Îmbunătățirea producției de tanshinonă în culturile de

rădăcini păroase Salvia miltiorrhiza
FUNDAL:
Tanchininele sunt compuși diterpenoizi care sunt folosiți pentru tratarea bolilor
cardiovasculare. Deoarece metodele actuale de extracție pentru tanansinone sunt ineficiente,
există o nevoie urgentă de a îmbunătăți producția acestor compuși bioactivi pentru a satisface
cererea din ce în ce mai mare.

REZULTATE:
Supraexprimarea SmMDS (2-c-metil-d-eritrolului sintaza 2,4-cyclodiphosphate, o gena
tanshinone biosinteză) în transgenice Salvia miltiorrhiza păros rădăcini a crescut în mod
semnificativ randamentul tanshinone comparativ cu controlul, și conținutul total tanshinone
în SmMDS -overexpressing linii crescut după tratamentul cu elicitor. Tanshinonele totale au
crescut la 2,5, 2,3 și 3,2 mg / g DW (greutate uscată) după tratamentul cu Ag + , YE (extract de
drojdie) și, respectiv, MJ (jasonat de metil), comparativ cu linia transgenică indusă (1,7 mg) / g
DW). De asemenea, analiza qRT-PCR a arătat că nivelurile de expresie ale două gene ale căii au
fost corelate pozitiv cu acumularea crescută de tanshinonă.

CONCLUZII:

Studiul nostru oferă o strategie eficientă pentru creșterea conținutului de tanshinone și alți
compuși naturali folosind o combinație de inginerie genetică și tratamentul cu elicitor.

Material suplimentar electronic

Salvia miltiorrhiza Bunge (Lamiaceae), cunoscută și sub numele de salvie chineză, este o
plantă medicinală tradițională chineză, cu o valoare remarcabilă din punct de vedere medical
și economic, care este folosită pe scară largă pentru tratarea bolilor menstruale,
cardiovasculare și a diverselor inflamații [ 1 - 5 ]. Tanzaninele sunt compuși diterpenoizi
bioactivi produși în rădăcinile S. miltiorrhiza care au activități farmacologice versatile
incluzând activități antibacteriene, antioxidante, antiinflamatorii, protectoare cardiovasculare
și antineoplazice [ 6 - 10 ]. Cu toate acestea, randamentul scăzut de tanansinone, care necesită,
de obicei, o cantitate mare de material vegetal, a devenit un obstacol major în dezvoltarea
dezvoltării farmaceutice aS. miltiorrhiza [ 11 - 13 ].
Calea biosintetică a tanansinonelor a fost bine studiată în S. miltiorrhiza , care sunt derivate în
principal din doi precursori comuni, dimetilalil difosfat (DMAPP) și izopren difosfat (IPP)
(fișier suplimentar 1 : Fig. S1) [ 14 - 18 ]. Acești doi precursori sunt sintetizați în
compartimente celulare separate prin două căi diferite; calea MVA (mevalonat) se găsește în
citoplasmă, în timp ce calea MEP este activă în plastidă. Calea MEP (metilerythritol
phosphate) include șapte reacții enzimatice, pornind de la G3P și piruvat și este considerată
principala sursă pentru biosinteza precursorilor C5 ai tanshinonei [ 17 , 19 , 20]. IPP este un
intermediar obișnuit în cele două căi, care este transformat în diterpenoizi prin GGPPS
(geranilgeranil difosfat sintaza), CPS (copalil difosfat sintaza), KSL (cavarenă simfaza), CPR
(citocrom P450 reductază) și câteva alte enzime necunoscute [ 3 , 9 , 17 , 19 ]. Conform căii
menționate, acumularea crescută a metabolitului țintă poate fi obținută prin creșterea genelor
care codifică enzimele cheie pe calea biosintetică sau prin inhibarea expresiei genice pe calea
competitivă la plantele S. miltiorrhiza sau rădăcini păroase [ 12 , 21 , 22]. Comparativ cu
liniile de control, producția de tanshinone a fost îmbunătățită semnificativ în liniile de
rădăcini transgenice păroase care supraexprimează SmGGPPS și /
sau SmHMGR (hidroximetilglutaril-CoA reductază), precum și SmDXS (1-deoxi- D- xiluloză
5-fosfat sintasa) [ 21 ]. Co-expresia SmGGPPS și SmHMGR a dus la cel mai mare randament
de tanshinonă în linia HG9 (2,73 mg / g DW), care a fost semnificativ mai mare (5,7 ori)
decât controlul (0,48 mg / g DW) [ 21 ]. MDS (2- C -metil- D-erytritol 2,4-ciclodifosfat
sintaza), care catalizează conversia CDP-ME2P (2-fosfo-4- (citidină 5′- difosfo) -2- C -
metil- D- eritritol) într-un MEcPP intermediar ciclic (2 - 2,4-ciclodifosfat C -metil- D -teritol)
în calea MEP, a fost izolat cu succes de S. miltiorrhiza [ 17 ]. Cu toate acestea, până în
prezent, nu există niciun raport cu privire la efectul genei MDS asupra acumulării de
tanansină în S. miltiorrhiza .
Culturile de rădăcini păroase, care sunt induse de bacteriile solului care apar în mod
natural Agrobacterium rhizogenes infectează țesuturile plantelor [ 20 , 23 , 24 ], au fost
utilizate pe scară largă pentru a dezvolta procese de bioreactor adecvate pentru culturi de
rădăcini păroase, pentru a elucida căile biosintetice și pentru a produce plante valoroase
-metaboliți secundari obținuți [ 25 - 27 ]. Elicitorii, care sunt definiți ca compuși de
semnalizare, pot îmbunătăți sau induce biosinteza metaboliților prin activarea căilor care
răspund la stresul extern [ 28 , 29]. Ca și în cazul altor sisteme de cultură in vitro, acumularea
metaboliților țintă poate fi ușor crescută prin adăugarea de elicitori la culturile de rădăcini
păroase [ 30 - 32 ]. Studiile anterioare au documentat efectul hormonilor endogeni și al
elicitorilor, cum ar fi acidul salicilic (SA), jasmonatul de metil (MJ) și extractul de drojdie
(YE), asupra metabolismului tanshinonei în culturile cu rădăcini păroase ale S.
miltiorrhiza [ 11 , 22 , 33 ].
În consecință, am emis ipoteza că o combinație de tratament elicitor și inginerie metabolică ar
putea fi o modalitate promițătoare de a crește randamentul tanshinonei. În studiul de față,
manipularea căii europarlamentare (prin supraexprimarea SmMDS ) a fost realizată pentru a
crește acumularea de tanshinone în rădăcinile păroase de S. miltiorrhiza . Pentru a testa dacă
acumularea de tanshinone poate fi crescută suplimentar prin adăugarea unui elicitor la
rădăcinile păroase transgenice, SmMDS-liniile de supraexprimare au fost tratate cu diferite
elicitoare. Rezultatele studiului nostru arată că combinația dintre tehnologia transgenică și
tratamentul elicitorului este o strategie eficientă pentru creșterea nivelului de tanshinone în
culturile de rădăcini păroase și poate oferi o modalitate de a îmbunătăți randamentele
tanshinonelor din procedurile actuale de extracție în rădăcinile păroase ale S. miltiorrhiza .

