă 1 ml soluţie de glicogen, se adaugă 2-3
picături din soluţia de iod în soluţie de iodură de potasiu, apoi se observă
apariţia unei coloraţii roşii-brune sau albastre. Se încălzeşte şi se constată
dispariţia culorii, care reapare după răcire.

5.2.3.4. Reacţia de hidroliză a celulozei

Celuloza este o poliglucidă, care conţine un număr mare de grupări


hidroxilice care reacţionează cu diverşi acizi formând esteri sau cu alcooli
când formează eteri. Grupările hidroxilice din molecula de celuloză participă
la reacţiile specifice cu formare de esteri, eteri, alcool. Celuloza tratată cu
144
amestec de acid acetic şi anhidridă acetică, poate forma mono-, di- sau tri-
acetatul de celuloză. Prin tratare cu soluţii concentrate de hidroxid de sodiu,
celuloza formează alcoliceluloza (alcoxid).
Formula chimică brută a celulozei este (C6H10O5)n, unde “n” reprezintă
numărul resturilor de -D-Glucopiranoză şi valoarea lui “n” poate fi cuprinsă
între 700-3000 de resturi de monoglucide (-D-Glucopiranozil).

Principiul metodei:
În urma reacţiei de hidroliză a celulozei se obţin glucide simple, de
tipul tri-, tetra- sau hexa glucide (e.g.: glucoză, celobioză). Prin reacţia
Fehling se poate evidenţia formarea oligoglucidelor şi a glucozei.

HO CH 2 HO CH 2
H O H O
O H 1 H
OH H O 4
H
1
3
OH
H 3
H
H OH H OH n

-D-glucopiranozil-1 4- -D-glucopiranoza
Celuloza

Reactivi
- hârtie de filtru fin mărunţită sau vată
- acid sulfuric soluţie 70%
- hidroxid de sodiu 30 – 40%.

Modul de lucru

145
Se introduce într-o eprubetă 1 ml soluţie de acid sulfuric 70% peste
care se inrtoduce hârtie de filtru fin mărunţită (care conţine celuloză) până se
obţine o soluţie vâscoasă. Se introduce eprubeta într-o baie de apă pentru
încălzirea soluţiei din eprubetă până la apariţia unei coloraţii slab brune. Se
răceşte soluţia obţinută şi se adaugă peste un volum de apă de 5 ori mai
mare.
Din soluţia care se obţine se iau 0,5 ml şi se alcalinizează cu 0,5 ml
soluţie hidroxid de sodiu. În final se evidenţiază prezenţa glucozei cu reacţia
Fehling.

Observaţii:

146
Observaţii:

147
Observaţii:

148
5.3. LIPIDE

Lipidele sunt esteri ai alcoolilor cu acizii graşi. Aceste substanţe sunt


insolubile în mediu apos şi solubile în solvenţi organici nepolari. Lipidele se
găsesc în membranele celulelor, în compoziţia organilelor celulare, dar şi a
citoplasmei.
Lipidele se clasifică în: - lipide simple (gliceride)
- lipide complexe

5.3.1. Reacţii specifice pentru gliceride (acilgliceroli)

Reacţia de saponificare

Principiul metodei:
Prin hidroliza cu alcalii al gliceridelor se obţine glicerol şi acizi graşi, care
datorită mediului alcalin formează săruri numite săpunuri. Această reacţie
numită reacţie de saponificare are loc conform ecuaţiei:

CH2 O CO R CH2 OH

CH O CO R +3 NaOH CH OH+ 3 R-COONa

CH2 O CO R CH2 OH

triacilglicerol glicerol sãpun

Reactivi
soluţie alcoolică de NaOH (NaOH 20% în alcool 60 %)
ulei vegetal
acid acetic glacial
soluţie saturată de sulfat de calciu
soluţie saturată de NaCl

149
Modul de lucru
 se introduc 4-5 picături de ulei vegetal într-o eprubetă
 se adaugă 3-4 cm3 alcool sodat
 se încălzeşte eprubeta într-o baie de apă la fierbere, până când
se constată dispariţia uleiului, ceea ce indică o saponificare
completă
 se adaugă aproximativ 10 cm3 apă
 se agită şi se observă formarea unei spume (acţiune detergentă)

 din soluţia de săpun obţinută, se iau în 3 eprubete cantităţi


egale pentru a pune în evidenţă unele proprietăţi ale
săpunurilor
 într-o eprubetă se acidulează soluţia cu acid acetic glacial. Acizii
graşi liberi nefiind solubili în mediul apos,determină apariţia unui
precipitat alb.
 în eprubeta a doua se adaugă o soluţie saturată de CaSO4. Se
observă formarea unui precipitat de săpun de calciu, insolubil.
 în eprubeta a treia se adaugă un volum egal de soluţie saturată
de NaCl. Se observă formarea unui precipitat floconos de
săpun, ce se formează datorită destabilizării coloidale a
acestuia, la adăugarea electrolitului.

