296 CAPITOLUL 4 SPECTROMETRIA DE ABSORBTIE IN ULTRAVIOLET $1 IN VIZIBIL CAPITOLUL 4 SPECTROMETRIA DE ABSORBTIE iN ULTRAVIOLET SIIN VIZIBIL 4.1. Domeniul spectral UV - VIS. Originea absorb! Spectrometria in UV-VIS se aplica in domeniul spectral 180-1100. nm, deci intre ultravioletul apropiat, domeniu in care se obfin mai pufine informatii structurale (mai ales pentru compusii nesaturati), dar se obtin-date importante pentru analiza cantitativa a compusilor organici medicamentosi a unor complecsi metalici ai acestora ete Pomeniul spectral UV-VIS este aleatuit de fapt din trei zone spectrale sii anume - ultravioletul apropiat, cuprins intre 185 si 400 nm; - vizibilul, cuprins intre 400 si'700 nm: ~infrarosiil foarte apropiat, ctiprins intre 700 si 1100 am; Determinarile spectrometrice in acest domeniu se bazeazi pe fenomenul de absor- bfie a tadiatiilor cuprinse tn acest domeniu spectral, de-catre speciile chimice analizate Prin urmare, determinarile in acest domeniu au la bazi masuratori de absorbanta (sau transmitan{a), cu ajutorul spectrofotometrelor automatizate, inclusiv pentru analiza multicomponent. Unele spectrofotometre UV-VIS sunt utilizate ca detéctori ai mai’ multor analiti, din amestecuri multicomponente, dupa prealabila lor separare prin cromatografie de lichide, sau electroforeza capilara. in astfel de cazuri, cromatogramele obfinute (sau clectroforegramele) sunt acompaniate de spectrele UV-VIS corespunziitoare fiec&rui pic cromatografic, cea ce serveste la identificarea analifilor si la dozarea lor. Spectrofotometrele UV-VIS disponibile in prezent lucteaza intre 185 nm si 900 hm, limita inferioara oprindu-se la cca'190 nm datorita atmosferei/aerului care devine opac sub aceasti limita. Dacd se lucreazd sub vid, se poate cobor! spre lungimi de undaCAPITOLUL 4 | SPECTROMETRIA DE ABSORBTIE IN ULTRAVIOLET SI IN VIZIBIL 297 mai mici, A < 190 nm, cu 10-20.nm. Brin urmare, spectrofotometrele oferd specttele electronice ale substantelor analizate, care se obtin prin inregistrarea variatiei absor- bantei in functie de lungiméa de unda, exprimata in nm: in practica analitica, domeniul spectral UV-util este domeiul UV apropiat, cuprins intre 200 si 380 nm, iar domeniul spectral VIS-util este cuprins intre 380 nm si 780 nm, Spectrometria UV-VIS este utilizata’mai!ales pentru’ determinari’ cantitative, bazate pe absorbtia radiatiilor din domeniilé mentionate mai sus, absorbfie care este proportional cu concentratia analitului, intr-un domeniu de concentrafii dat, in care existi o relatie liniard intre absorbanta si concentfatie. O’substanti moleculari/aflata intr-o solutie, expusd la actiunea unor radiatii din regiunea spectrald UV-VIS, poate absorbi anumite lungimi de-unda, cand are loc un transfer partial de energie ciitre moleculéle de analit, concomitent cu scdderea intensititii radiatiei incidente (1,). Daca este absorbitd o radiatie din domeniul vizibil, solutia devine colorata. Efectul de absorbtic parfiald a unei parti a radiatiei este prezentat in figura 4, | sursa de lumind . Figura 4.1. |lustrarea fenomenului de absorbtie a luminii in domeniu! UV-VIS = intensitatea radiatiei incidente; I; = intensitatea radiatiei transmise Practic are loc o absorbfie a unor fotoni din radiatia incidenta de'c&tré moleculele de analit, iar cantitatea (numarul) de fotoni absorbita este proportionala cu concentratia analitului. Sursa de radiatie vizibila este o lampa cu fir de wolfram care furnizeaza un fascicul de lumina cu lungimi de unda cuprinse in domeniul.320-2500 nm. Un proces similar are loc si in spectrometria UV, dar fh acest caz sursa dle radiatii UV este o lampa cu hidrogen sau cu deuteriu care furnizeaz un fascicul de radiatii UV cu 2 = 160 - 380 nm Trebuie precizat c& analitul absoarbe numai anumite radiatii, cu anumite lungimi de unda caracteristice structurii moleculelor de analit, restul radiatiilor fiind transmise, deci nu sunt absorbite (de aceea sigeata care semnifica radiafia incidenta este mai mare, mai lata, iar sigeata care semnifica radiatiile transmise este mai ingust’).298 CAPITOLUL 4 SPECTROMETRIA DE ABSORBTIE IN ULTRAVIOLET $I IN VIZIBIL. 4.2. Absorbtia luminii e Producerea absorbtiei luminii se explic& prin aceea cA, in UV-VIS, radiatiile au o energie mai mare decdt IR, ceea ce produce tranzifii electronice de pe anumite niveluri (orbitali) pe altele. Tranzitiile electronice se suprapun peste tranzitiile rotationale si peste cele vibrationale care sunt produse de energii mai mici. in figura 4.2 se prezinta schematic diagrama nivelurilor (starilor) de rotatie, de vibratie si electronice. Cele trei tipuri de tranzitii sunt legate de excitafia electronilor de valenta prin relafia urmatoare: Tranzitii electro! AE total = AErotatie + AEvibratie + AEelectronice (4.1) La impactul unui foton UV-VIS asupra unei molecule (izolate), se modifi termenl Exjecjrnies C208 Ce determina variatia energie’ mecanice totale; de altfel, aceasta perturbare electronicd este insofita si de modificarea termenilor Eysrie Si Evibraie Desi toate tranzitiile au loc intr-o manier cuantificati, corespunzand unor lungimi de unda discrete, lungimile de unda individuale sunt numeroase si foarte inchise, in pachet, astfel c& ele nu se pot separa in linii individuale sau in picuri vibrafionale, Din acest motiv spectrele UV-VIS prezinté adesea benzi largi ale undelor absorbite. Asa se explica faptul cd, in faze condensate lichide (solutii), niei un aparat nu poate si ofere aparifia tranzitiilor individuale, din cauza apropierii moleculelor intre ele si implicit @ interacfiunilor care se exercitd intre ele. 00; hy ivel $1 electronice nivel de rotatie ae — th nivel de vibratie 001 De 00;= orbi alt ocupati 00j= orbitall inferior, vacanti (a) (b) Figura 4.2. Diagrama nivelurilor de rotatie, de vibratie si electronice ale acelelasi molecule (a) si diagrama de absorbiie a fotonului (b)CAPITOLUL 4 SPECTROMETRIA DE ABSORBTIE IN ULTRAVIOLET SIN VIZIBIL 299 in figura 4.3 (a) sunt prezentate spectrele benzenului in solutie (s) si in stare de vapori (v, cdnd apare o structura fina), iar in figura 4.3 (b) este prezentat spectrul vaporilor de iod (de asemenea cu structur find) care se intinde pe numai 0,14 nm, adicd intre 536,97 nm si 536,83 nm (536,97 - 536,83 = 0,14 nm) si care a fost inregistrat cu un aparat cu inalt rezolufic. in figura 4.3 (c) este prezentatd diagrama energetic’ a benzenului, in molecula cdruia exista trei duble legaturi conjugate, fiind posibila exis- tenta a sase orbitali, trei in starea fundamentala si trei in stare excitata. Interactiunile electronice modifica energiile starilor excitate, astfel ca diagrama energetica a moleculei de benzen, determinata de interactiunile mentionate, este aceea dati in figura (c). Ca o consecinfa a interactiunilor electronice, in spectrul electronic al benzenului apar trei benzi de absorbtie, la 183 nm, 207 nm si 264 nm. rn degenerate bsorbana stares fandamentald ind inter tinind seam de (©) [ 5683 0m <———— longime de wnat 100 et 0 0 8608 iat 19626 a0 18624 2 (b) fir de und’, em’ Figura 4.3 Spectrele UV ale benzenului (a) in solutie (s) si in stare de vapor (v), si ale jodului in stare de vapori (b); diagrama energetic a benzenului (c)300 CAPITOLUL 4 SPECTROMETRIA DE ABSORBTIE IN ULTRAVIOLET $1 IN VIZIBIL Compusii organici obisnuifi, inclusiv cei medicamentosi, sunt formati din atomi usori, precum C, H, N, O, iar tranzifiile care se observa pentru acesti compusi sunt determinate de electronii implicati in legaturile o si m si de electronii n neparticipanti, care formeaza dublete neimplicate in legaturi, in cursul acestor tranzitii se produc modificari ale polaritifii legaturilor, de aceea spectrele care se obtin pentru acesti compusi se mai numesc si ,,spectre de. transfer de sarcina“. Fiecare tranzitie este caracte- rizata de lungimea sa de unda si de absorbanfa sa molard, ¢ (exprimatd in L; mole’). Diferitele tipuri de tranzifii care pot avea loc sunt date