onstruirea vectorilor de expresie vegetală

Cadrul de citire deschis SmMDS  a fost amplificat prin PCR dintr-o bibliotecă de ADNc de S.
miltiorrhiza (30 d) ADNc utilizând primerii care conțin siturile de restricție Xba I și Xma I la
capetele lor 5 ′ (fișier suplimentar 6 : Tabelul S1). Produsul PCR (718 bp) a fost clonat pentru
prima dată în vectorul pMD18-T (TaKaRa Biotech). După digestia cu Xba I
și Xma I, fragmentul ORF SmMDS a fost inserat într-un vector pBI121 modificat care conține
o peptidă 2A legată de capătul N al genei raportoare GUS și NPT IIgena pentru rezistența la
kanamicină ca marker selectabil (fișier suplimentar 2 : Fig. S2). Dezarmat Agrobacterium
tumefaciens C58C1 tulpina care conține atât recombinante SmMDS plasmida vector binar
și A . rhizogenes Ri plasmida (pRiA4b) a fost utilizată pentru transformarea genetică a
plantelor. Tulpina C58C1 care conține numai plasmidă Ri a fost utilizată ca control al
transformării.
Transformarea plantelor, detectarea moleculară și cultivarea rădăcinilor păroase
Plantele aseptice S. miltiorrhiza au fost cultivate într-un mediu bazal Murashige și Skoog
(0,5X MS) cu jumătate de rezistență conținând 3% zaharoză și 0,7% agar (pH 5,8 ± 0,1), la 25
± 1 ° C cu 16 h de lumină / 8 h fotoperioadă întunecată. Frunzele de răsaduri de S.
miltiorrhiza crescute aseptic (30 d) au fost tăiate în pătrate de 0,5 cm × 0,5 cm, infectate
cu Agrobacteriumtulpina C58C1 timp de 25 min, apoi co-cultivată pe mediu MS cu 100
umol / L AS (acetosirringonă) la întuneric timp de 2-3 zile. Frunzele infectate au fost
transferate în mediu MS 0,5X conținând 400 mg / L Cef (sodiu cefotaximă) și cultivate timp
de 2-3 săptămâni pentru a controla supraagregarea Agrobacterium. Rădăcinile păroase au fost
apoi excizate din bucățile de frunze (2-3 cm lungime) și transferate la B5 Mediu care conține
400 mg / L Cef și 50 mg / L Kan (kanamicină) pentru selectarea rădăcinilor păroase
transgenice (Fig.  1 ). Rădăcinile păroase de tip sălbatic nu au crescut pe mediu conținând 50
mg / L Kan (fișier suplimentar 3 : Fig. S3), astfel încât au fost plasate pe un mediu care
conține doar 400 mg / L Cef. Liniile de rădăcini păroase au fost stabilite folosind linii de
rădăcini în creștere rapidă care nu erau contaminate de bacterii [ 30].
 metodă modificată de bromură de cetiltrimetil amoniu (CTAB) a fost utilizată pentru a
extrage ADN genomic din rădăcinile păroase rezistente la kanamicină [ 13 ]. Amorsa 35S-F
înainte și primerul invers SmMDS-R, care au fost proiectate pentru secvențele promotorului
CaMV 35S și , respectiv, gena SmMDS , au fost utilizate pentru a identifica liniile
transgenice p35S :: SmMDS . Primerele Rol AF și rol AR au fost utilizate pentru a verifica
transformarea cu Agrobacterium rizogenePlasmida Ri. Mărimile acestor două produse de
amplificare au fost de 746 CP și respectiv 304 CP. Amplificarea PCR a unui fragment de genă
actină (267 pb) a fost utilizată ca control intern. Rădăcinile păroase pozitive PCR au fost
tăiate în secțiuni de aproximativ 4 cm lungime și transferate în baloane Erlenmeyer de 150 ml
conținând 100 ml mediu 0,5X B5 și crescute pe un agitator orbital la 150 rpm la întuneric la
25 ° C. Culturile de rădăcini păroase au fost sub-cultivate în 0,5X B5 mediu la fiecare 28 de
zile.

