Curs 5.

Genetica bacteriană

5.1. Suportul eredităţii

Genetica bacteriană studiază ereditatea şi variabilitatea la bacterii.
Suportul material al eredităţii este reprezentat de ADN (acidul dezoxiribonucleic).
Molecula de ADN conţine codificată informaţia ereditară, care se exprimă prin sinteza
unor proteine şi se transmite prin replicare şi diviziune la descendenţi. Gena reprezintă
unitatea funcţională a eredităţii iar noţiunea de genă este cunoscută încă din anul 1909.
Dacă nu au loc modificări genetice, toţi descendenţii unei bacterii vor fi identici cu
bacteria „mamă” şi identici între ei. O celulă bacteriană inoculată pe un mediu de cultură
(având la dispoziţie nutrienţii necesari) va produce prin multiplicare în condiţii prielnice
(de pH, temperatură, umiditate etc.) o colonie bacteriană, o clonă.
Materialul genetic al unei celule bacteriene poate fi modificat fie prin incorporarea unui
fragment de material genetic exogen (prin procesul de recombinare genetică), fie prin
apariția spontană sau indusă a unei mutaţii care poate consta în adăugarea, pierderea,
substituirea sau inversarea ordinii unor baze în secvenţa ADN-ului.

Structura acidului dezoxiribonucleic

ADN-ul este un macropolimer de dezoxirbonucleotide.
Unitatea structurală este formată dintr-o bază azotată purinică (adenina, A; guanina, G)
sau pirimidinică (timina, T; citozina, C), o pentoză (dezoxiriboza) şi acid fosforic.
Legături fosfodiester unesc carbonul 5 al unei molecule de dezoxiriboză cu carbonul 3 al
moleculei adiacente, formând o catenă lungă polinucleotidică. Prin analiza compoziţiei în
baze azotate a ADNului (provenit din surse diferite) s-a demonstrat că există o anumită
compoziţie care diferă la diversele specii.
Compoziţia de nucleotide a ADN-ului este surprinzător de variabilă. Suma procentuală a
citozinei şi guaninei variază la bacterii de la 22% până la 74%, în timp ce la organismele
eucariote intervalul este ceva mai restrâns (28 - 58%). La om variază între 39-40% în
funcţie de tipul de ţesut (timus 39%; ficat 39,4%). Acest fapt se explică prin evoluţia în
decursul a mai multor mii de ani a procariotelor comparativ cu a eucariotelor în general şi
a omului în particular.
Comparaţiile conţinutului de C+G ale diferitelor organisme și microorganisme au fost
folosite drept fundament în vederea stabilirii relaţionării/legăturii genetice. Timina fiind
susceptibilă la alterări fotochimice (lumină UV), bacteriile cu un conţinut bogat de C+G
este posibil să fi evoluat în medii supuse unei lumini solare foarte puternice sau unor
temperaturi înalte, iar cele cu conţinut redus de C+G s-ar fi dezvoltat în locuri mai
protejate.
Așadar, compoziţia în baze azotate, numită şi procentul de C+G, este diferită în funcţie
de specie, dar se păstrează constantă în cadrul unei anumite specii.
Procentul de C+G se calculează după formula: (C+G)/ (C+G+A+T). De exemplu acest
raport diferă la diferitele specii bacteriene, sper exemplu este 26,8% la Clostridium
perfringens, 40% la Streptococcus pneumoniae, 40,5% la Proteus vulgaris, 51,7% la
Escherichia coli, 53% la Proteus morgani şi67% la Pseudomonas aeruginosa. Aşa cum a
fost precizat de către diverşi autori, compoziţia de baze azotate este un index taxonomic.