in figura 4.4, dupa care ele se descriu pe scurt. agro" | [oat ee) pt. nesaturare | nye CI ngor CI gor OO a 200 nm 400 nm Figura 4.4 Tipuri de tranzitii electronice mai frecvent intalnite in cazul substantelor cu ‘oxigen si azot si zonele spectrale aferente p= tranzifii puternice; s =tranzitii slabe ‘Tranzitii o > 0%. Legaturile o din substantele organice au o mare stabilitate, ceca ce se traduce printr-o departare mare intre orbitalii vacanfi. Tranzitia (saltul) unui electron de pe un orbital molecular de legatura 6 pe un orbital de legaturd o* necesita multa energie, de aceea tranzifia apare in UV-indep&rtat (sub 200 nm). Asa se explic& de ce sunt ,,complet transparent“ in UV-conventional (traditional) hidrocarburile saturate, cum sunt hexanul si ciclohexanul (ex.: pentru hexan Ayax = 135 nm. iar€ = 10.000). Acest fapt permite utilizarea heptanului si ciclohexanului ca solventi in determinati UV. deoarece spre 200 nm sunt transparente, absorbanta lor este egal cu | pentru o grosime astratului de 1 cm, Puterea de dizolvare a hexanului si ciclohexanului fafa de substantele polare este sc&zuta. si apa lichida este transparent in UV apropiat, avand o absorbanta ‘A = 0,01 pentruo grosime a stratului de solutie de I cm, lao lungime de unda = 190 nm. Aceasti transparent se datoreaz’ faptului ca in apa pot avea loc numai tranzitiin >0* sid 20%.CAPITOLUL 4 SPECTROMETRIA DE ABSORETIE IN ULTRAVIOLET SI IN VIZIBIL_ 301 n 36*. O astfel de tranzitie consta in trecerea (saltul) unui electron dintr-un dublet ,,n“ al atomilor de O, N, $ sau de halogen X pe un nivel o*. Aceasti tranzitie se produce la limita regiunii UV apropiat si are o intensitate medie. Tranzitia n 0% se situeaz la lungimi de unda diferite, in functie de natura substantelor si anume: - clitre 180 nm pentru alcool; ex.: pentru metanol Amay = 183 nm, € = 50: - citre 220 nm pentru amine; ex.: pentru dietilamina Amax =210 nm, € = 800; - ctre 190 nm pentru derivati halogenati sau eteri; ex.: pentru eterul etilic Amax = 190 nm, iar € = 2000. in cazul anilinei, tranzitian >0* corespunde formei sale mezomere, dar absorbtia corespunzitoare acestei tranzitii dispare atunci cand are loc reacfia anilinei (amina primara aromatica) cu acidul clothidric, datorita formarii clorurii de aniliniu: Gi, Me (=i anilina forma sa mezomer& NH, + (H+ +X-) ——> NH, +X halogenura de a fenilamoniu Disparitia tranzitiei n >0* datorita acestei reactii se explica prin blocarea duble- tului de electroni ,,n* in procesul de protonare a grupei amino, cu formarea ionului de fenilamoniu (aniliniu). ‘Tranzitia n n*. Aceasti tranzitie const in saltul unui electron de pe un orbital molecular de nelegatura n pe un orbital molecular de antilegdtura 1* si este o tranzitie de intensitate mic. De regula, acest tip de tranzifii se intalneste la sistemele nesaturate, care confin un heteroatom ce are un dublet de electroni neparticipanti, cum este cazul compusilor carbonilici. in aceste cazuri exist’ o ,,banda carbonil situatd in domeniul 270-295 nm. Astfel, in cazul aldehidei acetice (etanal), tranzitia n —>7* este situata la Aenay = 293 nm, ei corespunzandu-i o absorbanfi molara € = 12 (dizolvati in etanol). Tranzitia t >n*. Tranzitiile de acest tip au loc in sisteme nesaturate care contin o dubla legatura etilenica izolata si lor le corespund benzi de absorbtie foarte intense, situate spre 170 nm, in functie de substituentii heteroaromici prezenti in molecula. in cazul etenei, Rnax = 165 nm, iar € = 16.000. in afara de tipurile de tranzitie mentionate mai sus, exist si ,,tranzitii d > d** specifice compusilor anorganici care implica electronii din orbitalii moleculari d, respec- tiv in tranzitia lor de pe un orbital d pe altul. Ele sunt insotite de o absorbtivitate mica, se produc in domeniul vizibil si li se datoreaz culoarea unor complecsi ai cationilor,302 CAPITOLUL 4 SPECTROMETRIA DE ABSORBTIE IN ULTRAVIOLET SI IN VIZIBIL Aceste tranzitii se produc prin saltul unui electron excitat d al unui generator de complex, de exemplu ty., pe un alt orbital d, de exemplu eg. Desi astfel de ,,tranzitii sunt interzise“, ele sunt posibile datorita actiunii perturbatoare a campului unui ligand. Datorita unor astfel de tranzitii, ionul de cupru (ID) (si sarurile lui) sunt colorate, ele continand in solutie ionul tetraaquocupru (II): [Cu(H0),]"" Din punctul de vedere al participarii sau neparticiptirii electronilor existenti intr-o electronice se disting patru tipuri de electroni - invelis de electroni inchis, in care electronii nu sunt implicati in legaituri chimice deoarece au energii de excitare foarte mari; acesti electroni nu contribuie la absorbtii in UV-VIS; - electroni de tip o in legaturi covalente 6, care au de asemenea energii mari de excitare si deci nu contribuie la absorbtii in UV-VIS (ex.: legaturile~CH2-CH2— din aleani); - electroni n, care se gasesc sub forma perechilor de electroni neparticipanti in inveligul exterior al unor atomi usori, cum sunt cei de N,:0,:8 si de halogen. moleculd, la tranz acesti electroni sunt mai slab atrasi de nucleele acestor atomi decat electronii 3, de aceea ei pot fi excitati cu radiatii UV-VIS si pot contribui la absorbtii in acest domeniu spectral; - electroni x, situafi pe orbitali m, in legdturile duble si triple, fiind mai usor excitabili, ei fiind responsabili pentru majoritatea spectrelor electronice. 4.3. Producerea culorii. Cromofori. Solvatocromie. Deplasari bato si hipsocrome Din cele expuse rezulta cA la originea tranzitiilor electronice stau ,.gruparile cromofore* care includ diverse tipuri de electroni. in cazul unei serii de compusi conti- nand acelasi cromofor (sau auxocrom), pozitia si intensitatea benzilor de absorbtie sunt constante, asa cum se poate observa din tabelul 4.1 Tabelul 4.1 Cromofori specifici unor grupari cu azot | Gruparea Cromoforul ‘max (nm) emax (L-motem") mina -NH) 195 3000 oxima -NOH 190 5000 nitro -NO, 210 3000 nitrit -ONO 230 1500 initrat -ONO> 270 12 nitroso | =N=0, 300 100 Dacé o moleculi confine mai multi cromofori separati prin cel putin doua legaturi simple, se poate observa o suprapunere a efectelor gruparilor individuale.CAPITOLUL 4 SPECTROMETRIA DE ABSORBTIE IN ULTRAVIOLET $1 IN VIZIBIL. 303 Este important de precizat ca atat pozitia, cat si intensitatea si chiar forma benzilor de absorbtie ale compusilor in solufie sunt influentate de natura solventului. Procesul acesta se numeste ,,solvatocromie™, iar modificarile mentionate sunt datorate interacti- unilor analit-solvent, care modifica diferenta de energie dintre starile fundamentala si de excitatie. Pentru exemplificare, se da in figura 4.5 spectrul de absorbtie al benzofe- nonei in ciclohexan si in etanol, ca si tranzifiile electronice care au loc si efectele electronice posibile, adica ,,deplasarile hipsocrome si batocrome*, care sunt inverse pentru doua tipuri de tranzitii, in functie de natura solventului. aot log ¢ E oa E 4 bv hve 3 Solvent * Solvent nepolar polar a nepolar polar 20 260 300 340 380nm Figura 4.8 Spectrele de absorbtie in UV ale benzofenonei dizolvata in ciclohexan (linia continua) $i in alcool (linia punctata), obfinute prin reprezentarea logaritmului absorbantei molare (e) in functie de Iungimea de unda (2) De remarcat ca cele mai multe tranzitii electronice sunt tranzitii n>n* si n 3x" care se constat ci au loc si in cazul benzofenonei si care corespund urmatoarelor structuri: deh Ys c=O ——> cc non non Tranzitii x on* sin >7* au loc si in cazul acetonei, al cArei spectru UV prezinti © banda de mare intensitate datorité primei tranzifii (la 195 nm) si una de mai mica intensitate datorata celei de a doua tranzitii (la 270-285 nm). Fapt interesant c& eterii (R-OR,), tiveterii (R-S-R,), disulfurile (R-S-S-R), halogenurile de alchil (R-X) si alchilaminele (R-NH3) prezinta o banda de mare intensi- tate datoratd unei tranzifiin n*, situata la 4 <200 nm, dar acesti compusi,sunt transpa- renti in UV-VIS deoarece nu