Master GAB anul I

Studiul asupra filogeniei dintre: Abraham Darby, Acapella,

Cristoph Columbus, Ingrid Bergman, Red Berlin cu Rosa canina

Caramitu Ana, Deak Timea, Moiceanu Georgiana, Oprea Daniela, Popescu Cristina

Cuvinte cheie: Rosa, ADN, markeri ISSR, variabilitate genetică

Abstract
Acest studiu are ca scop determinarea gradului de înrudire dintre Abraham Darby (A.D)
Acapella (A), Cristoph Columbus (C.C), Ingrid Bergman (I.B), Red Berlin (R.B) cu Rosa
canina (R.C), folosind primerul: UBC835b-(GA)8CT. Evidențierea înrudirilor este
determinata prin analiza spectofotometrică a extractelor de ADN de la cele cinci soiuri de
trandafir analizate și are ca obiectiv evidențierea înrudirii cât și a variabilități genetice a
acestora.
Introducere

 Familia Rosaceae
Genul Rosa L. -Trandafir- este o reprezentat de plante perene, ornamentale din familia
Rosaceae.
Provenit din regiunile continentale și subtropicale ale emisferei nordice. Înglobează
peste 200 de specii de arbuști cu tulpina lemnoasă și prevazută cu spini.
Planta originară este trandafirul sălbatic - Rosa canina - prevăzută cu spini și fructe
cunoscute sub numele de măceșe. Aceasta crește sub forma de tufișuri în special în zone
aride.

 Markeri ISSR
Repetițiile simple de secvențe (SSR) se regăsesc în genomul eucariotelor. Single-locus
markeri SSR există pentru număr mare de specii dar există și un obstacol major în
dezvoltarea markerilor SSR și constă în cunoașterea secvențelor de flancare spre a crea
ancore 5’ pentru primerii PCR. Poate fi dezvotată amprentarea de tip SSR (ISSR) astfel
încât să nu fie necesară cunoașterea secvenței. Pot fi realizați primeri bazați pe o secvență
repetitivă utilizând o ancoră degenerată 3’. Reacția PCR rezultată amplifică secvența între
două SSR-uri, dând un sistem marker multiloc.

Materiale și metode

A fost analizat trandafirul sălbatic - Rosa canina – și soiurile hibride Abraham

Darby (A.D), Acapella (A), Cristoph Columbus (C.C), Ingrid Bergman (I.B),
Red Berlin (R.B).Țesuturile vegetale folosite pentru studiu au fost recoltate din
Grădina Botanică București, după care au fost congelate. Analiza
spectofotometrică a fost obținută prin tehnica CTAB/sarcosyl (Dehestani și
Kazmi, 2007). Măsurătorile spectofotometrice ale probelor au avut loc la
aparatul nanodrop ACT Gene ASP-26.
S-au mixat țesuturile vegetale cu 700 µl tampon după care a avut loc
vortexarea. Mixul a fost precipitat și concentrat cu alcool etilic rece. Următorul
pas a fost aplicarea proceduri de electroforeză cu 8µl ADN și 2µl de albastru
de bromfenol și s-a introdus câte 10µl de amestec pe godeu.
Soiurile + ordinea de încărcare Primerul utilizat în studiu
în gelul de electroforeză
7 pentru A.D (Abraham Darby) UBC835b-(GA)8CT

8 pentru R.B (Red Berlin)

9 pentru I.B (Ingrid Bergman)

10 pentru C.C (Cristoph Columbus)

12 pentru A (Acapella )

11 pentru R.c (Rosa canina)

Tabel 1.1

S-au adăugat în câte un tub, 11µl din amestecul rezultat din tabelul de mai jos (Tabelul
1.2) : +ADN 1µl din fiecare probă +1µl apă în martorul negativ.

Componente 1 probă în µl Cele 8 probe

GOTag Green Master 6 48
mix
Primer 2 16
ADN 1 -
Apă distilată sterilă 3 24
V final al probei 12µl

Tabel 1.2
Etapele izolării ADN

Izolarea a fost inițiată de cântărirea materialul vegetal, urmata de mojararea acestuia și

centrifugare. S-a adaugat un tampon de extracție, și s-a agita și apoi s-a băgat la incubat.
După incubare s-a lăsat la răcit aproximativ 5 minute la temperatura camerei apoi s-a
adăugat cloroform și s-a agitat ușor 5 minute. S-a centrifugat 10 minute la 800 rmp pentru
îndepărtarea proteinelor și apoi s-a transferat faza apoasă în recipiente curate, s-a repetat
deproteinizarea. S-a reluat supernatantul în tuburi curate și s-a adăugat izopropanol rece.
S-a amestecat ușor pentru precipitarea ADN-ului, s-a centrifugat la 1200 rpm timp de 5
minute. S-a îndepărtat supernatantul și sedimentul s-a spălat cu etanol și s-a centrifugat din
nou.
S-a îndepărtat soluția de spălare iar sedimentul s-a uscat la temperatura camerei timp de
10-20 min. Extrasul obținut a fost extras în volum minim de tampon și păstrat la 4⁰C.

Rezultate

Figura 1.1
Figura 1.2

Figura1.3
Figura 1.4

Figura 1.5
Figura 1.6

Figura 1.7
Figura 1.8

Discuții
În Figura 1.1. rândul de jos rezultatul grupei 2. Ordinea de încărcare a avut loc astfel: în
godeul 1 Abraham darby (A.D), în godeul 2 Red Berlin (R.B), în godeul 3 Ingrid
Bergman (I.B), în godeul 4 Cristoph Columbus (C.C), în godeul 5 Rosa Canina (R.C), în
godeul 6 Acapella (A). S-a folosit primerul UBC 835b-(GA) 8 CT. În Figuriile 1.2-1.7
ordinea de încărcare a fost aceeași la soiurile de trandafir ca în Figura 1.1, diferența fiind
dată de primerii utilizați, astfel pentru: Figura 1.2 primerul utilizat a fost ISSR 1a, 1.3
UBC809, 1.4 ISSR 4b, 1.5 UBC 811, 1.6 UBC 823, 1.7 UBC 835b.
În Figura 1.8 reprezentată de dendrograma care prezintă filogenia dintre soiuri: Linia 1=nr
7 (A.B); Linia 2=nr 8 (R.B);Linia 3=nr 9 (I.B); Linia 4=nr 10 (C.C);Linia 5=nr 11 (R.c);
Linia 6=nr 12 (A).
Se observă faptul că: soiul de trandafir I.B(Ingrid Bergman) este cel mai înrudit cu A.B
(Abraham Darby), aceste 2 soiuri sunt înrudite cu R.B(Red Berlin) având un strămoș
comun cu acesta. R.B are undeva un strămoș comun cu R.C (Rosa canina).
Ultimele 2 soiuri cele mai înrudite sunt A (Acapella) și C.C (Cristoph Columbus), care
au un strămoș comun cu R.C (Rosa canina) mai îndepărtat.

Concluzii
După experimentele efectuate a rezultat, în urma interpretării rezultatelor, că cele mai
îndepărtate soiuri de trandafir din punct de vedere filogenetic sunt Ingrid Bergman (I.B) și
Cristoph Columbus (C.C) si cele mai înrudite sunt Cristoph Columbus (C.C) cu Acapella
(A).
Bibliografie
1. Godwin, I. D., Aitken, E. A., & Smith, L. W. (1997). Application of inter simple
sequence repeat (ISSR) markers to plant genetics. Electrophoresis, 18(9), 1524-
1528.
2. Gustafsson, Ä. (1944). The constitution of the Rosa canina complex. Hereditas,
30(3), 405-428.