Colorarea GUS și analiza expresiei genice prin qRT-PCR

X-Gluc a fost utilizat ca substrat cromogen pentru localizarea histochimică a activității
enzimei GUS [ 34 ]. Ca amestec de reacție a fost utilizată o soluție tamponată de fosfat de
sodiu (50 mM, pH 7,2) care conține 1 mM X-Gluc. Probele de rădăcină păroasă au fost
incubate în soluția de X-Gluc (conținând 50 mM ferricianură de potasiu și 50 mM ferocianură
de potasiu) la 37 ° C timp de 12 ore, iar pigmenții au fost îndepărtați prin curățarea în 100%
etanol înainte de observare.
ARN total a fost extras din rădăcini păroase așa cum s-a descris anterior [ 35]. Integritatea
ARN a fost analizată prin electroforeză cu gel de agaroză 1,5% (datele nu sunt prezentate). S-
au utilizat cantități egale de ARN total (2 pg) pentru sintetizarea ADNc folosind rezerva
transcriptazei M-MLV (Promega) cu o concentrație finală de 10 U / µL. Testele qRT-PCR au
fost efectuate pe PCR în timp real iCycler iQ5 ™ (Bio-Rad) folosind kitul q-PCR SYBR
Green. Fiecare reacție de amplificare (20 µL) conținea 10 µL de 2 × SYBR Green Mix, 1 µL
de ADNc și 0,25 μM de primerii înainte și invers. Programul de amplificare a fost inițiat cu o
etapă inițială de denaturare la 95 ° C timp de 3 minute, urmată de 40 de cicluri de 30 s la 95 °
C, 30 s la 60 ° C și 30 s la 72 ° C. Curba de disociere la sfârșitul fiecărei rulări a fost utilizată
pentru a monitoriza specificitatea amplicon. Nivelurile relative ale expresiei genice au fost
determinate folosind 2- ΔΔCTmetodă și normalizată la expresia GAPDH și actinei. Toate genele
specifice au fost analizate de trei ori în aceleași condiții.
Pregătirea și elicitarea elicitorului
Elicitarea a fost efectuată prin tratarea rădăcinilor păroase cu Ag + , YE și MJ. AgNO 3 s-a
dizolvat în apă distilată la o concentrație de 30 mmol / L și s-a sterilizat filtrul printr-o
membrană de 0,22 μm [ 36 ]. Extractorul de drojdie a fost făcut așa cum s-a descris anterior
[ 28 ]. MJ a fost mai întâi dizolvat într-o cantitate mică de dimetilsulfoxid, apoi dizolvat în
apă distilată până la o concentrație de stocare de 10 mmol / L și sterilizat printr-un filtru de
0,22 μm [ 33 ]. Elicitorii s-au adăugat la culturile de balon de agitare a rădăcinilor
păroase de S. miltiorrhiza în ziua 60. Tratamentele cu elicitor au fost efectuate la următoarele
concentrații: Ag + 30 μmol / L, YE 100 mg / L și MJ 100 μmol / L și rădăcinile păroase au fost
colectate pentru extracția ARN și analiza conținutului de tanansonă la 45 de zile după
tratamentul cu elicitorii individuali.