prezint& tranzitii mn".304 CAPITOLUL 4 SPECTROMETRIA DE ABSORBTIE IN ULTRAVIOLET SIN VIZIBIL Probabilitatea producerii tranzitiilor t >m* este mai mare dect aceea a producerii Pp ‘Producern molare €= 10°-10° tran: lor n -7*, fapt dovedit de valorile mari ale absorbantei : “ate tidal 3 pentru primele tranzitii si mai mici, € < 10° pentru n n* in cazul substantelor transparente intr-un anumit domeniu spectral, acestea pot sa dobandeasca insusiri absorbante printr-o interactiune donor-acceptor, DA, cu o specie potrivita acestui proces, asa cum rezulta din figura 4.6. doaor ‘aeteptor, donort acceptor > Ton | + | f —T ov |ooe—f- | tf o0e erat complex de agociale D ecu acceptorul A ioniek DvA™ Figura 4.6 Schema de interactiune donor-acceptor, starea excitata implicdnd forma ionicd D*-A ov orbital vacant; OOc = orbital ocupat Aceasta se explic& prin trecerea unui electron de pe un orbital de legitura al donorului care devine radical cationic, pe un orbital vacant al acceptorului care devine radical anionic. Se formeaza astfel un complex de asociatie ionic’ D'-A™, a carui banda rbtie are o pozitie dependent de potentialul de ionizare al donorului, dar si de afinitatea acceptorului fata de electron (in astfel de cazuri absorbanta molard € are o valoare foarte mare). de al Efectul hipsocromic const in deplasarea benzilor de absorbfie spre lungimi de und mai mici, iar efectul batocromic consta in deplasarea benzilor de absorbtie spre lungimi de unda mai mari in cazul sistemelor conjugate continand mai multi cromofori despartiti prin cate o simpli legatura, spectrele electronice sunt mult perturbate in raport cu suprapunerea simpli a efectelor produse de catre cromofori izolafi. Delocalizarea spatiald a electro- nilor este cu att mai important cu ct este mai mare numarul de atomi de carbon, iar departarea dintre nivelul energetic fundamental si cel excitat este cu atét mai mica. Ca urmare a acestor efecte, spectrele de absorbtie sufera o deplasare batocroma (spre lungimi de unda mai mari) concomitent cu un ,,efeet hipereromie* care const in cresterea intensitatii benzilor; o astfel de comportare se intalneste in cazul -carotenului, forma tran: care confine 11 legaturi duble conjugate, spectrul sau prezentéind un maxim la Anax nm si ined dowa benzi la 480 nm si la 425 nm.CAPITOLUL 4 SPECTROMETRIA DE ABSORBTIE IN ULTRAVIOLET SIN VIZIBIL 305 Betacarotenul este provitamina A, din care se formeaza in organism vitamina A printr-o reactie enzimatica, Prin interactiunea vitaminei A, ca de altfel si in cazul altor alcooli care confin mai multe duble legaturi conjugate, cu acizi Lewis, cum este AICI; dar mai ales SbCl, rezulta carbocationi, conform reactiei aa SS cH,OH { forme mezomers 24; carbocationului A vitamina A. 27 Oastfel de reactie se numeste ,.reactie de halocromie™ si consti in aparitia carboca- tionilor a cAror sarcind pozitiva atrage electronii vecini, ceea ce determina o deplasare a dublelor legaturi concomitent cu delocalizarea sarcinii pozitive. Astfel, apare un fenomen de mezomerie datorita cAruia se micsoreaza distanta dintre nivelurile de energie fundamental si excitat, deci se absorb radiafii cu lungimi de und’ mai mari decat pentru molecula ca atare (ex.: molecula de vitamin A). ‘Asa se explic& faptul c& produsul reactiei dintre vitamina A si SbCl; este colorat in albastru si se poate utiliza la determinarea cantitativa a vitaminei in cazul steroizilor se pot obtine de asemenea compusi colorati sub actiunea acidului sulfuric concentrat, tot pe baza unei reactii de halocromie. ‘Asa cum s-a mai ardtat (Figura 4.3), compusii aromatici au absorbtii mai impor- tante si dau spectre electronice mai complicate decdt compusii etilenici. La baza structurii fine a spectrelor stau tranzitiile n—sm*, asa cum se poate vedea in figura 4.3 in care este prezentat spectrul vaporilor de benzen. Reactiile de substitutic la nucleul aromatic produc modificari insemnate ale aspectului benzilor de absorbtie, Cantitatea de informatii oferiti de spectrele relativ simple, cum este cel al benzenului in stare lichida, este mic, de aceea analiza structurala bazati pe astfel de spectre electronice este oarecum aleatoare, deci de mai mic’ incredere. Exist totusi unele reguli empirice de corelare a structurilor cu pozifiile benzilor maximelor de absorbtie. O astfel de regula este accea a lui Woodward-Feiser, care se aplicd in cazul compusilor carbonilici nesaturafi, dienelor si steroizilor, asa cum se poate observa din tabelul 4.2, in care sunt prezentati unii factori si unele particularitati de structura, sub forma de incrementi. Plecdndu-se de la aceste date, se poate prevedea pozitia benzii de absobfie datoraté unei tranzitii mo* in sisteme conjugate, intre valorile calculate si pozitiile reale experimentale ale benzilor existand 0 concordanta bund,CAPITOLUL 4 SPECTROMETRIA DE ABSORBTIE IN ULTRAVIOLET SI IN VIZIBIL Tabelul 4.2 Regula Woodward-Feiser-Scott de corelare a structurii cu pozitia benzii, pentru calcularea maximei de absorbtie in cazul enonelor si dienonelor Structura/formula | Structura de baza feat | Banda chimicd din formula [ct SubstituenttX | am 5 X=H 207 « 2S alchil ais | xX OH, O-alchil 193 ‘in metanol sau in etanol |- lant deschis sau ciclu de 6 C | = pentru ciclu de 5 C: 202 nm incrementi ad@ugafi pentru 1m __|incrementi pentru solventi] nm - fiecare dubla legsturd conjugata in plus) 30 Japa ~ caracterul exociclic al legaituriiC=C_ | 5 |cloroform = caracterul dienic 39 leer : cicohexan_ | |- pentru fiecare substituent se adauga, in| pozitii: | a | B Wels | nm: = alchil 10 2 is| is | -Cl 1S 12 - - | -Br 25 30 Sale -OH 35 30 fo - O-alchil 35 30 2 . - O-acil 6 6 6 6 |- N(R)» I : 95 - Nota: precizia maximelor de absorbtie este de 3 nm. 4.4, Spectrofotometria UV-VIS Pentru inregistrarea spectrelor electronice se utilizeaz un spectrofotometru UV- VIS, care include o sursa de radiafii, un sistem dispersiv combinat cu un monoctomator si un detector, figura 4.7 (a) Trebuie precizat, cd in spectrofotometrele utilizate in analiza de rutina, fotomulti- plicatoarele sunt inlocuite cu fotodiode, care au o sensibilitate si o liniaritate foarte bune, precum si o gama dinamica de raspuns de asemenea foarte bund. Pentru imbunatatirea serie de 100, confectionate din pozitionate aldturat pe un singur cristal de siliciu (Figura 4.8 a). Fiecare fotodiox are asociat un condensator pentru stocare, cu rol de colector si de integrare a fotocuren- tului generat de lovirea fotonilor de dioda, Unele detectoare includ pana la 1024 de elemente. Fotocurentul este citit prin descdrcare periodica pentru intreg ansamblul de fotodiode, un astfel de detector putand citi raspunsul spectral in domeniul 180-1100 nm. In figura 4.8 b este prezentatd o sectiune a unui tub fotomultiplicator. xi igura 4.8 b) care servesc la transmite- rea luminii si senzori/detectori cu fibre optice (CAPITOLUL 4 SPECTROMETRIA DE ABSORBTIE IN ULTRAVIOLET SIIN VIZIBIL \ ; tse spectrofotometrie cava eiy excitate de absorbtic UV-Vis S ram SS molecule in stare fundamental sursa de lumina (a) ‘lamp W/Vis, fant intrare gril coneavs ‘compararea lampi D/UV raportulut transmitanti sau absorbant fotodioda 1 filtru ogling semitransparenta O __referinta (b) Figura 4.7 Schema de principiu a unui spectrofotometru UV-VIS (a) si schema cu detalii ale partilor componente (b); tn figura (b) este schema unui aparat Hitachi U-1000, cu dublu fascicul UV-VIS (pentru fig. (a) este un singur fascicul de radiatli VIS) oti 1 = sursa de radiafii, 2 = monocromator, 3 = proba si referinta, 4 = amplificator imbededmintea: mode sau colector Fotocatod ae peraere (a) (b) Figura 4.8 Schita unei sectiuni transversale intr-un tub fotomultiplicator (a) si schema de constructie a unei fibre optice (b)CAPITOLUL 4 SPECTROMETRIA DE ABSORBTIE IN ULTRAVIOLET St IN VIZIBIL Asa cum se observa din figura, un cablu de fibre optice este format dintr-un miez de SiO,, care functioneaz ca un ghid de unde