Imunologie LP PDF

Explorarea în laborator a
hemostazei
Pentru uz intern
Este interzisă copierea și distribuirea neautorizată a acestui material.
Hemostaza
• Functiile hemostazei:
• Mentinerea fluiditatii
sangelui in patul vascular
• Formarea trombusului la
locul leziunii si oprirea
hemoragiei
• Regenerarea peretelui
vascular
• In conditii fiziologice
factorii pro- si
anticoagulante se gasesc
in echilibru
• haemostasis equilibrium - Bing

images
INDICAŢIILE EXPLORĂRII HEMOSTAZEI
• Investigarea cauzei unei hemoragii/tromboze
• Monitorizarea terapiilor anticoagulante,

fibrinolitice sau substituţiilor de factori de
coagulare
• Evaluarea riscului de apariţie a hemoragiilor

înaintea intervenţiilor chirurgicale
• Screeningul diatezelor hemoragice/trombotice
• Evaluarea capacităţii de sinteză a ficatului

ASPECTE PREANALITICE
• Pregătirea bolnavului:
• evitarea efortului fizic (↑leucocitele, trombocitele)
• evitarea fumatului (creste agregabilitatea plachetara, induce
un status procoagulant, ↑ fibrinogenul si PAI-1 si ↓ tPA), a
băuturilor conținând cofeină (influenteaza activitatea
fibrinolitica), stresului (cresc reactantii de faza acuta,
fibrinogenul, fvW)
• interval recoltare 7-9 a.m, cu repaus fizic de minim 5 minute
inainte de recoltare
• Explorarea funcţiei plachetelor:
• nu se consumă medicamente care influentează funcţia
plachetară (antiagregante plachetare) (aspirina,
clopidogrel, etc)
• Explorarea trombofiliilor:
• Nu se administrează derivaţi de cumarină (Syncumar,
Trombostop, etc)
Aspecte preanalitice
• Erori preanalitice:
• Consumul de alimente- lipemie- influenteaza
rezultatele in cazul metodelor de detectie optice (nu si
in cazul celor mecanice)
• In cazul unui hematocrit mare-volumul de citrat ar

trebui adaptat (dilutie a plasmei)
• Ordinea de recoltare:
• Tub hemocultura
• Tub coagulare
• Tub biochimie
• Tub heparina
• Tub EDTA
• Respectarea tipului de anticoagulant (teste biochimice
pentru diferentierea plasmei citrat Na - K3EDTA

Recoltarea sângelui
o Tuburi cu citrat de sodiu 3,2% (dop albastru) din material care nu
induce activarea coagularii
o Grosimea acului 19-22 G (evitarea hemolizei)
o Se evită aplicarea garoului timp îndelungat
o Nu se recoltează primii 5 ml de sânge pentru probe de hemostază

(conţinut crescut de TF (factor tisular=F III))
o Nu se recoltează de pe branule spălate cu heparină , sau de pe linii

venoase
o respectarea raportului sange/anticoagulant si omogenizare imediată

o Transport: evitarea temperaturilor mari/mici
o Centifugare: 1500 g - minim 15 min
o Testarea – în 3 ore de la recoltare

Teste de laborator:
HEMOSTAZA
•Număr de trombocite
•TS (timp de sângerare)
•TC (timp de coagulare)
•TP (Timp de Protrombină/
Quick)
Injurie •APPT (Timpul de
vasculară tromboplastină
Răspuns
•. nervos
parțial activat)
Factor tisular
Constricție Agregare Cascada

vasculară plachetară coagulării
Tromb hemostatic primar
Activare
Flux sanguin plachetară Formarea de
redus fibrină
Tromb hemostatic
stabil

Hemostaza
•Primară – legarea plachetelor la colagenul expus

din subendoteliul vaselor lezate
•Secundară – activarea factorilor de coagulare
generarea trombinei
Etapele hemostazei
• Hemostaza primara – faza vasculo-plachetara

(vasoconstrictie locala, adezivitatea, agregarea
palchetara, secretia factorilor procoagulanti)
• Hemostaza secundara – activarea in cascada a
factorilor de coagulare si generarea trombinei
• Fibrinoliza- degradarea cheagului de fibrina

Investigarea hemostazei primare (faza
vasculo-plachetara)
• Timpul de sangerare
• Numaratoarea plachetelor sangvine
• Evaluarea functiilor plachetare –
• Testele de adezivitate plachetara
• Factorul von Willebrand (vWF)
• Agregabilitatea la ristocetina
• Testele de agregabilitate plachetara - agregometrie
• Evaluarea functiei de secretie plachetara

Investigarea hemostazei primare
• Trombocite (engl.PLT=platelets)
Număr
Morfologie
Funcţie
1. Timpul de sângerare
2. Adezivitatea plachetară
3. Agregabilitatea plachetară

Investigarea
hemostazei primare
Număr trombocite
- Valori normale: 150.000- 400.000 ∕ mm³
- Trombocitopenii (Tr ): < 100.000 ∕ mm³
purpură ∕hemoragii
- Trombocitoze (Tr ):

- fiziologice → mobilizare de la nivel splenic
- patologice → creşterea producţiei de plachete

• Scadere productie:
• Reducere megacariocite
• Hipoplazie medulara (iradiere, citostatice, etc)
• Congenitale
• Scaderea duratei de viata a Tr: distructie mecanism imun (purpura
autiomuna, HIV, purpura trombocitopenica idiopatica) consum excesiv
(CID, SHU, sepsis)
• Sechestrare splenica
• Trombocitopenie dilutionala
• Crestere: fiziologic (efort, menstruatie, lauzie, etc); reactie faza acuta,
regenerare medulara dupa anemii; boli mieloproliferative (LGC, MMM,
TV, PE, SMD)
• Anomalii calitative: defecte de aderare (deficit GpIb- sdr Bernard-
Soulier, deficit de GP IIb-II a- trombastenia Glanzmann) si activare
(deficit COX, Tx-sintetaza, defecte receptori TxA2), defecte de secretie
din granule
• Anomalii proteine plasmatice: boala vonWillebrand (neaderare
plachetara de endoteliu), afibrinogenemia

Cauzele
trombocitopeniilor
Cauze Cauze non- Productie
imunologice imunologice scazuta
Purpura trombocitopenica Consum crescut: Coagulare Anemie aplastica, infiltrarea
idiopatica (PTI) intravasculara diseminata tumorala a maduvei osoase
(CID)
Trombocitopenie imuna Purpura trombotica Tratamente cu citostatice
declansata medicamentos trombocitopenica (PTT)
Trombocitopenie aloimuna: Sindrom hemolitic uremic Defecte genetice (gena

neonatala, (SHU) MYH9)
posttransfuzionala
Trombocitopenie de Viroze, alcoolism
distributie: hypersplenism,
splenomegalie

Investigarea hemostazei
primare
Trombocite -morfologie
a.Frotiu periferic: trombocite b.Frotiu periferic: magacariocit
c.Frotiu periferic: trombocite agregate

Investigarea hemostazei primare –
timpul de sangerare (TS)
TS metoda Duke -măsoară durata sângerării provocate prin incizia unei zone mediane a
lobului urechii
- incizie standardizată: port-acul Francke +lanțetă (lățime1,3mm, adâncime 3mm)
- aprecierea duratei hemoragiei: se culeg picăturile de sânge cu o hârtie de filtru,
din 30 în 30 de secunde, prin absorbție și prin apăsare pe incizie
- testul se practică la ambele urechi, se face media rezultatelor obținute

• Valori normale: 2-4 minute
• Alungire semnificativă: > 5 minute
•

Timpul de sângerare prin metoda Ivy modificată
- stază venoasă la nivelul antebraţului (40mmHg)(presiunea sanvină capilară)

- 2 incizii paralele standardizate pe fața anterioară a antebrațului
(lungime 10 mm, adâncime 2 mm, 2 cm distanță intre ele )
- aprecierea duratei şi abundenţei hemoragiei
Valori normale: 2,5-9,5 min.

primare
•TS crescut:
• trombocitopenii
• trombocitopatii (afecţiuni ale agregării, adeziunii
trombocitare şi ale proceselor de secreţie
trombocitară)
• afecţiuni ale pereţilor capilari;
• Afectiuni combinate ale plachetelor si a factorilor de
coagulare
• Boala von Willebrand
•TS este normal în coagulopatii: hemofilii (A,B,C),

afibrinogenemii.

secundare

Coagulometria
• Măsoară timpul scurs de la
momentul adăugării reactivului
până la apariţia cheagului de
fibrină (în general momentul
gelificării şi nu cheagul de fibrină
stabilizat)
• Principii de masurare:
• inducţie electromagnetică
• Utilizarea substratelor cromogene + fotometrie
• lumino- agregometrie

Investigarea hemostazei secundare-
Timpul de protrombină (TP)(Timpul Quick)
Principiu: explorarea factorilor căii extrinseci si a caii comune (VII, X, V, II) =
complexul protrombic- timp de recalcifiere efectuat în prezența unui exces de
tromboplastină tisulară (F III)
-Permite evaluarea terapiei anticoagulante orale (cumarina)
-Test de baza in evaluarea CID
Tehnică:
- plasma citratată + CaCl2 (preîncălzite la 37°C, 5 minute)
tromboplastina (F III, preîncălzită la 37°C)
TP: timpul scurs de la adăugarea tromboplastinei tisulare până la formarea

cheagului (secunde)

secundare
1. Timpul de protrombină (PT)(Timpul Quick)
Valori normale: 11- 16 secunde
Timp de protrombină prelungit:

- lipsa factorilor II, V, VII, X
- avitaminoză K
- hepatită, ciroză
- anticorpi anti factor II, V, VII, X,
- hipo-sau afibrinogenemie, disproteinemie.
TP folosit pentru monitorizarea tratamentului cu anticoagulanți de tip
antivitamine K1 (anticoagulante orale)

Investigarea hemostazei secundare- Timpul de
protrombină (TP)(Timpul Quick)/INR
• Timpul de protrombină (PT)(Timpul Quick)

• Se exprima in secunde fata de plasma normala
• Se exprima in procente fata de o plasma martor normala-
indicele de protrombina (80-120%).
• Ca INR reprezinta (TQbolnav/TQ normal)^ISI
• ISI= international Sensitivity index –caracteristic
tromboplastinei utilizate (0.9-1.1)
•PT plasmă control (MNPT- Mean Normal Protrombin Time):
Media geometrică a PT determinat pe minimum 20 plasme
provenite de la persoane sănătoase;
•ISI: International Sensitivity Index;
•Valori critice:
• Normal INR=0.8-1.2
•INR < 0,5 (risc de tromboze)
•INR > 6 (risc de hemoragii)

Investigarea hemostazei secundare
2. APTT (Activated Partial Thromboplastin Time)
(Timpul de tromboplastină parțial activat)
Principiu:
- explorează coagulabilitate globală intrinsecă (factorii: XII, XI, IX, VIII
și X, V, II, I) cu excepția plachetelor
- se bazează pe recalcifierea plasmei deplachetate, în prezența cefalinei (substituent
plachetar) și a caolinului (activare standardizată a F XII)
plasma săracă în plachete + cefalină + caolin
(preîncălzite la 37°C, 3 min)
CaCl2
APTT: timpul scurs de la contactul plasmei (cu substituent

plachetar-cefalina) cu o suprafaţă electronegativă (caolină-
activator F XII), după adaos de Ca2+, până la apariţia cheagului
de fibrină (sec.)
Valori normale: 25- 40 sec

Alungirea APTT cu peste 9secunde se consideră valoare patologică
secundare
3. Timpul de trombină (TT)- informaţii asupra fibrinoformării
•Principiu:
• în prezenţa unei cantităţi standard de trombină o plasmă normală, cu nivel de
fibrinogen normal, coagulează într-un timp definit şi constant
• TT: timpul scurs de la adăugarea trombinei până la formarea cheagului de

fibrină (sec.)
•Valori normale: 10- 14 secunde
•Indicaţii: evidenţierea hipofibrinogenemiilor, disfibrinogenemiilor, afibrinogenemiilor,
monitorizarea terapiei cu heparină
•Valori crescute:
• Anomalii cantitative si calitative ale fibrinogenului
• Prezenta unei antitrombine in exces

Tratamentul anticoagulant
Boala tromboembolica principală cauză de deces
Forme clinice: - izolată (tromboze venoase,arteriale)

- generalizată (sindromul CID)
Tratamente antitrombozante:
- antiagregante plachetare (aspirina, clopidogrel)
- antivitamine K1(trombostop, cumarina) şi heparina
- trombolitice (streptokinaza, alteplaza, etc.)

