24.06.2021 Teză de Abilitare

UNIV E RSI T AT EA DE MED I CINĂ ŞI FA RM ACIE “IU L IU HAŢI E GA NU” C LU J - NAPO CA
ŞCOALA DOCTORALĂ
CLUJ-NAPOCA 2021
2 Boșca Adina Bianca
Abordări terapeutice inovative în boala parodontală în contextul stresului oxidativ și metainflamației locale și
sistemice Premise ale utilizării celulelor stem mezenchimale derivate din parodonțiul uman în ingineria 3
tisulară
TEZĂ DE ABILITARE
Abordări terapeutice inovative în boala

parodontală în contextul stresului
oxidativ și metainflamației locale și
sistemice
Premise ale utilizării celulelor stem
mezenchimale derivate din parodonțiul
uman în ingineria tisulară
Conf. Dr. Adina Bianca Boșca

tisulară
LISTA DE PUBLICAŢII
Articole publicate in extenso ca rezultat al cercetării
1. Boşca AB, Ilea A, Șovrea AS, Constantin AM, Ruxanda F, Rus V, Rațiu C, Miclăuş V. An
Experimental Model for Inducing Periodontal Pathology in Rat: Histopathological
and Enzymatic Aspects Bulletin UASVM Veterinary Medicine 2014; 71(2):507-508
2. Boșca AB, Dinte E, Colosi H, Ilea A, Câmpian RS, Uifălean A, Pârvu AE. Curcumin
effect on nitro-oxidative stress in ligature-induced rat periodontitis, Rom
Biotechnol Lett. 2015; 21(4):10709 – 10717.
3. Boşca AB, Soriţău O, Ilea A, Moga M, Cenariu M, Câmpian RS, Virag P, Pârvu AE.
Effect of curcumin and epigallocatechin-3- gallate on stem cells derived from
human periodontium. Ann Rom Soc Cell Biol. 2015;19(3):83-94. doi:10.ANN/RSCB-
2015-0030:RSCB.
4. Ilea A, Boșca B, Miclăuș V, Rus V, Băbțan AM, Câmpian RS Human papillomavirus
infection in the oromaxillofacial area. Clinical anatomy and histological
considerations. Clin Anat. 2015 Nov;28(8):1002-7. doi: 10.1002/ca.22620.
5. Boşca AB, Ilea A, Șovrea AS, Constantin AM, Ruxanda F, Rus V, Raţiu C, Miclăuş V.
Multinucleated Giant Cells Polymorphism in Epulis. Bulletin UASVM Veterinary
Medicine 72(1)/2015, 47-52.
6. Ilea A, Boşca B, Miclăuş V, Rus V, Băbţan AM, Mesaros A, Crişan B, Câmpian RS. Oral
Human Papillomavirus Infection in Children. Pediatr Infect Dis J. 2016
Feb;35(2):e65-8.
7. Boșca AB, Miclaus V, Ilea A, Câmpian RS, Rus V, Ruxanda F, Ratiu C, Uifălean A,
Pârvu AE. Role of nitro-oxidative stress in pathogenesis of experimental rat
periodontitis Clujul Medical; 2016: 89 (1) 150-159.
8. Moga M, Boşca AB, Soriţău O, Baciut M, Lucaciu O, Virag P, Ilea A, Dîrzu N, Campian
RS.. Nicotine cytotoxicity on the mesenchymal stem cells derived from human
periodontium. Rom Biotechnol Lett. 2016;21(4):11632-11641.
9. Băbțan AM, Boșca AB, Crișan M, Lenghel M, Câmpian RS, Ilea A. Ultrasound
Investigation in Congenital Masseter Hypertrophy. Biomed J Sci&Tech Res 6(3)-
2018. BJSTR. MS.ID.001350. DOI: 10.26717/ BJSTR.2018.06.001349.
10. Ilea A, Băbţan AM, Boşca BA, Crişan M, Petrescu NB, Collino M, Sainz RM, Gerlach JQ,
Câmpian RS. Advanced glycation end products (AGEs) in oral pathology. Arch Oral
Biol. 2018 May 18;93:22-30.
11. Ilea A, Miclaus V, Ruxanda F, Bosca AB, Campian RS, Petrescu NB, Babtan AM,
Mesaros AS. Osteoclasts recruitment in internal root resorption associated with
external granuloma. Integrative Molecular Medicine. 2018;5(5):1-4 ISSN: 2056-
6360
12. Boşca AB, Şovrea AS, Miclăuş V, Ruxanda F, Mihu CM, Melincovici CS, Constantin
AM, Petrescu BN, Câmpian RS, Pârvu AE, Ilea A. Diagnostic and therapeutic
approaches in oral cavity granulomas based on new data concerning their origin
and pathogenesis Rom J Morphol Embryol. 2018;59(3):679-690.
13. Băbțan AM, Ilea A, Boșca BA, Crișan M, Petrescu NB, Collino M, Sainz RM, Gerlach J,
Câmpian RS. Advanced Glycation End Products (AGEs) as biomarkers in systemic
diseases. Premises and perspectives of salivary AGEs. Biomarkers in Medicine.

2019;13(6):479–495
14. Băbțan AM, Boșca BA, Petrescu NB, Pârvu AE, Uifălean A, Tăulescu M, Negru M,
Crișan M, Câmpian RS, Ilea A. Accumulation of N-epsilon carboxymethyl lysine in
various tissues and organs related to diet-induced aging process. State of the art
and experimental animal study. HVM Bioflux 2019;11(3):106-115.