electromagnetice. Acest miez este imbracat cu un material cu indice de refractie mai mare si apoi cu un strat tampon, cu rol protector. Fasciculul de lumind transmisd intra in acest tub sub un unghi of, transmisia luminii prin miezul cablului fiind datorat& unei reflexii totale a miezului si imbrac4min- tei, ceea ce asigur o transmisie de 97,7%, restul luminii pierzndu-se. Pentru exemplificare, se mentioneaza ca o fibra de siliciu cu diametrul de 50-1000 im, imbracata in cauciue siliconic si intr-un strat tampon de nylon se poate utiliza intre 200 nm - 2,3 jum, Fibrele optice pot fi utilizate si ca sonde spectrofotometrice conventionale pentru determinari de fluorescent. in acest caz se utilizeaza cabluri bifurcate cu fibre optice, © ramura pentru transmisia radiafiei sursei si a doua pentru a primi radiatia de fluores cent sau absorbita. Fibrele optice pot fi utilizate si pentru obfinerea unor senzori electrochimici, daca sunt cuplate cu unele specii chimice cum sunt enzimele, precum penicilinaza, utilzat’ pentru determinarea cantitativa a penicilinei (penicilinaza catal- izeazi hidroliza penicilinei din care rezulti acidul penicilinoic, care determin’ de- seresterea pH-ului), Exist ins si senzori cu fibre optice sensibili pentru ionii Li”, K", Na’, precum si pentru bioxidul de carbon. in prezent se utilizeaz spectrometre optice cu monofascicul de tip multicanal, dotate cu un detector care include pana la 2000 fotodiode miniaturizate, care permite achizitionarea intregii game spectrale in céteva milisecunde. 4.5. Legea fundamentala a absorbtiei In spectrometria de absorbtie in UV-VIS se masoara de regula absorbanta, care este proportional cu concentratia analitului, conform legii Lambert-Beer, utilizand relafiile: Az logit = log Ht (42) stutie sau A=e-b-c (4.3) de unde: ny = (4.4) on i (44) ‘in care: A = absorbanta; a = absorbtivitatea; b= grosimea stratului de solutie, deci a cuvei, in cm; © =concentratia analitului determinat; = absorbanfa molara (in L/em-mol) sea este egal cue = aM este independent de concentratie.CAPITOLUL 4 SPECTROMETRIA DE ABSORBTIE IN ULTRAVIOLET $1 IN VIZIBIL 309 Dacé este vorba de o solutie'multicomponenta (intre care se exercita interactiuni i reciproce), se calculeaz absorbanta total astfel Atotala = Al + Ao + ..+ An = e1-b-c} Fe2bcr #4 enb-on (4.5) Legea Lambert-Beer este valabil& numai pentru solutii diluate si se poate exprima prin ecuafia urmatoare: Ig 107 (4.6) in context este necesard si definirea ,.transmitanfei care este egal cu raportul dintre intensitatea Juminii transmise I si intensitatea luminii ineidente Ip, deci T=I/lo; logt A (47) slog 1/1 in analiza si controlul medicamentelor se utilizeaza, frecvent. si conceptul de absorbant specifica, notati cu Aj;s, definiti ca-absorbanta unui strat de solutie cu grosimea de | cm, care confine 1 g de substanta in 100 mL. Absorbanta specifica este 0 constanta specifica fiecdrei substanje (lao lungime de und’ data) si se utilizeaza la calcularea concentratiei unui analit: (4.8) A unei substanfe medicamentoase, se poate utiliza raportul Pentru evaluarea puritat absorbanfelor substantei la doud lungimi de unda diferite, A, / A;, sau diferenta dintre aceste absorbante, Aj, — A; Pentru calcularea concentratiei necunoscute a unui analit c, se poate utiliza absorbanta unui standard similar, pe baza legii Lambert-Beer: Al=erber si A2=e2:b¢2 (4.9) bsorbanta necunoscuta a analitului: ibsorbanfa standardului. Apoi sé calculeaz’ raportul: At_erbrer 4.10) Al exbz-02 ese Deoarece analitul si standardul sunt identice (este vorba de un acelasi compus), £; = ey si'bj = by: prin urmare: Ale) Also Zr=T deunde oc: (4.14 Anse RU ea Prin urmare se poate calcula concentrafia ¢; necunoscuta a unui nalit, daca se compara absorbanfa sa cu aceea a unui standard similar (din aceeasi substanta,-dar de puritate analiticd) pentru care se cunosc concentrafia c; si absorbanta A>,310 CAPITOLUL 4 SPECTROMETRIA DE ABSORBTIE IN ULTRAVIOLET SI IN VIZIBIL Determinarea concentratiei uui analit se poate determina si prin metoda ,.adausului standard“, Pentru o astfel de determinare se prepara o solutie de analit cu absorbanta A, si concentratie necunoscuta si o solutie standard din aceeasi substanta, dar de puritate analitica, cu absorbanta Ay si concentratia cp. Se masoara un volum V mL de solutie de analit si peste aceasta un volum V mL de standard si apoi se compara absorbantele solufiei de analit sia solutiei de analit + standard: Al=e-b-c) pentru solutia de analizat (4.12) Ad ~alvertvea) pentru solutia de analit + standard (4.13) Vr=Vi+V2 (4.14) Deci volumul total pentru a doua solutie este egal cu suma celor dou volume de analit (Vj mL cu concentratia necunoscuti) si de standard (V3 mL. cu concentratia cy cunoscuta), Se face apoi raportul celor doua absorbante AL e An (vier + V2e2)/Vi (4.15) iar din aceasta relatie se deduce relatia de calcul a concentratiei necunoscute a oricdrei substante medicamentoase: ALY. VrAiw2-AlV1 cr (4.16) Aj42= absorbanta solutiei standard confindnd analitul + standard Aceasta metoda a adausului de standard este utila mai ales in cazul determ nor cantitifi foarte mici de substanta sau a urmelor de impuritati i si in cadrul metodologiei de validare a metodedelor instrumentale de analizi 4.6. Abateri de la legea Lambert-Beer. Erori datorate instrumentelor Legea Lambert-Beer este valabila numai pentru solufii diluate deoarece la concen- trajii mai mari de 10° M solutiile au 0 forta ionica ridicati, iar interactiumile electro- statice dintre componentii solutiei sunt mai intense, Din acest motiy nu existi o liniaritate (proportionalitate) intre absorbant si concentrafie. Interactiunile electrostatice pot fi insemnate si in solufii diluate de analiti, daca aceste solutii contin electroliti (sau alte speci chimice) in concentrafii mai mari. in literatura de specialitate sunt mentionate $i abateri chimice de la legea Lambert- Beer, in cazurile in care analitii pot interactiona cu solvenfii, de exemplu pentru a se ioniza sau pentru a forma aducti cu acestia, care au o absorbtivitate caracteristicd diferitCAPITOLUL 4 SPECTROMETRIA DE ABSORBTIE IN ULTRAVIOLET $1 IN VIZIBIL 341 de aceea a analitului. Legea Lambert-Beer este limitata si de radiatiile policromatice. De aceea, aceasti lege se respecta numai daci se lucreazi cu .,radiatii monocromatice™, pentru a cdror obtinere se poate utiliza un laser (= amplificarea luminii prin emisie stimulat de radiatie). Cum laserii sunt costisitori, in mod obisnuit se utilizeaza surse de radiatii policromatice, din care se selec ioneaz cu ajutorul unor filtre sau fante o radiatie aproximativ monocromatica. Practic, se izoleaz o , banda ingusta de radiafii cu lungimi de unda dispuse simetric de 0 parte si de alta a lungimii de unda dorita, asa cum se vede in figura 4.9. Pentru infelegere, se admite cd se aleg doua benzi de radiatii A si B (figura 4.9.a) cdrora le corespund curbele de absorbtie date in figura 4.9.b. x banda A banda B absorbanta absorbanta (a) Be (b) c Figura 4.9 Alegerea corecta a unei benzi de radiatil Se observa ca banda A de radiafii este corect aleasi deoarece ei fi corespunde in figura 4.9 (b) o curba liniard de absorbtie, in timp ce pentru banda B, curba de absorbtie prezinta o mare abatere de liniaritate si deci nu poate fi utilizaté pentru determinari cantitative. Trebuie si se tind seama ci masuratorile de absorban{a se fac de regula intr-un domeniu de la 0,1 - 2,0 unitati de absorbant. Unele spectrofotometre pot face masuratori ale valorii absorbantei pind la 4 - 6 unitati, deci pana la valori foarte mari care sunt mai putin fiabile, deoarece aceste valori corespund la intensitati transmise foarte slabe, pentru care raportul I/Iy = 10°, cdruia ii corespunde o absorbanta A Exist trei cauze mai importante ale erorilor datorate aparatelor (erori care se si anume: 1) zgomotul de fond al sursei luminoase, iar termenul AT =k este considerat constant si independent de T 2) zgomotul de fond al fotomultiplicatorului, termenul AT variind in functie de T conform ecuatiei: A= kV? +T (4.17) 3) procesele de reflexie si difuzie in timpul parcursului optic al spectrofo- tometrului; termenul corespunziitor se noteaza cu AT; si este proportional cu T: AT; =ksT.312 CAPITOLUL 4 SPECTROMETRIA DE ABSORBTIE IN ULTRAVIOLET SIN VIZIBIL Desi aceste erori sunt minimizate continu prin constructie, se reecomanda sa se lucreze pe solutii diluate, judicios alese, astfel incdt absorbantele masurate sa se situeze intr-un domeniu optim de masurare, Eroarea relativa asupra transmitanfei (suma erorilor mentionate) se poate corela cu eroarea relativa a concentratiei, prin intermediul relatiei dco d, AT co Wt T Be in cazul solutiilor care contin particule coloidale (micelare), ale unor probe de , Se produce un fenomen Tyndall de difuzie a luminii, ceea ce determina aparitia unei absorbfii suplimentare care variaz in functie de lungimea de unda. Din acest motiv este fiecesar s& se faci o corelatie a liniei de baz utilizdnd spectrometria derivata sau prin calcule folosite in metoda Morton-Stubbs. 