1
La celulele procariote ADN-ul este inelar, împachetat în nucleoidul din citoplasmă.
La bacteria intestinală E. coli cele 4,7 milioane de perechi de baze alcătuiesc o
macromoleculă de 1,4 milimetri lungime, dar numai 2 nanometri lăţime. Aceasta conţine
4.400 de gene deja secvenţiate. În ciuda lungimii sale, de peste o mie de ori diametrul
celular, ADN-ul este extrem de bine înfăşurat în nucleoid, în aproximativ jumătate din
diametrul celular.
ADN-ul apare ca o macromoleculă formată din două catene polinucleotidice antiparalele
şi complementare răsucite în dublu helix. Cele două catene sunt unite prin punţi de
hidrogen formate între bazele azotate opuse (A=T şi G≡C). Modelul structural al
ADN-ului a fost propus de către Watson şi Crick în anul 1953. Complementaritatea
bazelor azotate este cea mai importantă proprietate a acizilor nucleici şi condiţionează
toate proprietăţile ADN-ului, mai ales cea de autoreplicare şi cea de transfer al
informaţiei genetice.
Rolul genetic al ADN-ului a fost dovedit prin experienţe succesive, iniţial prin cercetările
lui W. Griffith (1928) privind fenomenul de transformare bacteriană, ulterior prin
experienţe care au confirmat rezultatele obţinute de Griffith, dar abia în 1944 Avery,
MacLeod şi Mc Carthy demonstrează faptul că ADN-ul este substratul chimic al eredităţii
şi reprezintă materialul genetic al oricărei celule (funcţie îndeplinită aşa cum ştim astăzi
de ARN, la ribovirusuri).
La temperatura camerei ADN-ul este o structură stabilă în condiţii fiziologice normale,
datorită legăturilor intercatenare (2 între A şi T şi 3 între C şi G). Dacă temperatura
depăşeşte 65ºC, stabilitatea punţilor de hidrogen începe să cedeze, dublul helix începe să
se desfacă şi rezultă două catene complementare (proces numit denaturare termică).
Denaturarea devine completă la temperaturi care depăşesc valoarea de 90º C.
Renaturarea („reannealing”) reprezintă refacerea structurii bicatenare a ADN-ului, iar
prin acest proces se poate stabili relaţia filogenetică între două specii (în funcţie de
procentul de renaturare). De exemplu dacă se utilizează ADN denaturat provenit de la
E. coli şi ADN denaturat provenit de la Salmonella spp., fiecare marcat cu acelaşi izotop
(ex. C14), fracţiunea de ADN marcată şi evaluată prin diferite tehnici va fi fracţiunea din
ADN care este complementară pentru cele două specii (aceste experienţe au stat la baza
brevetării tehnicilor de hibridare moleculară). Renaturarea este un proces mai lent decât
denaturarea.
Denaturarea şi renaturarea acizilor nucleici sunt procese fizice importante, folosite fie în
tehnologia ADN-ului recombinant, fie în studierea relaţiilor filogenetice între diferite
specii. Cu cât speciile sunt mai înrudite, cu atât secvenţele de baze azotate au un mai
mare grad de similitudine (lanţurile lor monocatenare renaturează mai rapid).

Genom. Genotip. Fenotip

Genomul reprezintă suma genelor unui organism.
Totalitatea informaţiei genetice a unui organism se numeşte genotip.
Suma caracterelor observabile, specifice unui organism, produse de genotip în
interacţiune cu mediul ambiant se numeşte fenotip.
Funcţiile ADN-ului ca material genetic sunt:
- conservarea informaţiei genetice;
- replicarea;
- transcrierea şi traducerea materialului genetic;

2
- protejarea materialului genetic propriu („self”);
- reglarea şi controlul activităţii celulare.
Transmiterea mesajului genetic la bacteriile descendente
Transmiterea mesajului genetic se face prin dublarea cantităţii de material genetic urmată
de diviziune.
Replicarea ADN constă în sinteza unor noi molecule de ADN, identice cu molecula
parentală şi identice între ele, pe bază de complementaritate (replicare
semiconservativă). După ruperea legăturilor de hidrogen şi separarea celor 2 catene,
fiecare catenă serveşte drept matriţă pentru sinteza unei noi catene. Replicarea ADN este
una dintre cele mai importante reacţii din lumea vie. Watson şi Crick au fost primii care
au propus modelul semiconservativ de replicare a ADN.
În celula care se dezvoltă rapid, există posibilitatea ca înainte de terminarea primei
replicări să se iniţieze încă o replicare. În acest caz celula bacteriană va putea fi
merodiploidă (doar anumite regiuni cromozomale sunt copiate de mai multe ori decât în
mod normal) sau chiar poliploidă (tot cromozomul a fost copiat de mai multe ori decît în
mod normal).
În general, dacă replicarea cromozomală nu este succedată de diviunea celulei (aşa cum
se întâmplă în mod obişnuit), putem remarca în celula bacteriană existenţa cromozomilor
supranumerari. Cromozomii suplimentari (în total 2 sau 4) nu aduc o informaţie genetică
diferită, pentru că ei reprezintă copii ale cromozomului iniţial (deci sunt identici cu
acesta).