Determinarea concentrației de tanshinonă prin HPLC

După recoltarea din culturile de balon de agitare, rădăcinile păroase au fost uscate la 50 ° C
până la atingerea unei greutăți uscate constante. Tanshinona a fost izolată și detectată conform
raportului anterior [ 37]. Probele uscate au fost măcinate în pulberi și extrase cu 80% metanol
timp de 1 oră într-o baie de temperatură constantă la 80 ° C. Filtratele au fost analizate pe un
sistem de cromatografie lichidă de înaltă performanță (HPLC) Shimadzu LC-20AT echipat cu
o coloană C18 (4,6 mm ID × 250 mm). Faza mobilă a constat în eluarea gradientă a
solventului A (0,2% acid fosforic) și B (acetonitril). Debitul a fost de 0,7 ml / min, lungimea
de undă de detectare a fost de 270 nm și temperatura coloanei de 35 ° C. Pentru determinare,
procedura a fost 0–25 min, solventul A (0,2% acid fosforic) 15-30%, solvent B (acetonitril),
85–70%; 25-30 min, solvent A, 30–60%, solvent B, 70–40%; 30–70 min, solvent A 60–80%,
solvent B 40–20%. Pe baza timpului de retenție și a zonei de vârf, tanshinona a fost
cuantificată prin comparație cu standardele autentice.

analize statistice
Toate datele raportate sunt exprimate ca valoare medie ± SD a cel puțin trei replici. Analizele
statistice (ANOVA) au fost efectuate utilizând software-ul SAS versiunea 9.1 pentru a testa
diferențele semnificative între WT și liniile radiculare păroase induse de transgenici sau
elicitor. Testul Duncan (P <0.05) a fost utilizat pentru a compara valoarea medie a fiecărui
grup de tratament.

Rezultate

Generarea de linii de rădăcini transgenice păroase

Vectorul care conține ADNc SmMDS cu lungime completă (fișier adițional 2 : Fig. S2) a fost
introdus în tulpina C58C1 de Agrobacterium modificată, care a fost apoi utilizată pentru a
transforma S. miltiorrhiza pentru a produce rădăcini păroase transgenice (Fig.  1 ). Liniile de
rădăcini păroase care au prezentat rezistență la kanamicină, un fenotip normal și o creștere
normală, pe măsură ce rădăcinile păroase WT cresc pe un mediu fără canamicină (datele care
nu sunt prezentate), au fost utilizate pentru analize suplimentare. ADN-ul genomic a fost
extras din liniile de rădăcină păroasă ale S. miltiorrhiza selectate și analiza PCR a fost
efectuată utilizând primerii special concepuți pentru a amplifica promotorul CaMV35S și
porțiunea N-terminală a SmMDSgena. Primeri PCR AF lei / R au fost folosite pentru a
identifica rădăcinile paros care conțin A. rhizogenes LEI a genei
de la A . tulpina tumefaciens C58C1 (Fig.  2 ). Rata pozitivă PCR a SmMDS rădăcini păros
a fost 46/68 (67,6%). Testele de colorare GUS au arătat că nivelul de expresie al genei GUS
a variat în diferitele linii de rădăcini păroase (Fig.  3 a). Pentru a investiga expresia genei
introduse, am efectuat o analiză cantitativă RT-PCR a șase linii transgenice independente care
au arătat niveluri ridicate de expresie GUS (Fig.  3b ). Două p35S
independente :: SmMDS linii transgenice păros rădăcină (11 și 16) care au exprimatPentru
analize suplimentare, au fost selectate SMMDS la niveluri înalte.

Fig. 2

Analiza PCR a transformanților primari folosind primerii specifici genelor 35S :: SmMDS , rol A și

actină. Lanele M, scara marcatorului dimensiunii ADN-ului; benzile 1–12, produse PCR din
transformatoare putative; banda WT, controale netransformate; banda V, ADN din plasmida p35S ::
SmMDS
 metodă modificată de bromură de cetiltrimetil amoniu (CTAB) a fost utilizată pentru a
extrage ADN genomic din rădăcinile păroase rezistente la kanamicină [ 13 ]. Amorsa 35S-F
înainte și primerul invers SmMDS-R, care au fost proiectate pentru secvențele promotorului
CaMV 35S și , respectiv, gena SmMDS , au fost utilizate pentru a identifica liniile
transgenice p35S :: SmMDS . Primerele Rol AF și rol AR au fost utilizate pentru a verifica
transformarea cu Agrobacterium rizogenePlasmida Ri. Mărimile acestor două produse de
amplificare au fost de 746 CP și respectiv 304 CP. Amplificarea PCR a unui fragment de genă
actină (267 pb) a fost utilizată ca control intern. Rădăcinile păroase pozitive PCR au fost
tăiate în secțiuni de aproximativ 4 cm lungime și transferate în baloane Erlenmeyer de 150 ml
conținând 100 ml mediu 0,5X B5 și crescute pe un agitator orbital la 150 rpm la întuneric la
25 ° C. Culturile de rădăcini păroase au fost sub-cultivate în 0,5X B5 mediu la fiecare 28 de
zile.