Obţinerea acizilor graşi

Principiul metodei:
Acizii graşi se pot separa din săpunuri prin acidularea unei soluţii se
săpun. De exemplu, prin acidularea palmitatului de sodiu cu acid sulfuric se
obţine acidul palmitic, conform ecuaţiei:

2 CH3- ( CH2 )14 – COONa + H2SO4 → 2 CH3-( CH2)14-COOH + Na2SO4


Palmitat de sodiu Acid palmitic

150
Reactivi
săpun
soluţie de acid sulfuric 1/5 n
roşu de Congo

Modul de lucru
 se solubilizează în apă distilată 0,1 -0,2 g săpun;

 se neutralizează cu acid sulfuric în prezenţa de roşu de


Congo;
 se constată apariţia la suprafaţă a acizilor graşi liberi.

Identificarea acizilor graşi nesaturaţi din gliceride

Principiul metodei:
Prezenţa acizilor graşi nesaturaţi în moleculele unor lipide , se poate
pune în evidenţă prin reacţia de adiţie a halogenilor la legăturile duble ale
acizilor graşi din gliceride.
CH3-(CH2)7-CH CH3-(CH2)7-CH-I
+I2
HOOC-(CH2)7-CH HOOC-(CH2)7-CH-I
Acid oleic Acid 9,10-diiod-stearic

Reactivi
ulei vegetal
soluţie cloroformică de brom

151
Modul de lucru
 într-o eprubetă se introduc câteva picături de ulei vegetal;
 se adaugă picătură cu picătură apă de brom;
 soluţia de brom se decolorează datorită adiţiei sale la dubla
legătură.

Identificarea gliceridelor prin reacţia de formare a acroleinei

Principiul metodei:
Gliceridele prin încălzire se descompun, eliberând glicerolul, care în
prezenţa substanţelor deshidratante (KHSO4), pierde 2 molecule de apă,
transformându-se în acroleină, substanţă nesaturată cu miros înţepător
caracteristic.
CH2-OH CH2
 -2H2O 
CH-OH  CH
 
CH2-OH H-C= O

glicerină acroleină

Reactivi
ulei vegetal
sulfat acid de potasiu KHSO4

Modul de lucru
 într-o eprubetă uscată se pun 2-3 picături de ulei vegetal;
 se adaugă 2 g KHSO4
152
 se încălzeşte la flacără;
 se constată degajarea unor vapori cu miros înţepător;
 se ţine la gura eprubetei o hârtie de filtru îmbibată în soluţie amoniacală
de azotat de argint şi se constată înnegrirea acesteia datorită vaporilor de
acroleină.

Punerea în evidenţa a gradului de râncezirea grăsimilor

Principiul metodei:
Păstrate mult timp la aer şi la lumina, grăsimile se descompun în
glicerină şi acizi graşi. Acizii graşi se oxidează în compusi volatili cu miros
neplăcut. Gradul de râncezire se poate pune în evidenţa prin reacţii de
culoare.

Reactivi
 ulei vegetal proaspăt

 acid clorhidric conc.


 soluţie de fluoroglucină ( soluţie eterică 2 %).

Modul de lucru
 se introduc 2cm3ulei într-o eprubetă;
 se adaugă 2cm3 acid clorhidric şi se agită ;
 se adaugă 2cm3 fluoroglucină şi se agită din nou;

Gradul de râncezire se constată prin coloraţia de la roşu la violet care


va apare.
5.3.2.Reacţii specifice steridelor

153
Steridele sunt esteri ai sterolilor cu acizi graşi superiori. Cel mai
răspândit şi important dintre sterolii animali este colesterolul.
Steridele se pot recunoaşte pe baza reacţiilor de culoare ale sterolilor.
Reacţia Salkowski

Principiul metodei:
În soluţie cloroformică, sterolii, în prezenţa acidului sulfuric
concentrat dau o culoare roşie.