Repliconul (Jacob, Brenner, Cuzin)

In vivo se pot replica numai moleculele de ADN constituite într-o unitate de replicare
independentă numită replicon. Indiferent dacă celula are mai mulţi cromozomi (celula
eucariotă este diploidă) sau un singur cromozom (celula procariotă), tot genomul trebuie
să fie replicat.
Repliconul bacterian este bicatenar şi circular, caracterizat prin:
- o secvenţă nucleotidică specifică marcând începerea replicării;
- gene care codifică sinteza unor proteine specifice numite iniţiatori;
- o secvenţă nucleotidică semnal pentru terminarea replicării.
Exemple de repliconi:
- cromozomul şi plasmidele bacteriene;
- genomul bacteriofagilor.
Cromozomul bacterian este unul dintre cele mai ilustrative exemple de repliconi. O genă
structurală din cromozom are toată informaţia necesară sintezei iniţiatorului replicării
(o proteină complexă). După ce replicarea a început, nu mai poate fi oprită până în
momentul când se ajunge la dedublarea cromozomului.
Cromozomul bacterian funcţionează ca un replicon, fapt dovedit de experienţa în care
fragmentele de ADN introduse într-o celulă bacteriană (de ex. prin conjugare) nu se pot
replica dacă rămân „libere” în citoplasmă, dar vor putea fi replicate odată cu întregul
cromozom în cazul în care sunt integrate în cromozomul bacterian.
Replicarea corectă este controlată de un mecanism foarte precis care „identifică” apariţia
de nucleotide libere, împerecheate eronat şi în momentul apariţiei unui astfel de
eveniment nucleotidul este „tăiat” iar polimerizarea se opreşte (corectitudinea citirii este
realizată cu ajutorul ADN-polimerazei I).

3
5.2. Hibridizarea acizilor nucleici
Reacţia de hibridizare a acizilor nucleici se poate realiza datorită complementarităţii
nucleotidelor (structura primară). Prin această tehnică se poate demonstra înrudirea sau
eventual identitatea a două microorganisme, pe baza gradului (procentului) de omologie a
secvenţelor nucleotidice.
Din punct de vedere tehnic, cultivăm o bacterie de referinţă (cunoscută) în aşa fel încât să
putem marca ADN-ul cromozomal (însă uneori aceste experienţe se fac prin marcarea
ADN-ului plasmidic). Spre exemplu, o variantă poate fi reprezentată de cultivarea în
mediu cu timidină tritiată, astfel încât rezultă marcarea radioactivă a ADN-ului cu tritiu.
ADN-ul extras din fiecare microorganism este tratat pentru a obţine fragmente
monocatenare. ADN-ul dublu catenar se reface, dacă fragmentele de ADN (ţintă) ale
bacteriei testate au secvenţe nucleotidice complementare cu fragmentele ADN (sondă
moleculară) de referinţă. Cu cât gradul de complementaritate dintre sonda moleculară şi
ţintă este mai mare, cu atât structura hibridă formată va fi mai stabilă şi mai greu de
disociat. Actualmente sondele moleculare sunt sintetizate chimic sau enzimatic.
Utilitatea hibridizării acizilor nucleici
Această tehnică se utilizează în taxonomia microbiană şi stă la baza funcţionării sondelor
nucleotidice, care depistează rapid şi cu foarte mare sensibilitate microorganisme sau
numai unii determinanţi genetici ai acestora. Un alt aspect important este reprezentat de
specificitatea sondei utilizate. Se apreciază, că pentru a elimina riscul unei hibridizări
întâmplătoare, sonda nucleotidică ar trebui să aibă cel puţin 20 nucleotide.
5.3. Amplificarea genetică
Conceptul amplificării cantităţii de acizi nucleici a fost introdus în 1983 de către Mullis,
dar anul 1955, odată cu descoperirea ADN polimerazei I, a reprezentat un moment
crucial. Folosind ADN-polimeraza şi două secvenţe scurte de ADN (oligonucleotide,
primeri), s-a pus la punct un test repetitiv de sintetizare a ADN-ului care a fost numit
„reacţia de polimerizare în lanţ” (Polymerase Chain Reaction, PCR).
ADN-polimeraza este capabilă să conducă la sinteza unui al doilea lanţ de ADN,
întotdeauna orientat 5’-3’, folosind ca substrat patru nucleotide trifosfat, un lanţ de ADN
ca „matrice” (model) şi un fragment scurt de ADN complementar utilizat drept „primer”
(amorsă). Pentru un lanţ polinucleotidic, vom utiliza de fapt doi primeri, care sunt
complementari pentru două secvenţe specifice şi diferite ale ADN-ului ţintă.
Iniţierea sintezei de ADN va putea avea loc numai după ce ADN dublu catenar este
denaturat (termic). Urmează o etapă de răcire, permiţând astfel ataşarea primerilor
(care sunt furnizaţi în exces) de fragmentele de ADN complementar. Sinteza de ADN
mediată de ADN-polimerază va produce două molecule dublu catenare. Dacă procesul se
repetă, vor rezulta patru molecule de ADN. ADN-ul se multiplică exponenţial
(dublându-se de fiecare dată) ori de câte ori se repetă reacţia. Teoretic, PCR poate
amplifica un fragment scurt de ADN pornind de la o singură moleculă la 1.000 de copii,
dacă procesul se repetă de 10 ori şi la circa un milion de copii, dacă procesul se repetă de
20 de ori. Acest proces poate avea loc automat într-un aparat numit termociclor; aparatul
repetă ciclul constând în denaturarea prin căldură (la 94-96ºC), ataşarea primerilor (la 40-
60ºC) şi sinteza ADN-ului (la 65-75ºC), folosind ADN-polimeraza termostabilă

