TEHNICA REALIZĂRII UNUI PREPARAT MICROSCOPIC

PERMANENT

Se obține în urma unor operații complexe și permite examinarea la microscopul optic a

principalelor caracteristici ale celulelor și a modului lor de organizare.
Reprezintă examenul unor celule, fragmente de țesut sau organ, cărora li s-
au suprimat procesele vitale prin fixare.

Un preparat microscopic este alcătuit din:

 obiect de examinat subțire și transparent
 mediu de fixare transparent
 lamă port-obiect și lamelă

Scopul  realizării unui preparat microscopic permanent este de

a conserva structurile celulare și raporturile dintre ele pe un timp nelimitat.

Este  folosit  în : clinică, laborator de anatomie patologică, medicină legală, cercetare, în scop
didactic.

TIMPII:

 Recoltare
 Fixare
 Spălare
 Includere
 Secționare
 Colorare sau impregnare
 Montare
 Etichetare

1.RECOLTAREA

Este  operația prin care obiectul de examinat este prelevat de la omul viu sau de la cadavru.

 Recoltarea bioptică se recoltează  de la om în scop diagnostic. Se realizeaza prin : raclare,

puncție bioptică, aspirație, intervenție chirurgicală.
 Recoltarea necroptică se practică în laboratoare în scop de cercetare sau didacti

Recoltarea dela cadavrele umane se practică în laboratoarele de anatomie patologică și
medicină legală în scopul de a confrunta datele de anatomie clinică și tanatogenetice.
 După recoltare, în cazul organelor cavitare, acestea se golesc de conținut prin injectarea
unei soluţii de fixator.

În cazul organelor retractile cum ar fi mușchiul, vasele, tendonul piesele se fixează prin două l
igaturi pe o baghetă de sticlă sau de lemn.

2. FIXAREA
Este o etapă decisivă în obținerea unui preparat microscopic permanent,
este un proces fizic sau chimic prin care sunt oprite cât mai rapid procesele vitale 
celulare păstrându-se
cu alterări minime volumul, forma, relieful și raporturile spațiale și moleculare .

FIXATORII POT FI:

- după natura lor fizici și chimici (acetona, acid tricloracetic, formol, acid osmic, alcool metilic)

- după reacția pe care o au cu proteinele solubile: coagulanți și necoagulanți

Pentru preparatele histoenzimologice și histochimice fixarea se face cu ajutorul criostatului.
Dupa teoria coloidală fixarea este considerată ca fiind trecerea din starea de soluție în starea de
gel a substanțelor albuminoide din țesuturi.

CALITĂȚILE UNUI BUN FIXATOR:

 pătrunde bine în țesuturi pentru a opri cât mai brusc procesele vitale
 stabilizează țesuturile păstrând nealterate caracterul și distribuția constituenților celulari
 nu provoacă artefacte
 nu deformează țesutul
 nu dizolvăp constituenți
 distruge microorganismele
 extrage enzimele autolitice inactivate
 conferă consistență
 produce diferențiere optică
 nu-și modifică compoziția
 ieftin, netoxic, neinflamabil, neiritant

TRATAMENTE POSTFIXARE

 decalcifierea impusă de prezența sărurilor de Ca în piese care împiedică secționarea
 disocierea pieselor pentru a le analiza izolat
 mordansarea  se realizează cu substanțe care duc la ameliorarea colorării și fixării

3.SPĂLAREA
 Este procedeul prin care
se oprește procesul de fixare  prin îndepărtarea agentului fixator din țesuturi .

În funcție de solubilitatea fixatorului spălarea se realizează cu :

 apă pentru fixatori solubili în apă
 alcool 70-80% pentru cei solubili în alcool

4.INCLUDEREA
Este procedeul prin care
se realizează condiții optime care să permită secționarea piselor în secțiuni subțiri de 
ordinul mm, transparente și cu fețe
plane astfel încât să poată fi examinate la microscop.
Cea mai utilizată masă de incluziune este parafina. Aceasta nefiind miscibilă cu 
apa presupune niște etape premergătoare includerii:
a.      deshidratare – alcool in concentrații crescânde începând cu 50°, fiecare în 3 băi succesive.
b.     clarificare – îndepărtarea alcoolului din piesă cu ajutorul unor reactivi numiți clarificator, miscib
ili cu parafina , care fac ca piesa sa devină translucidă.
Se efectuează cu alcool anilic sau cu hidrocarburi benzenice.
c.      impregnare este operația de pătrundere a piesei până în cele mai mici interstiții cu parafină topit
ă și solidificarea în bloc prin răcire pentru a oferi o consistență omogenă.
Ea decurge în termostat, la o temperatură cu
2-3° mai mare decât punctul de topire al parafinei utilizate. Ea va fi înglobată într-un
bloc de parafină solidă de consistență omogenă.
d.     turnarea blocurilor – blocul înglobat se montează pe un port-obiect

5. SECȚIONAREA
Piesa inclusă sau înghețată se taie în felii subțiri de ordinul micronilor cu ajutorul unui aparat nu
mit microtom.
Elementele componente:
1.     suport pentru cuțite
2.     port-obiect
3.     capul mobil
4.     micrometru gradat care permite înaintarea port-obiectului pe distanțe foarte mici
Se obțin astfel secțiuni seriate sub formă
de panglici.Acestea se etalează și se lipesc pe lama port-
obiect . Aceasta se realizează cu albumina Mayer.
Secțiunile astfel obținute se lasă la uscat, apoi se pun în stativ.
Secționarea la microtomul pentru parafină presupune următorii timpi pregătitori:
1.     modelarea blocului pentru secționare
2.     lipirea blocului pe port-obiect
3.     secționarea propriu-zisă
4.     etalarea și lipirea secțiunilor

6. COLORAREA
 - este etapa prin care :
se urmărește creșterea contrastului între elementele tisulare sau celulare prin 
modificarea indicilor de refracție ai substratului morfologic cu ajutorul coloranților.
Tehnica de colorare depinde de natura fixatorului și de țesutul pe care se aplică.

7.MONTAREA
Este procedeul  care are drept scop protejarea secțiunilor fragile
de eventualele deteriorări, conservarea colorației și asigurarea unui mediu optic 
omogen și transparent necesar examinării microscopice.
Se face între lamă și lamelă în diferite medii de montare inițial fluide.

Mediile de montare pot fi: - apoase (glicerina, sirop Apathy), anhidre (balsam de

Canada, colofoniu). Pentru a realiza montarea se foloseste balsamul de Canada 
1-2 picături pe o lamelă de sticlă care se întoarce cu fața în jos și se așează
pe suprafața secțiunii apăsând ușor pentru a preveni apariția bulelor de aer.

8. ETICHETAREA
Pe fiecare lamelă se notează: tipul celular, sursa de recoltare, fixatorul, metoda de
colorare, data efectuării.
Aceste preparate se păstrează în cutii sau mape speciale, ferite de lumină.