Capitolul 14. METODE DE INTENSIVIZARE A REPRODUCŢIEI.

14.5. Transferul de embrioni

Transferul de embrioni reprezintă o metodă biotehnică de
intensivizare a reproducţiei la animale şi constă în recoltarea embrionilor,
aflaţi în diferite stadii de dezvoltare, din uterul femelei donatoare şi
introducerea lor în aparatul genital al femelelor receptoare, în vederea
continuării dezvoltării embrionilor până la parturiţie.

14.5.1. Importanţa transferului de embrioni

Prezintă importanţă din punct de vedere zootehnic, economic,
sanitar-veterinar şi ştiinţific. Astfel, prin transferul de embrioni se asigură
folosirea intensă la reproducţie a celor mai valoroase femele, care după
provocarea poliovulaţiei şi după fecundaţie vor fi utilizate ca donatoare
de embrioni. Iată deci că, prin această metodă modernă se restabileşte
egalitatea în ceea ce priveşte aportul masculilor şi femelelor la
ameliorarea efectivelor; masculii participă la îmbunătăţirea
performanţelor animalelor prin folosirea lor la însămânţări artificiale, iar
femelele prin producerea unui număr cât mai mare de embrioni
transferabili.
Certitudinea obţinerii de mai mulţi descendenţi valoroşi este mărită
şi datorită faptului că femelele valoroase desemnate ca donatoare de
embrioni, trebuie să fie împerecheate cu cei mai buni masculi. Se
intensifică prin transferul de embrioni şi ritmul ameliorării efectivelor.
Importanţa economică a transferului de embrioni rezidă în faptul că
se obţin mai mulţi descendenţi valoroşi rezultaţi din cupluri cu însuşiri
superioare, iar reproducătorii cei mai buni (masculi şi femele) sunt folosiţi
intens la reproducţie.

1
 Transferul de embrioni are şi importante implicaţii sanitar-
veterinare şi genetice. Interesul genetic se explică prin posibilitatea de a
schimba, fără risc, genele dorite, regrupate individual, independent de
mediul matern. În anumite condiţii de manipulare, transferul de embrioni
constituie mijlocul cel mai sigur pe plan sanitar-veterinar de mutaţie a
genelor.
De o mare actualitate, cu implicaţii sanitar-veterinare, dar şi
economice, este problema embrionilor purtători de boli. În cadrul
operaţiunilor de asanare, mii de animale contaminate sunt eliminate din
efectiv prin sacrificare, rezultând astfel pierderi economice imense.
Unele cercetări întreprinse de Singh Elizabeth şi col. în 1982, au
demonstrat că embrionii recoltaţi de la animale serologic pozitive şi
transferaţi la receptoare negative, nu au transmis infecţia la produşii
rezultaţi.
Din punct de vedere ştiinţific, transferul de embrioni permite
studierea proceselor intime ale reproducerii animalelor, ca şi utilizarea
unor metode biotehnologice conexe, cum ar fi: micromanipularea şi
microchirurgia ovulelor şi embrionilor, fertilizarea “in vitro”, conservarea
embrionilor pe lungă durată, obţinerea de himere, etc.
Ca un corolar al activităţii pe plan mondial în domeniul transferului
de embrioni, stau mărturie importantele consfătuiri şi simpozioane
ştiinţifice organizate în diferite ţări, care au subliniat importanţa acestei
biotehnologii. Astfel, în 1974, în SUA s-a înfiinţat “International Embryo-
Transfer Society”, care cuprinde specialişti din domeniul transferului de
embrioni la specia umană şi la animale. În Europa, la Paris, în 1982 s-a
constituit “L’ Association Europene de Transplantation Embrionaire”.
În ţara noastră s-au făcut lucrări de transfer de embrioni la taurine
(ICPCB Baloteşti, SEZ Tg. Mureş, Facultatea de Zootehnie şi
Biotehnologii Timişoara), la ovine (SCPCOC Palas, USAMV Cluj-Napoca
şi Timişoara), la suine (Romsuintest Periş) şi acestea continuă.