Monitorizarea terapiilor cu anticoagulante
orale (cumarinice)
• Inhiba vitamin K epoxide-reductaza si vitamin K
reductaza
• Cumarina, Sintrom, Marcumar (antagonisti ai
vitaminei K), inhibă activarea factorilor
dependenţi de vit. K (II, VII, IX, X, proteina C,
proteina S).
• Teste de laborator: Timpul de protrombină
(PT)
INR=PR ISI (PR=rata protrombinică)
• Rezultate:
•Profilaxie secundară antitrombotica: INR 2-3;
•Terapie antitrombotică (valve mecanice, embolie
pulmonara): INR 2,5-3,5
•Terapie antitrombotică (endocardită infecţioasă,
valvulopatii ): INR 2-3
•>6 risc major de accidente hemoragice.
AVK
• Warfarina – (Wisconsin Alumni Research Foundation WARF
inventions)
• Administrare orala, dar cu farmacologie impredictibila (T1/2 scurt pt
acenocumarol si lung pt phenprocoumon); actiune cu debut lent
• Necesia monitorizare permanenta pana la stabilirea dozei optime
• Interactiuni cu multe medicamente (antiagregante) si alimente (care
contin vit K sau diversi inhibitori)
• Noi anticoagulante orale-Dabigatran, Rivaroxaban Apixaban
• Nu necesita monitorizare, au o cinetica simpla cu interferente
putine si un raspuns terapeutic rapid.
• Actioneaza specific pe cate un factor: Rivaroxaban, Apixaban-Xa;
Dabigatran-IIa.

Monitorizarea terapiei cu heparină
nefracţionată
• Complexul heparină-ATIII
inactivează
• trombina şi FXa,
• FXIIa, FXIa, FIXa
• Actioneaza prin
legarea de AT
• Biodisponibilitate
larga
• Testul recomandat: APTT

Heparina
- produsa endogen de diverse cellule
- dupa legarea de AT III induce modificari conformationale
care cresc interactiunea cu F IIa, Xa, IXa.
Administare exogena: anticoagulant terapeutic cu actiune rapida, cu
T1/2 scurt). AT III se leaga atat de forma oligozaharidica cat si
pentazaharidica a heparinei fractionate.
• forma oligozaharidica inhiba FIIa (+F V, VIII)
• forma pentazaharidica (Fondaparinux-forma sintetica a
heparinei) inhiba cu precadere FXa
• Antitrombina III (cofactorul heparinei): serin-proteaza sintetizata

hepatic, cu rol in indepartarea FIIa din circulatie; necesita formarea
complexului Heparina-AT III- FIIa.

Monitorizarea terapiei cu
heparină fracţionată
• Se obţine din heparină prin depolimerizare
controlată
• Inhibă FXa, în mai mică măsură FIIa
• Monitorizare obligatorie doar în:
• Hemoragie pe parcursul terapiei
• Insuficienţă renală
• Ineficienta profilaxiei trombozelor
venelor profunde
• Test de laborator: testul de inactivare a FX
activat
• Nu se recomanda utilizarea APTT in
vederea monitorizarii terapiei cu heparina
fractionata!
• Test de laborator cromogenic: testul de
inactivare a FXa (nu este influentat de
tehnica de recoltare, de reactantii de faza
acuta, de afectiunile hepatice)
Monitorizarea terapiei cu heparină
nefracționată și fracţionată

COAGULOPATIE
DOBÂNDITĂ: CID
• Sindrom (40-50 de stări patologice
individuale):
• Sepsis, tumori maligne, insuficienta
hepatica, embolie amniotică, sindrom de
făt mort, traumatisme, muşcătură de
şarpe, etc.)
• starea de activare a sistemului de
coagulare sub acţiunea factorului tisular
şi al diferitelor citokine, eliberate din
monocite, elemente subendoteliale;
• Tromboembolism diseminat cu ocluzii
arteriale şi necroză tisulară;
• Activarea fibrinolizei (plasmina)
• Activarea continuă determină consumul
factorilor de coagulare si trombocitopenie
marcata, cu apariţia hemoragiilor;
COAGULOPATIE
DOBÂNDITĂ: CID
• Indicaţii:
• Diagnosticul
coagulopatiilor prin
consum (Diagn Diferential.
Fibrinoliză primară şi
secundară)
• Diagnosticul
tromboemboliilor
• Dozare: metode imune

cantitative şi semicantitative

COAGULOPATIE
DOBÂNDITĂ: CID
• Evidenţierea D-dimerilor:
• F XIIIa stabilizează monomerii de fibrină prin legături
covalente încrucişate;
• Fibrinoliza degradează fibrina prin mecanism asemănător,

rezultând fragmente D şi E;
• Dacă anterior fibrinolizei s-a format fibrină stabilizată,

rezultă pe lângă monomerii de fibrină şi fragmente D-
dimerice legate prin legături covalente;

COAGULOPATIE
DOBÂNDITĂ: CID
• Diagnosticul de laborator în CID
• Evidențierea coagulopatiei de consum:
-  Trombocitele, prelungirea TP, APTT, ±fibrinogenului
• Evidențierea produșilor rezultați prin activarea coagulării in
vivo:
- monomeri solubili de fibrină
• Evidențierea răspunsului fibrinolitic compensator
- PDF (produși de degradare a fibrinei)/ D-dimeri
• Evidențierea complexelor între factorii activați ai coagulării și
antitrombină, a complexelor plasmină/2 antiplasmină

Panel CID
• Teste de laborator:
• TP – consumul factorilor caii extrinseci (FV!)
• APTT- consumul factorilor caii intrinseci (FVIII, FV)
• TT – aparitia produsilor de degradare ai
fibrinogenului/fibrinei, scaderea nivelului de
fibrinogen
• testul monomerilor de fibrină – evidentierea
monomerilor de fibrina
• Evidenţierea produşilor de degradare a
firinogenului/fibrinei (testul FDP,/D-dimeri)
• Numărătoarea trombocitelor – trombocitopenie prin
consum
• Frotiul periferic – prezenta fragmentocitelor

COAGULOPATIE DOBÂNDITĂ: CID
evoluția parametrilor de laborator
Normal Hipercoagu- CID I CID II
labilitate
Trombocite 250.000±50.000 N,   N,
Agregare N  N, N
TS 2’-4’ N N,  
aPTT 35’’-55’’ N,   
TP 12’’-15’’ N  
AT III 80-120% N  
Fibrinogenul 300±100 mg% N,   
Plasminogenul 10-20% N N,  
D-dimeri -, ± N + ++++
Monomeri de -, ± -, ± ++++ ++
fibrină
Diagnosticul de laborator în hemostază, F.Enache

Testul monomerilor de fibrina (testul MF)
• Indicatii: diagnosticarea CID, tromboze,

tromboembolii
• Interpretarea rezultatelor:
• Latex aglutinare: negative
• Metode imunologice: <15 mg/l

Evidentierea produsilor de degradare ai
fibrinogenului/fibrinei, D-dimeri (testul PDF)
• PDF se genereaza prin scindarea fibrinogenului si
a fibrinei de catre plasmina
• Determinarea D-dimerilor in suspiciunea de tromboembolism venos
reprezinta un diagnostic de excludere.
• Indicatiile determinarii:
• Produsi de degradare ai fibrinogenului:
• Suspiciunea de fibrinolizei
• DD intre coagularea intavasculara si hiperfibrinoliza
• F.rar, evaluarea retrospectiva a terapiei fibrinolitice
• D-dimeri: - activarea coagularii intravasculare cu
fibrinoliza secundara
• Susp. De tromboza venoasa profunda si embolie pulmonara
• CID si coagulopatie prin consum
• Monitorizarea starilor cu hiperfibrinogenemie

Inhibitorii coagularii: AT, PC, PS
Hemostasis and Thrombosis

Bagot, Catherine N., Medical Biochemistry, Chapter 41, 599-613
Sites of action of blood coagulation inhibitors. Antithrombin, protein C, protein S,

and tissue factor pathway inhibitor (TFPI). See text for details.
Copyright © 2019 © 2019, Elsevier Limited. All rights reserved.

Antitrombina (AT)
• Cel mai eficient inhibitor al proteinazelor coagularii activate,
inhibitor fiziologic al coagularii
• Deficitul de ATIII determina activarea coagularii, cu risc ridicat
de tromboza
• Indicatii:
• Coagulopatie de consum
• Screening pentru trombofilie
• Insuficienta hepatica
• Sindrom nefrotic
• Monitorizarea terapiilor cu administrare de AT
• Interval de referinta: 10-15 UI/l
• Valori crescute: colestaza, terapie cu anticoagulante de tip cumarinic
• Valori scazute: coagulopatie de consum, insuficienta hepatica, sindrom
nefrotic, deficit ereditar de AT, adm. de heparina, etc.
Sistemul proteinei C-Proteinei S
• Mecanism anticoagulant si fibrinolitic important
• Intervine in degradarea proteolitica a factorilor
Va si VIIIa in prezenta ionilor de Ca si ProtS
• Format din Proteina C-zimogen vit K dependent;
dupa activare are efect anticoagulant prin
inactivarea proteolitica a FVa si VIIIa (necesare
activarii FXa).
Deficitul de proteina C sau rezistenta la PC
activata (F V Leiden)-trombofilie (risc crescut 7x
de tromboze in cazul excesului de estrogeni,
sarcina)
• Proteina S-vit K dependenta, cofactorul proteinei
C
• Dozarea proteinei C
- ELISA – ca antigen
- teste functionale coagulometrice sau
imunologice

Proteina C
• Sintetizata in ficat, este dependenta de vit. K
• Este un inhibitor natural al factorilor V si VIII ai coagularii
• Activarea prin trombina si Ca legate de trombomodulina,
accelerata de proteina S
• Activarea fibrinolizei prin neutralizarea PAI-1
• Indicatii:
• Trombofilie
• CID
• Insuficienta hepatica
• Inaintea tratamentului cu antivitamine K
• Suspiciune de purpura fulminanta la nou-nascut
• Valori scazute:
• Deficit ereditar de proteina C
• Deficit dobandit de proteina C: deficit de vit. K, hepatopatii, CID
Rezistenta APC (Activated Protein C)/
mutatia factorului Leiden
• Un defect ereditar duce la ”rezistenta” fata de proteina C activata (APC) cu
hipercoagulabilitate:
• Mutatia genei factorului V Leiden (aprox. 5% dintre europeni): in gena
factorului V in pozitia 1691 guanina va fi substituita de catre adenina, iar pe
pozitia 506 arginina va fi inlocuita de glutamina
• Rezistenta sporita a factorului activat V la inhibarea de catre proteina C
• Indicatii: trombofilie (tromboembolism inexplicabil sau recurent la
pacienti <45 ani)
• test de coagulare care acţionează specific la nivelul complexului protrombinazei, prin utilizarea unui
activator de protrombină dependent de FVa izolat dintr-un venin de şarpe
• Se efectuează două teste de coagulare cu şi fără adăugarea de APC, după care se calculează raportul dintre
cei doi timpi; adăugarea APC va alungi semnificativ timpul de coagulare la persoanele cu genotip sălbatic,
• Pacienţii cu factor V Leiden prezintă rezistenţă la APC, astfel că timpul lor de coagulare nu va fi influenţat
semnificativ de adăugarea acestui reactiv;
• V.N: raportul celor doi timpi >2.5
• In caz APC, mutatie Leiden raportul este <2