15. Ilea A, Timuș D, Sorițău O, Vulpoi A, Boșca BA, Pall E, Petrescu BN, Băbțan AM,
Câmpian RS, Șovrea AS. Interaction of stem cells derived from maxillary and
mandibular bone with salts from culture medium. Front Nanosci Nanotech.
2019;5:1-7. doi: 10.15761/FNN.1000180
16. Boșca AB, Ilea A, Sorițău O, Tatomir C, Miklášová N, Pârvu AE, Mihu CM, Melincovici
CS, Fischer-Fodor E. Modulatory effect of curcumin analogs on the activation of
metalloproteinases in human periodontal stem cells. Eur J Oral Sci 2019; 000: 1–9.
DOI:10.1111/eos.12625.
17. Băbțan AM, Boșca AB, Petrescu BN, Mirică CI, Crișan M, Câmpian RS,Ilea A. Use of
Ultrasound Investigation in the Treatment Plan of Apical Surgery Relapse. Biomed J
Sci & Tech Res. 2019;19(1):13983-87. BJSTR. MS.ID.003230, DOI:
10.26717/BJSTR.2019.19.003230, ISSN: 2574-1241
18. Ilea A, Timuș D, Höpken J, Andrei V, Băbțan AM, Petrescu NB, Câmpian RS, Boșca
BA, Șovrea AS, Negucioiu M, Mesaros AS. Oral appliance therapy in obstructive
sleep apnea and snoring - systematic review and new directions of development.
CRANIO: The Journal of Craniomandibular & Sleep Practice. 2019 Oct 5;1-12. doi:
10.1080/08869634.2019.1673285.
19. Ilea A, Timuș D, Petrescu NB, Sorițău O, Boș ca BA, Mager V, Barbu-Tudoran L,
Bă bțan AM, Câ mpian RS, Barabá s R. An in vitro Study on the Biocompatibility of
Titanium Implants Made by Selective Laser Melting. Biotechnol Bioproc E. 2019;24:
782-792. DOI 10.1007/s12257-019-0105-7
20. Ilea A, Vrabie OA, Bă bțan AM, Miclaus V, Ruxanda F, Sarkozi M, Barbu-Tudoran L,
Berce C, Boș ca BA, Petrescu NB, Cadar O, Câ mpian RS, Barabá s R. Osseointegration
of titanium scaffolds manufactured by selective laser melting in rabbit femur defect
model. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 2019;30(2):26
21. Ilea A, Andrei V, Feurdean CN, Băbțan AM, Petrescu NB, Câmpian RS, Boșca AB, Ciui
B, Tertiș M, Săndulescu R, Cristea C. Saliva, a Magic Biofluid Available for Multilevel
Assessment and a Mirror of General Health—A Systematic Review. Biosensors
2019, 9(1), 27.
22. Faragó P, Gălătuș R, Hintea S, Boșca AB, Feurdean CN, Ilea A. An Intra-Oral Optical
Sensor for the Real-Time Identification and Assessment of Wine Intake. Sensors,
2019, 19, 4719; doi:10.3390/s19214719
23. Băbțan AM, Petrescu NB, Ionel A, Boșca BA, Uriciuc WA, Feurdean CN, Mirică CI,
Bordea R, Miclăuș V, Ruxanda F, Todea AD, Alexescu TG, Câmpian RS, Ilea A.
Insights into the pathogenesis of nicotine addiction. Could a salivary biosensor be
useful in Nicotine Replacement Therapy (NRT)? J Mind Med Sci. 2019; 6(2): 196-
209. DOI: 10.22543/7674.62.P196209 ISSN: 2392-7674
24. Băbțan A-M, Timuș D, Sorițău O, Boșca BA, Barabas R, Ionel A, Petrescu NB,
Feurdean CN, Bordea IR, Saraci G, Vesa ŞC, Ilea A. Tissue Integration and Biological
Cellular Response of SLM-Manufactured Titanium Scaffolds. Metals. 2020;
10(9):1192.
