Diagnosticul de laboretor al

infectiilor: de la coloratia
Gram la Genom

Dr. Otilia Banu

Formator acreditat MSP
 Domenii tematice identificate in
evolutia laboratorului de
microbiologie

• Testarea Sensibilității Antimicrobiene

• Rolul laboratorului clinic în diagnosticul
proceselor infecțioase
• Metodele conventionale versus moleculare,
pentru detectarea agentului patogen; rolul
Laboratorului de Microbiologie Clinică în
supravegherea epidemiologica
• Microbiologia Clinică în anul 2015
• Aspecte comerciale legate de Microbiologia
Clinică
 Diagnostic de urgenta
 Noile tehnologii in Microbiologia Clinica, vizeaza
în special diagnosticarea rapida a infectiei
sanguine (BSI) și a manifestarilor asociate
cunoscute sub numele de Sepsis, care este
printre primele 10 cauze de deces in lume (peste
600 de pacienti mor in fiecare zi).
 Standardele actuale se bazeaza pe diagnosticul
prin culturi, o metodă care poate dura 3 până la 5
zile pentru a produce rezultate, întârziere care a
fost identificata ca motiv cert, pentru mortalitate
ridicată și apariția rezistentei bacteriene la
antibiotice.
Puncte cheie

 Diagnosticul de laborator al infectiei

 Utilizarea adecvată a laboratorului
 Microscopie
 Culturi
 Testarea sensibilitătii
 Analize imunologice
 Metode rapide
 Randamentul ridicat de secvențiere (High
throughput sequencing)
Diagnosticul de laborator al
infecțiilor
 Daca clinicianul suspecteaza o infectie recomanda
recoltarea probelor de tesut sau fluide pentru analize:
Microbiologice
Imunologice
Biologie moleculara
 Probele includ:
Sange
Urina
Fecale
Sputa
Lichidele corpului
Puroi
Principiile de baza ale
diagnosticului microbiologic

 Colectare probelor
 Primirea probelor

 Procesarea probelor

 Testarea probelor (culturilor)

 Interpretarea rezultatului

 Raportarea rezultatului
O evaluare clinică adecvată este esentiala
pentru utilizarea optimă a serviciilor de
laborator !

Intrari

Laborator

Iesiri
 Factorii care limiteaza utilitatea
analizei microbiologice
 Recoltarea si manipularea
corecta a probelor
 Proba trebuie recoltata de la locul
infectiei
 Proba trebuie luata aseptic
 Marimea (cantitatea) probei trebuie
sa fie suficienta
 Cerintele metabolice ale
microorganismelor trebuie
mentinute pe toata perioada
recoltarii, pastrarii si transportului
• Probe necorespunzatoare
Ex. Saliva in loc de sputa
• Intarzieri in transport / pastrare
necorespunzatoare
Ex. LCR
• Suprainfectia cu contaminanti
Ex. Hemocultura
• Proba insuficienta/eroare de
prelevare
Ex. In recoltarea micobacteriilor

•Pacientul a primit tratament

antibiotic
 Biosiguranta in laboratorul de
microbiologie

• Laboratorul de microbiologie
prezinta factori de risc semnificativi
pentru personal

• Standardele de “buna practica”

sunt in masura sa ofere protectia
personalului

• Laboratoarele sunt clasificate in

functie de potentialul lor
contaminant, sau nivelul de
biosiguranta (BSL), nivele
desemnate de la BSL 1 la BSL 4.
 Coloratia Gram
 Coloratia Gram se aplica culturilor bacteriene sau
probelor biologice
 coloratia Gram nu este utila in orice situatie
- Micobacteriile au perete celular subtire care se evidentiaza
usor folosind coloratia acid/alcool
- Spirochetele sunt bacterii spiralate cu diametru extrem de
redus care nu se evidentiaza cu coloratie Gram
- Bacteriile cu localizare intracelulara, ca ricketiile si
chlamidiile, nu pot fi evidentiate cu coloratie Gram

Neisseria gonorrhoeae intr-un

frotiu din secretie uretrala
(Coci Gram negativi si PMN)