Colorarea GUS și analiza expresiei genice prin qRT-PCR

X-Gluc a fost utilizat ca substrat cromogen pentru localizarea histochimică a activității
enzimei GUS [ 34 ]. Ca amestec de reacție a fost utilizată o soluție tamponată de fosfat de
sodiu (50 mM, pH 7,2) care conține 1 mM X-Gluc. Probele de rădăcină păroasă au fost
incubate în soluția de X-Gluc (conținând 50 mM ferricianură de potasiu și 50 mM ferocianură
de potasiu) la 37 ° C timp de 12 ore, iar pigmenții au fost îndepărtați prin curățarea în 100%
etanol înainte de observare.
ARN total a fost extras din rădăcini păroase așa cum s-a descris anterior [ 35]. Integritatea
ARN a fost analizată prin electroforeză cu gel de agaroză 1,5% (datele nu sunt prezentate). S-
au utilizat cantități egale de ARN total (2 pg) pentru sintetizarea ADNc folosind rezerva
transcriptazei M-MLV (Promega) cu o concentrație finală de 10 U / µL. Testele qRT-PCR au
fost efectuate pe PCR în timp real iCycler iQ5 ™ (Bio-Rad) folosind kitul q-PCR SYBR
Green. Fiecare reacție de amplificare (20 µL) conținea 10 µL de 2 × SYBR Green Mix, 1 µL
de ADNc și 0,25 μM de primerii înainte și invers. Programul de amplificare a fost inițiat cu o
etapă inițială de denaturare la 95 ° C timp de 3 minute, urmată de 40 de cicluri de 30 s la 95 °
C, 30 s la 60 ° C și 30 s la 72 ° C. Curba de disociere la sfârșitul fiecărei rulări a fost utilizată
pentru a monitoriza specificitatea amplicon. Nivelurile relative ale expresiei genice au fost
determinate folosind 2- ΔΔCTmetodă și normalizată la expresia GAPDH și actinei. Toate genele
specifice au fost analizate de trei ori în aceleași condiții.

Pregătirea și elicitarea elicitorului

Elicitarea a fost efectuată prin tratarea rădăcinilor păroase cu Ag + , YE și MJ. AgNO 3 s-a
dizolvat în apă distilată la o concentrație de 30 mmol / L și s-a sterilizat filtrul printr-o
membrană de 0,22 μm [ 36 ]. Extractorul de drojdie a fost făcut așa cum s-a descris anterior
[ 28 ]. MJ a fost mai întâi dizolvat într-o cantitate mică de dimetilsulfoxid, apoi dizolvat în
apă distilată până la o concentrație de stocare de 10 mmol / L și sterilizat printr-un filtru de
0,22 μm [ 33 ]. Elicitorii s-au adăugat la culturile de balon de agitare a rădăcinilor
păroase de S. miltiorrhiza în ziua 60. Tratamentele cu elicitor au fost efectuate la următoarele
concentrații: Ag + 30 μmol / L, YE 100 mg / L și MJ 100 μmol / L și rădăcinile păroase au fost
colectate pentru extracția ARN și analiza conținutului de tanansonă la 45 de zile după
tratamentul cu elicitorii individuali.

Determinarea concentrației de tanshinonă prin HPLC

După recoltarea din culturile de balon de agitare, rădăcinile păroase au fost uscate la 50 ° C
până la atingerea unei greutăți uscate constante. Tanshinona a fost izolată și detectată conform
raportului anterior [ 37]. Probele uscate au fost măcinate în pulberi și extrase cu 80% metanol
timp de 1 oră într-o baie de temperatură constantă la 80 ° C. Filtratele au fost analizate pe un
sistem de cromatografie lichidă de înaltă performanță (HPLC) Shimadzu LC-20AT echipat cu
o coloană C18 (4,6 mm ID × 250 mm). Faza mobilă a constat în eluarea gradientă a
solventului A (0,2% acid fosforic) și B (acetonitril). Debitul a fost de 0,7 ml / min, lungimea
de undă de detectare a fost de 270 nm și temperatura coloanei de 35 ° C. Pentru determinare,
procedura a fost 0–25 min, solventul A (0,2% acid fosforic) 15-30%, solvent B (acetonitril),
85–70%; 25-30 min, solvent A, 30–60%, solvent B, 70–40%; 30–70 min, solvent A 60–80%,
solvent B 40–20%. Pe baza timpului de retenție și a zonei de vârf, tanshinona a fost
cuantificată prin comparație cu standardele autentice.

analize statistice
Toate datele raportate sunt exprimate ca valoare medie ± SD a cel puțin trei replici. Analizele
statistice (ANOVA) au fost efectuate utilizând software-ul SAS versiunea 9.1 pentru a testa
diferențele semnificative între WT și liniile radiculare păroase induse de transgenici sau
elicitor. Testul Duncan (P <0.05) a fost utilizat pentru a compara valoarea medie a fiecărui
grup de tratament.