tisulară
CUPRINS
INTRODUCERE 13
CERCETAREA ȘTIINȚIFICĂ
1. Mecanisme patogenetice în boala parodontală și noi abordări
19
terapeutice
1.1. Acumularea produșilor finali de glicare avansată (AGEs) în țesuturile asociate
cavității orale la șobolan în funcție de vârstă
19
1.2. Expresia imunohistochimică a carboximetil lizinei în gingie la pacienții
parodontopați
24
1.3. Implicarea stresului oxidativ în patogeneza bolii parodontale induse pe model
animal
27
1.4. Eficiența tratamentului antioxidant în parodontita experimentală 32
2. Răspunsul celulelor stem mezenchimale derivate din parodonțiul
uman la factorii patogenetici și eficiența in vitro a antioxidanților 36
naturali
2.1. Izolarea și caracterizarea celulelor stem mezenchimale de la nivelul
țesuturilor parodontale umane
37
2.1.1. Metode de prelevare și prelucrare a țesuturilor parodontale umane
în vederea obținerii celulelor stem mezenchimale
37
2.1.2. Tipuri de celule mezenchimale izolate din țesuturile parodontale
umane
38
2.1.3. Metode de caracterizare a celulelor mezenchimale parodontale
umane
40
2.1.3.1. Caracterizarea fenotipică prin immunocitochimie și citometrie
în flux
40
2.1.3.2. Caracterizarea genetică 41
2.1.3.3. Capacitatea de diferențiere înspre lineajele condrogenic,
osteogenic și neurogenic
42
2.2. Mecanisme patogenetice induse de lipopolizaharidul de Prophyromonas
gingivalis (LPS-Pg) și nicotină în celulele stem mezenchimale derivate din 45
parodonțiul uman
2.2.1. Efectul oxidant indus de lipopolizaharidul de Prophyromonas
gingivalis în culturile de celule stem mezenchimale derivate din 46
parodonțiul uman
2.2.2. Efectul citotoxic indus de nicotină în culturile de celule stem
mezenchimale derivate din parodonțiul uman
50
2.2.3. Efectul lipopolizaharidului de Prophyromonas gingivalis (LPS-Pg) și
nicotinei asupra diferențierii osoase a celulelor stem mezenchimale 53
derivate din parodonțiul uman
2.3. Eficiența terapeutică in vitro a antioxidanților naturali 58
2.3.1. Efectul curcuminei și epigallocatechin-gallate asupra celulelor stem
58
2.3.2. Eficiența curcuminei și epigallocatechin-gallate în modularea

producerii radicalilor liberi sub influența lipopolizaharidului de
Prophyromonas gingivalis (LPS-Pg) în culturile de celule stem
64
efectului citotoxic indus de nicotină în culturile de celule stem 71
2.4. Metode inovative de potențare a efectului terapeutic al antioxidanților
naturali asupra celulelor stem mezenchimale derivate din parodonțiul uman
73
2.4.1. Lipozomii cu curcumină și epigallocatechin-gallate 74
2.4.1.1. Efectul biologic al lipozomilor cu curcumină și
epigallocatechin-gallate
75
2.4.1.2. Eficiența lipozomilor cu curcumină și epigallocatechin-
gallate în modularea efectului oxidant determinat de 76
lipopolizaharidului de Prophyromonas gingivalis (LPS-Pg) in vitro
2.4.2. Analogii sintetici ai curcuminei 80
2.4.2.1. Efectul biologic al analogilor sintetici ai curcuminei 83
2.4.2.2. Acumularea intracelulară a analogilor sintetici ai
curcuminei
85
2.4.2.3. Eficiența analogilor sintetici ai curcuminei în modularea
balanței dintre metaloproteinazele matriceale și inhibitorii tisulari 87
in vitro
3. Efectul biologic al matricilor din Titan cu structură poroasă
93
utilizate în ingineria tisulară osoasă
3.1. Capacitatea de osteointegrare in vivo a matricilor poroase din Ti obținute prin
topire selectivă cu laser
93
3.2. Biocompatibilitatea in vitro a matricilor din Ti condiționate cu nano-
hidroxiapatită
98
4. Aspecte microscopice în modificările de volum ale gingiei cu
103
diverse etiologii
4.1. Modificările de volum induse de terapia cu blocante ale canalelor de Calciu 103
4.2. Modificările de volum în infecția cu virusul Papilloma uman 106
4.3. Modificările de volum în leziunile granulomatoase ale cavității orale 109
5. Metode de evaluare a metainflamației la nivelul cavității orale în
114
contextul afecțiunilor sistemice
5.1. Citoblocul de mucoasă orală 115
5.2. Ultrasonografia de înaltă frecvență 120
5.3. Biosenzorii salivari 123
6. Discuţii generale 126
7. Concluzii generale 129
8. Originalitatea şi contribuţiile inovative ale tezei de abilitare 130
CARIERA ACADEMICĂ ȘI PROFESIONALĂ

1. Cariera academică 135
2. Cariera profesională 142
tisulară
PRINCIPALELE DIRECȚII DE DEZVOLTARE A CARIEREI ȘTIINȚIFICE,
ACADEMICE ȘI PROFESIONALE
1. Principalele direcții de dezvoltare a carierei științifice 147
2. Principalele direcții de dezvoltare a carierei academice 148
3. Principalele direcții de dezvoltare a carierei profesionale 149
4. Capacitatea de a coordona echipe de cercetare 149
5. Capacitatea de a gestiona și organiza activități didactice 149
6. Capacitatea de a explicare și facilitare a învățării 149
7. Capacitatea de a explicare și facilitare a cercetării 150
REFERINŢE 151
sistemice Premise ale utilizării celulelor stem mezenchimale derivate din parodonțiul uman în ingineria11
tisulară
ABREVIERI UTILIZATE IN TEXT

ABSCs Celule stem derivate din osul alveolar
ADN Acidul dezoxiribonucleic
AGEs Advanced Glycation Endproducts
ALEs Advanced Lipoxidation Endproducts
ALP/FA Alkaline phosphatase/Fosfataza alcalină
AP-1 Proteina activatoare-1
ARN Acidul ribonucleic
BDNF Brain-Derived Neurotrophic Factor