Proteina S
• Cofactor al proteinei C activate, dependent de vit. K,
un inhibitor al coagularii
• Indicatii:
• Screening trombofilie
• Hepatopatii severe
• Valori scazute:
• Deficit ereditar de proteina S: sinteza scazuta sau
functie deficitara
• Deficit dobandit: deficit de vit. K, bolile parenchimului
hepatic

Fondaparinux
Rivaroxaban, Apixaban
Dabigatran etexilat

Facultatea de Medicină
Principiul metodelor imune de

diagnostic
Clasificarea si prezentarea metodelor
imune de diagnostic
Disciplina Laborator clinic
Pentru uz intern
Proprietăţile fundamentale ale sistemului
imun
• Specificitatea antigenica
• Memoria imună
• Recunoaşterea self-ului şi nonself-ului

Antigenele
• Proteine, polizaharide (molecule suficient de
mari)
• Lipidele, acizii nucleici- antigene slabe
• Caracteristicile antigenelor:
• Diferenta mare intre structurile proprii si cele ale antigenului
• Rapiditatea cu care este degradat antigenul (necesita un timp pana
recunoasterea de catre sistemul imun)
• Greutatea moleculara (haptenele slab imunogene)
• Stabilitatea structurala
• Complexitatea moleculei de antigen (structurile heteropolimerice
sunt mai imunogene)
• Epitopi- determinanti antigenici care
interactioneaza specific cu anticorpii sau cu
receptorii celulelor T

Dinamica răspunsului imun

Generarea celulelor efectoare si a
celulelor cu memorie

Interacţiunea Ag -Ac
• Legături necovalente între epitop şi
domeniul regiunii variabile a anticorpului:
• legături de hidrogen,
• legături electrostatice,
• interacţiuni hidrofobe
• forţe van der Waals
• Concept lacăt-cheie
• Reversibilitate
• Posibilitatea existenţei
legăturilor multiple

Factori care influenţează reacţiile
Ag-Ac
• Afinitatea (Fab-epitop)
Ac în exces Ag în exces
• Aviditatea
• Raportul Ag:Ac
• Forma fizică a Ag
• Specificitatea
(capacitatea unui anticorp specific
de a se lega de antigenul
complementar)/cross-reactivitate
Anticorpi heterofili Echivalenţă => formarea unei reţele
Aviditatea
Relative changes in CMV IgM, IgG, and IgG avidity levels over time following primary CMV infection. IgM pattern A
represents the typical IgM response pattern, whereas IgM pattern B represents long-term IgM persistence. In a CMV
IgG-positive individual, an IgM-positive result of 20 indicates infection around 3 months previously if the individual
exhibits IgM pattern A but around 6 months previously if the individual exhibits IgM pattern B.
By employing CMV IgG avidity testing, the correct time since infection can be determined; a low-avidity result
(expected to be about 30 based on this figure) indicates primary infection about 3 months previously, whereas a high-
avidity result (expected to be about 70) indicates primary infection more than 6 months previously.

Anticorpi policlonali
Polyclonal antibodies (pAbs) are antibodies that are secreted by different B

cell lineages within the body (whereas monoclonal antibodies come from a single cell
lineage). They are a collection of immunoglobulin molecules that react against a
specific antigen, each identifying a different epitope.

Producerea Ac monoclonali
- Laborator (prepararea reactivilor)
- Identificarea agentilor ingectiosi
- Clasificarea celuleor imune (CD)
- Identificarea antigenelor
tumorale, autoantigenelor
- Imunoterapie

Clasificarea aplicaţiilor analitice ale
interacţiunilor secundare Ag-Ac
Reactia Atg-Atc
Atg/Atc este fixat
In solutie In gel
pe suport solid
Tehnici Tehnici Tehnica Chemi-

Tehnici cantitative Tehnici cantitative
calitative calitative ELISA luminescenta
Dubla Imunodifuziunea
Latex-aglutinare Nefelometria Turbidimetria imunodifuziune radiala simpla Tehnica LAURELL
OUCHTERLONY MANCINI

Aglutinarea
• Aglutinarea când un anticorp interacţionează cu un antigen
multivalent, insolubil, cu legarea încrucişată a particulelor antigenice
de către anticorp şi formarea unor agregate mari, insolubile, vizibile
macroscopic sau microscopic. Aglutinarea nu are loc în cazul
haptenelor. Dimensiunea agregatelor depinde de raportul
concentraţiilor de antigen şi anticorp.
• Aglutinarea poate avea loc în două situaţii diferite:

• când un antigen unideterminat, multivalent (care conţine mai
multe copii ale epitopului „A”) interacţionează cu un singur tip de
anticorp (anti-A)
• când un antigen multideterminat, univalent (cu epitopii A, B, C etc.)
interacţionează cu cel puţin două tipuri diferite de anticorpi (anti-
A, anti-B etc.)

AGLUTINAREA
Ag este corpuscular (bacterie,

eritrocite-hemaglutinare,
particule inerte-latex)
Se formeaza un produs de aglutinare
Produsul de aglutinare este vizibil cu

ochiul liber
IgM IgG
Aplicatie limitata la serologia infectiilor BACTERIA
(determinarea de anticorpi specifici)

AGGLUTINATE
FORMATION
Aplicatie limitata la determinarea de
autoanticorpi
(factori reumatoizi)
Tehnici calitative in suspensie
Aglutinarea
Ex.: Latex aglutinarea

- detecţia creşterii nivelului de proteină C reactivă circulantă:
aglutinarea particulelor de latex legate de Ac anti- proteina C
reactivă
+ -
Reacţie calitativă
[INSERT FIGURE 17.11]
Reacţie semicantitativă
Latex-aglutinare
Ex. PCR – proteina C reactiva
Metoda automatizată- metoda

Metoda manuală- metodă cantitativă
calitativă/ semicantitativă -Metoda imunoturbidimetrica imbunatatita
cu particule
- PCR umana aglutineaza cu anticorpi

monoclonali anti-PCR fixati pe suprafata
unor particule de latex
- Precipitatul se determina turbidimetric la

=552 nm

Reactanţi de fază acută.
Proteina C reactiva (CRP = C reactive protein)
• Denumire: aglutinează cu un polizaharid (fracţiunea C )
din peretele Pneumococului;
• Rol: în apărarea antiinfecţioasă (actioneaza ca o
opsonina)
• În timpul reacţiilor de fază acută concentraţia poate

depăşi valoarea normală de peste 1000-2000 de ori;
• Concentraţia CRP creste rapid in 4-6 ore după
infectare/interv. chirugicala/trauma, si atinge nivelul
maxim la 24-72 de ore.
CRP
• Valoare normală: sub 5 mg/l
• Nou-născut: sub 15 mg/l
• Valoare crescută:
• Inflamaţie acută
• Boli reumatice
• Malignoame
• Interventii chirurgicale
• Infecţiile virale nu determină creşteri ale CRP, sau apar

creşteri moderate!
• Valoarea normala a CRP nu exclude existenţa unei boli
maligne!
Aglutinarea
Hemaglutinarea
Ex: determinarea grupelor sanguine
Aglutinarea
Hemaglutinarea
Ex: TPHA (Treponema Pallidum Hamaglutination Assay)
- determinarea cantitativa si semicantitativa a anticorpilor anti-T.pallidum in serul uman
- hematiile de pui stabilizate, sensibilizate cu o solutie antigenica de T.pallidum, aglutineaza in
prezenta anticorpilor anti-T.pallidum, generand un pattern caracteristic
Precipitarea
 Recţia de precipitare se desfăşoară după acelaşi

principiu ca şi reacţia de aglutinare, cu diferenţa
că antigenul este solubil.
 La un anumit raport între cantitatea de Ag şi cea

de Ac, legarea antigenului de către anticorp duce
la formarea de complexe insolubile.

PRECIPITAREA:
Ag is soluble
Precipitation in:
semi-solid medium (gel)
visual determination
in fluid:
instrumental determination
direct determination of precipitates:

turbidimetry,
nephelometry
PRECIPITATE
indirect determination of precipitates FORMATION
by secondary antibody labeled by:

- enzyme: EIA (enzyme immunoassays)
- isotope: RIA (radio immunoassays)
- luminofore: LIA (luminiscence immunoassays)
„
Precipitarea
 Pentru o concentraţie fixă a anticorpului, cantitatea de precipitat

format depinde de cantitatea de antigen.
 La concentraţii mici de antigen, anticorpul este în exces şi se
comportă univalent, iar formarea precipitatului este inhibată (“efect de
prozonă”).
 În zona de echivalenţă, antigenul şi anticorpul sunt prezente în
proporţii aproximativ egale şi se formează o cantitate maximă de
precipitat.
 La concentraţii mari de antigen, acesta se comportă univalent,
excesul său nepermiţând formarea unei reţele mari, insolubile de
precipitat (efect de postzona)

Immune Testing

1. AGLUTINARE 2. PRECIPITATARE
Ag CORPUSCULAR Ag SOLUBIL
IgM IgG
BACTERIE
FORMAREA FORMAREA
PRODUSULUI DE PRECIPITATULUI
AGLUTINARE
Tehnici cantitative in gel
Imunodifuzia radială simplă (Mancini)
• Este un test cantitativ pentru antigene.
• Acest test este efectuat într-un gel care conţine o concentraţie constantă,
uniformă de Ac, în întregul volum al gelului.
• Diferite concentraţii de Ag dizolvate în volume standard sunt plasate
ulterior în godeurile rotunde realizate în gel.
• Plăcile sunt lăsate la incubat cel puţin
24 ore, perioadă în care Ag difuzează
în gel. Pe măsură ce Ag se depărtează
de godeu, concentraţia acestuia scade
proporţional cu pătratul distanţei
parcurse. Când concentraţia Ag ajunge
la un raport optim cu concentraţia Ac
din gel (zona de echivalenţă), se
formează o linie de precipitat sub
formă de inel centrat de godeu.
Diametrul inelului (d) este un
indicator al concentraţiei antigenului.

Imunodifuziunea radială simplă
(Tehnica Mancini)
 [Ag] ~ d2
Imunodifuzua radiala simpla (Mancini) (2)
[Ag] ~ d2
Tehnica Laurell
• Gel de agaroză cu anticorpi
preîncorporaţi;
• Decupare godeuri la catod, în
care se pipetează serurile de
control şi probele de la
bolnavi;
• Migrare în câmp electric;
• Se formează conuri de
precipitare de dimensiuni
proporţionale cu
concentraţia antigenului care
urmează a fi evidenţiat;

Metoda dublei imunodifuzii Ouchterlony-
tehnică calitativă
• Reactie de precipitare in gel.
• Se efectuează 2 godeuri în gel:

• Într-un godeu se pune o soluţie de Ag, Incubare 12-48h (la 37° С)
• În celălalt godeu se pune o soluţie de Ac.
• Reacţia de precipitare: la zona de echivalenţă se formează un precipitat vizibil.
Metoda dublei imunodifuzii Ouchterlony.
Aplicatii
• 1.Testarea prezenţei unor anticorpi serici:
• Ag complementar cunoscut => identificarea prezentei unui Ac
• Amestec de Ag cunoscute => identificarea prezenţei mai multor Ac
Aplicatii
• 2. Testarea identităţii antigenelor:
• Ex.: într-un godeu a fost amplasat un amestec de anticorpi, iar aceştia, la

contactul cu antigenele din cele două godeuri, generează linii de precipitare
independente.
• Caz 1: antigene identice.
• Caz 2: un astfel de model demonstrează non-identitatea celor două antigene.
• Caz 3: este prezentă o linie de precipitare similară modelului de identitate, dar
care prezintă un „pinten” suplimentar. Acesta reflectă faptul că cele două
antigene au epitopi în comun, dar că antigenul y prezintă şi epitopi
suplimentari, responsabili pentru reacţia suplimentară a unor molecule de Ac.
Aplicatii
Imunelectroforeza. Tehnica calitativă
• Reprezintă o variantă a precipitării în gel, în care unul dintre componentele

reacţiei Ag-Ac, de obicei antigenul, este supusă întâi separării în câmp
electric.
• După separarea electroforetică a fracţiunilor antigenului, se realizează un

godeu lung paralel cu direcţia de migrare a proteinelor, în care va fi
introdus Ac sau amestecul de Ac.
• Moleculele de Ac şi de Ag difuzează în gel şi, în zona de echivalenţă apar

arcuri de precipitare.
• Este efectuată, de obicei, când este necesară confirmarea prezenţei unui

component monoclonal detectat prin electroforeză.
Tehnici calitative in gel
Imunelectroforeza
Imunelectroforeza nu este o metodă cantitativă.