Reactivi
acid sulfuric concentrat
cloroform
grăsime animală

Modul de lucru
 într-o eprubetă uscată se introduc 2-3 picături de ulei şi se
solubilizează cu 1-2 cm3 cloroform.
 se prelinge pe peretele eprubetei 1 cm3 H2SO4concentrat. Se
constată separarea a două straturi, între ele obţinându-se un inel
roşu-portocaliu;
 se agită eprubeta.Stratul cloroformic se va colora în roşu iar

cel de acid sulfuric va fi cu o fluorescenţă verzuie.

Reacţia Lieberman- Burchard

Principiul metodei:
Colesterolul cu anhidrida acetică în mediu de acid sulfuric se va
colora în final în verde închis.

154
Reactivi
anhidridă acetică
acid sulfuric concentrat
grăsime animală
cloroform

Modul de lucru
într-o eprubetă uscată se introduc 1-2 picături de ulei care se solubilizează în 1-2
cm3 de cloroform.
se adaugă 1 cm3 de anhidridă acetică.
se adaugă 3-4 picături de acid sulfuric concentrat şi se agită.La început apare
coloraţie verde-albăstruie care trece treptat în verde închis.

5.3.4.Determinarea indicilor de calitate ai lipidelor

5.3.4.1.Determinarea indicelui de saponificare


Indicele de saponificare reprezintă cantitatea de hidroxid de potasiu
în mg necesară pentru saponificarea unui gram de grăsime.
Valoarea indicelui de saponificare este direct proporţională cu
cantitatea de acizi graşi conţinuţi şi invers proporţională cu masa moleculară
a lor, respectiv a lipidelor.
Se dau mai jos valorile indicelui de saponificare pentru principalele
grăsimi şi uleiuri vegetale şi animale:

Tabel 5.4. Indicele de saponificare specific pentru uleiuri


Nr.
Denumirea materialului Indici de saponificare (Is)
crt.

155
1. ulei de bumbac 191 - 198
2. ulei de floarea soarelui 188 - 194
3. ulei de in 189 - 192
4. ulei de măsline 189 - 196
5. ulei de porumb 188 - 198

Principiul metodei:
O cantitatea cunoscută de gliceride, se saponifică cu hidroxid de
potasiu, de concentraţie cunoscută, luată în exces.
Excesul de hidroxid de potasiu se titrează cu o soluţie acidă
echivalentă.

Reactivi
soluţie alcoolică de KOH 0,5 n (28g KOH se solubilizează în puţină apă distilată
şi se completează la 1000 cm3 cu alcool 90% ).
soluţie HCl 0,5 n (41 cm3 HCl concentraţie la 1 litru )
fenolftaleină 1% soluţie alcoolică
ulei vegetal

Modul de lucru
 într-un balon Erlenmayer la care se poate adapta un refrigerent cu
reflux, se cântăreşte la balanţa analitică o cantitate de grăsime de
0,5g.
 se solubilizează în 10 cm3 benzen
 se adaugă 20 cm3 soluţie alcoolică de KOH 0,5 n exact măsurată
 paralel se face o probă martor în aceleaşi condiţii dar fără
grăsime,folosind 20 cm3 KOH 0,5 n alcoolic
 se montează refrigerentele la cele două probe.

156
 se încălzeşte pe baie de apă ,la fierbere 30 minute din momentul
începerii fierberii
 se lasă balonul săse răcească şi se scoate refrigerentul
 se adaugă 1-2 picături de fenolftaleină
 se titrează excesul de KOH cu acid clorhidric 0,5 n până la dispariţia
culorii roşii.

Calcul:
(V2- V1) x FHClx 28,052
Indicele de saponificare = 
G

V2 = cm3 soluţie de HCl folosiţi la titrarea probei martor


V1 = cm3 soluţie de HCl folosiţi la titrarea probei cu grăsime
G = greutatea în grame a probei de grăsime luate pentru determinare
28,052 = mg KOH ce se găsesc într-un cm3 soluţie de KOH 0,5 n

5.3.4.2.Determinarea indicelui de aciditate

Indicele de aciditate (Ia) reprezintă cantitatea în mg de KOH


necesară pentru a neutraliza acizii graşi liberi dintr-un gram de grăsime.

Principiul metodei:
Se titrează o cantitate cunoscută de grăsime cu o soluţie de KOH
de concentraţie cunoscută în prezenţa unui indicator .