bFGF basic Fibroblast Growth Factor
BMP4 Bone Morphogenetic Protein 4
BMP Bone Morphogenetic Protein
BSA Bovine Serum Albumine
CGCG Granulomul central cu celule gigante
CML N-ε-Carboxymethyl-lysine
CM-FDA Clorometilfluorescein diacetat
CURC Curcumină
DAPI 4',6-Diamidine-2'-phenylindole dihydrochloride
DAGEs Dietary AGEs - Advanced Glycation Endproducts
DC-FDA 2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate
DMEM/F12 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium: Nutrient Mixture F-12
EDAX Energy-dispersive X-ray spectroscopy analysis
EGCG Epigallocathechin-gallate
EGF Epidermal Growth Factor
ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay
FCS Fetal Calf Serum
FITC Fluorescein isothiocyanate
GFAP Glial Fibrillary Acidic Protein
GLSCs Celule stem derivate din ligamentul gingival
GTSCs Celule derivate din corionul gingival
HAP Hidroxiapatită
H-E Hematoxilină-eozină
HPV virusul Papilloma uman
IHC Imunohistochimie
iNOS Sintetaza inductibilă a oxidului nitric
ITS Insulina, Transferina, Selenium
L-CURC Lipozomi cu vurcumină
L-EGCG Lipozomi cu EGCG – Epigallocatechine-gallate
LPS-Pg Lipopolizaharid de Porphyromonas gingivalis
MCs Celule mononucleare
MGCs Celule gigantice multinucleate
MMP Matrix metalloproteinase
MSCs Celule stem mezenchimale

3-(4, 5-dimethylthiazolyl-2)-2, 5-diphenyltetrazolium
MTT
bromide
Nano-HapSi Nano-hidroxiapatită îmbogățită cu siliciu
NEA Non-essential amino acids
NF Neurofilamente
NF-kB Factorul nuclear-κB
NGF Nerve Growth Factor
NO Oxid nitric
NOx Nitriții și nitrații totali
OC Osteocalcina
OP Osteopontin
OSI Indicele de Stres Oxidativ
PBS Soluția fostfat salină tamponată
PDLSCs Celule stem derivate din ligamentul parodontal
PE Phycoerythrina
PGCG Granulomul periferic cu celule gigante
PMN Polimorfonucleare neutrofile
RAGE Receptor al AGEs - Advanced Glycation Endproducts
ROS Speciile reactive ale oxigenului
RT-PCR Real-Time Polymerase Chain Reaction
SEM Scanning Electron Microscopy
SLM Selective Laser Melting
TAC Capacitatea Antioxidantă Totală
TGF-β3 Transforming Growth Factor beta-3
Ti Titan
TIMP-1 Tissue Inhibitor of Metalloproteinases - 1
TLRs Toll-like receptors
TOS Statusul Oxidativ Total
tisulară
INTRODUCERE
Boala parodontală reprezintă una dintre afecțiunile cele mai comune la nivel
global, cu o prevalență de 50-70% la adulții cu vârsta de peste 30 de ani 1.
În prezent este recunoscut faptul că patogeneza complexă a bolii parodontale
implică deopotrivă prezența plăcii bacteriene și răspunsul imuno-inflamator al
organismului gazdă 2. În plus, numeroși factori intrinseci și de mediu influențează
predispoziția față de boala parodontală și se pot constitui ca agravanți ai evoluției bolii.
Porphyromonas gingivalis este o bacterie anaerobă care face parte din complexul
roșu al biofilmului. Este prezentă în principal în regiunile profunde ale pungilor
parodontale și asociată cu situsurile unde evoluția bolii parodontale este activă.
Factorul său de virulență, lipopolizaharidul (LPS-Pg), este asociat membranei externe
și considerat ca fiind „endotoxina cheie” în parodontita cronică 3. LPS-Pg inițiază
mecanismele patogenetice prin activarea sistemului imun și prin generarea stresului
oxidativ3, 4.
Fumatul este un important factor de risc în progresia și severitatea bolii
parodontale, iar nicotina, componentul major al fumului de țigară, determină multiple
efecte toxice la nivel tisular și celular, fiind asociată cu leziuni intens distructive ale
țesuturilor parodontale 5, 6.
Produșii finali de glicare avansată (AGEs – Advanced Glycation Endproducts)
provin din surse exogene (dietă, radiația ultravioletă, fumat) și endogene, prin glicarea
proteinelor în condițiile unor niveluri crescute ale glicemiei și stresului oxidativ. Studii
recente au demonstrat influența AGEs asupra progresiei și severității bolii parodontale
prin existența unei corelații între Porphyromonas gingivalis, nivelurile crescute ale
glicemiei în cadrul diabetului zaharat, acumularea AGEs în țesuturile parodontale și
stresul oxidativ local, ceea ce conduce la liza colagenului și rezorbția osului alveolar.
În evoluția bolii parodontale, mecanismele patogenetice sunt caracterizate prin
eliberarea de citokine, enzime și radicali liberi în țesuturile parodontale, ceea ce
determină progresia inflamației parodontale, distrucția ligamentelor dento-alveolare,
rezorbția osului alveolar și în final, pierderea dinților 7.
Parodontita cronică este un proces inflamator cronic asociat cu stresul nitro-
oxidativ local și sistemic. Stresul oxidativ este consecința acumulării intracelulare a
radicalilor liberi datorită, pe de o parte, unei produceri crescute, iar pe de altă parte,
unei neutralizări insuficiente de către sistemele antioxidante 8.
Stresul nitro-oxidativ de la nivelul cavității orale se manifestă și la nivel sistemic,
afectând alte țesuturi sau organe, la distanță 9. Prin urmare, în decursul ultimilor ani,
denumirea de „boală parodontală” este utilizată pentru a sugera relația bi-direcțională
dintre parodontita cronică și alte afecțiuni, cum ar fi: artrita reumatoidă, insuficiența
renală cronică și bolile cardiovasculare 10.