FIGURE 6-6 (a)
Immunoelectrophoresis.
- an antigen mixture is first electrophoresed to separate its components by charge
- diffusion & producing lines of precipitation.
Imunelectroforeza
Tehnici cantitative in
 Măsurarea intensităţii unei
radiaţii luminoase reflectate sub
suspensie Nefelometria
un anumit unghi;
 Nefelometria măsoară
intensitatea luminii
împrăștiate sub un anumit
unghi, la trecerea unei radiații
prin proba de analizat.
 Turbidimetria - masoara
intensitatea luminii transmise
prin proba
- utilizata in cuantificarea
proteinelor serice
- IgG, IgA, IgM si IgE
- C3, C4, C1 inhibitor
- haptoglobina, PCR, transferina,
albumina, alfa1-antitripsina,
alfa2-macroglobulina,
fibrinogenul, ceruloplasmina,
factorul reumatoid

Tehnici cantitative in suspensie
Turbidimetria
 Turbidimetria măsoară
scaderea intensitatii unei
radiatii luminoase care nu
isi modifica drumul optic,
la trecerea prin proba de
analizat, datorita reflectiei,
absorbtiei sau imprastierii.
 Turbiditatea intr-un lichid

– cauzata de prezenta
particulelor suspendate,
care sunt fin divizate. Daca o
raza trece printr-o proba
turbida, intensitatea este
redusa de imprastiere, iar
cantitatea luminii
imprastiate este dependenta
de concentratia si marimea
particulelor.

Metode imune suport solid
• ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent assay):
• Anticorpi marcati cu peroxidaza(necompetitive-
direct, indirect/competitive, de captura), fosfataza
alcalina, etc
• Chemiluminiscenta:
• anticorpi marcati cu isoluminol, acridinium esteri
• Electrochemiluminiscenta:
• Anticorpi marcati cu rutheniu (complex Rutheniu-
tripropilamina)
• Fluoroimmunoassay:
• Marcaj cu molecule fluorescente

Determinarea calitativa a AgHbs prin - ELISA
➀ Godeu acoperit cu anticorpi anti-HBs (monoclonali, de şoarece).

➁ HBsAg din mostră sau control.
➂ Conjugat enzimatic: anticorpi anti-HBs (de oaie), conjugaţi cu peroxidază din hrean
(PH).
Teste de fază solidă
ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay)
ECLIA (Electrochemiluminescence Assay)
https://www.youtube.com/watch?v=PHbcvBGfzMM
LP 3 Imunologie
Hemoleucograma automata
Frotiul periferic
Sistemul imun
• Sistemul imun – sumă de celule şi molecule ce protejează

organismul de infecţii, transformări maligne şi celule proprii
transformate (non-self)
• Imunitatea:
• Înnăscută
• Celulară
• Umorală
• Dobândită
• Celulară
• Umorală

Celulele sistemului imun celular nespecific
•Fagocite:
•Neutrofilele – fagocitează bacterii
•Macrofage - "big eaters" , APC
•Leucocite non – fagocitare:
•Bazofile - conţin granule toxice ce pot
distruge microorganisme străine. Sunt
implicate în răspunsul alergic;
•Mastocite – asemănător bazofilelor,
conţin o varietate de substanţe
proinflamatoare inclusiv histamină şi
serotonină;
•Limfocite NK – apărare antivirală,
antitumorală chiar si in absenta MHC; Macrofag distrugând bacterii
•Eozinofile - secretă enzime ce
omoară paraziţi; eliberare
peroxidaza cu generare acid
hipocloric, proteina bazica-distructia
parazitului, prot cationice-
neurotoxina cu distructia
parazitului

Provenienţa leucocitelor din MO

Explorarea apărării imune celulare
nespecifice
• Hemoleucograma automată
• Frotiul periferic
• Testul de fagocitoză

Hemoleucograma automată
 Definiţie
◼ Hemograma automată reprezintă o serie de
teste folosite pentru a evalua compoziţia şi
concentraţia componentelor celulare în sânge.
Constă în efectuarea următoarelor teste:
numărul de leucocite, numărul de hematii,
numărul de plachete, măsurarea concentraţiei
de hemoglobină, clasificarea leucocitelor
(formula leucocitară), calcularea hematocritului
şi a indicilor eritrocitari MCV, MCH, MCHC.

 Indicaţiile determinării:
◼ Investigarea cantitativă a numărului de leucocite –
imunitatea celulară nespecifică şi specifică
◼ Test de rutină pentru verificarea capacităţii de
transport a oxigenului(Hg)
◼ Diagnosticul anemiei
◼ Indentificarea persoanelor cu potenţiale infecţii
◼ Indentificarea bolilor cronice sau acute (ex. Leucemii
acute sau cronice)
◼ Investigarea hemostazei – numărul de plachete
◼ Monitorizarea tratamentului anemiei şi a altor
afecţiuni hematologice
◼ Determinarea efectului chimioterapiei şi radioterapiei
asupra producţiei de celule sanguine

 Parametrii hemogramei:
◼ WBC - White Blood Cell sau număr de leucocite
◼ NEU - neutrofile (număr absolut şi procentual)
◼ LYM - limfocite (număr absolut şi procentual)
◼ MONO - monocite (număr absolut şi procentual)
◼ EOS - eozinofile (număr absolut şi procent)
◼ BASO - bazofile (număr absolut şi procent)
◼ RBC - Red Blood Cell sau număr de eritrocite
◼ HGB - hemoglobină
◼ HCT - hematocrit= (RBCxMCV)/10
◼ MCV - Mean Corpuscular Volume ( volumul corpuscular mediu)= HCT/RBC x 10
◼ MCH - Mean Corpuscular Hemoglobin (hemoglobina corpusculară medie)=HGB/RBC x 10
◼ MCHC - Mean Corpuscular Hemoglobin Concentration (concentratia medie de
hemoglobina corpusculară)= HGB/HCT x 100
◼ RDW - Red Cell Distribution Width (lăţimea distribuţiei eritrocitelor; heterogenitatea);
◼ CV - Coeficientul de variaţie
◼ PLT - Platelet sau număr de trombocite
◼ MPV - Mean Platelet Volume (volumul trombocitar mediu)
◼ PDW - Platelet Distribution Width (lăţimea distribuţiei trombocitelor)

Indici eritrocitari

 Recoltare:
◼ Se recoltează sânge integral venos sau capilar, pe
anticoagulantul K3EDTA (eprubete cu dop mov).
Probele recoltate pe heparină sau citrat de sodiu pot
fi prelucrate, însă anumite rezultate pot fi afectate
datorită utilizarii acestor anticoagulanti.
◼ ICSH (International Committee for Standardization in

Haematology) prevede ca probele din sânge integral
proaspăt să se prelucreaze pe parcursul a 4 ore de la
recoltare.

 Principii de măsurare:
◼ Pentru determinarea WBC şi formulei leucocitare se

foloseşte citometria în flux cu laser cu
semiconductori
◼ RBC şi PLT sunt numărate şi măsurate folosind

impedanţa şi focusarea hidrodinamică
◼ Determinarea concentraţiei de hemoglobină se face

colorimetric folosind metoda cu sodiu lauril sulfat
(SLS)

Citometria în flux
•Tehnică ce permite analiza simultană a mai multor

caracteristici celulare
•Celulele analizate se află în suspensie
•Parametrii sunt determinaţi pentru fiecare celulă în

parte
Dimensiunea relativă a celulelor (FSC –Forward
Scatter)
•Complexitatea structurală internă (SSC –Side Scatter)
•Emisia fluorescentă relativă
•Viteza de analiză: 200 –30.000 celule/sec

Citometria în flux
 Celulele trec în flux prin
dreptul razei laser; celula
este menţinută în axul
fluxului
 Forward scatter (“FSC”)
◼ Lumină transmisă prin
împrăstiere la 180°
◼ Proporţională cu suprafaţa
(dimensiunea) celulei
 Side scatter (“SSC”)
◼ Lumină refractată si
împrăstiată la 90°
◼ Proporţională cu
complexitatea structurală
internă a celulei

FSC ŞI SSC
Forward Scatter
LASER
LASER
Side Scatter

Impedanţa / Focusarea hidrodinamică
 La trecerea unei celule prin
orificiul detectorului se
produce o modificare a
impedanţei între cei doi
electrozi ceea ce generează
un impuls electric
proporţional cu volumul
celulei.
 Permite separarea corectă a
hematiilor mici de plachete
 Previne dubla numărare a
acestora
 Permite obţinerea unei
curbe de distribuţie
gaussiană pentru mărimea
hematiilor şi plachetelor.

Impedanţa / Focalizarea hidrodinamică

Determinatea concentratiei Hgb-metoda SLS
 Metoda colorimetrica, rapida, netoxica de determinare a

concentratiei de hemoglobina din proba
 Hemoglobina eliberata in urma lizei hematiilor se transforma

in methemoglobina (Fe2+ trece in Fe3+)
 Met Hgb se combina cu SLS -> SLS HGB
 Curba de absorbtie la 535 nm si 560 nm.

Aspectul hemogramei normale

Valori normale adulţi – Femei / Barbati
ANALIZE VALORI U/M ANALIZE VALORI U/M
Leucocite 3.6-10 x103/μL
Leucocite 3.6-10 x103/μL LY 20.5-51.1 %
LY 20.5-51.1 % LY# 1.2-3.4 x103/μ
LY# 1.2-3.4 x103/μ MO 1.7-9.3 %

MO 1.7-9.3 % MO# 0.1-0.6 x103/μL
MO# 0.1-0.6 x103/μL GR 42.2-75.2 %
GR 42.2-75.2 % GR# 1.4-6.5 x103/μL
GR# 1.4-6.5 x103/μL BA 0-1 %
BA 0-1 % BA# 0.01-0.08 x103/μL
BA# 0.01-0.08 x103/μL EO 0-4 %
EO 0-4 %
EO# 0.03-0.04 x103/μL
EO# 0.03-0.04 x103/μL
Eritrocite 3.50-6 x106/μL
Eritrocite 3.50-6 x106/μL
HGB 12-17 g/dl
HGB 11-15 g/dl
HTC 36-54 %
HTC 36-48 %
MCV 80-95 fl
MCV 80-95 fl
MCH 27-36 pg
MCH 27-36 pg
MCHC 31-36 g/dl
MCHC 31-36 g/dl
Trombocite 150-450 x103/μL
Trombocite 150-450 x103/μL
Explorarea apărării imune celulare nespecifice
Modificări ale formulei leucocitare
• leucopenie – număr scăzut de • leucocitoză – număr crescut de
leucocite (WBC < 3000/μl cu leucocite (WBC > 10.000/μl:
morfologie normală) celule tinere, vacuole
✓ insuficiență/fibroză/aplazie citoplasmatice, corpi Dὄhle)
medulară; ✓ infecţie, inflamații;
✓ consum masiv de leucocite în ✓ boli hematologice, leucemie;
infecțiile bacteriene, mai rar în ✓ sarcină;
infecțiile virale;
✓ boli autoimune; ✓ menstruaţie;
✓ boli cronice; ✓ efort fizic excesiv;
✓ neoplasme, boli hematologice; ✓ traumatisme;
✓ reacții medicamentoase, ✓ inflamație;
chimioterapie; ✓ boală Cushing
✓ malnutriţie. ✓ policitemia vera

Modificări ale formulei leucocitare - granulocitoză

Explorarea apărării imune celulare nespecifice
• neutrofilie – număr crescut de
PMN
✓ infecţii acute și cronice,
• neutropenie – număr scăzut de
inflamații;
neutrofile (PMN < 1.500/μl)
✓ boli hematologice;
✓ reacție leucemoidă: neutrofilie
✓ PMN < 500/μl – risc mare pentru
severă cu forme tinere și imature
apariția infecțiilor bacteriene;
(nesegmentate, mielocite) în
✓ neoplasme, boli hematologice; procese reactive, infecții
✓ reacții medicamentoase, bacteriene;
chimioterapie; ✓ reacție leucoeritroblastică:
✓ leziuni ale măduvei osoase. neutrofilie severă cu forme tinere
(nesegmentate), imature
(mielocite) și eritrocite nucleate

•Eozinofilie:
•infecţii parazitare
•reacţii alergice
•Eozinofile ↓ •astm bronşic
•sinteză crescută de corticosteroizi •eczeme
•sindrom Cushing •pemfigus
•administrare de epinefrină/ tiroxină/prostaglandine •dermatită herpetiformă
•infecţii bacteriene acute cu deviere marcată la stânga a •boli autoimune
formulei leucocitare •boală Addison
•boală Hodgkin
•leucemie mieloidă cronică
•boli de ţesut conjunctiv
•LES
•sindrom Loffler
•idiopatice – este diagnostic de
excludere
•medicamentoase: aspirina, beta-
blocante, peniciline, cefalosporine,
AINS etc.