4
(Taq-polimeraza) izolată de la o bacterie, care trăieşte în izvoarele termale din
Yellowstone National Park, Thermus aquaticus.

Aplicaţiile tehnicii de amplificare genetică

PCR a început să fie aplicată în numeroase domenii ale cercetării medicale fundamentale.
Succesul depinde de puritatea sursei de ADN, precum şi de metoda de extragere şi de
recuperare a ADN-ului. Datorită sensibilităţii extrem de mari a procesului, contaminarea
datorată manipulării produselor de amplificare PCR obţinute anterior în acelaşi laborator
poate reprezenta o problemă deosebit de serioasă. Contaminarea se poate realiza fie între
probe, în timpul desfăşurării protocolului de lucru, fie datorită diferitelor manipulări.
Prima variantă este mai uşor de evitat, astfel încât sursa majoră de contaminare în
laboratorul de biologie moleculară rămâne eventuala contaminare a reactivilor.
Verificarea acestei posibile erori este obligatorie pentru orice reacţie PCR, printr-o reacţie
de control (control negativ) la care nu se adaugă ADN. Această problemă a contaminării
nu este superpozabilă cu cea a rezultatelor fals-pozitive. O contaminare între probe este
mult mai dificil de identificat. Principalele măsuri de precauţie ar fi reprezentate de:
utilizarea unor camere de lucru separate pentru manipularea produselor care conţin ADN
şi respectiv pentru prepararea celorlalţi reactivi, folosirea micropipetelor (două seturi de
micropipete, pentru produse cu şi fără ADN), utilizarea conurilor cu filtru, lucrul într-o
nişă special amenajată şi dotată cu hotă cu flux laminar de aer.
Recent s-a demonstrat faptul că lumina ultravioletă are capacitatea de a inactiva ADN-ul
dublu catenar contaminant.
Alte modalităţi de a elimina (diminua) riscurile contaminării sunt reprezentate de:
includerea unei nucleotide modificate în PCR (înlocuirea deoxiuridinei-P cu
deoxitimidină-3P) şi respectiv folosirea enzimelor de restricţie pentru îndepărtarea ADN
contaminat din RT-PCR (transcriere inversă).

Utilizarea PCR în diagnosticul bolilor infecţioase

PCR poate fi utilă în diagnosticul bolilor virale, bacteriene, fungice sau parazitare. În
infecţia cu HIV, PCR şi-a dovedit utilitatea atât în diagnostic (secvenţele HIV-1 sunt
detectabile în 100% din cazuri atunci când virusul este cultivabil şi în 64% din cazuri în
situaţia unor culturi negative), cât şi în stabilirea prognosticului. În cazul infecţiilor cu
citomegalovirus (CMV), PCR poate detecta ADN viral în sânge cu 7-10 zile mai devreme
decât sunt identificate antigenemia sau viremia. În mod asemănător, PCR este utilă în
identificarea altor agenţi etiologici (în contextul general epidemiologic, clinic şi
paraclinic) precum virusurile hepatitei B şi C, virusurilor papilloma, herpes virusurilor
sau a unor enterovirusuri.
Diagnosticul infecţiilor bacteriene poate beneficia de asemenea de tehnicile moleculare
prin amplificare genică. Actualmente sunt puse la punct protocoalele de lucru utile
identificării agenţilor etiologici ai tusei convulsive (Bordetella pertussis), legionellozei
(Legionella pneumophila), pneumoniei atipice (Mycoplasma pneumoniae), tuberculozei
(Mycobacterium tuberculosis), proceselor inflamatorii pelviene (Chlamydia trachomatis),
gonoreei (Neisseria gonorrhoeae), sifilisului (Treponema pallidum), meningitei
(Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis), gastritelor şi ulcerului (Helicobacter
pylori), febrei tifoide (Salmonella typhi), dizenteriei bacteriene (Shigella dysenteriae),
septicemiei cu E. coli (enterotoxigen), bolii Lyme (Borrelia burgdorferi), leprei