Cultura pura de Escherichia coli

(Bacili Gram negativi)
Culturi de microorganisme
patogene
 Medii solide:
- Pentru identificare
- Numaratoare de UFC
 Medii inclinate:
- Pentru pastare
culturilor pe termen indelungat
- Lowenstain-jansen pentru
tulpini TBC
 Medii lichide
- Pentru imbogatire
- Senzitivitate maxima (pt.
hemoculturi)
Culturi de microorganisme
patogene
 Desi multe microorganisme pot fi crescute in 18-24
ore “in vitro” exista unele exceptii semnificateive:
- Anaerobii si bacteriile cu necesitati nutritive
pretentioase, cresc in cateva zile/saptamani
- Mycobacteriile cresc cel mai greu (M. leprae
este necultivabila)
- Treponema pallidum nu pote fi cultivata “in vitro”
- Bacteriile obligat intacelulare (ex. Clamydia,
Rickettsia cresc in culturi celulare)
 Diagnosticul infectiilor cu crestere lenta sau
necultivabile are tendinta sa se bazeze pe metode
moleculare (PCR) sau serodiagnostic (detectia de
anticorpi)
Culturi de microorganisme
patogene
Multe patogeni de interes clinic pot fi izolati si identificati cu
medii de cultura:
 Nutritive de interes general
- Suporta cersterea multor bacterii aerobe si acultativ
anaerobe (ex. mediu cu sange)
 Medii de imbogatire
- Contin factori de crestere specifici care
favorizeaza cresterea unor patogeni pretentiosi
 Medii selective
- Lasa unele bacterii sa creasca in timp ce le inhiba pe
altele
 Medii diferentiale
- Permit identificarea microorganismelor dupa
cresterea si aspectul lor pe mediu (medii cromogene)
 Identificarea bacteriilor

 Morfologie
 Cerinte de crestere
 Biochimie
 Enzime
 Antigene
 Testarea sensibilitatii la
antibiotice
 Pe medii solide
- Tehnica Disc-
difuzimetrica
- E test
 In medii lichide
-Testul CMI
Testarea sensibilitatii la
antibiotice
 Procedura CMI
(concentratia minima
inhibitorie) se utilizeaza
pentru evaluarea
sensibilitatii
antimicrobiene la la
concentratii variate ale
unui antibiotic

Turbiditatea reprezinta cresterea dupa incubatie,

inseamna concentratia la care bacteria poate creste
(CMI = 2mg/l)
Diagnosticul infectiilor virale
 Microscopie electronica
 Detectia de antigene
 Detectia de anticorpi
 Culturi de virusuri
- Detectarea efectului
citopatic sau antigenul
 Metode moleculare
- Polymerase Chain
Reaction (PCR)
Teste imunologice pentru
diagnosticul infectiilor
Identificarea infectiilor prin masurarea
titrului anticorpilor anti –antigen produsi
de agentul patogen
 Aglutinare
 ELISA
 Radioimunodifuzie
Teste bazate pe celule T
 Testul cutanat
 Teste Intreferon gamma
 Aglutinarea

Aglutinarea pasiva
 Aglutinarea antigenelor
solubile sau anticorpilor
care au fost adsorbiti sau
cuplati chimic cu celule sau
particule insolubile (ex.
latex, perle , carbune)
 Reactia poate fi de pana la
5 ori mai senzitiva decat
cea cde aglutinare directa
Puncte cheie( outline)