Rezultate

Generarea de linii de rădăcini transgenice păroase

Vectorul care conține ADNc SmMDS cu lungime completă (fișier adițional 2 : Fig. S2) a fost
introdus în tulpina C58C1 de Agrobacterium modificată, care a fost apoi utilizată pentru a
transforma S. miltiorrhiza pentru a produce rădăcini păroase transgenice (Fig.  1 ). Liniile de
rădăcini păroase care au prezentat rezistență la kanamicină, un fenotip normal și o creștere
normală, pe măsură ce rădăcinile păroase WT cresc pe un mediu fără canamicină (datele care
nu sunt prezentate), au fost utilizate pentru analize suplimentare. ADN-ul genomic a fost
extras din liniile de rădăcină păroasă ale S. miltiorrhiza selectate și analiza PCR a fost
efectuată utilizând primerii special concepuți pentru a amplifica promotorul CaMV35S și
porțiunea N-terminală a SmMDSgena. Primeri PCR AF lei / R au fost folosite pentru a
identifica rădăcinile paros care conțin A. rhizogenes LEI a genei
de la A . tulpina tumefaciens C58C1 (Fig.  2 ). Rata pozitivă PCR a SmMDS rădăcini păros
a fost 46/68 (67,6%). Testele de colorare GUS au arătat că nivelul de expresie al genei GUS
a variat în diferitele linii de rădăcini păroase (Fig.  3 a). Pentru a investiga expresia genei
introduse, am efectuat o analiză cantitativă RT-PCR a șase linii transgenice independente care
au arătat niveluri ridicate de expresie GUS (Fig.  3b ). Două p35S
independente :: SmMDS linii transgenice păros rădăcină (11 și 16) care au exprimatPentru
analize suplimentare, au fost selectate SMMDS la niveluri înalte.
Fig. 2

Analiza PCR a transformanților primari folosind primerii specifici genelor 35S :: SmMDS , rol A și

actină. Lanele M, scara marcatorului dimensiunii ADN-ului; benzile 1–12, produse PCR din
transformatoare putative; banda WT, controale netransformate; banda V, ADN din plasmida p35S ::
SmMDS
Pentru a investiga efectele supra-expresiei SMMDS și / sau a tratamentului
elicitor asupra liniilor de rădăcină păroase S. miltiorrhiza , conținutul de
tanshinone IIA, tanshinona I, dihidrotansinona I și criptotanshinona au fost
determinate prin cromatografie lichidă de înaltă performanță (HPLC)
(Fig.  5 ). Rezultatele au arătat că linia p35S tratată cu MJ :: SmMDS -16 a
avut cel mai mare conținut de dihidrotansinona I (1,3 mg / g DW), linia p35S
tratată cu MJ :: SmMDS -11 a avut cel mai mare conținut de criptotansinona
(1,26 mg / g DW) și tanshinona I (0,69 mg / g DW), p35S tratată cu
YE :: SmMDS-11 linie a avut cel mai mare conținut de Tanshinone IIA (0,35
mg / g DW). Suma celor patru tanshinone a fost luată ca conținut total de
tanshinone. Analiza HPLC a relevat faptul că, comparativ cu liniile WT,
conținutul total de tanansinonă a fost semnificativ mai mare în liniile SmMDS ,
liniile de tip sălbatic tratate cu elicitor și liniile SmMDS tratate de
elicitor (Fig.  6 ). Linia p35S tratată cu MJ :: SmMDS -16 a avut cel mai mare
conținut de tanansinone totale (3,2 mg / g DW), de 5,2 ori mai mare decât cea a
liniilor radiculare păroase WT. Analiza expresiei genelor biosintetice terpenoide
după tratamentul cu elicitor
Pentru a investiga în continuare profilurile de expresie ale genelor căii terpenoide, am folosit
aceleași probe pe care le-am folosit pentru cuantificarea tanshinonei pentru a efectua teste
qRT-PCR cu nouă gene cunoscute ca fiind legate de căile MEP și MVA. Așa cum se arată în
Fig.  7 , nivelurile relative de expresie ale tuturor celor nouă gene au fost reglate în sus
în liniile SmMDS , elicitor tratat linii de tip sălbatic și elicitor tratat liniile SmMDS . Cele mai
ridicate niveluri de expresie relativă de SmMCT , SmCMK și SmHDR au fost detectate în linia
p35S tratată cu MJ :: SmMDS -16. Cea mai înaltă expresie a SmMDS și SmCPS a fost în Ag+ -
tratat p35S: linia SmMDS -16. În linia p35S tratată cu YE: SmMDS -16, am detectat o expresie
crescută a SmHMGR , SmPMK , SmIDI și SmKSL . Rezultatele de mai sus indică faptul că
modificările observate în conținutul de tanshinonă și expresia genelor în căile de biosinteză
ale tanshinone au fost în general consistente.