5
(Mycobacterium leprae) etc. Dacă în cazul majorităţii bolilor enumerate există alternative
bacteriologice sau imunologice clasice decisive, atunci când sunt implicate
microorganismele aparţinând genului mycobacterium (Mycobacterium tuberculosis,
Mycobacterium leprae) se ridică anumite probleme. În tuberculoză, agentul etiologic se
izolează relativ dificil din produsele patologice, se multiplică lent, coloniile vizibile
apărând pe mediile de cultură după 2-8 săptămâni, iar testele necesare identificării
fenotipice clasice necesită 2-6 săptămâni suplimentare şi nu au relevanţă în 100% din
cazuri. Pe de altă parte, Mycobacterium leprae nu se multiplică pe nici un tip de mediu de
cultură. Cu alte cuvinte, aplicarea unor metode sensibile şi specifice este foarte necesară.
Sunt puse la punct protocoalele de lucru PCR utile în scopul diagnosticării infecţiilor
grave produse de Candida albicans, pneumoniei la pacienţi imunodeprimaţi
(Pneumocystis carinii), meningitei cu Cryptococcus neoformans sau al unor infecţii cu
Coccidioides immitis (ex. la persoane infectate cu HIV), pentru a enumera câteva din
aplicaţiile biologiei moleculare în domeniul afecţiunilor produse de fungi.
În domeniul parazitologiei, exemplele cele mai bine cunoscute sunt legate de diagnosticul
dizenteriei amoebiene (Entamoeba histolytica), altor diarei de origine parazitară
(de exemplu, cele produse de Giardia lamblia), malariei (Plasmodium falciparum) sau
diagnosticul toxoplasmozei (Toxoplasma gondii).
Actualmente s-au pus la punct şi alte metode de amplificare genetică utile în diagnosticul
sau în identificarea agenţilor etiologici ai maladiilor transmisibile. În mod suplimentar
dorim să menţionăm faptul că dacă iniţial tehnicile de bază ale biologiei moleculare
(hibridizarea moleculară, utilizarea sondelor nucleotidice marcate radioactiv sau
neradioactiv, amplificarea genică) erau utilizate individual, majoritatea protocoalelor de
lucru actuale cuprind combinaţii de tehnici, din ce în ce mai complexe şi mai subtile.
Pe de o parte, există şi o întregă serie de variante tehnice ale reacţiei de amplificare
genică, de ex. Invers-PCR (pentru amplificarea unei regiuni la care nu este cunoscută
secvenţa, dar zonele învecinate au secvenţe cunoscute); LCR (ligase chain reaction) în
care este necesar să cunoaştem integral secvenţa ADN-ului ţintă; RT-PCR (PCR înainte
de care are loc o revers-transcriere, pornind de ex. de la ARNm şi obţinând ADNc);
Nested PCR (în care are loc o amplificare dublă a acidului nucleic folosind 2 perechi de
primeri diferiţi) etc. Pe de altă parte, tehnica PCR este utilizată din ce în ce mai frecvent
ca o completare esenţială a unei alte tehnici (de exemplu RFLP, restriction fragment
length polymorphism; SSCP-PCR; DRE-PCR, double repetitive element PCR;
DRV-PCR, direct variable repeat-PCR; UP-PCR, single universal primer-PCR;
spoligotyping etc.).

5.4. Organizarea genomului bacterian

Plasmidele
Genomul bacterian este alcătuit din două categorii de determinanţi genetici:
1. genele esenţiale, localizate în structura cromozomului bacterian şi
2. genele accesorii extracromozomale prezente în structura:
- plasmidelor şi
- elementelor genetice transpozabile.
Plasmidele sunt elemente genetice extracromozomale, capabile de replicare fizic
independentă de cromozom (replicon), dar depinzând de factori codificaţi de nucleul
bacterian. Conţin informaţie genetică neesenţială pentru viaţa celulei bacteriene.

6
Sunt transmise stabil de-a lungul generaţiilor. Dimensiunea plasmidelor variază între 1 kb
şi circa 200 kb. Majoritatea sunt alcătuite din molecule de ADN circular, dar există şi
plasmide liniare (ex. la Borrelia burgdorferi). Unele plasmide sunt ADN dublu catenar,
dar există şi plasmide de ADN monocatenar (se consideră că plasmidele de ADN
monocatenar reprezintă de fapt o situaţie intermediară în cursul procesului de replicare;
au fost detectate de ex. la Staphylococcus aureus).
Unele plasmide (numite şi epizomi) pot exista alternativ în stare autonomă (libere în
citoplasmă) sau integrate în cromozomul celulei gazdă (de exemplu factorul F,
bacteriofagul temperat etc). Celelalte plasmide persistă indefinit numai în stare autonomă
(de exemplu plasmida R, Col, F etc).