Agenții care modulează răspunsul imuno-inflamator față de patogenii
parodontali includ substanțe farmaceutice și extracte vegetale care, administrate local
sau sistemic, sunt capabile să restabilească echilibrul biologic prin controlul eliberării
citokinelor pro-inflamatoare, prin blocarea activității unor enzime sau prin
neutralizarea radicalilor liberi 11.
Tendințele moderne în medicină se axează pe produsele vegetale, care

simbolizează siguranța, în contrast cu subtanțele sintetice care sunt considerate
potențial dăunătoare pentru om și mediul înconjurător 12.
Printre substanțele fitochimice intens studiate în ultimele decenii, curcumina și
epigallocatechine-3-gallate (EGCG) au fost prezentate ca având proprietăți anti-
inflamatoare 13, 14, antioxidante, antibacteriene, antivirale, antifungice, și
antitumorale 15, 16, și s-au dovedit eficiente în diverse patologii 17, 18.
Dezavantajele terapiei cu curcumină includ următoarele aspecte:
biodisponibilitatea redusă la administrarea pe cale orală, posibilitatea restrânsă de
utilizare locală și acumularea limitată la nivel intracelular16, 17. Având în vedere aceste
neajunsuri, în cadrul studiilor experimentale am utilizat metode de optimizare a
efectului teraputic al curcuminei: asocierea cu piperina pentru administrarea orală și
înglobarea într-un gel mucoadeziv pentru aplicarea locală. În cadrul studiilor in vitro,
în culturile de celulele stem mezenchimale derivate din parodonțiul uman, am folosit
curcumina și EGCG incluse în lipozomi și am utilizat analogi sintetici ai curcuminei
pentru creșterea acumulării intracelulare.
Distrucțiile tisulare asociate bolii parodontale impun instituirea unor terapii
eficiente și dezvoltarea unor modalități de regenerare a țesuturilor parodontale.
Principala provocare în terapia regenerativă parodontală constă în dificultatea de a
induce regenerarea unui aparat complex, care reunește țesuturi diferite: os alveolar,
cement și ligament parodontal.
Integritatea tisulară și regenerarea parodonțiului sunt asigurate de celulele
stem mezenchimale prezente în țesuturile parodontale. Însă, în cadrul inflamației
cronice a parodonțiului și în prezența unor factori toxici exogeni, regenerarea și
reparația nu se desfășoară normal, ceea ce amplifică distrucțiile tisulare, inclusiv
resorbția osului alveolar.
Rezultatele studiilor noastre au relevat multiple mecanisme patogenetice induse
de LPS-Pg și nicotină in vitro, care includ: citotoxicitatea, producerea de radicali liberi
și inhibarea diferențierii celulare. Eficiența terapeutică in vitro a curcuminei,
curcuminelor sintetice și EGCG a fost demonstrată prin efectele antioxidant, de
inhibare a activării metaloproteinazelor matriceale (MMPs) și de susținere a viabilității
și proliferării celulare. În plus, înglobarea curcuminei și EGCG în lipozomi a optimizat
captarea și acumularea intracelulară a acestor substanțe, cu un efect biologic mai
intens.
Tendințele moderne în chirurgia osoasă urmăresc dezvoltarea unor implante
metalice cu proprietăți mecanice și reziliență asemănătoare biomaterialelor de tipul
polimerilor și ceramicii, care să le confere aplicabilitatea pe termen lung și o eficiență
terapeutică superioară, în special la pacienții cu suport osos deficitar 19. În cadrul unor
studii in vivo, pe defecte osoase produse pe femurul de iepure, cât și in vitro, în culturi
de celule stem mezenchimale umane, am testat efectele biologice ale unor matrici de
titan (Ti) obținute prin tehnica de topire selectivă cu laser (Selective Laser Melting -
SLM). Rezultatele acestor studii au indicat faptul că matricile de Ti au prezentat o
capacitate de osteointegrare dependentă de dimensiunea porilor și de proprietățile
suprafeței, fiind potrivite pentru reconstrucții ale defectelor osoase 20. În plus,
biocompatibilitatea in vitro cu stimularea proliferării și diferențierii celulelor stem
înspre lineajul osteoblastic poate fi favorabilă pentru susținerea regenerării osoase 21.
Studiile in vitro și in vivo pe model animal sunt premergătoare studiilor clinice, iar
tisulară
validarea efectului biologic al matricilor de Ti cu structură poroasă, obținute prin
tehnica SLM și condiționate cu HAP deschide noi perspective pentru realizarea unor
implante individualizate, care să se adreseze particularităților fiecărui pacient, în
conformitate cu principiile medicinii personalizate.
În cadrul modificărilor de volum ale gingiei, am studiat aspectul histologic al 3
entități cu etiologie diferită: hiperplazia gingivală indusă medicamentos în urma
tratamentului cu blocane ale canalelor de Ca (Nifedipin), leziunile hiperplazice de tip
papilomatos în infecția cu virusul Papilloma uman (HPV) și granulomul periferic cu
celule gigante. Aspectele microscopice ale leziunilor au confirmat diagnosticul clinic
prezumtiv și au furnizat informații esențiale pentru stabilirea diagnosticului de
certitudine și orientarea conduitei terapeutice.