2
 14.5.2. Etapele transferului de embrioni
Transferul de embrioni cuprinde mai multe etape:
- alegerea donatoarelor şi receptoarelor;
- pregătirea femelelor donatoare şi receptoare;
- sincronizarea estrului la femelele donatoare şi femelele
receptoare;
- provocarea poliovulaţiei la femelele donatoare;
- recoltarea embrionilor şi controlul calităţii lor;
- conservarea embrionilor;
- transferul propriu-zis al embrionilor la femelele receptoare;
- îngrijirile donatoarei şi receptoarelor după transfer.

14.5.2.1.Alegerea donatoarelor
Alegerea donatoarelor este o etapă deosebit de importantă pentru
reuşita transferului de embrioni. În această activitate se ţine seama de
starea de reproducţie a efectivului din care provin donatoarele.
Principalele criterii de selecţie a donatoarelor sunt: rasa, vârsta,
valoarea zootehnică, dezvoltarea corporală armonioasă, starea de
sănătate perfectă, modul de comportare la reproducţie, modul cum au
decurs fătările anterioare, rezistenţa la boli, etc. Foarte importantă este
valoarea progesteronemiei, stabilită în perioada ciclului de control,
înaintea inducerii superovulaţiei. De mare actualitate este şi problema
utilizării şi reutilizării donatoarelor pe parcursul unuia sau mai multor ani
consecutivi. Pentru aceasta sunt cercetate posibilităţile de evitare a
îmbolnăvirilor donatoarelor în timpul sincronizării estrului, a provocării
poliovulaţiei, recoltării embrionilor şi altor operaţiuni legate de transferul
de embrioni.

14.5.2.2. Alegerea receptoarelor.

3
 Cu toate că, aparent, receptoarele sunt mai uşor de selecţionat
decât donatoarele, alegerea lor este o problemă complexă. Se au în
vedere mai multe criterii:
- este de preferat ca transferul de embrioni să se facă la tineret
femel şi primipare, deoarece la aceste categorii de femele
frecvenţa infecţiilor genitale este mai redusă, traumatismele
postpartum sunt mai rare, iar răspunsul la sincronizare este mai
bun;
- starea de sănătate perfectă, pentru aceasta fiind obligatoriu
examenul ginecologic;
- starea de întreţinere bună pentru a face faţă solicitărilor din
timpul gestaţiei;
- situaţia epizootologică a efectivului – bună.
Receptoarele pot avea călduri naturale sau induse hormonal. În
efectivele mici se recomandă sincronizarea provocată, iar din efectivele
mari se pot folosi femele cu călduri spontane, urmărite pe parcursul mai
multor cicluri.
Foarte importante sunt: depistarea căldurilor şi stabilirea
momentului optim pentru însămânţarea donatoarei şi respectiv transferul
propriu-zis la receptoare; este necesară eliminarea receptoarelor care nu
sunt bine sincronizate cu donatoarele.
Înainte de efectuarea transferului şi după acesta trebuie să se evite
stresul provocat de schimbarea bruscă a regimului de furajare,
separarea animalelor, variaţiile climatice, acţiuni sanitar-veterinare,
durata şi intensitatea zilei lumină (ovine).
Scopul acestor măsuri preventive este realizarea unui echilibru
hormonal, metabolic, de histocompatibilitate pentru a păstra calitatea
mediului uterin ce condiţionează implantarea şi nidaţia embrionului.

14.5.2.3. Inducerea poliovulaţiei la donatoare.

4
 Principalul factor limitativ în eficacitatea transferului de embrioni
este producţia de embrioni. Actualmente se apreciază că 30% din
donatoare nu produc niciun embrion utilizabil, iar 45% produc în medie 4
embrioni. Această diferenţă de răspuns se datorează, pe de-o parte,
variabilităţii produselor hormonale utilizate, iar pe de altă parte
receptivităţii individuale (Saumande, J. 1980, Buggin, M. 1990).
Pentru provocarea poliovulaţiei la donatoare se pot folosi diferite
scheme de tratament:
- administrarea de PMSG în doză unică sau în doze repetate, la
diferite intervale de timp, asociat cu anticorpi anti-PMSG şi cu
progesteron;
- folosirea FSH, obţinut din extracte hipofizare de porc;
- utilizarea uor produse comerciale, pure, de FSH şi LH;
- administrarea de gonadotropină corionică (HCG), urmată de
PGF2α la 48 ore după stimularea hormonală cu HCG.
Indiferent de substanţele stimulente utilizate, eficacitatea lor
depinde de reactivitatea ovarelor donatoarei, de echilibrul neuro-
hormonal şi metabolic al acesteia.