Clasificarea plasmidelor
În raport cu caracterele exprimate fenotipic, plasmidele se pot clasifica în:
1. plasmide care codifică rezistenţa la agenţi antibacterieni:
- factorii R (primul factor R a fost izolat de la o tulpină de Shigella dysenteriae);
- plasmidele de rezistenţă la UV etc.
2. plasmide care codifică sinteza unor agenţi antimicrobieni:
- factorii Col (conferind capacitatea de producere de colicine cu activitate antibiotică) etc.
3. plasmide de patogenitate care codifică sinteza de:
- hemolizine;
- factori de colonizare;
- enterotoxine sau alte exotoxine etc.
4. plasmide care codifică enzime ale unor căi metabolice particulare:
- în anumite condiţii, unele bacterii pot utiliza ca sursă de C diferite substanţe cu potenţial
toxic, precum octanul sau toluenul, iar plasmidele care permit supravieţuirea şi
dezvoltarea în aceste condiţii se numesc plasmide degradative;
5. plasmide care permit transferul genelor cromozomale de la o celulă care deţine
respectivul plasmid (F) la alta, putând fi transmis inclusiv plasmidul (factorul) F;
6. plasmide criptice, pentru care nu se cunosc caracterele fenotipice exprimate.
Plasmidele R
Plasmidele R (de rezistenţă la antibiotice) conferă celulei purtătoare rezistenţa la unul sau
la mai multe antibiotice. Plasmidele R au o structură genetică complexă, fiind alcătuite
din:
- gene care asigură proprietatea de rezistenţă la antibiotice;
- gene care formează „factorul de transfer al rezistenţei” (RTF).
Asigură capacitatea de replicare autonomă şi de transfer prin conjugare (cele două tipuri
de elemente pot exista independent sau se pot asocia).
Transferul plasmidelor R se poate face prin conjugare bacteriană sau prin transducţia
mediată de bacteriofagi.
Plasmidele „Col”
Plasmidele „Col” codifică proprietatea unor bacterii de a elabora substanţe antibiotice de
tip special, numite bacteriocine (colicine, pesticine, vibriocine, piocine etc).
Plasmidele „Col” sunt transferabile de la tulpinile Col+ la tulpini Col- prin transformare
genetică, transducţie fagică sau prin conjugare.
Bacteriocinele sunt bactericide, au un spectru de activitate limitat (faţă de specia
omologă), iar biosinteza lor nu are efect letal pentru specia producătoare.

7
Factorul F (factorul de „sex”, factorul de „fertilitate”)
Factorul F controlează capacitatea unor bacterii de a acţiona ca donoare de material
genetic în procesul de conjugare. Factorul F codifică structurile (de exemplu pilul „F”) şi
enzimele necesare transferului de ADN.
În funcţie de prezenţa plasmidelor F, de raportul lor cu cromozomul bacterian şi de
modul în care facilitează transferul de material genetic, bacteriile se pot grupa în patru
categorii distincte: bacterii F-; bacterii F+; bacterii Hfr; bacterii F’.
Bacteriile F-
Bacteriile F- sunt lipsite de factorul F. Sunt echivalente unor celule „femele” care se
comportă ca receptoare de material genetic.
Bacteriile F+
Bacteriile F+ deţin factorul F autonom în citoplasmă. Sunt echivalente unor celule
„masculine”, donoare de material genetic, capabile să transmită factorul F.
Bacteriile Hfr (High frequency of recombination)
Bacteriile Hfr (cu mare frecvenţă de recombinare) deţin factorul F integrat în
cromozomul bacterian. Se comportă ca donoare de material genetic, au o mare frecvenţă
de conjugare şi recombinare. De obicei prezenţa factorului F integrat determină transferul
unui număr variabil de gene cromozomale şi mai rar, chiar transferul factorului F.
Bacteriile F’
Bacteriile F’ deţin o structură plasmidică de tip special (factor de fertilitate recombinant)
care a fost anterior integrată în structura unui cromozom şi s-a desprins din acesta,
încorporând în structura sa unele gene cromozomale. Aceste bacterii au caracter de
„mascul” şi se comportă ca donoare de material genetic (factorul F’).