•Bazofilie:
•afecţiuni mieloproliferative: PV, TE,
•Bazofile ↓: MMM
•leucemie mielocitară cronică
•reacţii alergice acute
•boală Hodgkin
•astm bronşic •policitemia vera
•stress •mielofibroza
•hipertiroidie •leucemie acută mieloidă cu bazofile
•anemie hemolitică cronică
•postsplenectomie
•inflamaţii
•alergii
•unele infecţii virale – varicela
•boli inflamatorii cronice
•hipotiroidism
•administrare de estrogeni

•Monocite ↓:
•administrare de prednison
•Monocitoză:
•afecţiuni inflamatorii cronice
•infecţii virale
•parazitoze
•colită ulceroasă
•ciroză hepatică
•boală Gaucher
•tuberculoză
•sarcoidoză
•neoplasme
•boli de colagen, LES
•leucemie monocitară
•policitemia vera
•anemie hemolitică
•boală Hodgkin
•iradiere
•purpură trombocitopenică

•Limfocitopenie:
•sepsis
•arsuri
•Limfocitoză: •administrarea de corticosteroizi sau
antineoplazice
•infecţii bacteriene sau virale
•radioterapie
•hepatită
•imunodeficienţă
•iradiere
•leucemie
•mielom multiplu
•boală Hodgkin
•leucemie limfocitară
•hipersplenism
•limfoame
•anemie aplastică
•boală Addison
•stadiul final al infecţiei HIV
•malnutriţie
•pneumonie
•tirotoxicoză
•septicemie
•macroglobulinemie Waldenström
•boală Gaucher
•boala hemolitică a nou-născutului
•purpură trombocitopenică
•reacţie tansfuzională

Anemiile
• Definiție: scăderea numărului de eritrocite, a concentrației de hemoglobină, a
hematocritului sub limita inferioară a intervalului de referință (cu volemie normală);
• Clasificarea etiopatologică
✓ prin pierferea de sânge (acută sau cronică);
✓ distrugerea crescută a hematiilor (hemoliză);
✓ prin producție insuficientă de hematii;
• Clasificare în funcție de MCHC și MCV:
✓ anemii normocrome, normocitare;
✓ anemii hipocrome microcitare;
✓ anemii hipercrome macrocitare;
• Clasificare în funcție de gravitate:
✓ anemie ușoara: Hb de 90-120 g/l;
✓ medie: Hb de 70-90 g/l;
✓ gravă: Hb sub 70 g/l;

Leucemiile
• „Sângele alb” – transformarea malignă și tulburarea de maturare a celulelor

sangvine albe (leucocite) cu apariția unor celule imature, anormale din p.d.v.
morfologic și biochimic.
• Celulele normale din sânge vor fi înlocuite treptat cu celule transformate malign:
✓ leucemie limfatică-afectarea seriei limfocitare;
✓ leucemie mieloidă- afectarea seriei granulocitare.
• Se dezvoltă treptat anemia, trombocitopenia (sângerari) și infecțiile (deprimarea

sistemului imun).

Leucemiile
• Leucemii acute - leucoza cu celule • Leucemii cronice – număr

imature (LAL, LMA) de leucocite semnificative
✓ leucemie malignă, letală fără terapie crescute (LLC, LGC)
intensivă într-o perioadă scurtă de
timp;
✓ diferențiere redusă a leucocitelor;
✓ anemie, trombocitopenie, leucocitoză
(uneori leucopenie), cu celule imature;
✓ examinarea M.O obligatorie;
✓ răspândirea hematogenă a celulelor
leucemice și infiltrarea organelor
parenchimatoase;
✓ infiltrarea masivă a ficatului.

Modificări ale formulei leucocitare - LGC
Canalul reticulocite: reactivul perforeaza mb celulelor, permite markerului fluorescent sa markeze intracelular acizii nucleici, astfel ca
reticulocitele vor fi diferentiate mai bine de celulele imatura:IRF (immature reticulocyte fraction) LFR 86.5-98.5%(low fluorescence
reticulocytes), MFR9.5-11.5%; HFR= 0-1.4%

Frotiul periferic
 Frotiul de sânge
reprezintă modalitatea de
studiere a morfologiei
elementelor sanguine.
 Formula leucocitară
reprezintă exprimarea
procentuală a diferitelor
tipuri de leucocite.
 Examenul citologic al
frotiului sanguin
presupune colorarea
prealabilă a acestuia prin
metoda May-Grünwald-
Giemsa.

Frotiul periferic
 Examinarea microscopică a granulocitelor urmăreşte:

◼ Formula leucocitară (numaratoare diferenţiată)
◼ Anomalii morfologice
 de talie
◼ gigantocite
◼ granulocite poliploide (mari, hipersegmentate; apar in
infectii, SIDA, dupa chimioterapie sau adm. factori de
crestere)
 nucleare
◼ Hipersegmentare (anemie megaloblastica) >5% celule >5
lobi nucleari;
◼ anomalie Pelger-Hüet (genetica, autozomal dominanta;
hiposegmentare nucleara; dobandita-leucemii, SMD,MM,
meta medulare)
◼ nuclei picnotici
◼ nuclei inelari

Frotiul periferic
 Examinarea microscopică a granulocitelor urmăreşte:

◼ Formula leucocitară (numaratoare diferenţiată)
◼ Citoplasmatice
◼ hipo-, hiper- sau agranularitatea neutrofilelor (boli
mielodisplazice)
◼ granule gigante, vacuole (infectii, chimioterapie)
◼ granulaţii toxice (granulatii negre sau purpurii, in infectii
grave, adm factori de crestere)
◼ corpi Dőhle (incluzii citoplasmatice gri, izolate sau grupate
(infectii, sarcina, mielodisplazii, adm factori de crestere)

Frotiul periferic
Neutrofile hipersegmentate Neutrofile cu granulaţii toxice

Frotiul periferic
Neutrofile cu corpi Dőhle Anomalia Pelger - Hüet

Frotiul periferic
 Examinarea microscopică a limfocitelor urmăreşte:

◼ Numaratoarea limfocitelor
◼ Prezenta limfocitelor reactive, limfoplasmocitelor, cel Mott
(limfoplasmocite cu corpi Russell, eozinofilici, secretanti de Ig,
asociati cu hipergama globulinemiile).
◼ Prezenta umbrelor nucleare

Frotiul periferic
 Examinarea microscopică a eritrocitelor urmăreşte:
◼ Modificari de dimensiune (microcite, macrocite,
anizocitoza-RDW)
◼ Modificari de forma poikilocitoza -ovalocite,
sferocite (sferocitoza ereditara, anemie
hemolitica), stomatocite (alcoolism, boli hepatice),
dacriocite (cel in lacrima, MMM),
drepanocite(aspect de secera, HgS, anemia
falciforma), schizocite (fragmente eritrocitare,
CID), acantocite (alterarea structurii membranare,
boli hepatice, SHU, hemoliza).
◼ Prezenta punctatiilor bazofile (anemii, intoxicatie
Pb), inele Cabot (resturi de material nucleic,
anemii severe)
◼ Corpi Howell-Joly (material nuclear, incluzii unice
bazofile dense; in anemii severe; hiposplenism,
postsplenectomie)
◼ Prezenta hematiilor in rulouri-MM; elemente tinere
◼ Prezenta parazitilor (malarie)

 Valori normale:
Granulocite 50 - 75 %
◼ Eozinofile 0–4%
◼ Bazofile 0–1%
◼ Limfocite 20 - 45 %
◼ Monocite 3 – 10 %

Teste functionale-explorarea
imunitatii celulare nespecifice
 Chemotaxia-migrarea fagocitelor la locul

inflamatiei (testul de migrare, placi cu filtru
permeabil, numararea celulelor, expresia L
selectinei)
 Fagocitoza –atasarea particulelor la suprafata
celulara si ingestia acestora (legare mediata de
receptori specifici, urmata de emisie
pseudopode, internalizare)
 Distrugerea intracelulara-test de generare a
speciilor reactive de oxigen (anionul superoxid,
apa oxigenata, acidul percloric)

Teste functionale-explorarea imunitatii celulare nespecifice

Fagocitoza
• Este un proces activ, determinat de legarea receptor- mediată

a agentului patogen, cu emitere de pseudopode membranare
şi internalizarea acestuia.
• Procesul este nespecific la primul contact cu antigenul, prin
intermediul receptorilor CD36, indiferent de tipul agentului
patogen.
• Membranele macrofagelor conţin şi structuri receptoare
specifice pentru porţiunile Fc ale Ig (CD16, CD64), pentru
factorul C3b de complement (CD11b). În cazul unei întâlniri
anterioare cu agentul patogen are loc combinarea prealabilă a
acestuia cu anticorpi specifici şi/sau factorul C3b de
complement.

Fagocitoza
Structura PMN Etapele fagocitozei

Specii reactive de oxigen
-radicali de oxigen (anion superoxid), apa oxigenata, acid percloric
-apar in urma proceselor celulare normale, respiratia celulara, dar
si in conditii patologice (explozia oxidativa), radiatii ionizante
-in cursul fagocitozei sub influenta NADPH, MPO, SOD
-eliminate/neutralizate in mod normal de
ceruloplasmina,transferina,vitamine antioxidante, etc
-produsi in exces-disfunctii membranare, modificari
conformationale proteice

Testul de fagocitoză:
•Principiul testului:
••Sângele proaspăt recoltat pe EDTA se amestecă
cu o suspensie bacteriană concentrată de
Staphyloccus aureus.
••Se introduce amestecul la termostat timp de o
oră, apoi se efectuează un nou frotiu.
••Frotiurile se colorează MGG, și se examinează cu
obiectiv cu imersie.
••Se examinează 25 de leucocite, notând numărul
de bacterii conținute în fiecare.