14.5.2.4. Sincronizarea estrului receptoarelor cu al donatoarelor.

În vederea asigurării condiţiilor optime pentru nidaţie şi dezvoltarea
produsului de concepţie transferat în organele genitale ale “mamei
adoptive” (femela receptoare) este necesară sincronizarea estrului
acesteia cu al “mamei naturale” (femela donatoare). Această necesitate
decurge din faptul că numai astfel modificările aparatului genital al
receptoarei sunt identice cu cele de la nivelul aparatului genital al
donatoarei.
Există două posibilităţi de sincronizare a estrului donatoarei cu
receptoarele: naturală şi hormonală.

5
 Sincronizarea pe cale naturală este mai greu de realizat, deoarece
necesită existenţa unui număr mare de femele din care să fie alese
receptoarele şi o perioadă mai îndelungată de timp, în care femela
donatoare şi viitoarele receptoare să fie urmărite riguros pe parcursul
mai multor cicluri succesive de călduri.
La ovine, această sincronizare constă în aplicarea “flushing-ului” şi
introducerea berbecilor în turma de oi. Flushingţul asigură o mai bună
metabolizare a proteinelor din hrană şi ca urmare creşte greutatea
hipofizei, care este urmată de intensificarea capacităţii acesteia de a
sintetiza hormoni gonadotropi: FSH şi LH. Prezenţa berbecilor în turmă,
prin feromonii elaboraţi, stimulează funcţia de reproducţie a oilor
(Signoret, J.P. 1991). Dacă, însă, berbecii sunt introduşi prea devreme în
turmă, înainte ca oile să fie receptive, atunci prezenţa berbecilor poate
avea efecte stimulative doar pentru o parte din oi, în timp ce altele îşi
prelungesc anestrul.
Sincronizarea căldurilor poate fi obţinută şi prin utilizarea unor
produse hormonale ca:
- cloprostenol, care este un analog al prostaglandinei PGF2α;
- PGF2α – în doză de 100-150μg, de 2 ori/zi, la intervale de 13-15
zile;
- progesteron – administrat intramuscular sau sub formă de
pesarii (bureţi vaginali) menţinute 11-12 zile, urmat de
inocularea a 400-750 U.I. de PMSG.
Metoda hormonală de sincronizare a estrului la cele două categorii
de femele, deşi este mai costisitoare, este mai răspândită în practică şi
rezultatele obţinute sunt mai sigure, mai bune.

14.5.2.5. Recoltarea embrionilor.

Tehnica şi momentul recoltării embrionilor variază în funcţie de
specie, cunoscându-se metode nechirurgicale şi metode chirurgicale.