Elemente genetice transpozabile

O anumită secvenţă specifică de ADN constituie un element genetic transpozabil dacă îşi
menţine integritatea fizică, structurală şi genetică, funcţională în cursul translocaţiei de la
o poziţie la alta în acelaşi genom, replicon (intramolecular) sau în genomuri diferite
(intermolecular). De obicei fenomenul de transpoziţie poate avea loc la nivelul oricărui
replicon, la „întâmplare”, dar există şi situaţii în care un transpozon „are” anumite zone
specifice unde se va insera (zone „calde”).
Pe baza complexităţii lor, elementele care îndeplinesc această condiţie se pot grupa în trei
categorii:
- secvenţe de inserţie (IS);
- transpozoni (Tn);
- bacteriofagi.
Secvenţele de inserţie (IS)
Secvenţele de inserţie nu conţin nici o genă şi nu au nici o altă funcţie (cunoscută) în
afară de cea de inserţie. Sunt cele mai simple elemente transpozabile. După inserţia lor
pot apărea modificări în expresia unor gene sau modificări în rata incidenţei deleţiilor în
regiunile adiacente situsului lor de inserţie.
Există anumite secvenţe de inserţie care au intrat în istoria practică medicală datorită
importanţei în diagnosticul anumitor afecţiuni. De ex. IS 6110 se întâlneşte în una sau
mai multe copii în genomul Mycobacterium tuberculosis şi poate fi pus în evidenţă prin
reacţia PCR pornind fie de la cultură, fie chiar şi de la produsul patologic, permiţând un
diagnostic mai rapid.

8
Transpozonii (Tn)
Transpozonii diferă de secvenţele de inserţie prin complexitate şi prin faptul că poartă
gene care conferă bacteriilor funcţii noi, detectabile, de exemplu:
- rezistenţa la antibiotice;
- capacitatea de sinteză a unor enzime;
- producerea de enterotoxine;
- sinteza antigenelor bacteriene de suprafaţă (de exemplu K88 la E. coli);
- sinteza unor factori de colonizare intestinală etc.
Există transpozoni compuşi, care pe lângă funcţia de transpoziţie includ şi o serie de
determinanţi genetici şi transpozoni complecşi. Dintre aceştia din urmă, transpozonul Tn3
a fost identificat la o tulpină de E. coli. El codifică 3 elemente: tnpA- cu activitate de
transpozază, rezolvaza tnpR şi beta-lactamaza (produsul genic notat „bla”) cu activitate
beta-lactamazică.
Bacteriofagii
Spre exemplu bacteriofagul Mu (numele rezultă prin prescurtarea „mutator”, pentru că a
fost identificat ca factor mutagen la tulpini de E. coli) are un genom de 30kb şi o structură
lineară. După infectarea celulei bacteriene, bacteriofagul Mu se inseră în cromozom la
„întâmplare” şi ulterior în diferite poziţii ale cromozomului bacterian apar copii ale
acidului nucleic Mu. Atunci când structura genetică Mu va părăsi genomul bacterian va
prelua o parte din structura genetică bacteriană (circa 100-150 pb).

5.5. Mecanismele de variabilitate bacteriană

Bacteriile sunt microorganisme haploide (cu excepţiile prezentate anterior), au un singur
cromozom iar pentru remanierea prin recombinare a genomului este necesară transferarea
de material genetic de la o tulpină („donoare”) la tulpina receptor („acceptoare”). În mod
clasic poate avea loc un transfer „pe orizontală” între tulpini care fie fac parte din aceeaşi
specie fie fac parte din specii foarte înrudite, chiar dacă genotipic sunt diferite. Relativ
recent a fost demonstrată posibilitatea unor schimburi genetice între tulpini din specii
diferite (ex. în ecosistemul intestinal). Variabilitatea bacteriană presupune modificarea la
un moment dat a comportamentului celulei bacteriene sau a descendenţilor ei şi pot exista
în principiu două variante:
- variabilitatea fenotipică şi
- variabilitatea genotipică;
Variaţiile fenotipice reprezintă modificări morfologice sau fiziologice de tip adaptativ,
care nu se transmit ereditar. Genomul nu este afectat.
Variaţiile genotipice reprezintă modificări definitive ale materialului genetic
(cromozomal sau extracromozomal) care se transmit descendenţilor.
Mecanismele variaţiei genotipice sunt reprezentate de:
- mutaţie;
- transfer genetic urmat de recombinare genetică.
Mutaţia
Mutaţia reprezintă o modificare accidentală în secvenţa nucleotidică a unei gene, ducând
la modificări ale mesajului genetic.
Mutaţiile pot apărea la nivelul materialului genetic prin:
- substituţii;

