Laborator 6.

Separarea ADN-ului prin electroforeză

Electroforeza în geluri de agaroză reprezintă metoda standard de analiză a acizilor

nucleici. Deplasarea moleculelor se face în prezența unui curent electric (acizii nucleici sunt
încărcați negativ datorită prezenței grupărilor fosfat și migrează spre electrodul încărcat
pozitiv). Mobilitatea electroforetică este influențată de următorii factori: concentrația de
agaroză, conformația moleculei de ADN (monocatenar, bicatenar sau superrăsucit), prezența
compusului fluorescent în gel, tamponul utilizat, tipul de agaroză și voltajul aplicat.

Figura 1. Tehnica de separare a acizilor nucleici prin electroforeză

orizontală (de tip submarin)

În Figura 1 este prezentată o cameră de electroforeză orizontală în care este imersat un

gel de agaroză.
Tehnica se folosește pentru determinarea purității ADN-ului sau ARN-ului, la
verificarea existenței produșilor rezultați în urma PCR-ului (reacție de polimerizare a
nucleotidelor sau de amplificare a ADN-ului) sau la analiza fragmentelor rezultate după
clivarea enzimatică (cu ajutorul enzimelor de restricție) a ADN-ului. Fragmentele analizate
pot avea mărimi între 1000 și 23000 pb (pb-perechi de baze). Unul dintre avantajele acestei
tehnici este acela că ADN-ul nu este denaturat, păstrându-și intacte elementele structurale.
Pentru a evita fragmentarea ulterioară a ADN-ului manipularea trebuie facută în așa fel încât
să se evite contaminarea cu amprente, picături, salivă sau microorganisme. Din acest motiv se
preferă utilizarea de materiale și soluții sterile (vârfuri, apă bidistilată sterilizată etc).
Cele mai folosite sisteme tampon (pH 8) pentru electroforeza în geluri de agaroză
sunt: TAE (Tris-acetat 40 mM, EDTA 1 mM), TBE (Tris- borat 45 mM, 1 mM EDTA), TPE
(Tris-fosfat 90 mM, EDTA 2 mM). Soluțiile tampon pentru electroforeză se pastrează sub
forma unor stocuri concentrate (10X-50X) la temperatura camerei.
Tamponul de încărcare are în componență un colorant (albastru de bromfenol sau roșu
de crezol 0,25%) care permite vizualizarea frontului de migrare și zaharoză (40%) sau
glicerină (30%) pentru a asigură o vâscozitate corespunzătoare la aplicarea probei.
Benzile sunt vizualizate cu compusi fluorescenți (SYBR Green I sau bromură de
etidiu) prin iradiere cu lumină UV. Sensibilitatea detecției variază între 100 pg și 1 ng/bandă.
Datorită faptului că acești coloranți se intercalează între bazele ADN-ului dublu catenar
(SYBR Green I se poziționează în adâncitura mare, iar bromura de etidiu se intercalează între
perechile de baze ale ADN-ului dublu-catenar), sensibilitatea detecției este influențată și de
lungimea lanțului acizilor nucleici.
 Mod de lucru
 Se toarnă gelul (0,3-3% agaroză în TBE; TBE-tampon) în camera de separare; în
prealabil se plasează două distanțatoare din material plastic care permit delimitarea
gelului;
 Se încălzește amestecul timp de 60 sec în cuptorul cu microunde;
 Se răcește soluția la 50C (temperatura este controlată cu ajutorul unui termometru
digital) și se adaugă 0,5 l bromură de etidiu 1 mg/ml (substanță fluorescentă care
complexează în special cu ADN-ul dublu-catenar permițând vizualizarea fragmentelor
de ADN separate);
 Atenție! Bromura de etidiu este un compus neurotoxic! Soluțiile se vor manevra folosind
mănuși de nitril. După electroforeză gelul nu va fi aruncat la coșul de gunoi! 
 Se așează pieptănul la o distanță de 1 cm de incinta în care se află așezat electrodul
încărcat negativ, după care se toarnă amestecul răcit la 50C și se așteaptă aproximativ
20 minute, timp în care gelul se solidifică;
 Se îndepărtează distanțatoarele din plastic și pieptănul;
 Se acoperă gelul cu soluție tampon (TBE) aproximativ 2-3 mm (această soluție se va
regăsi în ambele incinte unde se află electrozii);
 Se aplică probele de analizat (preparate folosind soluția tamponului de încărcare;
soluția de încărcare 6X conține 0,25% albastru de bromfenol, 40% zaharoză sau 30%
glicerină dizolvate în apă bidistilată) și probele de referință (un amestec de molecule
de ADN cu dimensiuni cunoscute – soluție standard 100 pb și 1 Kb);
 Se migrează probele timp de 40 min la 90V și 75 mA;
 Se îndepărtează soluția tampon, se vizualizează benzile separate prin excitare la
lungimea de undă de 254 nm (la întuneric);
 Fragmentele de ADN separate pot fi prelevate prin tăierea gelului și utilizate pentru
purificare sau digestie (cu enzime de restricție) sau pot fi transferate pe membrane
(tehnica Southern blot – după transfer pe membrane fragmentele imobilizate de ADN
monocatenar pot fi hibridizate cu alte fragmente de ADN etichetate cu substanțe
fluorescente);
 Gelurile pot fi redizolvate la cald în tamponul de migrare și reutilizate de 5-6 ori.