 Diagnosticul de laborator al infectiei

 Utilizarea adecvată a laboratorului
 Microscopie
 Culturi
 Testarea sensibilitătii
 Analize imunologice
 Metode rapide
 Randamentul ridicat de secvențiere
 Metode microbiologice rapide
Tehnologii bazate pe Tehnologii bazate pe
crestere
componente
 masurarea parametrilor
biochimici sau fiziologici celulere
care reflecta cresterea • detectia componentelor celulare
microorganismelor include: specifice include:
 bioluminiscenta ATP:
• profilul acizilor grasi
AKuScreen pentru
screeningul contaminarii • spectrometria de masa
microbiene in farmaceutica • ELISA
 detectia colorimetrica a • detectia fluorescentei probei
productiei de CO2: Bactec;
BacT/Alert
 Metode microbiologice rapide
Tehnologii bazate pe acizi
nucleici
• Probe AND: Gene-Trak; Gene-
Probe
•Tipare moleculara
•PCR (Polymerase Chain Reaction)
si alte tehnologii de amplificare a
acizilor nucleici (NAATs= Nucleic Acid
Amplification Technology)
• Secventierea
Metode automate
• Se utilizeaza metode clasice pentru
procesarea probelor, apoi se detecteaza
modificarile colotimetrice care arata
cresterea mult inaintea detectiei vizuale
• Inlocuieste metodele de detectie umana
cu cele ale masinii; judecata umana cu
inteligenta artificiala
- Include : BacT/ALERT, VITEK,
Pheonix,s.a.
 Vitek 2
• Sistem complet automat pentru identificarea si
testarea sensibilitatii la antibiotice, a tulpinilor
bacteriene si levurice
• Reducerea timpului de setare si micsorarea
manualitatii pasilor de lucru
•Carduri complet sigilate pentru ID/AST
• Identificare rapida a microorganismelor
•Testare rapida (in aceeasi zi ) a sensibilitatii la
antibiotice
• Sistem Expert avansat de validare a ID
• Software de menegement a datelor capabil sa
genereze raportari epidemiologice si de testare
a sensibilitatii
 Xpert MTB/Rif
• Xpert® MTB/RIF purifica si concentreaza Mycobacterium tuberculosis din
sputa, izoleaza materialul genomic din bacteriile capturate prin sonicare si
consecutiv amplifica DNA care induc mutatii in gena care determina rezistenta
la RNA polymeraza beta (rpoB) in genomul Mycobacterium tuberculosis in
timp real folosind probe fluorescente numite beacons moleculare. Rezulatul se
obtine direct din proba de sputa in 90 minute, in conditii de biosiguranta si
operare simpla.
•Cartus sigilat
• Procedura de extractie robuste prin sonicatie/mecanica a AND
• Tinte incrucisate ale PCR pentru gena rpoB asociata cu rezistenta la
rifampicin
• Rezultat in 2 ore
 Urmatoarea generatie de secventiator de
randament ridicat

• De 100 x mai rapid, de 100 x mai ieftin, deci abordabil conventional

• Populatii clonale sablon obtinute prin metode noi:
- amplificarea in faza solida a cresterii de “colonii moleculare”
- cresterea masiva a numarului de clone , dar scurtarea lungimii de citire
• Biochimie noua pentru citirea secventei
- detectia pirofosfatului (detectia PPi dupa adausul de baza)
- o singura baza fluorescenta (blocheaza reversibil capatul 3„) adaugata
pe etapa: Solexa
- secventiere prin Ligatura (ABI SOLiD)
Puncte cheie( outline)

 Diagnosticul de laborator al infectiei

 Utilizarea adecvată a laboratorului
 Microscopie
 Culturi
 Testarea sensibilitătii
 Analize imunologice
 Metode rapide
 Randamentul ridicat de secvențiere
Randament ridicat al secventierii in
microbiologia clinica
 Detectarea si descoperirea agentilor patogeni
- Metagenomici clinice ("Metagenomul" = toatalitatea
comunitatilor microbiene, care ocupă diverse site-uri din
organism este estimat a fi mai mare de aproximativ 100 de
ori în termeni de conținut genetic decat genomului uman)
 Detectarea si descoperirea polimorfismului
- Epidemiologie genomica
- Modificari adaptive
 Biologia agentului patogenului
- Detectarea si descoperirea genelor
 Metodologii de secventiere