4.7. Determinari cantitative. Curba de calibrare Pentru determinari cantitative este recomandabil s se stabileasca, in fiecare caz, © curba de calibrare a carei liniaritate se verifica prin ,,metoda celor mai mici patrate“, metoda numit& si .,regresie liniard simplé“. Pentru exemplificare, se di in continuare curba de calibrare pentru’ determinarea’ spectrofotometrica in UV (Ajay 254 nm) a vitaminei D, din VITAMENOL/ dupa separarea Vitaminei dit'amestecul formule farma- ceutice, ‘prin HPLC. Vitaminolul este tin preparat polivitaminizat a carei’ formula (in mg/g) este urmatoarea: - Vitamina D3 (20 pig D5) = Vitamina A ~Vitamina E (7,9 mg E-acetat) - Vitamina By (riboflavin) - Vitamina Bj (cianocobalamina) - Vitamina Bg (piridoxina-HC!) © Calciu pantotenat - Niacinamida ~ Menadion-Na bisultit = Dextroza 1000,0 mgCAPITOLUL 4 SPECTROMETRIA DE ABSORBTIE IN ULTRAVIOLET $1 IN VIZIBIL 313 CH H3 (Co#H40) SS HO’ CHy ‘CH3 VITAMINA D3 (cholecalciferol) 1UL activitatea a 0,025 pig Vit. D3 pura Separarea prin HPLC a vitaminei D, s-a facut pe o coloana ODS, utilizéind ca faza mobil un amestec de metanol - acetonitril - apa (1000:200:50), iarca eluent un amestec de metanol - tetrahidrofuran - dimetilsulfoxid (500:500:20), folosindu-se un standard intern de ftalat de diundecil in acid acetic - metanol, tetrahidrofuran (THF) si dimetilsul- foxid (DMSO). Prepararea probei se face dizolvand 1,5 g Vitaminol in 20 mL ISS, se agit, se centrifugheaza, apoi se cromatografiazi. Pentru construirea curbei de calibrare, se reprezint& grafic cantitaile de vitamin Dy injectate (xi) in coloana HPLC si detectate prin inaltimea picului din spectral UV al substantei (y,). Valorile xj injectate si yysunt urmatoarele: x; — 1.0 mg! 2.0 mg: 2,5 mg; 3,0 mg; 3.5 mg: 4,0 mg $i 5,0 mg yj= 1,5 mm; 3,0 mm; 3,5 mm; 4,5 mm; 4,6 mm; 5,2 mm si 7,0 mm Curba dé calibrare obtinuta prin reprezentarea grafica a indlfimit picului (y,) in fuinetie de cantitatile de vitamind D;/analizate (x)) este dati in figura 4.10 (A), iar in figura 4.10 (B) este data dreapta de regresie. Valorile x, si y, date mai sus apartin curbei de calibrare experimentale (A), iar datele corespunzatoare dreptei de regresie (B) sunt urmatoarele: x, =1,0 mg; 2,0 mg: 2,5 mg: 3.0 mg: 3.5 mg; 4.0 mg; 5,0 mg yy, = 1.4286 mm; 2,9286 mm; 3,6786 mm; 4,4286 mm; 5,1786 mm; 5.9286 min; 7,4286 mm Ecuatia dreptei de regresie este y = ax + b, de unde: nda Dade iar ny #-(Zx) Coeficientul de corelatie R (Pearson) este un parametru fara dimensiuni, care leaga variabilele x; si yj; 0 valoare de +1 si de -1 indicd o legdtura foarte strdnsi intre aceste variabile (se admite a priori ca erorile ce insofesc variabila y se supun legii de distributie normali a lui Gauss). Valoarea coeficientului de corelatie se caleuleaza astfel: aX (4.19)314 CAPITOLUL 4 SPECTROMETRIA DE ABSORBTIE IN ULTRAVIOLET $1 IN VIZIBIL Vit D3 [uwigl Figura 4.10 Curba de calibrare (A) pentru determinarea vitaminei D3 in UV (4=254 nm) si dreapta de regresie liniara (B) Valoarea mare a lui R’ araté o concordant buna intre cele doua drepte Un alt exemplu se refera Ia determinarea spectrofotometrica in VIS a fluorurii ca atare sidin forme farmaceutice si preparate dentare (R. Sandulescu si altii, 1996) pe baza reactiei ionului fluorurd eu complexul anionic [Fe(sulfosal}s]™ rosu violet, edd rezulta complexul anionic [FeF,]* incolor. Se lucreaz la pH = 1-3, absorbanta fiind liniara in domeniul de concentratie de 0,01 - 0,08 1g NaF/mL, masuratorile facdndu-se la $25 nm. S-a construit curba de calibrare a carei ecuatie este y = 0,31676 - 0,00203x si s-a calculat coeficientul de corelatie r = -0,99319, ceea ce arata o liniaritate foarte bund pentru domeniul de concentratie menfionat. Aceastd metodi e validata pentru 20 determindiri (fiecare valoare individuala fiind media a cinci masuratori), calculandu-se parametrii statistici necesari: X = 100,62; repe- tabilitatea (S, = 5,4 si RSD, = 5,39%), reproductibilitatea (Sp = 5,88 si RSD = 5.87%) si intervalul de incredere (pentru un nivel de 95%), A = 100,162 + 2,33%. S-a utilizat un spectrofotometru Ultrospee III UV-VIS (Pharmacia L.K.B., UK). Ea a fost aplicati la determinarea fluorurii din tablete de NaF (Osofluor ICCF, Cluj-Napoca), din gel stomatologic si din past de dinti etc. Rezultatele analitice sunt date in tabelele 4.3, 4.4 si 4.5CAPITOLUL 4 SPECTROMETRIA DE ABSORBTIE IN ULTRAVIOLET $1 IN VIZIBIL 315 Tabelul 4.3 Determinarea NaF din Osofluor (in mg/tableta) Proba Sielul Parametri statistici 3 1 2 3 4 24,88 26,69 24,86 2530 | 2634 20; 01 | 2467 | 25.34 |A = 24,86 0.78 mg per tablet Repetabilitatea: | 0,77 mg per tablet; RSD,= 3.10% | 23,64 24,97 . S, 24.57 24,97 24,60 | Reproductibilitatea: | media | 23,96 25,66 | 25,36 _|Sp=1,09 mg per tablet: RSDp= 4.41% Tabelul 4.4 Determinarea fluorurii din gel Elmex (CIBA Int. Ltd., Suisse) - - = 1 Proba NaF (%) %vs.X Parametrii statistici | 3,20 102,09 X =3,15% 274 80,75 n= 6; 0.= 0,95; ty = 2,57 3.26 104,97 Repetabilitatea: | 102,28 S, = 0,205 (%) Quan | 3,28 l Jabelul 4.5 Determinarea fluorurii din Colgate Dual Floride (Palmolive Romania) Proba NaF (mg per 100 g) Parametri statistici | 1 88,00 [X = 100,69 mg/100 g 2 104,00 n= 6; = 0,95; ty = 2,57 3 115,00 Repetabilitatea A 96,72 S$, = 8,89 mg/100 g; RSD, = 8,83% 5 10143 00,69 + 3.81% 6 98.89 4.8. Utilizarea spectrelor electronice pentru studii de structura - activitate in cazul in care o substanta medicamentoasa sufera modificdri de structura, se poate modifica si activitatea sa farmaceuticd. Astfel, tetraciclina poate suferi in solutic acida o reactie reversibila de epimerizare, forma ,,epi* fiind inactiva, Tetraciclina Epitetraciclina316 CAPITOLUL 4 SPECTROMETRIA DE ABSORBTIE IN ULTRAVIOLET $1 IN VIZIBIL in acest caz este deosebit de importanta determinarea raportului tetraci- clina/epitetraciclina, cea ce se poate face prin spectrofotometrie in UV. intr-adevar, in figura 4.11 sunt prezentate spectrele de absorbtie inUV ale tetraciclinei (1) si epitetraci- clinei (2) in H)SO, 0,1 N. ex 104 ‘am. 200 250 300 350, 400 Figura 4.11 Spectrele de absorbjie in UV ale tetraciclinei (1) si epitetraciclinei (2) In H2S04 0,1. N Asa cum se observa din acest’ figura, desi cele doud molecule sunt similare, in spectru apar modificdri datorate diferentei de structura. lar aceste diferente se reflecta in valorile absorbtivitatilor molare ale tetraciclinei si epitetraciclinei la 267 nm si 254 nm. Din absorbantele la cele doua lungimi de unda se poate calcula concentratia fiecZrei componente, dupa calcularea prealabili a absor- bantelor lor molare, care au valorile: tet = 16,000 la 254 nm €tet = 19,000 la 267 nm epi = 16,000 la 254 nm. Eepi = 15,000 la 267 nm Prin urmare; A2s4= tet beter + epi beepi = 16,000crer + 16,000 cepi si A267 = Eet beter + Eepi beepi = 19,000c%et + 15,000 cep In cazul unui amestec dat de tetraciclina si epitetraciclina al cdrui spectru in UV este dat in figura 4.12, se pot calcula concentrafiile molare ale celor doi compusi utiliz’nd absorbantele determinate experimental si absorbantele molare ale celor dou substante.CAPITOLUL 4 SPECTROMETRIA DE ABSORBTIE IN ULTRAVIOLET SI IN VIZIBIL. 