CURS 9

Chimie analitica
si analize fizico-chimice
Metode de analiză cromatografică
• Analiza cromatografică include două tipuri de metode:
• 1. metode de separare a componenţilor și
• 2. metode de analiză a componenţilor amestecului din
probă.
• Separarea cromatografică presupune realizarea
echilibrului de distribuţie între două faze, echilibru
care se repetă de un număr mare de ori.
• - o fază este imobilă şi poartă denumirea de fază
staţionară;
• - o fază este mobilă - aflată în mişcare, se deplasează
prin golurile fazei stationare.
 Principiul de functionare al
analizei cromatografice
• Faza mobilă, denumită şi eluent - patrunde cu viteză
constantă prin interstiţiile fazei staţionare, adeseori
poroase, si poate provoca migrarea, cu viteze diferite, a
celor “n“ componenţi ai amestecului de separat.
• Componenţii probei migrează cu viteze diferite datorită
interacţiunilor fizice specifice, dintre moleculele
probei şi faza staţionară. Efectul, este numit retenţie, şi
provoacă o aşa-numită migrare diferenţiată.
• Adică moleculele migrează în “grupuri” (denumite
uneori zone), în fiecare zonă existând doar molecule de
acelaşi fel.
Clasificarea tehnicilor cromatografice
• După natura fazei mobile şi a fazei staţionare:
• 1.Cromatografia de lichide (LC) : faza mobilă este
un lichid. Se poate realiza pe coloană deschisă şi
pe coloană închisă.
• 2. Cromatografia de gaze (GC) când faza mobilă
este un gaz
• 3. Cromatografia cu fluide supracritice la care faza
mobilă este un lichid aflat peste temperatura
critică(temperatura peste care substanta nu mai
poate ramane in stare lichidă).
 Clasificarea cromatografiei de lichide(LC)
• În funcţie de mecanismele de separare:
• 1. Cromatografia de adsorbţie (Ţvet, 1903), separarea
substanţelor organice cu molecule de dimensiuni mici şi medii
pe adsorbenţi(faza staționară), ca silicagel(SiO2) şi
alumină(AlO3), folosindu-se, ca faze mobile: amestecuri de
solvenţi organici.
• 2. Cromatografia ionică (de schimb ionic), se folosește o fază
staţionară solidă, poroasă, formată din materiale specifice
numite schimbătorii de ioni. Schimbătorii de ioni sunt
substanţe cu o reţea solidă afânată, de natură organică sau
anorganică, pe care se găsesc grefate, prin procesul de
obţinere, nişte „centre de schimb ionic”. Cele mai răspândite
faze staționare folosite în cromatografia de schimb ionic sunt
răşinile schimbătoare de ioni – organice – la care scheletul-
suport este unul organic – un polimer poros.
• 3. Cromatografia de excluziune sterică se desfăşoară pe faze
staţionare poroase cu porozitatea selecţionată astfel încât să
corespundă dimensiunilor moleculelor supuse separării. O
parte dintre molecule intră prin pori, reuşind să interacţioneze
cu suportul solid, prin forţe de adsorbţie foarte slabe, iar
altele sunt “excluse” deplasându-se practic nereţinute odată
cu faza mobilă. Se obţine astfel un soi de “sită” la scară
moleculară, separarea moleculelor făcându-se în funcţie de
dimensiune și de orientarea spatială.
• 4. Cromatografia lichid-lichid (LLC), în care faza staţionară
este o fază lichidă, nemiscibilă cu cea mobilă şi imobilizată pe
un support solid, într-o coloană. Suportul solid trebuie să fie
inert faţă de componentele din proba de analizat.
 Cromatografia pe coloană deschisă sau
cromatografia planară (PC)
• Se referă la un grup de tehnici înrudite cu cele din LC, care au în
comun faptul că faza mobilă circulă printr-un material poros
dispus într-un plan şi formând un strat relativ subţire.
• 1. Cromatogafia pe hârtie: faza staţionară este o hârtie poroasă
din celuloză (o hârtie de filtru) care este irigată de solvent prin
forţe capilare.
• 2. Cromatografia pe strat subţire (TLC), în care faza staţionară
pulverulentă este fixată de suportul plan (sticlă, aluminiu, material
plastic) cu un liant, formând un strat subţire (0,1 - 0,5mm) de
asemenea irigată prin capilaritate.
• 3.Cromatografia pe strat subţire de înaltă performanţă(HPTLC),
în care faza staţionară are granulaţie extrem de fină mărindu-se
eficienţa separărilor.
 Tehnicile cromatografiei în fază gazoasă GC
• 1. Cromatografia gaz-lichid în care faza staţionară
este un lichid nevolatil imobilizat pe un suport solid.
• Aici suportul poate fi granular, poros, situat într-o
coloană în aşa-numita cromatografie de gaze
“convenţională” sau chiar pe pereţii coloanei,
confecţionată de dimensiuni capilare, în
“cromatografia pe coloană capilară”. Eluentul este în
stare gazoasă.
• 2. Cromatografia gaz-solid Faza staţionară este
alcătuită din silicagel sau alumină, sau “site
moleculare” .
• Eluentul este în stare gazoasă.
 Cromatografia planară
• În literatura de specialitate pentru cromatografia
planară (PC) se utilizează mai multe denumiri:
• - cromatografia în strat subţire (CSS sau thin layer
chromatography – TLC)
• - cromatografia în strat subţire de înaltă
performanţă (high performance thin layer
chromatography – HPTLC)
• - cromatografia de lichide planară (planar liquid
chromatography – PLC).
 Tehnica separarii în CSS
• Separarea in CSS are loc pe o fază staţionară
granulară (poroasă) dispusă într-un strat
subţire, formând un plan. Acest strat denumit
“subţire”, se realizează dintr-un adsorbent cu
grosimi cuprinse între 100 – 250 µm, care
este pulverulent (silicagel, celuloză, alumină,
poliamidă) dispuse în straturi subţiri pe plăci
rigide din sticlă sau, pe folii flexibile din
aluminiu, poliester.
• Pentru analiza pe strat
subţire se depun pe
placă volume mici de Capac etanş