Întrebări:
1. Electroforeza este:
a) procesul de separare a fragmentelor de ADN;
b) procesul de adăugare de noi nucleotide la ADN cu ajutorul câmpului electric;
c) procesul de replicare al fragmentelor de ADN în câmp electric;
d) nici un răspuns.
2. Ce se întâmplă cu lanțurile de ADN de aceeași lungime?
a) se deplasează cu aceeași viteză și se plasează în zone diferite;
b) se deplasează cu aceeași viteză și se grupează în aceeași zonă;
c) se deplasează cu viteze diferite și se grupează în aceeași zonă;
d) nu se deplasează.
3. Ce compus este utilizat pentru developarea gelurilor în care se separă fragmente de ADN:
a) agaroza; b) poliacrilamida; c) glicerina; d) bromura de etidiu.
4. Electroforeza poate fi aplicata pentru separarea:
a) lipidelor; b) proteinelor; c) zaharurilor; d) ADN-ului.
5. Din ce motive se utilizează albastru de bromfenol la electroforeza acizilor nucleici?
6. Un fragment de ADN liniar a fost tăiat cu enzime de restricție (proteaze). Ținând cont de
faptul că ADN-ul are două potențiale situsuri de legare pentru enzimă, susceptibile la clivarea
enzimatică, identificați numărul de fragmente separate prin electroforeză după clivare.
 Bibliografie:
1. Westermeier, R. (2005) Electrophoresis in practice, 4th ed., Willey, Weinheim, Germany.
2. Jany K-D, Hahn H (1991) In: Bertram S, Gassen G (eds.) Gentechnische Methoden. pp. 39–43. Fischer,
Stuttgart.
3. Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T. (1989) Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed., vol. 1,
chapter 6, Cold Spring Harbor Laboratories Press.
4. Berger, S. L., Kimmel, A. R. (1987) Guide to molecular cloning techniques, In Methods in
Enzymology, vol 152, Academic Press, London.
5. Rickwood, D., Hames, B.D. (eds.) (1984) Gel electrophoresis of nucleic acids: a practical approach.
IRL Press, Oxford.
6. http://www.phschool.com/science/biology_place/labbench/lab6/analysis2.html
7. http://www.dnalc.org/resources/animations/gelelectrophoresis.html
 Laborator 6. Separarea ADN-ului prin electroforeză

Electroforeza în geluri de agaroză reprezintă metoda standard de analiză a acizilor

nucleici. Deplasarea moleculelor se face în prezența unui curent electric (acizii nucleici sunt
încărcați negativ datorită prezenței grupărilor fosfat și migrează spre electrodul încărcat
pozitiv). Mobilitatea electroforetică este influențată de următorii factori: concentrația de
agaroză, conformația moleculei de ADN (monocatenar, bicatenar sau superrăsucit), prezența
compusului fluorescent în gel, tamponul utilizat, tipul de agaroză și voltajul aplicat.

Figura 1. Tehnica de separare a acizilor nucleici prin electroforeză

orizontală (de tip submarin)

În Figura 1 este prezentată o cameră de electroforeză orizontală în care este imersat un