Nr. bacterii Intensitate Cotare leucocite Index fagocitar =

= nr. Leucocite x nr.
cruci
0 0 3x0 0
1-24 + 4x1 4
25-49 ++ 6x2 12
> 50 +++ 12 x 3 36
Suma = 52
Interpretare:
0-10 –fagocitoză ineficientă (organism receptiv la infectii)
10-24 –capacitate fagocitară redusă
25-49 –capacitate fagocitară normală
50-75 –capacitate fagocitară crescută (organism bolnav, fagocite
activate in vivo)

•Fagocitoză – infecţia in vitro cu

Staphylococcus aureus – bacterii
fagocitate, vacuole digestive

•Celula lupică (LED) – leucocit

neutrofil care a fagocitat corp
amiloid (nucleul denaturat al altor
leucocite)

Facultatea de Medicina
Explorarea imunitatii
UMORALE
Disciplina Medicina de Laborator
LP 4 Imunologie
Pentru uz intern
Explorarea imunității umorale nespecifice
• Reactanţi de fază acută

• Sistemul complement
• Derivaţi ai acidului arahidonic
(Prostaglandine, Leucotriene)

Determinarea răspunsului de fază
acută

Reactanţii de fază acută
Apar ca răspuns la leziuni tisulare: infecţii, traumatisme,

arsuri.
determina cresterea rezistentei organismului la infectie,
favorizeaza fagocitoza
Favorizeaza procesele de rezolutie si vindecare a leziunilor
inflamatoare
• Se manifestă prin modificarea compoziţiei în proteine a
plasmei

Reactanți de fază acută

REACTANȚII DE FAZĂ ACUTĂ (proteine de fază acută-PFA)
Sunt proteine plasmatice a căror nivel se modifică pe parcursul

inflamației.
infectie
injurie
cancer
IL-1
macrofage hepatocite PFA
TNF

Reactanții de fază acută
Proteinele de fază acută pot fi clasificate în trei categorii

în funcție de mecanismul lor de acțiune:

Proteina C reactiva (CRP = C
reactive protein)
• Denumire: aglutinează cu un polizaharid (fracţiunea C ) din peretele

Pneumococului;
• Rol: în apărarea antiinfecţioasă (actioneaza ca o opsonina)
• În timpul reacţiilor de fază acută concentraţia poate depăşi valoarea
normală de peste 1000-2000 de ori;
• Concentraţia CRP creste rapid in 4-6 ore după infectare/interv.
chirugicala/trauma, si atinge nivelul maxim la 24-72 de ore.
• Valori normale < 5 mg/L (creste in infectii, boli inflamatoare si boli
maligne)

hsPCR (Proteina C reactivă )
 Infecţiile virale nu determină creşteri semnificative ale CRP (apar creşteri

moderate!)
 Valoare CRP normală nu exclude existenţa unei boli maligne!

PCR (Proteina C reactivă)
Utilitate clinică:
-Indicator de risc cardiovascular:
-cresteri moderate ale concentrației PCR importante în
evaluarea microinflamației în plăcile de aterom și au valoare
predictivă în evaluarea riscului cardiovascular.

Procalcitonina
• Produsa de celulele C tiroidiene parafoliculare

• Prohormonul Calcitoninei (cu rol in metabolismul calciului)
• Constituita din 116 aa, sinteza codificata de CALC1
• In conditii NORMALE: sintetizata doar de catre celulele C

tiroidiene, nivelul plasmatic <0.05 ng/ml
• In infectii bacteriene are loc activarea nespecifica a genei cu
cresterea productiei in toate tesuturile (adipos, cerebral,
pancreas, renal, etc), cu eliberare directa in circulatie.
• niveluri plasmatice > 2 ng/ml denota probabilitatea unei
infectii sistemice, cu risc de progresie spre sepsis

Cinetica PCT
• Siteza indusa dupa 2-3 ore de la eliberarea

exotoxinelor
• Maxim de sinteza la 6-12 ore
• T1/2 de 24 ore
• Utilitate:
Diagnosticul si prognosticul sepsisului
Monitorizarea antibioterapiei
Adaptabil la sectile de ATI (dispozitivele de tip POCT)
Biomarker mai bun decat numarul de leucocite, CRP
Monitorizarea complicatiilor dupa interventiile
colorectale

Procalcitonina
● O infecţie sistemică (sepsis) este posibilă, dar există şi
alte condiţii asociate cu aceste valori ale PCT.Riscul de
≥ 0.5 si < 2 ng/mL progresie către un sepsis sever este moderat.
● Pacientul va fi atent monitorizat, iar testul va fi repetat
după 6-24 ore
● Probabilitatea unei infecţii sistemice este mare cu risc

≥ 2 si < 10 ng/mL
de progresie către un sepsis sever este mare.
● Răspunsul inflamator sistemic este important,

≥ 10 ng/mL datorat aproape în exclusivitate unui sepsis bacterian
sever sau şoc septic.

Fractiunile electroforetice
Prealbumină
Albumină
α1- globuline:
 α1- antitripsina
 α1- glicoproteina acidă
α2- globuline:
 Haptoglobina
 α2-macroglobulina
 Ceruplolasmina
β-globuline:
 Transferina
 ApoB
 Factorii de complement
γ-globuline:
 IgG
 IgA
 IgM
 IgE
 IgD

Markeri negativi de inflamatie
Sinteza scade in cursul inflamatiei
Albumina- sinteza este inhibata de IL 6 pentru a prezerva aa necesari
sintezei reactantilor de faza acuta
Transtiretina (prealbumina) proteina transportoare din plasma (sinteza

hepatica) si LCR (sinteza la nivelul plexurilor coroide) pentru tiroxina (T4)
si RBP (proteina transportoare a retinolului)
Transferina –proteina transportoare a fierului in plasma, este internalizata

de macrofage in vederea sechestrarii fierului
Antitrombina III
C3- chiar daca sinteza este crescuta, in plasma nivelul este redus datorita
consumului
Transcortina –proteina transportoare a CBG (corticosteroid-binding

globulin) Este interzisă copierea și distribuirea neautorizată a acestui material.
Reactanti de faza acuta Functie
Proteina C reactiva Opsonizare, fixare complement
SAA Inhiba activarea plachetara, mobilizarea monocitelor; la
nivel tisular-inhiba explozia oxidative, leaga LPS din
peretele bacterian. Stimularea prelungita –amiloidoza
secundara
Manose binding protein Fixarea complementului, opsonizare
Alfa 1 glicoproteina Transportor
Factorii de complement C3, Creste activitatea complementului
C4, factorul B
Ceruloplasmina Indepartarea radicalilor liberi
Fibrinogenul Coagulare, favorizeaza repararea endoteliului lezat; se
coreleaza cu VSH
Alfa 1 antichimotripsina Inhiba proteazele bacteriene
Haptoglobina Capteaza hemoglobina libera; efect antibacterian,
antiinflamator, antioxidant. Reduce disponibilitatea fierului
pentru bacterii
Hepcidina Inhiba absorbtia fierului la nivelul celulor mucoasei
intestinale prin legarea de feropontina. Determina anemia
din bolile cronice inflamatoare
Feritina Capteaza fierul; sinteza este stimulata de citokinele
proinflamatoare
Sistemul complement
 Factorul C3: reflecta activarea sistemului de complement
 Creşteri: reactie de faza acuta (ex. infecţii bacteriene), boli inflamatorii cronice, sarcina
 Scăderi:
 Activarea sistemului de complement si consumarea sporita a acestuia (boala complexelor imune)
– glomerulonefrită, lupus eritematos sistemic, poliartrită reumatoidă
 Deficienta innascuta
 Factorul C4: reflecta activarea sistemului de complement

 Creşteri: reactie de faza acuta (infecţii bacteriene), boli inflamatorii cronice, sarcina
 Scăderi:
 boala complexelor imune (lupus eritematos sistemic, artrita reumatoida, glomerulonefrita)
 Edem angioneurotic (boala Quincke)
 Deficienta innascuta de factor C4
Inhibitorul C1-esterazei (C1-INH)

 Valori scăzute: edem angioneurotic congenital si dobandit

Interpretarea modificărilor valorilor factorilor de
complement
Inhibitorul C1q C3 C4 Boala

C1-
esterazei
  Edem angioneurotic ereditar
  Boli limfoproliferative
 Lipsa ereditară de C4 (cu LED), lipsa

α1-antitripsină
  Glomerulonefrită, LE, afecţiuni
hepatice, poliartrită reumatoidă, LE,
 apărare imună scăzută, urticarie-
vasculită
 Apărare imună scăzută, afecţiuni
hepatice, glomerulonefrită
  Infecţii bacteriene
Panel evaluare pacienti COVID 19
Markeri de inflamatie
CRP, PCT, D-dimeri, feritina, IL6, BNP, Troponina, Hlg,
La internare
NTL ratio, Mg
CRP, feritina, D dimeri, PCT

Zilnic
D dimeri 2X ULN
PCR >2X ULN
Risc crescut tromboza
>60 ani
Imobilizare prelungita

Biomarkerii sindromului inflamator din COVID-19

Explorarea apărării imune
specifice
COMPONENTA UMORALĂ

Imunoglobuline
• Recunosc moleculele de antigen

şi reacţionează în mod specific cu
acesta
• Activează mecanismele efectoare

menite să le îndepărteze
(fagocitoza, sistemul
complement)

Clasele de imunoglobuline

IgA, IgG, IgM în ser in functie de vârstă
IgA g/L IgG g/L IgM g/L

Sub 1 lună 0,00-0,02 7,0-14,8 0,05-0,30
1-6 luni 0,03-0,82 3,0-10,0 0,15-1,09
7-24 luni 0,14-1,08 5,0-12,0 0,43-2,39
3-6 ani 0,23-1,90 5,0-13,0 0,50-1,99
7-12 ani 0,29-2,70 7,0-16,5 0,50-2,60
13-16 ani 0,81-2,32 7,0-15,5 0,45-2,40
Peste 16 ani 0,69-3,82 7,2-16,9 0,63-2,77

IgG
Proprietăți:
1. Principala imunglobulină serică (constituie 75% din

imunoglobulinele plasmatice)
2. Principala imunoglobulină din spațiile extravasculare
3. Anticorpi majori produși ca răspuns la un contact
secundar cu un antigen
4. Traversează placenta
5. Fixează complementul
6. Funcționează ca opsonine (se leagă la suprafața
bacteriană favorizând fagocitoza)

IgG
Proprietăți:
- 4 Subclase de IgG, fiecare cu functii efectoare distincte

- Interactioneaza cu receptorii FcR de pe suprafata
diverselor celule

IgM
Proprietăți:
1. Se produc după nastere – prezența lor la nn. indică o

infecție intrauterină
2. Anticorpi majori produși în timpul răspunsului imun
primar
3. Rămân cantonați intravascular
4. Fixează complementul, sunt activatori potenti ai
compelmentului atunci cand sunt legati de antigen
5. Funcționează ca opsonine (se leagă la suprafața
bacteriană favorizând fagocitoza)

IgA
Proprietăți:
1. Anticorpi majori secretori
2. Se găsesc în ser și in secrețiile corpului: lacrimi,
salivă, secreții respiratorii, secreții gastro-intestinale,
secreții ale tractului genito-urinar.
Formele monomerice in ser/cele dimerice in secretii
3. Rol: leagă bacteriile, împiedicând penetrarea
mucoaselor.
Colostrul si laptele matern contine IgA dimerica,
oferind protective pasiva in perioada postnatala

IgD
Proprietăți:
1. Imunoglobuline aflate pe suprafața limfocitelor B, cu

rol de receptor al acestora pentru antigene.
2. Rol: in activarea limfocitelor B

Niveluri serice crescute ale IgD: stare de inflamatie
desemnata ca sindromul hiperIgD

IgE
Proprietăți:
1.Imunoglobulin care fixeaza cu afinitate foarte mare

receptorii FcɛRI, pe suprafața mastocitelor de la nivelul
micoaselor (nazale, conjunctivale, etc)
2.Cuplarea lor cu antigenul induce degranularea

mastocitului cu declanșarea reacției alergice.
Initial ofereau protective antiparazitara, astazi implicate

in reactiile alergice

Variaţia concentraţiei imunoglobulinelor în ser in
diverse patologii hepatice si renale
IgA IgG IgM
Hepatită acută A   săpt. 1  Săpt. 1  

săpt. 2  Săpt. 2 
După săpt. 8  Săpt. 4 
Hepatită acută B  Iniţial  Iniţial 

După săpt. 8  După săpt. 4 
Hep. Cr. Pers. B     
Hep. Cr. Activă B    
Ciroză posthep.   
Ciroză biliară     
Ciroză alcoolică     
Obstr. Biliară   
Pielonefrită ac.    
Pielonefrită cr.     
Sindrom nefrotic    
Variaţia concentraţiei imunoglobulinelor în ser in
diverse patologii
IgA IgG IgM
Infecţie acută    
Infecţie cronică     
Artrită reumatoidă      
Lupus eritematos    
Sindrom Sjögren    
Malignoame   
LLC    
Iatrogen (citostatice)   
Lipsa imunogl. Nu există  Nu există
Lipsă IgA select.   
Lipsă select. IgM   
paraproteinemie O clasă Ig crescută, Restul scăzute

Biomarkeri virali si imunologici in
infectia cu SARS CoV-2

Imunologie – LP5
Citometria în flux
Pentru uz intern
Imunitatea celulară specifică - limfocitele
• Se împart în două mari categorii:

• Limfocite T
răspunzatoare de imunitatea celulară
• circulă în sânge, limfă, dar cea mai importantă fracţie se găseşte
cantonată în organele limfoide
• se găsesc în circulaţie, în drum spre organele limfoide primare
sau în interiorul acestora, aflate în diferite stadii de maturare
• Limfocite B
• răspunzatoare de imunitatea umorală
• au originea, iniţial în ficatul fetal şi ulterior în măduva
hematogenă
• în sângele periferic aproximativ 10-20 % din limfocite aparţin
liniei B.
• trec prin mai multe stadii până să devină efectori competenţi ai
imunităţii umorale

Maturaţia limfocitelor T

Limfocitele T - funcţii
• Limfocitele T se împart în mai multe populaţii celulare cu funcţii specifice.