Cultura – dependente Cultura – independente

• Bibliotecă a ADN-ului • Profilul filogenetic: PCR cu

genomic purificat primers 16S
- Ofera secventierea intregului • Metagenomici: secventierea
genom AND-ului comunitar
Detectarea agentului patogen
independent de cultura
 Corpul uman găzduiește un consorțiu mare de
microorganisme, estimat sa depaseasca numarul
celulelor umane in proportie de 10 la 1.
 Microbiologia tradițională s-a bazat pe cultivarea si
caracterizarea microbioamelor umane și descoperirea
agentului patogen.
 Apariția de tehnici de cultură independente de cultura,
cuplate cu tehnologii avansate de secventiere a ADN-
ului si bioinformatica, au permis perspectiva fara
precedent in structura comunităților microbiene,
demonstrând faptul că amploarea deplină a diversității
microbiene, în orice ecosistem dat este rareori
descrisa prin cultivare.
 Detectarea agentului patogen
independent de cultura
 Două tehnici independente de cultura sunt utilizate pe scară largă pentru a descrie
populațiile microbiene:
1) metagenomice
2) profilurile comunitare.

 Tehnicile metagenomice implică extracția cu ridicata și secvențierea ADN-ul total

microbian dintr-un mediu, în timp ce profile comunitare se bazează pe amplificarea și
secvențierea genelor ARN-ului ribozomal (ARNr) 16S, foarte conservate
- Studiile Metagenomice pot oferi o perspectiva asupra taxonomie microbiene
(cine este acolo? ), diversitatii (cât de multe sunt acolo?), funcție (ceea ce fac ei?),
dar poate fi dificil de realizat pe o scară largă din cauza limitărilor informatice și de
secventiere.

 Profile comunitare descriu nu numai taxonomia și diversitatea, ci pot fi aplicate cu

ușurință la sute de probe, care sa permita studiile clinice pe grupuri considerabile de
pacienti
- Folosind profilurile comunitare, bazate pe pirosecventiere (454
pyrosequencing ) a genei 16S rRNA, s-au investigat comunitatile microbiene din lavaj
bronchoalveolar (BAL) probe de la pacienți cu transplant pulmonar, cu și fără
bronșiolita obliterante a(BOS), precum și controale la pacientii sanatosi.

Dana Willner, PhD, The University of Queensland, Unlocking Microbial Diversity with Metagenomics, St. Lucia, QLD, AUSTRALIA,
d.willner@uq.edu.au
Epidemiologie metagenomica: o cerinta a
politicilor de sanatate publica pentru controlul
rezistentei antimicrobiene.
 Intestinul este un spațiu comun în care interiorul și exteriorul
organismului fuzioneaza. Complexitatea microbiomului intestinal
moduleaza interacțiunea, și reflectă evoluția coordonata a
animalelor si micoorganismelor intestinale. Microbiomul intestinal
este expus la “resistomul” mediului intestinal și, de asemenea, la
substante microbiom-dăunătoare, cum ar fi antibiotice. Rezultatul
este un "reactor genetic-genomic-metagenomic", în care gene
de rezistență “sar” între diferite unități biologice de diferite niveluri
ierarhice, cum ar fi integroni, transpozoni, plasmide, clone,
specii sau comunități realizand schimbul genetic. Metagenomica
oferă posibilitatea de a explora prezența genelor de rezistență la
antibiotice, în toate aceste unități biologice și evolutive, precum și
pentru a identifica 'asociații cu posibil risc ridicat “

 Epidemiologia metagenomic este necesară pentru a înțelege, a

anticipa și a aplica interventii cu scopul de a limita rezistenta la
antibiotice
Baquero F. Department of Microbiology, Ramón y Cajal University Hospital, IRYCIS and CIBERESP, and Joint Unit
for Antimicrobial Resistance and Virulence, Ramón y Cajal Hospital-Centre for Biotechnology CSIC, Madrid, Spain,
Clin Microbiol Infect. 2012 Jul;18 Suppl 4:67-73. doi: 10.1111/j.1469-0691.2012.03860.x.
Epidemiologia genomului la
Acinetobacter
Detectarea unui focar epidemic intr-un spital din
Birmingham, sase pacienti au fost colonizati cu
tulpini ABC-MDR, imperceptibile prin tenhici
standard (PFGE- pulsed field gel electrophoresis si
VNTR -variable number tandem repeat)