iscuţie
Metaboliții secundari cu structuri complexe și activități remarcabile găsite în culturile și
țesuturile cu suspensii de celule vegetale au fost examinate pe larg [ 38 ]. Culturile de
rădăcină păroasă, care sunt transformate din rădăcinile plantelor de Agrobacterium rhizogenes
care transportă plasmida Ri T-ADN, au devenit biocatalizatorul preferat de celulele plantelor /
culturile de calus și de suspensie datorită stabilității lor biochimice / genetice, potențialului de
sinteză multi-enzimatic, hormon-autotrofie și cerințe de cultură relativ scăzute
[ 28 , 39 ]. Până în prezent, culturile de rădăcini păroase au fost folosite pentru a produce
componente bioactive ale mai multor plante medicinale [ 40 , 41 ]. Prin izolarea cu succes a
genelor biosintezei tanshinone, cum ar fi SmDXS, SmDXR , SmHMGR și SmGGPPS , de la S.
miltiorrhiza , s-au făcut încercări de creștere a randamentului tanshinonei în rădăcinile
păroase ale S. miltiorrhiza prin inginerie genetică [ 22 , 36 , 42 ]. S-a constatat că conținutul
de tanshinone din rădăcinile păroase care supraexprimă SmHMGR (linia H) a fost de 1,567
mg / g, cu 2,5 ori mai mare decât în control (0,613 mg / g) [ 36 ]. În studiul nostru, raportăm
pentru prima dată că supraexpresia unei singure gene MDS în rădăcinile păroase ale S.
miltiorrhizaa dus la o creștere mare a conținutului de tanshinonă, ceea ce indică faptul că
MDS este un punct cheie de reglementare pentru reglarea metabolismului izoprenului.
Deoarece elicitarea chimică este o strategie eficientă pentru creșterea biosintezei tanshinonei,
multe abiotice (Ag + , Co 2+ și Cd 2+ ) și elicitoare biotice (YE, MJ și SA) au fost folosite
anterior pentru tratarea culturilor radiculare păroase din S. miltiorrhiza [ 26 , 43 ]. S-a raportat
pe scară largă că Ag + poate spori producția de tanshinone în rădăcinile păroase ale S.
miltiorrhiza [ 44 ]. După tratamentul cu 30 μM Ag + , conținutul maxim de tanansinone totale
în rădăcinile păroase de S. miltiorrhiza a fost de 1,2 ori mai mare decât la control [ 45]. Într-un
alt studiu, 25 μM Ag + au crescut conținutul de tanshinone I, criptotansinonă și tanshinone IIA
cu 0,87-, 30,0- și 3,9 ori, respectiv [ 43 ]. În studiul de față, Ag + a fost, de asemenea, eficient
în inducerea producției celor patru componente ale tanansinei (Fig.  5 ), iar conținutul
tanshinonei I, tanshinone IIA, dihidrotansinona I și criptotansinona au fost 1,43-, 6,57-, 1,7-,
și respectiv 2,38 ori mai mare decât în control. Conținutul total de tanshinonă a fost dublat,
ceea ce indică faptul că Ag + este un potențial elicitor al producției de tanshinone și că IIA de
tanshinonă este mai sensibilă la elicitarea Ag + decât ceilalți trei compuși cu tanshinonă.
Iasmonatul de metil (MJ) și extractul de drojdie (YE) sunt, de asemenea, considerate a fi
elicitori eficienți care pot crește acumularea de tanansonă [ 22 , 26 ]. Lucrările anterioare au
arătat că, după tratamentul cu 100 μM MJ, nivelul de tanshinonă a crescut după 3 zile și a
atins un maxim de 0,93 mg / g DW în a noua zi, cu aproximativ 5,8 ori mai mare decât
controlul (0,16 mg / g DW) [ 46 ]. Expresia multor gene de cale a fost, de asemenea, dovedită
a fi reglementată de MJ [ 46 ]. Tratamentul cu extract de drojdie (YE) poate crește, de
asemenea, biosinteza tanshinonei în culturile rădăcinoase păroase ale S. miltiorrhiza , iar
conținutul total de tanasinonă a crescut de la 0,46 mg / g la 1,37 mg / g greutate uscată (DW)
într-un mod dependent de doză. [ 47]. Conținutul de Tanshinone IIA și criptotansinona (CT)
au fost, de asemenea, crescute prin tratamentul YE. Rezultatele unui studiu anterior au arătat
că acumularea tanansinonei a crescut după 3 zile, iar nivelul maxim a atins 0,643 mg / g DW
în a 6-a zi, care a fost de 3,99 ori mai mare decât controlul [ 46 ]. În studiul nostru de față,
acumularea de tanshinonă a fost, de asemenea, indusă atât de tratamentul MJ, cât și de YE, iar
tanansinonele au crescut de 2,8 ori, respectiv 1,5 ori, ceea ce a fost în concordanță cu
rapoartele anterioare de elicitare.
Acumularea crescută de tanshinone poate fi indusă prin co-supraexprimarea diferitelor gene
ale căii sau printr-o combinație de tratament al elicitorilor diferiți. Co-
supraexpresia SmDXSII și SmGGPPS a dovedit a avea un efect sinergic pozitiv în stimularea
acumulării de izoprenoizi derivate din plastid și a diterpenei tanshinone [ 42 ]. Cheng și
colab. a raportat că YE + Ag + și YE + Ag +  + MJ au fost cele mai eficiente combinații de
elicitori pentru a stimula acumularea de tanshinone, în special criptotansinona și
dihidrotansinona I, iar elicitorii combinați au fost mai eficienți decât elicitorii individuali la
creșterea nivelului de tanshinonă [ 28]. În plus, combinația dintre tehnologia transgenică și
tratamentul elicitorului poate fi o strategie viabilă pentru producția pe scară largă a
tanshinonei în rădăcinile păroase ale S. miltiorrhiza [ 33 ]. În acest studiu, s-au utilizat linii de
rădăcină păroase care exprimă SmMDS transgenice pentru experimentele ulterioare de
tratament cu elicitor. Conținutul maxim al tanshinonelor totale a fost semnificativ îmbunătățit
până la 2,5, 2,3 și 3,2 mg / g DW prin tratamentul cu Ag + , YE și, respectiv, MJ, comparativ
cu linia p35S indusă: SmMDS -16 (1,7 mg / g DW), care indică faptul că acești elicitori au un
efect semnificativ asupra acumulării de tanshinone a SMMDS transgenicelinii radiculare
păroase. Rezultatele noastre arată că o combinație dintre cele două metode poate îmbunătăți
producția de tanshinone în culturile de rădăcină păroasă de S. miltiorrhiza mai eficient decât
fie modificarea genetică, fie tratamentul cu elicitor. În plus, cultura de rădăcini păroase de S.
miltiorrhiza s-a dovedit a fi o alternativă mai eficientă la creșterea fermelor de plante întregi
pentru producția de tanshinonă [ 28 ]. În cercetările noastre anterioare, tanshinonele totale din
rădăcinile plantei S. miltiorrhiza au fost măsurate ca 2,28 mg / g DW, după creșterea pe un
câmp experimental timp de 5 luni [ 13 ], care a fost semnificativ mai mică decât cea a p35S
tratată cu MJ: : Linia SmMDS-16 (3,2 mg / g DW) în a 45-a zi din acest studiu.