6
 Metoda nechirurgicală de recoltare a embrionilor se aplică la
taurine şi ovine şi necesită un instrumentar adecvat cu ajutorul căruia se
realizează spălarea oviductelor şi a coarnelor uterine. Acest procedeu
de recuperare a embrionilor din aparatul genital al femelei donatoare se
aplică la câteva zile după momentul fecundaţiei, când embrionii se
găsesc la nivelul segmentelor respective.
La vacă, această metodă se aseamănă cu însămânţarea spermei
prin metoda bimanuală, în timp ce la oaie este necesară endoscopia
precedată de anestezie şi laparascopie; această metodă de recoltare a
embrionilor nu se aplică la scroafă datorită lungimii mari a coarnelor
uterine.
Recoltarea embrionilor prin metode chirurgicale se poate face de la
animale sacrificate sau de la animale vii. Astfel, în cazul sacrificării
animalelor, se pot recolta atât ovule pentru fecundare “in vitro”, cât şi
embrioni din oviducte sau din coarnele uterine. Această metodă nu este
răspândită datorită imposibilităţii reutilizării donatoarelor.
Recoltarea de la animale vii elimină acest neajuns, creând
posibilitatea reutilizării donatoarelor de mai multe ori. Se face la 4-5 zile
de la fecundare şi cuprinde următoarele momente operatorii: contenţia
femelei în decubit lateral sau dorsal (în funcţie de specie); laparatomia
pe linia albă, aproape de simfiza ischio-pubienă; exteriorizarea aparatului
genital; realizarea puncţiei cornului uterin cu un ac bont, care face parte
dintr-un circuit: oviduct-corn uterin-canulă-cateter-placă de recoltare-
pahar colector cu pereţii dubli; spălarea cornului uterin; examinarea
embrionilor cu stereolupa; cultivarea sau transferul imediat al
embrionilor; aplicarea unor tratamente postoperatorii pentru prevenirea
infecţiilor şi aderenţelor.

14.5.2.6. Examinarea embrionilor.

7
 După recoltare şi până când aceştia sunt transferaţi la receptoare
sau conservaţi, embrionii sunt examinaţi pentru a se aprecia viabilitatea
lor în momentul recoltării şi şansele ulterioare de a fi transferaţi.
Examenul embrionilor se realizează în două etape:
- identificarea şi clasificarea embrionilor;
- aprecierea viabilităţii embrionilor:
Prima etapă constă în identificarea şi recuperarea embrionilor din
lichidul de spălare, unul câte unul, cu ajutorul unei lupe binoculare şi a
unei micropipete şi introducerea lor într-o placă cu mediul de cultură; cel
mai des utilizat mediu de cultură este PBS (Phosphate Buffered Saline).
Urmează clasificarea lor astfel:
- ovocite nefecundate – au membrana pelucidă neregulată,
lipseşte conturul celular, apar vacuole şi dispersia materialului
celular;
- embrioni degeneraţi – caracterizaţi prin degenerescenţa
blastomerelor, apariţia în interiorul membranei pelucide a unei
mase netransparente, nestructurate;
- embrioni normali dezvoltaţi – au blastomerele integre şi în
număr variabil, în funcţie de momentul recoltării;
- embrioni retardaţi – au blastomerele integre, dar ca dezvoltare
nu corespund momentului recoltării.
Cea de-a doua etapă şi anume aprecierea viabilităţii embrionilor
are o mare importanţă pentru evitarea factorilor de risc în apariţia şi
instalarea mortalităţii embrionare, în timpul cultivării, conservării,
transferului, nidaţiei şi gestaţiei.
Metode utilizate pentru aprecierea viabilităţii embrionilor sunt:
- aprecierea morfologică;
- metode biochimice;
- metode histologice;
- cultura “in vitro”.

8
 În aprecierea morfologică a embrionilor se are în vedere o serie de
criterii, cum ar fi: sfericitatea embrionilor, forma şi regularitatea
embrionului, grosimea, fisurile membranei pelucide, transparenţa
embrionului, structura lui, conturul celular, variabilitatea taliei celulelor,
integritatea celulelor. Pe baza acestor criterii se stabileşte calitatea
embrionilor: excelentă, bună, mijlocie, slabă.
Dintre metodele biochimice utilizate amintim: folosirea diacetatului
de fluorosceină (devin fluorescente numai celulele vii), determinarea
consumului de glucoză, determinarea lactatdehidrogenazei, care este
invers proporţională cu calitatea embrionilor.
Prin metode histologice se apreciază ca fiind nesatisfăcători
embrionii care au celule cu nucleu picnotic.
Pentru cultura “in vitro” a embrionilor, se foloseşte mediul PBS, cu
adaos de ser de capră (25%) sau de ser fetal (20%) sau de ser de bou
(20%) sau de ser uman inactivat (20%); acest mediu complex se aduce
la temperatura de 37 oC şi trebuie să conţină 5% oxigen, 5% dioxid de
carbon, 90% azot.