Metainflamația, sau inflamația cronică de intensitate joasă, este considerată
principalul factor implicat în inițierea și progresia tulburărilor fiziopatologice care
acompaniază sindromul metabolic 22. Această stare pro-inflamatoare a fost descrisă în
obezitate, diabetul zaharat de tip 2, bolile cardiovasculare și alte afecțiuni asociate
sindromului metabolic 23. Caracterul multifactorial al sindromului metabolic,
determinat de intricarea factorilor genetici, de mediu și psihosociali, impune metode
complexe de diagnostic și tratament.
Inter-relația dintre patologia sistemică și cea orală explică apariția
manifestărilor orale în afecțiunile asociate cu sindromul metabolic și face posibilă
detectarea și evaluarea anumitor biomarkeri în salivă și în țesuturile cavității orale.
Numeroase studii au demonstrat implicarea AGEs acumulați în diferite țesuturi
și organe în mecanismele patogenetice din sindromul metabolic și rolul de biomarkeri
al AGEs pentru diagnosticul și monitorizarea bolilor sistemice 24,25. Cu scopul de a
investiga modificările citologice la nivelul epiteliului mucoasei orale, am prelevat
celulele epiteliale descuamate și am realizat citoblocuri, iar secțiunile au fost colorate
cu H-E și examinate histologic.
Ultrasonografia de înaltă frecvență (HFU – High Frequency Ultrasound) este o
metodă de diagnostic în timp real, non-invazivă, non-ionizantă, reproductibilă, care,
față de radiografia convențională, prezintă avantajul furnizării de date morfometrice și
a funcției Doppler pentru investigarea vascularizației diferitelor țesuturi 26,27. În
decursul ultimilor ani, aplicațiile ultrasonografiei au fost extinse de la investigațiile din
zonele toracică și abdominală înspre zona capului și gâtului în vederea examinării
detaliate a țesuturilor moi, pentru investigarea și diferențierea tumorilor 28. Glicarea
este considerată unul dintre determinanții principali ai îmbătrânirii cutanate, fiind
asociată cu alterări ale proteinelor și în special ale colagenului din structura matricii
extracelulare și acumularea AGEs. În cadrul proiectului SalivAGEs, a fost efectuat un
studiu care a determinat modificările morfologice de la nivelul țesuturilor maxilo-
faciale expuse și non-expuse la radiația ultravioletă (UV), evaluate cu ajutorul HFU.
Aceste modificări au fost corelate cu fototipul tegumentar, vârsta și parametrii
sindromului metabolic.
În prezent, probele biologice umane sunt folosite nu numai pentru screening-ul
și diagnosticul diferitelor patologii, dar și pentru a evalua complianța la tratament și
eficiența terapeutică. În funcție de tipul de investigații necesare, pot fi prelevate probe
de sânge, salivă, spută, urină, etc. În ultimii ani, saliva a fost investigată ca alternativă la
plasmă sau ser pentru evaluarea homeostaziei și identificarea unor stări patologice 29,
întrucât conține numeroși constituenți difuzați din sânge 30.
În cadrul proiectului SALIVAGES, a fost dezvoltat prototipul unui senzor optic

intra-oral care a fost testat pentru detectarea consumului de băuturi pe bază de vin și
evaluarea calității vinului. Implementarea acestui senzor inovator se bazează pe
avantajele conferite de detecția spectrală cu ajutorul unei fibre optice și posibilitatea
de integrare într-o gutieră, pentru monitorizarea în timp real a biomarkerilor din
salivă. Mai mult, detectarea intra-orală a consumului de alimente sau băuturi și
corelarea acestora cu modificările biomarkerilor salivari ar putea furniza informații
valoroase privind factorii de risc în bolile asociate dietei 31.
Aceste studii au fost realizate prin colaborarea în cadrul unei echipe
multidisciplinare, care a reunit medici de diferite specialități și farmaciști de la UMF
Cluj-Napoca, Institutul Oncologic și USAMV, și experți din diverse domenii de la UBB și
UTCN din Cluj-Napoca. Doresc să le mulțumesc tuturor colaboratorilor care m-au
susținut în cercetările pe care le-am realizat: colectivului de la Disciplina de Histologie,
condus de doamna Prof. Dr. Carmen Mihaela Mihu, care m-a susținut în activitatea
didactică și de cercetare, doamnei Prof. Dr. Alina Elena Pârvu de la Disciplina de
Fiziopatologie pentru coordonarea cercetărilor în cadrul grantului intern, doamnelor
Conf. Dr. Elena Dinte și Conf. Dr. Alina Porfire de la Facultatea de Farmacie, care au
realizat preparatele pe bază de curcumină și EGCG utilizate în studiile experimentale și
in vitro. Doresc în mod special să le adresez cele mai alese mulțumiri colegilor de la
Disciplina de Reabilitare Orală, Facultatea de Medicină Dentară, domnului Prof. Dr.
Radu Septimiu Câmpian, doamnei Prof. Dr. Aranka Ilea pentru coordonarea și
colaborarea în studiile clinice, experimentale și in vitro în cadrul proiectului
SALIVAGES și al granturilor interne, precum și tinerilor medici, rezidenților și
studenților cu care am lucrat în aceste proiecte. Doresc să aduc mulțumiri colectivului
de la Laboratorul de Radiobiologie și Biologie Tumorală de la IOCN Cluj-Napoca,
condus de doamna biolog Dr. Piroska Virag, și în mod special doamnei Dr. Olga Sorițău
pentru îndrumarea în studiile pe culturi celulare, doamnei Dr. Eva Fodor-Fischer
pentru susținerea în realizarea studiilor pe analogii sintetici ai curcuminei, și doamnei
Dr. Gabriela Cherecheș pentru colaborarea în studiul efectului lipozomilor în culturile
celulare. Le mulțumesc și domnului Prof. Dr. Viorel Miclăuș pentru îndrumarea și
susținerea în realizarea studiilor de microscopie și domnului Conf Dr. Marian Tăulescu
pentru colaborarea în studiile de imunohistochimie pe țesuturile parodontale și
citoblocuri. De asemenea, le mulțumesc colaboratorilor de la Facultatea de Chimie,
UBB, doamnei Conf. Dr. Reka Barabas pentru realizarea matricilor de Ti folosite pentru
implantele in vivo și în studiile in vitro, și specialiștilor de la UTCN: inginer Prof. Dr.