 Analiza a 454 secvente a evidentiat 6 tulpini bacteriene

 Detectia SNP(single nucleotide polymorphisms) prin
cartografiere Trierea SNP pentru eliminarea probelor fals
pozitive
 Validarea SNP cu Sanger prin secventierea PCR a
ampliconilor

T. Lewis, N.J. Loman, L. Bingle, P. Jumaa, G.M. Weinstock, D. Mortiboy, M.J. Pallen, High-throughput whole-genome
sequencing to dissect the epidemiology of Acinetobacter baumannii Isolate s from a hospital outbreak , Journal of
Hospital Infection, Volume 75, Issue 1, May 2010, Pages 37-41, ISSN 0195-6701,
 De retinut
Secventierea genomului aduce avantaje:
 Deschiderilor (dezvaluirea necunoscutului necunoscutelor)
open-endedness (revealing the unknown unknowns)
 aplicatibilitate universala
 Ultimatum in rezolutie
 Banck-ul platformei de secventiere generează acum date
suficient de rapid și ieftin, avand un impact major asupra
problemelor clinice și epidemiologice ale lumii reale
 banck-top sequencing platforms now generate data
sufficiently quickly and cheaply to have an impact on real
world clinical and eoidemiological problems
 Nanotehnologii

 Stiinta
construirii
masinilor la
nivel
subatomic
 Perspective

 Tehnicile bazate pe nanomateriale promit sa fie capabile pentru o

seama de teste de diagnostic“in vitro”, avand in vedere ca scopul
suprem este detectia bolii cat mai devreme posibil, in stadiul in care
sa fie posibila detectia biomakerilor in cantitatea cea mai mica,
capabila sa anunte debutul bolii
 Avantajul cheie al nanoparticulelor este senzitivitatea senzitivitatii,
pentru o detectie rapida si acuratetea quantificarii biomakerilor ,
prezenti in concentratie foarte scazuta .
 Marea sensitivitate, poate face testele mult mai rapide, flexibile, cu
cerinte foarte reduse de biomarker tinta, ceea ce se reflecta in
reducerea costului.
 Nanoparticulele, daca sunt corect construite, pot realiza acuratete a
separarii mult superioara in tehnologiile moderne actuale.
Nanoparticulele de aur, punctele quantice, nanoparticulele
magnetice, nanotuburile carbonice , sunt exemple care ofera noi
platforme pentru imunotestele multiplexed cu posibilitatea
integrarii in matricele de secventiere rapida, deci in diagnosticul
clinic
Concluzii
Bibloigrafie
 Ordin MSP 1301/2007 /MO 617/06.11.2007 privind aprobarea Normelor privind
functionarea laboratoarelor de analize medicale
 Standard 15189 Laboratoare medicale. Cerinte particulare pentru calitate si
competenta
 Contract- cadru privind conditiile acordarii asistentei medicale in cadrul sistemului
de asigurari sociale de sanatate pentru anul 2010
 ORDIN MSP 1301/20.07.2007; SECŢIUNEA a 9-a. Managementul calităţii.
Controlul intern de calitate şi evaluarea externă a calităţii în laboratorul de analize
medicale.
 Bacteriologie medicala volumul I si II, editia 1985, Balbaie si Pozsgi
 Pocket guide to Clinical Microbiology ; 2-nd Edition Patrick R. Murray, ASM-Press,
Washington DC1998
 Clinical Manual of microbiology Patrick R. Murray, 2007
 Clinical Microbiology –Procedures Handbook ; Second Edition, Henry D. Isenberg,
vol 1,2 si 3, 2004
 CLSI – 2013, Performance Standards for Antimicribial Susceptibility Testing ;
Clinical and Laboratory Standard Institute
 EUCAST 3013 ( The European Committee for Antimicrobial Susceptibility Testing)
 Turton JF, Kaufmann ME, Gill MJ, et al.Comparison of Acinetobacter baumannii
isolates from the United Kingdom and the United States that were associated with
repatriated casualties of the Iraq conflict. J Clin Microbiol. 2006; 44 : 2630-4.