14.5.2.7. Conservarea embrionilor.

Pentru menţinerea şi prelungirea viabilităţii embrionilor până în
momentul transferului, se folosesc diferite metode de conservare: de
scurtă durată şi respectiv de lungă durată.
Conservarea de scurtă durată asigură menţinerea embrionilor “in
vitro”, o perioadă variabilă de timp: 9-48 ore, în cazul conservării la
temperatura camerei; când temperatura este de 37 oC embrionii îşi
continuă dezvoltarea putând ajunge până în stadiul de blastocist; la
temperatura de 0-10 oC dezvoltarea embrionilor este oprită şi se reia la
37 oC. se folosesc diferite medii de cultură, dar rata gestaţiilor este mai
mică decât în cazul în care embrionii ar fi transferaţi imediat după
recoltare.

9
 Conservarea de lungă durată presupune congelarea embrionilor.
Embrionul, spre deosebire de spermatozoid este un ansamblu de celule
bogate în apă şi evoluează în timp. De aceea, congelarea embrionilor
este un proces mai complex, care impune măsuri severe pentru evitarea
mortalităţilor.
În procesul de crioconservare sunt implicaţi doi factori:
- evitarea formării gheţii intracelulare, care prin formarea de
cristale mari poate să ducă la distrugerea membranei
citoplasmatice;
- evitatarea deshidratării brutale.
Pentru evitarea acestor factori dăunători se iau următoarele
măsuri:
- asigurarea unei viteze optime de răcire. Pentru aceasta,
embrionul aspirat într-o paietă de plastic se introduce într-un
congelator programabil, echilibrat la –7 oC. Apoi temperatura
scade progresiv cu 0,3 oC, până ajunge la –30 oC, după care
paieta cu embrion se introduce în azot lichid la –196 oC.
- utilizarea crioprotectorilor pentru reducerea şocurilor osmotice:
dimetil sulfoxid (DMSO), glicerol 10% sau propandiol.
Eficienţa congelării în paiete se apreciază prin compararea ratei de
supravieţuire obţinută după stocare cu cea a ratei utilizării embrionilor
necongelaţi.
Începând cu lucrările lui Foley şi col. (1984), vitrificarea suscită un
mare interes în criobiologie, constituind o nouă cale de crioconservare a
embrionilor, prin care este depăşit obstacolul de formare a cristalelor
mari de gheaţă, intracelular.
Cu ajutorul vitrificării, trecerea de la stadiul lichid la cel solid se
realizează progresiv, astfel încât, la o temperatură suficient de joasă,
lichidul devine atât de vâscos încât are rigiditatea unui solid.

10
 În cazul metodelor clasice de congelare, concentraţiile de
crioprotector sunt prea mici pentru a obţine un stadiu vâscos şi la
exteriorul celulelor embrionare. De aici, necesitatea creşterii acestor
concentraţii, indiferent de viteza de congelare.
Inconvenientul major al concentraţiilor mari de crioprotectori este
toxicitatea acestora pentru embrioni. De aceea, s-a încercat reducerea
acestui efect toxic prin scăderea temperaturii şi a duratei de expunere a
celulelor înainte de congelare şi utilizarea unor amestecuri de
crioprotectori (glicerol+propandiol).
Embrionii aflaţi în diferite stadii de dezvoltare (morulă compactă,
blastocist tânăr, blastocist) sunt aspiraţi într-o paietă cu mediu de
vitrificare şi depuşi într-o picătură din acel mediu, situat la mijlocul
paietei. Picătura cu embrion este separată prin două bule de aer de o
soluţie de sucroză. Paieta se închide apoi la cele două capete şi este
plonjată progresiv în azot lichid, începând cu extremitatea dinspre capul
uzinal.
După o durată variabilă de stocaj, paietele sunt scoase din azotul
lichid şi imersate într-o baie de apă la temperatura de 20 oC, până
dispare gheaţa din soluţia de sucroză. Conţinutul fiecărei paiete este
trecut apoi într-o placă şi lăsat la temperatura camerei timp de 5-10
minute; apoi embrionii sunt trecuţi de 1-3 ori prin soluţie de PBS, înainte
de a fi puşi în cultură sau transferaţi la receptoare.