gel de agaroză.
Tehnica se folosește pentru determinarea purității ADN-ului sau ARN-ului, la
verificarea existenței produșilor rezultați în urma PCR-ului (reacție de polimerizare a
nucleotidelor sau de amplificare a ADN-ului) sau la analiza fragmentelor rezultate după
clivarea enzimatică (cu ajutorul enzimelor de restricție) a ADN-ului. Fragmentele analizate
pot avea mărimi între 1000 și 23000 pb (pb-perechi de baze). Unul dintre avantajele acestei
tehnici este acela că ADN-ul nu este denaturat, păstrându-și intacte elementele structurale.
Pentru a evita fragmentarea ulterioară a ADN-ului manipularea trebuie facută în așa fel încât
să se evite contaminarea cu amprente, picături, salivă sau microorganisme. Din acest motiv se
preferă utilizarea de materiale și soluții sterile (vârfuri, apă bidistilată sterilizată etc).
Cele mai folosite sisteme tampon (pH 8) pentru electroforeza în geluri de agaroză
sunt: TAE (Tris-acetat 40 mM, EDTA 1 mM), TBE (Tris- borat 45 mM, 1 mM EDTA), TPE
(Tris-fosfat 90 mM, EDTA 2 mM). Soluțiile tampon pentru electroforeză se pastrează sub
forma unor stocuri concentrate (10X-50X) la temperatura camerei.
Tamponul de încărcare are în componență un colorant (albastru de bromfenol sau roșu
de crezol 0,25%) care permite vizualizarea frontului de migrare și zaharoză (40%) sau
glicerină (30%) pentru a asigură o vâscozitate corespunzătoare la aplicarea probei.
Benzile sunt vizualizate cu compusi fluorescenți (SYBR Green I sau bromură de
etidiu) prin iradiere cu lumină UV. Sensibilitatea detecției variază între 100 pg și 1 ng/bandă.
Datorită faptului că acești coloranți se intercalează între bazele ADN-ului dublu catenar
(SYBR Green I se poziționează în adâncitura mare, iar bromura de etidiu se intercalează între
perechile de baze ale ADN-ului dublu-catenar), sensibilitatea detecției este influențată și de
lungimea lanțului acizilor nucleici.
 Mod de lucru
 Se toarnă gelul (0,3-3% agaroză în TBE; TBE-tampon) în camera de separare; în
prealabil se plasează două distanțatoare din material plastic care permit delimitarea
gelului;
 Se încălzește amestecul timp de 60 sec în cuptorul cu microunde;
 Se răcește soluția la 50C (temperatura este controlată cu ajutorul unui termometru
digital) și se adaugă 0,5 l bromură de etidiu 1 mg/ml (substanță fluorescentă care
complexează în special cu ADN-ul dublu-catenar permițând vizualizarea fragmentelor
de ADN separate);
 Atenție! Bromura de etidiu este un compus neurotoxic! Soluțiile se vor manevra folosind
mănuși de nitril. După electroforeză gelul nu va fi aruncat la coșul de gunoi! 
 Se așează pieptănul la o distanță de 1 cm de incinta în care se află așezat electrodul
încărcat negativ, după care se toarnă amestecul răcit la 50C și se așteaptă aproximativ
20 minute, timp în care gelul se solidifică;
 Se îndepărtează distanțatoarele din plastic și pieptănul;
 Se acoperă gelul cu soluție tampon (TBE) aproximativ 2-3 mm (această soluție se va
regăsi în ambele incinte unde se află electrozii);
 Se aplică probele de analizat (preparate folosind soluția tamponului de încărcare;
soluția de încărcare 6X conține 0,25% albastru de bromfenol, 40% zaharoză sau 30%
glicerină dizolvate în apă bidistilată) și probele de referință (un amestec de molecule
de ADN cu dimensiuni cunoscute – soluție standard 100 pb și 1 Kb);
 Se migrează probele timp de 40 min la 90V și 75 mA;
 Se îndepărtează soluția tampon, se vizualizează benzile separate prin excitare la
lungimea de undă de 254 nm (la întuneric);
 Fragmentele de ADN separate pot fi prelevate prin tăierea gelului și utilizate pentru
purificare sau digestie (cu enzime de restricție) sau pot fi transferate pe membrane
(tehnica Southern blot – după transfer pe membrane fragmentele imobilizate de ADN
monocatenar pot fi hibridizate cu alte fragmente de ADN etichetate cu substanțe
fluorescente);
 Gelurile pot fi redizolvate la cald în tamponul de migrare și reutilizate de 5-6 ori.

Întrebări:
1. Electroforeza este:
a) procesul de separare a fragmentelor de ADN;
b) procesul de adăugare de noi nucleotide la ADN cu ajutorul câmpului electric;
c) procesul de replicare al fragmentelor de ADN în câmp electric;
d) nici un răspuns.
2. Ce se întâmplă cu lanțurile de ADN de aceeași lungime?
a) se deplasează cu aceeași viteză și se plasează în zone diferite;
b) se deplasează cu aceeași viteză și se grupează în aceeași zonă;
c) se deplasează cu viteze diferite și se grupează în aceeași zonă;
d) nu se deplasează.
3. Ce compus este utilizat pentru developarea gelurilor în care se separă fragmente de ADN:
a) agaroza; b) poliacrilamida; c) glicerina; d) bromura de etidiu.
4. Electroforeza poate fi aplicata pentru separarea:
a) lipidelor; b) proteinelor; c) zaharurilor; d) ADN-ului.
5. Din ce motive se utilizează albastru de bromfenol la electroforeza acizilor nucleici?
6. Un fragment de ADN liniar a fost tăiat cu enzime de restricție (proteaze). Ținând cont de
faptul că ADN-ul are două potențiale situsuri de legare pentru enzimă, susceptibile la clivarea
enzimatică, identificați numărul de fragmente separate prin electroforeză după clivare.
 Bibliografie:
1. Westermeier, R. (2005) Electrophoresis in practice, 4th ed., Willey, Weinheim, Germany.
2. Jany K-D, Hahn H (1991) In: Bertram S, Gassen G (eds.) Gentechnische Methoden. pp. 39–43. Fischer,
Stuttgart.
3. Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T. (1989) Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed., vol. 1,
chapter 6, Cold Spring Harbor Laboratories Press.
4. Berger, S. L., Kimmel, A. R. (1987) Guide to molecular cloning techniques, In Methods in
Enzymology, vol 152, Academic Press, London.
5. Rickwood, D., Hames, B.D. (eds.) (1984) Gel electrophoresis of nucleic acids: a practical approach.
IRL Press, Oxford.
6. http://www.phschool.com/science/biology_place/labbench/lab6/analysis2.html
7. http://www.dnalc.org/resources/animations/gelelectrophoresis.html