317 0,50: 0,25 n 200 300 400 Figura 4.12 Spectrul de absorbjie in UV al unui amestec de tetraciclina si epitetraciclina A= 0,790 la 254 nm A= 0,750 la 267 nm ‘A254 = 16,000ctet + 16,000 cepi = 0,790 A267 = 19,000cter + 15,000 cepi = 0,750 Din aceste ultime ecuatii se afla concentratiile molare ale celor doi compusi din amestec: cret = 2517-10 mol/L. 2,37:10°° mol/L. epi Este posibil si se prevada un rezultat (respectiv variabila dependenta) care depinde de mai multi factori (care sunt variabile independente) printr-o analiza de regresie liniar’ multipla, Asa de exemplu, pentru un caz ipotetic cu trei factori (variabile independente) se poate utiliza ecuatia generala: yeatbxi +ex2 + dx3 (4.21) st de asemenea ca prin metoda regresie’ liniare multiple se pot calcula Deemter, care corespunde,unor date Trebuie r factorii (parametrii) A, B si C din ecuatia lui v: experimentale in determindirile gazcromatografice. Cand este necesar s4 se compare daca dowd metode spectrofotometrice de dozare a unei substanfe medicamentoase condue la rezultate concordante pentru o serie de esantioane, se calculeaz’ coeficientii de corelatie corespunzatori Ry si Rp si valoarea testului student: tte pentru k =n-2 grade de libertate (4.22)CAPITOLUL 4 SPECTROMETRIA DE ABSORBTIE IN ULTRAVIOLET $1 IN VIZIBIL Asa cum s-a mai aratat anterior, in aplicarea testelor statistice se admite (presu- pune) ca rezultatele se supun unei distributii normale, Dar adesea unele metode de analiza conduc la rezultate care arata distributii diferite, nu sunt simetrice, sau dacd sunt simetrice, nu sunt normale ete. De regula, majoritatea rezultatelor au o distributie normala fat de .,media aritmeticd X“ a tuturor rezultatelor. in astfel de cazuri se utilizeaza in locul mediei aritmetice, mediana, iar in locul abaterii tip (standard) se calculeaza deviatia medie (DM) xi -X pM=4/ ZA-® (4, 23) n 4.9. inregistrarea spectrelor Aceasta este una dintre problemele de mare importanta in det substantelor medicamentoase, inregistrarea spectrelor se poate face, tarea_grafi ectia si dozarea ie prin reprezen- a_absorbantei_in functie de lungimea de unda (Figura 4.13 a), fie a in functie de lungimea de unda (Figura 4.13 b), Aceasta inregistrare se face latele experimentale fiind inmagazinate in calculator, acesta avand programe de prelucrare a datelor. in aceasta figuré sunt prezentate Spectrele unor solutii de permanganat de poatsiu de diferite concentratii exprimate in ppm. 20.00 (b) Figura 4.13 Spectrele unor solutii de permanganat de potasiu cu concentrati diferite (in ppm, valorile inscrise pe curbe), in functie de absorbanta (@) sau de transmitanta % (b) Inregistrarea spectrelor UV-VIS se face in solutiile analitilor in solventi potrivit, iar alegerea solventului portivit in fiecare caz este 0 problema deosebiti, deoarece ~-Solventul nu trebuie sa absoarba semnificativ* in regiunea spectrala utilizata pentru determinarea unui anumit analit,CAPITOLUL 4 SPECTROMETRIA DE ABSORBTIE IN ULTRAVIOLET SI IN VIZIBIL 319 Pentru determinarile spectrofotometrice in ultraviolet a substantelor insolubile in 4 se alege unul dintre solvenfii dafi in tabelul 4.6, iar pentru determinari in domeniul vizibil se utilizeazd apa, intotdeauna cand este posibil, sau unul dintre solventii dati tot in acest tabel. La alegerea solventului trebuie s& se acorde o mare atentie deoarece interactiuinile dintre analifi si solventi (ex.: solvatocromia) produc modificari in spectrul UV. Asa de exemplu, utilizénd mai multi solvenfi, incepand cu unul nepolar, pand la unul polar, se poate pierde structura find a spectrului unei substanfe, sau pot avea loc deplasiri bato- sau hipsocrome in functie de interactiunile care au loc si de natura tranzifiei care se produce. Tabelul 4.6 Solventii utilizati in spectrometria UV-VIS | Solventut Absoarbe la J.nm Solventul “Absoarbe la. nm Apa 200 Diclormetan 233 | Etanol de 95% 205 Butileter 235 | Metanol 210 Cloroform 245 | Acetonitril 210 Propionat de etil 255 Ciclohexan 210 Formiat de metil 260 |Cictopentan 210 Tetraclorura de carbon 265 Heptan | 210 | Dimetilformamida (N.N) | 270 Hexan | 210 Benzen | 280 | Pentan | 210 |Toluen 285 | Alcool izopropilic 210 m-Xilen 290 Izooctan | 215 Piridina 305 | Dioxan 20 [Acetona 330 | Dietileter 220 Bromoform 360 | Glicerina 220 Sulfura de carbon 380 | |1.2-Dicloretan 230 Nitrometan ___380 Absorbanfele au fost determinate in cuva de 1 cm fafa de apa - referinta. Spectrometria UV (VIS) se poate utiliza si in studiul unor procese chimice care se petrec in solutie. De exemplu, salicilatul de metil sufera in solutie apoasa alcalina 0 reactie de hidroliza, din care rezultd acid salicilic, iar cu exces de baza salicilatul alealin corespunzator: COOCH, COOH OH +10 al + NaOH ae Co, ‘OH ‘OH salicilat de metil acid salicilic salicilat de sodiu COONaCAPITOLUL4 SPECTROMETRIA DE ABSORBTIE IN ULTRAVIOLET $1 N VIZIBIL Daca se noteaza cu A salicilatul de metil si cu B produsul de reactie (acidul salicilic sau salicilatul de sodiu) se obtin in fazele intermediare ale hidrolizei mai multe ame- stecuri ale celor dou substante, care au concentratiile c4 si cy care pot varia invers proportional (cAnd scade ca, creste cg), dar concentratia totald, cr = cy + ep nu se modifica, fiind deci constant, astfel c& se poate serie: A1=eabca + epbep =eb(ca ten) =constant (4. 24) b= grosimea stratului de solutic La reprezentarea graficd a absorbantei amestecului de A siB in diferite momente ale hidrolizei, in functie de lungimea de unda (la aceeasi valoare a concentratici totale) se obfin mai multe spectre care se intretaie ,,prin suprapunere in acelasi punct, numit .,punct izobestic, asa cum se poate vedea in figura 4.14, deoarece absorbantele solutiilor de A si B, pentru o anumita lungime de unda a punctului izobestic, sunt identice, Ca urmare, absorbantele molare €, si éy sunt identice la punetul izobestic. a ae 280 290 300 310 320 280 340 350 Figura 4.14 Reprezentarea punctului izobestic al spectrului UV al salicilatului de meti in timpul hidrolizei lui bazice. Spectrele au fost inregistrate in domeniul 280-350 nm la intervale de 10 minute De retinut ca la punctul izobestic absorbanta este aceeasi pentru toate amestecurile de A siB.CAPITOLUL 4 SPECTROMETRIA DE ABSORBTIE IN ULTRAVIOLET $1 IN VIZIBIL. 321 4.10. Determinarea valorii pKa din masuratori spectrofotometrice Se stie c&i numeroase substante medicamentoase au caracter slab acid (8-hidroxi- chinolina) sau slab bazic (morfina) si ca lor le corespund 0 forma molecular si o forma ionizata (acida sau bazicd), fiind deci de asteptat ca cele doud forme si aiba spectre diferite. Unui acid slab fi corespunde o baza conjugatd tare, iar unei baze slabe fi cores- punde un acid conjugat tare, conform echilibrelor (in mediu apos) urmatoare: HOt eg Fa * HA====H's Asi Bo+H BH acid slab baz tare baz slaba acid conjugat tare conjugata Fiind vorba de acizi si de baze slabe, proportia relativa dintre cele doud forme depinde de pH-ul mediului de reactie, conform relatiei urmitoare [baz] [acid] 120 pH =pKa + log (4.28) Asa se explic& faptul c& in cazul unui acid slab existent in mediu acid. in solutie exist practic numai forma sa moleculara (in acest caz raportul bazdi/acid < 10”), iar in mediu alcalin predomina forma ionizata (in acest caz raportul bazi/acid > 10°), Pentru determinarea pK, al unui acid slab (K, pK,= 5) se inregistreaza spectrele solutiei la pH = 2 (cand predomina forma moleculard pura, acidul nefiind ionizat), la pH = 8 (cand predomina forma ionizaté pura, acidul fiind practic ionizat) si la pH = 5,5, deci intermediar, pentru care exist un echilibru intre cele doua forme si evident c& acest echilibru este legat de pK. Pentru masuratori cat mai precise este necesaré determinarea prealabilé a lungimii de und& cea mai potrivita pentru méasuratoare, la care diferenta dintre absorbantele formelor ionizati si moleculara este cea mai mare. Se admite cA Aypyim = 358 nm, asa cum rezulta din figura 4.15. 