14.5.2.8.Transferul propriu-zis al embrionilor la receptoare.

Introducerea embrionilor proaspăt recoltaţi sau a celor congelaţi în
aparatul genital al receptoarelor se poate realiza prin metode
nechirurgicale sau chirurgicale.
Metodele nechirurgicale se aplică la vacă, după aceiaşi tehnică de
inoculare a spermei, prin metoda recto-vaginală.

11
 Metodele chirurgicale se aplică la oaie şi scroafă şi constau în
efectuarea laparatomiei pe linia albă, evidenţierea cornului uterin în care
se va introduce embrionul cu ajutorul unui pipete de plastic sau a unei
seringi speciale. Locul de depunere a embrionului trebuie să corespundă
cu dezvoltarea lui şi poate fi treimea posterioară a oviductului sau vârful
cornului uterin.
La oaie, transferul embrionilor se face şi prin metoda endoscopică,
procedându-se astfel: receptoarea se contenţionează în decubit dorsal, i
se face toaleta mecanică locală şi anestezia locală. Apoi se
puncţionează abdomenul şi se insuflă aer în cavitatea abdominală. Se
vizualizează cornul uterin corespondent ovarului cu corp galben şi se
fixează cu o pensă. Se puncţionează cornul uterin şi se depune
embrionul la locul corespunzător vârstei lui.

14.5.3. Perspectivele transferului de embrioni.

Transferul de embrioni va căpăta o extindere mai mare, deoarece
cu ajutorul lui pot fi studiate procese biologice, cum ar fi: limitele de
hrănire şi adăpostire a produşilor de concepţie în uter, relaţiile dintre
embrion-uter-ovar, influenţa unor factori genetici şi nutriţionali asupra
produsului de concepţie, crearea de linii consangvine, de rase noi.
Biotehnologiile finalizate prin transfer de embrioni cuprind
totalitatea metodelor şi tehnicilor rezultate din integrarea ştiinţelor
biologice, biochimiei, biofizicii, informaticii, în scopul manipulării genetice
a unui embrion, celule embrionare, nucleu, gene, etc. În cadrul acestora
se disting o serie de tehnici ca: fecundaţia “in vitro”, diagnosticul timpuriu
al sexului, manipularea genetică.
Fecundaţia “in vitro” cuprinde o serie de etape: obţinerea
ovocitelor, maturarea ovocitelor “in vitro”, capacitarea spermatozoizilor,
fecundarea, cultura embrionilor “in vitro”, transferul embrionilor.
Sexarea embrionilor se poate realiza prin:

12
 - procedeul citogenetic – presupune analiza cariotipului celulelor
trofoblastice, în metafază, recoltate prin microchirurgie; este
traumatizant pentru embrion;
- procedeul imunologic – se bazează pe prezenţa la suprafaţa
celulelor mascule a unui antigen de histocompatibilitate, numit
AgH-Y; acesta poate fi evidenţiat prin imunofluorescenţă sau cu
ajutorul anticorpilor monoclonali anti H-Y;
- procedeul enzimologic – care se bazează pe faptul că unele
enzime celulare sunt codificate de către gene din cromozomul
X; cantitatea acestor enzime este de 2 ori mai mare la celulele
femele decât la cele mascule;
- determinarea unei secvenţe de AND specifică cromozomului Y
ajută la identificarea embrionilor masculi, cu o precizie de 95%.
Biotehnica transferului de embrioni a creat posibilitatea obţinerii
ovulelor şi a embrionilor în stadiile de dezvoltare dorite, pe care apoi se
pot efectua diferite manipulări genetice. Cu ajutorul unui microscop
micromanipulator şi a unor microinstrumente specifice se pot efectua
diferite manopere microchirurgicale, cum ar fi:
- extracţiile de celule embrionare, pronuclei, fragmente de nuclei;
- secţionarea embrionului şi repunerea jumătăţilor rezultate în alte
membrane pelucide; obţinerea de himere, de clone;
- transferul de gene, grupuri de gene, nuclei diploizi.

13