CH3-(CH2)14-COOH+KOH  CH3-(CH2)14-COOK+H2O

157
acid palmitic palmitat de potasiu

Reactivi
amestec alcool etilic : benzen neutralizat
soluţie hidroxid de potasiu – KOH 0,1N (5,6104 g / dm3)
grăsime animală
fenolftaleină, soluţie alcoolică 1%

Modul de lucru
se cântăresc 2,5 g grăsime într-un flacon Erlenmayer
se adaugă 20 cm3 amestec alcool etilic şi benzen neutralizat în prealabil
se titrează cu KOH 0,1 n în prezenţă de fenolftaleină până la apariţia culorii roz,
persistentă 30 secunde
dacă în cursul titrării amestecul se tulbură , se încălzeşte puţin fiola într-un vas
cu apă caldă.

Calcul:
5,6104x Vx F
Ia = 
G

V=cm3KOH0,1 n folosiţi la titrare


F=factorul soluţiei de KOH 0,1n
G=grame substanţă luată în analiză
5,6104= mg KOH dintr-un cm3de KOH 0,1n

5.2.5.Extragerea şi dozarea grăsimii din


produse biologice animale prin metoda Soxhlet

158
Principiul metodei:
Extracţia se realizează, cu aparatul Soxhlet, în proces continuu şi se
bazează pe proprietatea grăsimilor din lichidele biologice şi din ţesuturi de a
se solubiliza în solvenţi organici.
Se îndepărtează solventul din extract şi se cântăreşte cantitatea de
grăsime conţinută de materialul de analizat.
Prin această metodă se determină o grăsime brută, deoarece se extrag
parţial şi alte forme de lipide.

Reactivi
amestec alcool-eter etilic 1:1
sau eter de petrol

Modul de lucru
se usucă la 1050C în etuvă, materialul de analizat, până la greutatea constantă
se cântăreşte o cantitate din materialul uscat
se triturează într-un mojar cu nisip de cuarţ
se introduce materialul într-un cartuş de hârtie de filtru care se închide cu dop de
vată
cartuşul şi dopul de vată se degresează în prealabil cu acelaşi solvent care va fi
folosit la extracţie.

Aparatul Soxhlet (fig. 5.2.) , folosit la extracţie se compune din:


1. balon de sticlă B - în care se adună solventul şi se concentrează
grăsimile
2. extractorul E - prevăzut cu un tub T,de comunicaţie între partea
superioară a extractorului şi tubul din partea inferioară. Evacuarea
periodică a lichidului din extractor în balon se face prin sifonul S.

159
3. refrigerent cu reflux

Funcţionarea aparatului Soxhlet


se introduce în extractorul E cartuşul cu materialul luat în analiză
se montează extractorul şi refrigerentul cu reflux

Fig. 5.2. Aparatul Soxhlet

prin tubul interior al refrigerentului se introduce în extractor amestec de eter-alcool


(raport 1: 1) până când sifonează în balonul de extracţie ,apoi se adaugă
solvent încă 1/4 sau 1/3 din volumul extractorului
se reglează fierberea în aşa fel încât sifonarea solventului să se producă în interval
de 3 minute
extracţia are loc în circa 4-6 ore
se lasă să se răcească
se trece prin sifonare, solventul din extractor în balon,se scoate cartuşul,
demontând refrigerentul
se demontează instalaţia, iar lichidul rămas în balon se trece într-o fiolă
Erlenmayer,cântărite în prealabil la balanţa analitică
se spală balonul cu cantităţi mici de solvent de extracţie adăugând acestea peste
extractul din fiola Erlenmayer
se evaporă solventul din fiolă pe o baie de apă, în nişă
160
rezidul rămas reprezintă grăsimea brută
după uscare 30 de minute la 800C, în etuvă, se lasă să se răcească în exicator
se cântăreşte la balanţa analitică
Extragerea grăsimii prin metoda Soxhlet se poate face indirect .Pentru
aceasta se cântăreşte cartuşul cu materialul din care se extrage grăsimea şi
înainte de extracţie şi după extracţie.
Diferenţa între cele două cântăriri reprezintă grăsimea extrasă.

Calcul:
G1 - G0
grăsimea brută % =  x 100
G
G0= greutatea fiolei Erlenmayer
G1=greutatea fiolei Erlenmayer cu grăsime după uscare
G =greutatea produsului luat în analiză

Observaţii:

161
Observaţii:

162
Observaţii:

163
Observaţii:

164