Ramona Gălătuș și inginer Lector Dr. Paul Farago pentru colaborarea în realizarea
senzorului optic intra-oral. Tuturor colaboratorilor le adresez cele mai alese gânduri
de apreciere și recunoștință pentru implicare și susținerea pe care mi-au oferit-o în
derularea cercetărilor.
tisulară
CERCETAREA ȘTIINȚIFICĂ
tisulară
1. Mecanisme patogenetice în boala parodontală și

noi abordări terapeutice
1.1. Acumularea produșilor finali de glicare avansată (AGEs)
în țesuturile asociate cavității orale la șobolan în funcție de
vârstă
Procesul de glicare este reacția chimică dintre gruparea carbonil (C=O) a
glucidelor reducătoare și grupările amino (-NH2) ale proteinelor și lipidelor 32. AGEs
cuprind un grup heterogen de compuși și reprezintă rezultatul unor serii complexe de
reacții secvențiale care conduc la formarea bazelor Schiff și produșilor Amadori 33.
Formarea AGEs prin reacția Maillard este o consecință a tratamentului termic al
alimentelor și ingredientelor acestora, fiind responsabilă de producerea unui grup de
substanțe heterogene care influențează în mod esențial aspectul produsului alimentar
finit 34. Reacții asemănătoare reacției Maillard apar, de asemenea, în organismele vii iar
produșii generați in vivo sunt denumiți AGEs endogeni și produși finali de lipoxidare
avansată (ALEs – Advanced Lipoxidation Endproducts) 35.
Unul dintre reprezentanții AGEs și ALEs cei mai intens studiați este
carboximetil-lizina (CML) 36, care poate fi produsă prin atât în alimente, cât și în
sistemele biologice 37. Printre numeroasele reacții descrise în literatură, majoritatea
implică oxidarea fructozil-lizinei (un produs Amadori) prin care se formează CML ca
AGEs. Iar reacția directă dintre glioxalul produs în timpul peroxidării lipidelor și
gruparea ε-amino a lizinei duce la formarea CML ca ALEs 38,39,40.
Datorită legăturilor chimice stabile, AGEs se acumulează în țesuturi și organe în
mod dependent de doză și de timpul de expunere. Multiplele căi de formare și prezența
CML în produsele alimentare și in vivo au conferit acestui compus rolul de marker al
acumulării AGEs, fiind investigat atât în studiile experimentale, cât și în studiile
clinice36.
Interesul științific față de CML derivă din descoperirea recentă a implicării AGEs
în numeroase afecțiuni, cum ar fi: diabetul zaharat, afecțiunile cardiovasculare și bolile
neurodegenerative33, 41.
Studii ale ultimelor decenii au demonstrat acțiunea sinergică in vivo a AGEs, și în
particular a CML din cele două surse: din dietă (DAGEs – Dietary AGEs) și de origine
endogenă, ceea ce inițiază multiple mecanisme patogenetice, cu consecințe importante
asupra sănătății 42,43.
Aceste mecanisme includ: (1) modificarea structurii proteinelor, cu alterarea
consecutivă a funcțiilor acestora; (2) formarea de legături cross-link intra- și inter-
moleculare cu producerea modificărilor tisulare; (3) favorizarea formării radicalilor
liberi cu apariția stresului oxidativ; (4) interacțiunea cu RAGE (receptorul specific al
AGEs) sau cu alți receptori membranari și inducerea răspunsului inflamator prin
modularea expresiei citokinelor pro-inflamatoare36, 44.
În prezent, se consideră că CML este un biomarker al îmbătrânirii, întrucât

procesul de îmbătrânire fiziologică implică formarea și acumularea AGEs, printre care
și CML, la nivel intra- și extracelular33, 41.
Prin acumularea extinsă în diverse țesuturi și organe, care apare odată cu
înaintarea în vârstă, AGEs influențează numeroase funcții biologice și contribuie la
inițierea diverselor patologii sistemice24, inclusiv afecțiuni ale cavității orale25. AGEs se
acumulează în parodonțiu 45 și mediază distrucțiile tisulare prin promovarea formării
radicalilor liberi și accentuarea lizei fibrelor de colagen, astfel influențând progresia și
severitatea bolii parodontale. În plus, AGEs induc modificări morfo-fiziologice în
fibroblastele parodontale, inhibă diferențierea osteoblastelor și activează
osteoclastele, ceea ce duce la pierderea atașamentului parodontal și rezorbția osului
alveolar 46,47.
AGEs care difuzează din pulpa dentară prin canalicule în matricea dentinară
afectează culoarea de la galben spre brun, iar duritatea dentinei este crescută datorită
modificării colagenului și obturării canaliculelor dentinare, factori care cresc riscul de
fracturi dentare25.