Ele nu se deosebesc din punct de vedere morfologic:
• limfocitele CD8+ sau citotoxice
• limfocitele CD4+ sau ajutatoare (helper)
• Th1:
• secretă IL-2, IL-12, IFN gamma, TNF beta;
• activează macrofagele, amplificându-le capacitatea de secreţie a
citokinelor şi potenţialul de prezentare a antigenelor;
• activează sinteza anticorpilor IgG, dar nu a IgE;
• sunt implicate în reacţiile de hipersensibilitate întarziată;
• sunt activate de semnalele date de virusuri şi bacterii
intracelulare;
• Th2:
• secretă IL-4, IL-5, IL-6, IL-10;
• activează sinteza de IgE;
• stimulează proliferarea şi activarea eozinofilelor;
• sunt stimulate de alergene sau componente parazitare;

Diferenţierea Ly T – CD4
• Diferenţierea limfocitului CD4+ naiv, activat, în limfocit efector de tip Th1

sau Th2 este influenţată de o serie de factori, dintre care cei mai
importanţi par să fie citokinele prezente în fazele precoce de activare şi
de expansiune clonală:
• în prezenta IL-12 şi a IFN-gamma CD4+ naive se vor diferenţia în limfocite
Th1
• limfocitul Th2 se diferenţiază în prezenţa IL-4

Modificări ale Ly T – CD4
• Scăderea CD4 apare în:
• Infecţii intercurente
• HIV/SIDA
• Leucopenii de diferite etiologii
• Terapie cu steroizi sau cu imunosupresoare
• Efort fizic excesiv
• Intervenţii chirurgicale
• Graviditate
• Stres psihic
• Variaţie diurnă – CD4 scad spre amiază şi
cresc seara

Modificări ale Ly T – CD8
• Creşterea CD8 se întâlneşte în:

• Boli autoimune
• Infecţii virale
• Reactii imune patologice de tipul „Graft versus host disease”, rejet de
transplant
• Deficienţe imune congenitale sau dobândite (SIDA)
• Scăderea CD8 se întâlneşte în:

• LES sau după tratament cu corticosteroizi
• Raportul CD4/CD8 normal este dovada unui sistem imun sănătos şi are
valoarea între 1 şi 4. În infecţia HIV scade numărul Ly CD4 iar raportul
devine subunitar.

Alte tipuri limfocitare T
• Celulele T γδ (celule T gamma delta)

• reprezintă un mic subset al celulelor T, care posedă un alt receptor T la
suprafaţă (TCR).
• majoritatea celulelor T au TCR alcătuit din 2 lanţuri gp α- şi β-. Spre
deosebire de acestea celulele T γδ au TCR alcătuit dintr-un lanţ gamma şi
unul delta.
• sunt abundente în mucoasa intestinală
• Celulele T natural killer (NKT)

• sunt un grup heterogen de celule T, care au proprietăţile atât ale celulelor
NK, cât şi ale celulelor T
• reprezintă doar 0.2% din totalul limfocitelor T circulante în sânge

Modificările seriei limfoide
• Limfocitoza:
• Fără modificări morfologice:
• După efort fizic
• Stres
• Boli endocrine
• Post splenectomie
• Tuse convulsivă
• Cu modificări morfologice:
• Modificări reactive: mononucleoză, toxoplasmoză, bruceloză, TBC, lues,
HIV, hepatite virale, CMV, LED, sarcoidoză
• Creşterea numărului de limfocite mari granulare apare uneori în
infecţia HIV, HVB, EBV;
• Vacuolizări apar la pacienţi cu boli metabolice (ex. glicogenoze)
• Limfoproliferări maligne: LLC, limfoame

Limfocite reactive

Citometria în flux – scurt istoric
• (1953) Wallace H. Coulter – primul dispozitiv de citometrie în
flux bazat pe principiul impedanței (Coulter)
• (1965) Mack Fulwyler – descrie tehnica citometriei în flux,
punând bazele citometriei moderne
• (1968) Wolfgang Gohde – primul citometru bazat pe
fluorescență (ICP 11)
• (1969 – 1972) Leonard Herzenberg – descrie tehnica de sortare
a celulelor pe baza fluorescenței în citometria în flux și
patentează termenul FACS împreună cu Becton-Dickinson
• Progresul tehnologic în robotică, electronică, mecanică,
industria anticorpilor monoclonali și a sintezei fluorocromilor a
determinat creșterea disponibilității FCM, aceasta devenind
mai performantă și mai ieftină

Citometria în flux – scurt istoric
ICP 22
Terminologie BD FACSAria III

• 5 lasere
Flow cytometer/try = FCM
• 17 canale de fluorescență
• 2 canale pentru FSC/SSC
FCM != cell sorter
• Sortează până la 4 populații simultan
• FCM “state of the art”
FACS machine = cell sorter
• Ideal pentru cercetare
Principiul general al FCM

Funcția de
sortare a FCM
• Gate-urile se
stabilesc în funcție
de FSC/SSC și
fluorescență
• Sortarea se face în
funcție de gate-uri
BD FACSAria III
• Sortare de viteză
• Puritate înaltă
• Până la 4 populații sortate

Interpretarea semnalului electronic
Semnale non-fluorescente
(proprietăți celulare generale)
• FSC: dimensiune
• SSC: granularitate,
complexitate internă
Semnale fluorescente (proprietăți celulare particulare - țintite prin mAb marcați cu fluorocromi)
Gate celule viabile Gate celule CD3+ (dot plot) Gate celule CD3+ (histogramă)

Exemplu de “strategie de gating” – sinteza de citokine la limfocitele T
stimulate cu PMA vs nestimulate
Gating strategy for identification of

cytokine-producing CD4+ and CD8+
cells. (Left to right)
B – pseudocolor density plots:

doublet discrimination, gating of
CD3+ cells, gating of CD4+/CD8+
cells;
A and C – histograms showing

cytokine-producing cells (IFN-γ, TNF-
α, IL-2) within the CD8+ and CD4+
populations, respectively. Surface
staining was performed using anti-
human CD3-AlexaFluor700, CD4-
PerCP-Cy5.5 and CD8-APC-Cy7
antibodies. For intracellular staining,
PE-conjugated isotype control and
anti-cytokine antibodies were used.
The blue population in histograms
represents the isotype threshold.
Plots and histograms were
generated in FlowJo v10 and each
plot displays a total of 25-30.000
events

Ce poate detecta/măsura FCM?
IMPORTANT – Proba de analizat trebuie să fie în suspensie lichidă!
Tipuri de probe: sânge, LCR, aspirat medular, urină, alte lichide biologice, lichide de puncție etc.
Dacă se dorește analiza unui țesut solid, se poate efectua digestia acestuia.
1. Proprietăți celulare (inclusiv la bacterii)

• Dimensiune, granularitate
• Conținut ADN/ARN
• Expresie genică (factori de transcripție)
• Receptori de suprafață sau intracelulari
• Proteine intra- și extracelulare
• Molecule terapeutice exogene etc
2. Particule solubile
• Macromolecule (ex: proteine)
• Vezicule (ex: exozomi)
Aplicațiile clinice ale FCM
1. Determinarea antigenelor de suprafață - imunofenotiparea
• Subseturi limfocitare
• Imunofenotipare din sânge periferic și/sau MO
• Detectarea celulelor rare (< 1:10.000)
• Detectarea markerilor de risc
• Receptori de citokine
• Diverse antigene speciale (în cercetare)
2. Determinări intracelulare
• Cuantificarea ADN și studiul ciclului celular
• Studierea apoptozei / necrozei
• Studierea cariotipului
• Molecule / markeri citoplasmatici (citokine, ROS)
• Molecule nucleare (ex: histone)

Imunofenotiparea este o tehnică
de identificare și clasificare a
celulelor pe baza tipurilor de
markeri prezenți la suprafața, în
citoplasma sau în nucleul acestora.
Tehnica are la bază reacția dintre
antigenul căutat și anticorpi
specifici marcați fluorescent.

Imunofenotiparea – analiza subseturilor limfocitare din sângele periferic
Rezultate: Procentul şi numărul absolut de limfocite:

T totale (CD3+)
B totale (CD19+)
T helper (CD3+ CD4+)
T citotoxice/supresoare (CD3+ CD8+) Domenii de interes clinic:
NK (CD3- CD16/CD56+)
•Imunodeficienţe primare
Raportul T helper / T citotoxice (CD4+/CD8+)
•Imunodeficienţe secundare
•Boli cu componentă autoimună
•Monitorizarea terapiei
imunosupresive
Imunofenotiparea – limfocitele T
Monitorizarea infecției cu HIV și a eficienței tratamentului antiretroviral
Monitorizarea tratamentului
și a imunocompetenței în HIV
Progresia infecției cu HIV

determină scăderea numărului
absolut de limfocite T helper
(CD3+CD4+).
Numărul de LyTh este un bun

indicator al evoluției infecției
cu HIV și a statusului imun.
Numărarea LyTh se realizează

concomitent cu determinarea
încărcăturii virale. Cele două
evoluează în sens opus.

Imunofenotiparea – sângele periferic și măduva osoasă
Rezultate:
•Identificarea celulelor maligne
•Determinarea proporţiei acestora
•Stabilirea liniei lor de diferenţiere
Domenii de interes clinic:

•Diagnosticul leucemiilor acute şi
al limfoproliferărilor cronice
•Markeri prognostici
•Monitorizarea efectelor terapiei
aplicate
•Depistarea semnelor de boală
minimă reziduală

Imunofenotiparea – sângele periferic și măduva osoasă
Diagnosticul hemopatiilor maligne
Boli limfoproliferative cronice: Leucemii acute: Boli plasmocitare:

CD5 CD10 anti-k
CD19 CD19 anti-
anti-k CD13 CD38
anti- CD33 CD45
CD3 CD34 CD56
CD20 CD45 CD19
CD23 CD7
CD10 CD14
CD45 CD3
Anti-HLA-DR

Imunofenotiparea – detectarea celulelor rare
Monitorizarea bolii
minime reziduale
(< 1:10.000)
Pentru evaluarea
tratamentului in
bolile hematologice
și a riscului de
recădere
Performanță bună,
dar în general
inferioară tehnicii
PCR

Imunofenotiparea – determinarea markerilor de risc
Persoanele cu HLA-B27 au o probabilitate crescută de a dezvolta boli
autoimune, cum ar fi spondilita anchilozantă, artrita reumatoidă juvenilă,
artrita reactivă (și sindromul Reiter) și uveita anterioară acută izolată.
Prezența HLA-B27 NU cauzează boala!
Testul HLA-B27 este, în

principal, destinat să
ajute la întărirea sau
confirmarea
diagnosticului.