310 330 350 370 ast Figura 4.15 Spectrele electronice ale solutiei unui acid slab (Ka = 10°, pKa = 5,0) la pH = 2 - forma moleculara, pH = 8 - forma ionizata si la pH = 5,5 (intermediar) pentru amestecul celor doua forme322 CAPITOLUL 4 SPECTROMETRIA DE ABSORBTIE IN ULTRAVIOLET $1 IN VIZIBIL Dupa inregistrarea spectrelor la 358 nm, se calculeazi absorbanfele molare ale formelor ionizata (¢; ) si moleculara (¢,, ) prin masuratori la pH-urile mentionate mai sus pentru cele dou’ forme, care au valori suficient de acida si de bazicd. Se masoara de asemenea absorbanfa solutiei amestecului celor doua forme la pH intermediar, cénd pH-ul are o valoare apropiati de aceea a pK, (cele doud forme fiind in echilibru). Concentratia solutiei este aceeasi si se noteaza cu c. in acest caz absorbanta se calculeaza utilizdnd relatia: a=(c-x)em+€i (4, 26) x =concentratia formei ionizate la pH-ul ales (2 in acest caz) Pe baza acestei relatii se poate scrie: foo a (4.27) ei-€m ei-Em oad a— ce x =cem Ka = pH = log H — log $= 4, 28 ee cox Pe ma ase, Deoarece ,.a este absorbanta la pH-ul ales, relatia de calcul a pK, (exponentul constantei de aciditate) se poate scrie astfel pKa= pHakes - log “—™ sau pKa= pH -loge—™ (4, 29) ai-a ei-e In aceste relatii ay) = CE = absorbanfa solutiei cu concentratia c la pH < 2, (a formei moleculare); -¢; = absorbanta aceleiasi solutii la pH 3 8, (a formei ionizate). O relatie similara se poate serie si pentru calcularea pK, pentru o baz, care are forma moleculara B (deci neionizata), careia ii corespunde forma acida ionizata BH’. Relatia de calcul a exponentului bazei slabe este urmiitoarea: aj-a pKa= pH ~ log (4. 30) aan Relafiile de mai sus si conditiile de pH sunt strict valabile pentru acizii slabi si bazele slabe monofuncfionale, pentru compusii polifunetionali fiind necesara 0 mai atenta evaluare a pH-ului acid si bazic la care se méisoara absorbantele molare &, si, .in cazul acestor compusi care au mai multe trepte de ionizare, este recomandabil ca modificarea pH si se fack lent pentru ca acesta s& atinga valorile dintre diferitele K, .), €e permit msurarea corect a absorbantelor. Acestii metodai a fost aplicatd la determinarea spectrofotometrica in UV a pK, si pK, pentru forma tiolicd a derivatilor de bistiouree (L. Roman, Simona Mirel etal.) care, in functie de pH, au o comportare tautomer:CAPITOLUL 4 SPECTROMETRIA DE ABSORBTIE IN ULTRAVIOLET $1 IN VIZIBIL. 323 Bo Nin fia N A at NHagt = H—C—N-—N=C—NH—-R' Ss s HH SH forma tionica forma tiolica $-a lucrat pe solutii alcoolice cca 10° M (f ~ 1), cuva de | em, la pH = 1,5 (HCI 0,1 N), pH ~ 12,5 (NaOH 0,1 N) si la pH = 7,5 - 9,5, deci intermediar (tampon Na B,O7 0,05 M/ HCI 0,1 N). Valorile pH au fost masurate cu un pH-metru Chemeadet 5986-62 (Cole Parmer), la forte ionice tt = 0,1 - 0,2. Masuratorile de absorbanta au fost Facute in domeniul 220-360 nm (pentru punctele izobestice A, = 238 nm si 2; = 263 nm). Au fost determinate in acest mod valorile pK, si pK, pentru bistiouree (BT) alilbistiouree (AIBT), bisalilbistiouree (BAIBT), fenilbistiouree (FBT) si ilbis- tiouree (BFBT). In figura 4,16 sunt prezentate spectrele UV si punctele izosbestice pentru alilbistiouree, inregsitrate in mediu acid, la pH intermediar (4 valori) si in mediu alealin, iar in tabelul 4,7 sunt date valorile pK, si pK, corespunzitoare celor 5 compusi studiati lap Figura 4.16 Spectrele UV ale alilbistioureii (AIBT) la pH acid, intermediar (4 valori) si puternic bazic 1-pH1,5; 2-pH7,4; 3-pH7.72; 4-pH8,85; 5-pH9,5; 6-pH12,20 Tabelul 4.7 Valorile pK,,si pKa, ale bistioureii si derivatilor sai Produsul pKa, | BT (bistiouree) 10,1140,45 AIBT (alilbistiouree) BAIBT (bisalilbistiouree) FBT (fenilbistiouree) BEBT (bisfenilbistiouree)324 CAPITOLUL 4 SPECTROMETRIA DE ABSORBTIE IN ULTRAVIOLET SI IN VIZIBIL Din datele acestui tabel se observa c& valorile pK, si pK,, ale fenilbistiourii si bisfenibistioureii sunt mai mici, datorité nucleelor aromatice pe care le contin si care imprima un caracter acid mai pronuntat acestor molecule. Caracterul acid scade apoi de jos in sus pana la bistiouree care are cel mai slab caracter acid. 4.11. Exemple de spectre UV ale unor substante medicamentoase 215 439 A 259 296 200 300 400 nm Figura 4.17 Spectrul UV al clozapinei (in metanol) 248.8 200 240 280 320 360 nm, Figura 4.18 Spectrul UV al didanozineiCAPITOLUL 4 “SPECTROMETRIA DE ABSORBTIEIN ULTRAVIOLET $1 IN ViZIBIL 325 200 250 300 nm Figura 4.19. Spectrul UV al clorhidratului de dipivrefina,(in etanol) 200 360. nm Figura 4.20 Spectrul UV al clorhidratului de metixen in: 1. HCI.0,1 N; 2. NaOH 0,1 N 3 si 4. amestec hidroalcoolic 220 225 230 235 240 245 250 255 260 nm Figura 4.21 Spectrul UV al simvastatinei326 CAPITOLUL 4 | SPECTROMETRIA DE ABSORBTIE IN ULTRAVIOLET SIN VIZIBIL 200 250 300 350 400 450 500 S50 nm. Figura 4.22 Spectrul UV al tenoxicamului (in etanol) 200 250, 300 nm Figura 4.23 Spectrul UV al tiamfenicolului in ap&: 4 = 0,015 mg/mL; 2 = 0,2 mg/mL 200 250 280 nm, Figura 4.24 Spectrul UV al tiamfenicolului in apa: 1 = capsule sintetice; 2 = matrice de capsule sinteticeCAPITOLUL 4 SPECTROMETRIA DE ABSORBTIE IN ULTRAVIOLET SI IN VIZIBIL 327 ia a ee ene 200 240 280 320 360 nm Figura 4.25 Spectrul UV al tolazamidei (in etanol), benzi mai importante la 256, 263, 268 si 274 nm 4.12. Spectrometria derivata in practica analitica a spectrometriei de absorbtie aplicata la amestecuri de subs- tante, exist adesea cazuri in care spectrele diferitilor compusi din amestec, nu sunt suficient de diferentiate, fiind posibila amplificarea micilor variatii de panta ale spectre- lor initiale, numite i spectre de ordin zero, prin aplicarea spectrometriei derivate, cand se obfin ,,curbele derivate“ corespunzitoare, ceea ce imbunatateste precizia determina- rilor. Aceasta se explica prin aceea cA picurile spectrelor derivate sunt mai accentuate, mai bine diferenfiate dect in cazul utilizarii unitatilor de absorbant’ la trasarea spec- trelor. Prin urmare, spectrometria derivata consti in transformarea unui spectru. de absorbtie initial, de ordinul zero, in spectrul primei sau celei de a doua derivate sau de ordin mai inalt. Un spectru al primei derivate indica traseul graficului curbei de absorbtie, adic’ al procentului sau proportiei de! schimbare a absorban(ei, exprimat prin derivata de .ordinul 1 dA/d). in functie de lungimea de unda. Spectrul celei de a doua derivate reprezinta curbura spectrului de absorbtie in functie de lungimea de unda, derivata lungimii de und fiind legati de concentratie prin ecuatiile urmatoare: i‘ slike @A_ WAI Lom 6 Ae ad? ae eb (4,31) in care: c/=concentrafia substanei analizate, care absoarbe lumina, in procente (m/v); € =abasorbanta molara; b = grosimea cuvei.328 CAPITOLUL4 SPECTROMETRIA DE ABSORBTIE IN ULTRAVIOLET St IN VIZIBIL. Practic, se utilizeaz un spectrofotometru UV-VIS echipat cu un modul analogic de diferentiere a capacitanfei sau rezistenfei sau cu un modul numeric sau cu orice alt dispozitiv capabil sé produed Spectre derivate. Dar trebuie s& se find seama de faptul c& unele dispozitive (module) produc un decalaj al lungimilor de unda in figura 4.26 este dat pentru exemplificare spectrul derivatei a doua a fenilalani- nei, comparatiy cu ,,spectrul de ordinul zero absorbant 2gnm a ot 240 260 280 300 Figura'4.26 Spectrele UV ale fenilalaninei reprezentate in unitati de absorbanta sin derivata a doua a acesteia Pledaiid de la curba prime’ derivate, dA/dA = f() , derivarea se poate extinde la mai filulte derivate succesive, pand la derivata a ,,n“-a, ceéa ce se poate realiza practic cu orice spectrofotometru modern. Asa cum se