Concluzie
Cercetările noastre arată că combinarea tehnologiei transgenice cu tratamentul cu elicitor
(Ag + , YE sau MJ) poate crește eficient nivelul tanansinonelor în culturile rădăcinoase
păroase ale S. miltiorrhiza , făcând din aceasta o strategie eficientă și fezabilă pentru
producția de tanshinone. Mai mult, studiul nostru a demonstrat, de asemenea, că acumularea
tanansinonelor este corelată pozitiv cu nivelurile de expresie ale genelor cheie ale biosintezei
în rădăcinile păroase transgenice ale S. miltiorrhiza . Rezultatele prezentate aici vor deschide
calea pentru inginerie metabolică a biosintezei tanshinone în rădăcinile păroase în viitor.

Abrevieri

MDS 2- C -metil- D- eritritol 2,4-ciclodifosfat sintaza

DW greutate uscata

qRT-PCR reacție în lanț cantitativă în timp real a polimerazei

VOI extract de drojdie

MJ jasmonat de metil

SA acid salicilic

MEP fosfat de metilitritol

MVA mevalonat

IPP izofrenul difosfat

GGPPS geranilgeranil difosfat sintaza

CPS copalil difosfat sintaza

KSL kaurene asemănător cu sintaza

CPR citocromul P450 reductază

G3P gliceraldehidă 3-fosfat

ORF cadru de lectură deschis

CaMV virusul mozaicului de conopidă

DOMNIȘOARĂ Murashige și Skoog

HPLC cromatografie lichidă de înaltă performanță

LA FEL DE acetosiringonă

CTAB bromură de cetiltrimetil amoniu