Determinări intracelulare – cuantificarea ADN
• ADN-ul celular poate fi ”colorat” cu un colorant fluorescent

• Colorantii specifici pentru ADN (de ex. Iodura de
Propidium) se leagă STOECHIOMETRIC
• Astfel se poate măsura cantitatea de ADN din celulă:

• Cunatificarea ADN+proteine specifice
• Determinarea ”ploidiei”, detecția clonelor ”anormale”
• Analiza ciclului celular
• Apoptoza
• Cariotipul (analiza cromozomială)

Determinări intracelulare – ADN și ciclul celular
Events
Conținutul în ADN determinat prin Citometrie în flux
Raportarea la fazele ciclului celular

Determinări intracelulare – apoptoza / necroza
• Apoptoza este ”moartea celulară programată” un șir de etape prin

care celula “trece în ne-ființă”.
• Dintre fenomenele care au loc la nivelul celulei, cel mai specific este
fragmentarea ADN-ului, cu condensarea cromatinei
• Adeseori fenomenul este acompaniat de degradarea

internucleosomală a ADN, dând naştere unui tipar “de scară
moleculară " distinctiv la electroforeza în gel a ADN


Analiza spermei

Determinări intracelulare – studierea cariotipului
Hoechst 33258 (A=T)
Proba de la un pacient cu
Leucemie
1) Rearanjare 1 <> 3
2) cromozom Philadelphia
Chromomycin A3 (GΞC)
Alte aplicații practice ale FCM
• Sortare celulară pentru purificarea liniilor celulare
• Teste de funcționalitate celulară
• Studierea fluxului intracelular de calciu
• Studierea potențialului de membrană
• Studierea eficienței transfecțiilor
• Studierea farmacocineticii și a mecanismelor de acțiune ale
medicamentelor
• Studierea citotoxicității și a mecanismelor de acțiune ale
unor substanțe
• Etc – în cercetare, aplicațiile FCM sunt vaste, tehnica putând
fi folosită exclusiv sau împreună cu alte tehnici.

Imunologie LP 6
Reacția de polimerizare în lanț
Pentru uz intern
Structura ADN

Mecanismul de replicare a ADN

Mecanismul de replicare a ADN

Reacția de polimerizare în lanț
PCR este o tehnică de biologie moleculară folosită

pentru amplificarea exponențială, de
milioane/miliarde de ori, a unei secvențe ADN
specifice. Metodele de diagnostic bazate pe PCR
modernă au specificitate și sensibilitate foarte înalte.
Testele pe bază de PCR au trei etape principale: EXTRACȚIA, AMPLIFICAREA și
VIZUALIZAREA & INTERPRETAREA REZULTATELOR
Polymerase Chain Reaction (PCR)

RO: a nu se confunda PCR cu Proteina C reactivă (C reactive protein – CRP)

Componentele reacției PCR
• ADN matriţă (secvenţa ţintă)

• Două amorse (primeri)
• Sens (Forward)
• Antisens (Reverse)
• ADN-polimerază
• patru tipuri de deoxinucleotid trifosfat (dNTP=A,G,C,T)
• Mg2+
• un tampon necesar menţinerii unui pH constant (8,4)

Extracția acizilor nucleici
• Extracția pe bază de
coloane cu silicați este
cea mai comună tehnică
de extracție a acizilor
nucleici.
• Pas 1 – liza membranelor
celulare pentru
eliberarea acizilor
nucleici
• Pas 2 – filtrarea probei
prin coloană (acizii
nucleici sunt reținuți)
• Pas 3 – spălarea
coloanelor cu soluții
tampon speciale
• Pas 4 – eluția acizilor
nucleici (desprinderea
de pe coloană)

Mecanismul PCR
Foarte similar cu mecanismul biologic de replicare a ADN
Taq-polimeraza are origine bacteriană (Thermus aquaticus). Are un timp de înjumătățire de 2h
la 92.5°C și o eficiență de sinteză de 1000 baze / 10 secunde la o temperatură de 72°C

Amplificarea exponențială a ADN țintă
Nr. copii = 𝟐𝒏
n = nr. cicluri de amplificare

Efectuarea tehnicii PCR
Atunci... Acum

Detectarea și cuantificarea ADN-ului amplificat
1.Electroforeză 2.Colorare
3.Detectie și cuantificare (UV)

Detectarea și cuantificarea ADN-ului amplificat

Utilitatea PCR și a tehnicilor bazate pe PCR în Medicină
Microbiologie: detecția precoce, identificarea tulpinilor și studiul
mutațiilor/genelor de rezistență la microorganisme (virusuri: HIV, HBV, HCV,
SARS-CoV-2 etc; bacterii: Chlamydia, BK etc)

Diagnosticul bolilor ereditare / mutațiilor oncogene

Marfan, acondroplazia, BRCA1, fibroza chistică, hemofilia, distrofia musculară
Duchenne, beta talasemia etc
(utilă doar pentru căutarea mutațiilor cunoscute!!!)

Screening prenatal: trisomii, aneuploidii, infecții congenitale

(toxoplasmoză, CMV), boli ereditare (talasemie, hemofilie) etc

Medicină
legală
• identificare
• teste de
paternitate

Alte tipuri de PCR
RT-PCR – Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction
• pentru detecția și cuantificarea ARN
• PCR amplifică doar fragmente ADN
• În RT-PCR, ARN-ul este folosit inițial ca matriță pentru sinteza cADN în prezența enzimei
revers transcriptaza (RT-)
• Restul reacției decurge ca în PCR, fiind amplificate fragmentele cADN
• Aplicații: studierea expresiei genice, detecție și determinare a încărcăturii virale în
infecțiile cu virusuri ARN (ex: HIV, HCV, SARS-CoV-2 etc)
qPCR – real time PCR / PCR cantitativ

• Tehnică PCR ce permite monitorizarea în timp real a numărului de copii ale genei țintă
• Mai rapidă și mai sigură decât PCR
• Necesită aparatură dedicată pentru real time PCR
• Folosește principiul fluorescenței. Semnalul luminos este analizat după fiecare ciclu, astfel
observându-se evoluția în timp real (se creează un grafic – vezi slide-ul următor)
• Poate fi combinată și cu RT-PCR, tehnica fiind numită RT-qPCR

qPCR – metode de cuantificare pe baza fluorescenței
Tehnica SYBR green

• SYBR green este un colorant care se
leagă preferențial de ADN dublu
catenar. Complexul ADN-SYBRgreen
absoarbe la 497nm și emite la 520nm.
• Cantitatea totală de ADN dublu catenar
poate fi monitorizată în timp real în
timpul PCR (la sfârșitul fiecărui ciclu
de amplificare)
• Dezavantajul SYBR green este că se
leagă nespecific la ADN dublu catenar,
astfel doar o singură genă de interes
poate fi urmărită în real time

qPCR – metode de cuantificare pe baza fluorescenței
Tehnologia Taq-Man
• Folosește sonde specifice

pentru regiunea care urmează
să fie amplificată
• Sondele conțin un fluorocrom
specific și un “quencher”. Cât
timp fluorocromul și quencher-
ul se află în vecinătate,
semnalul luminos al
fluorocromului este foarte
redus
• Dacă primer-ul este atașat
catenei ADN, Taq-polimeraza va
începe elongarea primer-ului
• Atunci când Taq-polimeraza
întâlnește sonda, o va degrada,
eliberând astfel fluorocromul
de sub influența quencher-ului

qPCR – SYBR green vs TaqMan
SYBR green permite urmărirea în timp real a unei singure gene de interes (se folosește un
singur primer)
TaqMan permite urmărirea mai multor gene de interes. Pentru fiecare primer folosit, exista
câte o sondă marcată cu un anume fluorocrom – urmărire multiparametrică în real time

qPCR – curba exponențială de amplificare

qPCR – interpretarea rezultatelor

qPCR - cuantificarea
𝑪𝒐𝒏𝒄𝒑𝒓𝒐𝒃ă = 𝟐(𝑪𝒕−𝒄𝒐𝒏𝒕𝒓𝒐𝒍 − 𝑪𝒕−𝒑𝒓𝒐𝒃ă ) × 𝑪𝒐𝒏𝒄𝒄𝒐𝒏𝒕𝒓𝒐𝒍

Imunologie LP PDF

Încărcat de

Informații document

Titlu original

Drepturi de autor

Formate disponibile

Partajați acest document

Partajați sau inserați document

Opțiuni de partajare

Vi se pare util acest document?

Este necorespunzător acest conținut?

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Imunologie LP PDF

Încărcat de

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Explorarea în laborator a

• haemostasis equilibrium - Bing

• Investigarea cauzei unei hemoragii/tromboze

• Monitorizarea terapiilor anticoagulante,

• Evaluarea riscului de apariţie a hemoragiilor

• Screeningul diatezelor hemoragice/trombotice

• Evaluarea capacităţii de sinteză a ficatului

• In cazul unui hematocrit mare-volumul de citrat ar

Este interzisă copierea și distribuirea neautorizată a acestui material.

o Grosimea acului 19-22 G (evitarea hemolizei)

o Se evită aplicarea garoului timp îndelungat

o Nu se recoltează primii 5 ml de sânge pentru probe de hemostază

o Nu se recoltează de pe branule spălate cu heparină , sau de pe linii

o respectarea raportului sange/anticoagulant si omogenizare imediată

o Testarea – în 3 ore de la recoltare

Constricție Agregare Cascada

Este interzisă copierea și distribuirea neautorizată a acestui material.

•Primară – legarea plachetelor la colagenul expus

•Secundară – activarea factorilor de coagulare

• Hemostaza primara – faza vasculo-plachetara

Este interzisă copierea și distribuirea neautorizată a acestui material.

Este interzisă copierea și distribuirea neautorizată a acestui material.

Este interzisă copierea și distribuirea neautorizată a acestui material.

- Trombocitoze (Tr ):

Este interzisă copierea și distribuirea neautorizată a acestui material.

Este interzisă copierea și distribuirea neautorizată a acestui material.

Trombocitopenie aloimuna: Sindrom hemolitic uremic Defecte genetice (gena

Este interzisă copierea și distribuirea neautorizată a acestui material.

a.Frotiu periferic: trombocite b.Frotiu periferic: magacariocit

c.Frotiu periferic: trombocite agregate

- incizie standardizată: port-acul Francke +lanțetă (lățime1,3mm, adâncime 3mm)

- aprecierea duratei hemoragiei: se culeg picăturile de sânge cu o hârtie de filtru,

din 30 în 30 de secunde, prin absorbție și prin apăsare pe incizie

- testul se practică la ambele urechi, se face media rezultatelor obținute

Este interzisă copierea și distribuirea neautorizată a acestui material.

- stază venoasă la nivelul antebraţului (40mmHg)(presiunea sanvină capilară)

Valori normale: 2,5-9,5 min.

Este interzisă copierea și distribuirea neautorizată a acestui material.

•TS este normal în coagulopatii: hemofilii (A,B,C),

Este interzisă copierea și distribuirea neautorizată a acestui material.

Este interzisă copierea și distribuirea neautorizată a acestui material.

Este interzisă copierea și distribuirea neautorizată a acestui material.

tromboplastina (F III, preîncălzită la 37°C)

TP: timpul scurs de la adăugarea tromboplastinei tisulare până la formarea

Este interzisă copierea și distribuirea neautorizată a acestui material.

Timp de protrombină prelungit:

Este interzisă copierea și distribuirea neautorizată a acestui material.

• Timpul de protrombină (PT)(Timpul Quick)

Este interzisă copierea și distribuirea neautorizată a acestui material.

APTT: timpul scurs de la contactul plasmei (cu substituent

Valori normale: 25- 40 sec

• TT: timpul scurs de la adăugarea trombinei până la formarea cheagului de

Este interzisă copierea și distribuirea neautorizată a acestui material.

Boala tromboembolica principală cauză de deces

Forme clinice: - izolată (tromboze venoase,arteriale)

Este interzisă copierea și distribuirea neautorizată a acestui material.

Este interzisă copierea și distribuirea neautorizată a acestui material.

Este interzisă copierea și distribuirea neautorizată a acestui material.

• Antitrombina III (cofactorul heparinei): serin-proteaza sintetizata

Este interzisă copierea și distribuirea neautorizată a acestui material.

Este interzisă copierea și distribuirea neautorizată a acestui material.

• Dozare: metode imune

Este interzisă copierea și distribuirea neautorizată a acestui material.