poate observa din figura 4.26, punctelor de inflexiune din spectrul de ordinul zero le corespund pe curba derivati maxime si minime (picur pozitive si negative), adica puncte de anulare a pantei,, Daci derivarea se face pind la aceea de ordinul n=-4, se pot pune in evident si mai bine variafiite mici ale absorbantei din spectrul de ordinul zero (initial). Obtineréa spectrelor derivate 1iu este mai dificila:decat obfinerea specttelor in absorbati{a, avand inst fafa de aceasta din urma o rezolutie net superioard, iar maximele si minimele spectrului derivatei an-a sunt proportionale cu valoarea absorbantei solutici analizate. Si in cazul spectrometriei derivate este necesara stabilirea unei curbe de etalonare utilivAnd mai multe solufi etalon, cu concentrafii diferite, pentru care se aplica acelasi tratament matematic aplicat solufiei probei de analizat Speciroinetria derivatti este importanta maj ales pentru situatiile in care absor- banta este denaturata si anume 4) cazul in care spectrul conventional (de ordinul zero) al solutiei de analizat prezinta un decalaj spre varf (maxim) din cauiza unei absorbtii de fond uniforma, ceea ce nu se intampl& in cazul spectrului derivat care este sensibil numai la variatiile pantei spectrului conventional (initial);CAPITOLUL 4 SPECTROMETRIA DE ABSORBTIE IN ULTRAVIOLET SIN VIZIBIL, 329 2) -cazul in care’in solufia de analit apare un fenomen de difuzie a luminii, care se, manifest printr-o absorbtie de fond care creste moderat spre Jungimi de unda mici, fenomen care nu afecteaz (decat putin) spectrele derivate, asa cum se observa in figura 4.27. fa) Tivw absorbant absorbanta prima derivati (absorbant) Figura 4.27 Efectul procesului de difuzie asupra spectrului inregistrat in unitafi de absorbanfé (2) si asupra spectrului derivatei intai (b) in spectrometria derivata, pe ling’ alfi parametri, mai intetvin doi factori foarte impottanti si anume ,,ordinul derivatei* si lungimea de’ unda la care se calculeaza derivata, Practic, este vorba de o transformare electronica a semnalului (absorbantei), operatie care este simpla si mai putin incomoda decat alte tehnici anterioare. Spectrometria derivata are aplicatii in analiza si controlul medicamentelor si analiza biochimica si de laborator clinic. Trebuie precizat c& derivata unui pic spectral se poate obfine in mai multe moduri, de aceea nu se obfine un singur spectru (identic) pentru toate procedeele. Ca urmare, atunci cand un spectru-este descompus in compo- nenfii sai initiali sub forma unor benzi izolate, diverse programe de calculator nu duc la © aceeasi rezolufie, Tindndu-se seama de faptul c& spectrofotmetria derivatd este un procedeu potrivit de amplificare si precizare a particularitatilor Spectrelor, scopul find cela de a studiaSa 330 CAPITOLUL 4 SPECTROMETRIA DE ABSORBTIE IN ULTRAVIOLET $1 IN VIZIBIL. traseul derivatei, dupa n derivari ale spectrului, comparativ cu spectrul de ordinul zero, desigur respectfind lungimea de unda. Pentru utilizarea tehnicii derivarii spectrelor trebuie si se realizeze cuplajul unui spectrofotometru cu un sistem de calcul electronic, pentru a se putea valorifica structura spectrului inifial a cdi rezolutie este slab. Aceasta valorificare a structurii spectrelor este utild in cazul dozarii unor substante dintr-un amestec, ale c4ror spectre se suprapun sau sunt interferate de semnalele unor impuritati care dau absorbtii parazite. inastfel de cazuri se pot calcula derivatele de ordinul 1, 2, 3 si4 in raport cu lungimea de und sau cu freeventa. in figura 4.28 sunt prezentate spectrul de ordinul zero si spectrele derivatelor de ordinul 1, 2, 3 si4 obfinute prin derivarea absorbanfei, in functie de lungimea de unda (in aceste spectre, pe ordonatele spectrelor derivate sunt date unitati exprimate in putere negativa a n deci a ordinului de derivare). (a) (b) Para? A a A l © (a) Baldr atayant A a a h Figura 4.28 Exemplu de spectru de ordinul zero si spectre derivate de ordinul 4, 2, 3 si 4 corespunzatoare (a) derivatele de ordinul zero si 1; (b) derivatele de ordinul zero si 2; (c) derivatele de ordinul zero si 3; (d) derivatele de ordinul zero si 4.CAPITOLUL 4 SPECTROMETRIA DE ABSORBTIE IN ULTRAVIOLET SI IN VIZIBIL 331 Asa cum se observa din aceasta figura, spectrele devin cu atét mai complicate cu cat creste ordinul derivate (in general derivatele cu ordin mai mare de patru, n> 4, sunt foarte rar utilizate in practica analitica). Derivata de ordinul 1, figura 4.28 (a), prezint& un maxim corespunzator punctului de inflexiune a partii ascendente a spectrului de ordinul zero si un minim corespunzator punetului de inflexiune din partea descendenti a spectrului de ordinul zero. Spectrul primei derivate intersecteaz’ abscisa la 0 lungime de unda ce corespunde maximului absorbtiei, iar pentru o absorbant zero, ea se confunda cu abscisa. Deci derivata de ordinul | prezinta un maxim si un minim. Spectrul derivat de ordinul 2, figura 4.28 (b), prezinti 2 maxime ce corespund celor doua punete de inflexiune ale primei derivate, precum si un minim care se afl la acceasi lungime de unda ca maximul de absorbtie din spectrul de ordinul zero. Spectrul derivat de ordinul 3, figura 4.28 (c), prezinté dowd maxime, unul mai mic, al doilea mai mare si doud minime dintre care una mai important, ca urmare a faptului cA aceasti derivati {ine seama de maximele, minimele si de inflexiunile spectrului derivatei de ordinul imediat inferior (adic& doi). Spectrul derivat de ordinul 4, figura 4.28 (4), confine un maxim aecentuat, incadrat intre doud maxime mai mici i doud minime accentuate, avand practic aceeasi marime. Picul important (mai mare) este situat la aceeasi lungime de unda ca si maximul picului de ordinul zero. S {in practica analitica se utilizeaza mai ales spectrele derivate de ordinul 4 cel de ordinul 3 nefiind utilizat de loc. Mai frecvent se utilizeaza spectrele derivate de otdinul 1 si2, dar adesea si cel de ordinul 4, datorit& maximului important situat la aceeasi lungime de unda ca si maximul spectrului de ordinul zero. Spectrele derivate prezinté dou’ avantaje importante care explica utilizarea lor si anume 4) eleofer’ o rezolufie mai bund decat spectrul initial (de ordinul zero), rezolutie care creste odata cu ordinul derivatei; dar cresterea rezolutiei nu este nelimi- tat, trebuind sd se tind seama de aspectul benzilor si de raportul dintre inalti- mea unei benzi la maximul absorbtiei si de lrgimea benzii la 1/2 din ‘inaltime; mai mult, dacd exist un zgomot de fond insemnat, trebuie sd se facd o curatire (netezire) a spectrului, adici eliminarea sau micsorarea cat mai mare a zgomotului de fond: 2) amplitudinea picurilor derivate creste cu ordinul derivatei, pentru o anumita amplitudine dat a picului initial (de ordinul zero). imbunatatirea rezolutiei si preciziei determinarilor spectrale derivate este util att pentru analiza calitativa, cat si pentru analiza cantitativa,332 CAPITOLUL 4 SPECTROMETRIA DE ABSORBTIE IN ULTRAVIOLET $1 IN VIZIBIL Uneori este necesard testarea practic& a rezolutiei, atunci cand o monografie cere agest lucru, Aceasti testare se face prin inregistrarea derivateia doua a spectrului unei solutii de toluen (R) 0,020% (m/v) in metanol (R), utilizind ca martor (lichid de compensare) hexanolul (R) prezentat in figura 4.29. Figura 4.29 ‘Spectril derivatei a 2-a al unei soluiti de toluen’ (R) 0,020% in metanol (R) ‘Asa cum se observa din aceasta figura, spectrul prezinta un pic negativ mai mic, incadrat de doua picuri negative mai mari (extreme) si mai importante la 261 nm si 268 nm, iat raportul/A/B = 0,2 (dar nu mai’ mic de aceast’ valoare). Ca metodologie de lucru este necesar pretratarea solutiei de analizat si reglarea aparatului in conformitate cu indicatiile producatorului, utilizand pentru aceasta reglare sulfatul.dublu de cobalt si amoniu, Co(NH,)9(SO,),:6H0, cu M = 395,2 (cristale rosii prismatice monoclinice) solubil in apa si practic insolubil in metanol.