10-50 μL de probă cu
ajutorul unor Placa cu strat

micropipete sau subţire

microseringi Hamilton. Linia de start

Produsele se depun pe Faza mobilă

linia de start, la 2 cm
de baza plăcii, Fig.1. Camera cromatografică

uscându-se imediat cu
aer cald pentru a evita
fenomenl de difuzie.
• Migrarea analiţilor pe placă se face prin antrenarea lor
de către faza mobilă.
• Migrarea eluentului prin coloana deschisă, are loc sub
acţiunea forţelor capilare şi provoacă migrarea
diferenţiată a componentelor amestecului de separat.
Placa cromatografica se introduce în eluentul potrivit.
Din acest moment, eluentul irigând prin capilaritate
stratul poros, migrează ascendent prin stratul subţire,
provocând separarea analitilor .
• Timpul de separare variază între 3 şi 60 min.
• Se poate realiza o migrare mono sau bidimensională.
migrare monodimensională migrare bidimensională
• Principalul parametru al
evaluării separării este
• Rf - factorul de
întârziere/retenţie
• Rf reprezintă raportul dintre
distanţa parcursă de analit de H2
la linia de start până la mijlocul H1
spotului caracteristic şi
distanţa parcursă de faza
mobilă pana la linia de oprire.
• În locul distanţelor parcurse
pentru a calcula Rf se pot H1
utiliza şi timpii necesari pentru Rf = ≤1
H2
eluarea analitului( t1) şi timpul
necesar pentru ca faza mobilă
să ajungă la front.
t1
Rf =
t2
 Tehnici de identificare a spoturilor caracteristice
• - examinarea plăcii cromatografice în ultraviolet (UV) când se
poate observa fluorescenţa proprie fiecărui analit. Pentru
analiţii nefluorescenţi se pot utiliza plăci fluorescente care
conţin un indicator fluorescent introdus în pasta din care se
prepară stratul subţire.
• - expunerea plăcii la vapori de iod.
• - pulverizarea de soluţii caustice si încălzirea plăcii la 1100C :
• - H2SO4 conc., H3PO4 sau oxidanţi cum sunt K2Cr2O7 sau KMnO4
în soluţii sulfurice, utilizaţi pentru revelarea unor alcaloizi,
steroizi, aminoacizi;
• - K2[HgI4], sol.I2 în KI, acid picric pentru revelarea unor
benzodiazepine
• - fluoresceina, eozina, ninhidrina pentru unele antibiotice.
• - utilizarea de substanţe etalon. Acestea se depun sub formă de
soluţii pe linia de start odată cu proba de analizat.