9
- inversii;
- inserţii;
- deleţii.
Mutaţia spontană
Mutaţiile care apar în condiţii de mediu obişnuite şi fără intervenţia unui factor decelabil
se numesc mutaţii spontane.
Mutaţia indusă
Mutaţiile care se produc sub acţiunea unor factori fizici (de exemplu raze UV, radiaţii
ionizante etc.) sau chimici (de exemplu agenţii alchilanţi), care acţionează ca agenţi
mutageni, se numesc mutaţii induse.
Rata mutaţiilor induse este semnificativ mai mare decât rata mutaţiilor spontane.
Mutaţia punctiformă are ca substrat alterarea unui singur nucleotid, respectiv a unui
singur codon.
Mutaţiile extinse reprezintă alterări care depăşesc limitele unui codon, putând afecta
secvenţe mai mari ale uneia sau mai multor gene (mutaţie poligenică).
Mutaţiile regresive (retromutaţii) afectează celule mutante, determinând revenirea
acestora la tipul iniţial, restabilind secvenţa nucleotidică originară.
Mutaţiile supresoare permit exprimarea funcţiei anterioare a genei, deşi o modificare a
secvenţei bazelor nucleotidice persistă.
Principalele mecanisme de transfer al materialului genetic de la o bacterie donor la o
bacterie receptor sunt:
- transformarea;
- transferul mediat de bacteriofagi (transducţia);
- conjugarea.
Transformarea
Transformarea este un transfer genetic realizat atunci când bacteria acceptă ADN liber
provenit de la o bacterie donor sau din alte surse. Bacteria receptor trebuie să fie
„competentă” în a accepta ADN-ul de la bacteria donor.
Prima transformare a fost descrisă în 1928 de către Griffith, în experimente referitoare la
virulenţa pneumococilor faţă de şoarecele alb.
Transformarea poate avea loc doar atunci când bacteriile intră în faza staţionară a ciclului
celular. Pătruns în celula receptoare, un fragment de ADN exogen poate înlocui
(prin recombinare genetică) o secvenţă nucleotidică omologă, bacteria receptoare
dobândind un caracter genetic nou (de exemplu sinteza unei structuri
capsulare/capsidice).
Unele bacterii sunt „competente” în mod natural. În cazul bacteriilor care nu sunt „natural
competente”, pentru a putea realiza fenomenul de transformare este necesară tratarea
chimică a acestora, de ex. cu ioni de calciu.
Transferul genetic mediat de bacteriofagi se poate realiza prin:
- transducţie;
- conversie lizogenică.
Transducţia reprezintă transferul unui fragment genetic (cromozomal sau
extracromozomal) de la o bacterie la alta prin intermediul unui bacteriofag (de obicei un
fag temperat). Fagul se numeşte transductor. Bacteria receptoare se numeşte transductant.

10
Transducţia specializată (restrictivă) este caracteristică fagilor transductori care au
proprietatea de a transfera numai un număr restrâns de gene bacteriene situate în imediata
apropiere a situsului de legare a profagului în cromozomul bacterian.
Transducţia generalizată (nerestrictivă) presupune că teoretic, oricare din genele
cromozomului bacterian, indiferent de poziţia lor în genom, pot fi încorporate în mod
accidental în particula virală matură pentru a forma un fag transductor, care le poate
transmite unor bacterii receptoare. Transducţia generalizată poate fi realizată de un mare
număr de fagi neintegraţi în cromozomul bacterian atunci când aceştia intră în ciclul litic.
Conversia lizogenică reprezintă apariţia unui caracter nou la bacteriile care găzduiesc un
profag, de exemplu producerea toxinei difterice este realizată numai de către
C. diphtheriae purtător al fagului temperat (profagul β care deţine gena tox) iar
producerea toxinei scarlatinoase este posibilă numai în cazul în care Streptococcus
pyogenes de grup A este lizogenizat. Există şi fagi care sunt integraţi în regiuni care
codifică un anumit produs din genomul bacterian (ex. fagul P4 de la E. coli se integrează
într-o genă care codifică leucina).
Conjugarea bacteriană reprezintă un proces de transfer de material genetic (cromozomal
sau extracromozomal) realizat prin intermediul unei legături intercelulare directe. Este
condiţionată de prezenţa factorului F în celula donoare.
Receptorii specifici
Pentru realizarea legăturii intercelulare este necesară existenţa unor „receptori” de
suprafaţă atât la celula donoare, cât şi la celula receptoare. Aceştia vor permite
„recunoaşterea reciprocă”.
Fiziologia conjugării bacteriene
După un număr de alipiri întâmplătoare, bacteriile F + formează cu bacteriile F- „perechi
de recombinare” şi între celulele alăturate se formează un canal de conjugare. Prin
canalul de conjugare se realizează transferul unidirecţional al materialului genetic.
Fragmentul transferat poate fi apoi integrat parţial sau total în genomul celulei receptoare,
ducând la apariţia unor proprietăţi noi ale acesteia, manifeste sau nu.

- Sfârşit curs -

BIBLIGRAFIE
Popa G.L., Genetică bacteriană, în Popa M.I. (coord.), Microbiologie Medicală, vol 1 -
curs UMF „ Carol Davila”, 2010.

11