În derm, formarea CML și a altor AGEs alterează turnover-ul colagenului și astfel
crește rigiditatea tegumentului, cu apariția semnelor caracteristice de îmbătrânire36.
În cadrul unui studiu experimental, am investigat distribuția CML în țesuturile și
organele asociate cavității orale la șobolan în funcție de vârsta animalelor 48.
Rezultatele acestui studiu au fost publicate in extenso în articolul Băbțan AM, Boșca BA
et al., 201948.
Studiul a inclus șobolani Wistar tineri, în vârstă de 8 luni, femele (n=5) și
masculi (n=5) și adulți, în vârstă de 2 ani femele (n=5) și masculi (n=5). Animalele au
fost hrănite cu pelete standard (20% proteine, 70% carbohidrați și 10% lipide) si apă
ad libitum. Animalele au fost eutanasiate prin anestezie profundă cu eter și s-a efectuat
necropsia completă. Studiul a fost aprobat de Comisia de Etică a Universității de
Medicină și Farmacie „Iuliu Hațieganu” din Cluj-Napoca, nr. 79/3.03.2017.
Au fost prelevate specimene de tegument, mucoasă orală, incisivii centrali
inferiori cu parodonțiul adiacent, inclusiv gingia. Specimenele au fost fixate în soluție
de formaldehidă 10% timp de 24h și apoi procesate conform tehnicii histologice
standard: au fost incluse în parafină, secționate la 3-4 microni (μm) și colorate cu
hematoxilină-eozină (H-E). Secțiunile au fost examinate cu un microscop Olympus și
imaginile au fost preluate cu o cameră digitală Olympus SP 350 și soft-ul Stream Basic
imaging (Olympus Corporation, Tokyo, Japan). În vederea examinării
imunohistochimice (IHC), secțiunile seriate de 3 μm au fost obțiunute din aceleași
blocuri de parafină. Secțiunile au fost desicate la 60°C și au fost colorate cu un anticorp
primar anti-CML NF- 1G (Abcam, ab30917), diluție - 1: 250. Martorul negativ pentru
fiecare specimen a fost preparat prin înlocuirea anticorpului primar cu IgG1 de șoarece
(Cod X0931, Dako, Danemarca). Legarea anticorpului a fost vizualizată cu ajutorul unui
aparat automat pentru imunohistochimie Leica BOND MAX system (Leica Biosystems,
Germania) conform indicațiilor producătorului. Imunopozitivitatea pentru CML a fost
apreciată utilizând o metodă semicantitativă. Intensitatea reacției de culoare pentru
CML a fost evaluată printr-un sistem gradual, acordându-se următoarele scoruri: 0 –
lipsa reacției; 1 (+) slab pozitivă; 2 (++) moderat pozitivă; și 3 (+++) intens pozitivă.
Evaluarea specimenelor imunohistochimice a fost efectuată de trei evaluatori
individuali. Discrepanțele privind cuantificarea CML în țesuturi au fost soluționate prin
tisulară
re-evaluarea secțiunilor histologice și s-a obținut consensul privind scorurile acordate.
Rezultatele au fost analizate statistic cu soft-ul GraphPad Prism 5 (La Jolla, CA, SUA).
Pentru comparația între scorurile IHC s-a folosit ANOVA two-way cu post-testul
Bonferroni (valoarea p < 0,05).
Examenul microscopic în colorația uzuală H-E nu a relevat diferențe morfologice
între grupurile de vârstă sau între femele și masculi (Fig 1A, 2A și 3A). Rezultatele
examinării IHC au indicat o distribuție variabilă a CML în țesuturi48. În țesuturile
epiteliale, reacția imunohistochimică pentru CML a fost observată în citoplasma
celulelor din mucoasa orală și epiderm, precum și în celulele endoteliale din vase. În
țesutul conjunctiv, expresia CML a fost observată în celulele conjunctive: fibroblaste și
celule inflamatoare și în asociere cu fibrele de colagen. La nivelul cavității orale, CML a
prezentat o expresie difuză în epiteliul și corionul mucoasei orale, în țesuturile dentare
și parodontale (Fig. 1 și 2). La animalele tinere, colorația imunohistochimică pentru
CML a fost mai intensă în fibroblaste și celulele endoteliale din lumenul capilarelor
(Fig. 1B). La animalele adulte, CML a prezentat o expresie mai accentuată în celulele
epiteliului mucoasei orale și în fibrele de colagen, comparativ cu animalele tinere (Fig.
1C), atât în cazul masculilor (p < 0,001), cât și în cazul femelelor (p < 0,05) (Fig. 1D).
Fig. 1. Mucoasa orală: A – epiteliul stratificat pavimentos și corionul, colorație H-E; B – animalele
tinere: expresia CML în fibroblastele și capilarele din corion; reacție negativă CML la nivelul
epiteliului, IHC pentru CML; C – animalele adulte: expresie intensă a CML la nivelul epiteliului și
a fibrelor de colagen din corion, IHC pentru CML; D – Comparația între nivelurile de expresie IHC
a CML în mucoasa orală la animalele tinere și adulte, femele și masculi.
În țesuturile dentare și parodontale, CML a fost exprimată în pulpă, dentină,

cement, osul alveolar (Fig. 2B), și cu intensitatea cea mai mare în ligamentele dento-
alveolare. La masculii adulți s-a observat o acumulare a CML semnificativ mai mare (p
< 0,05) în ligamentele dento-alveolare comparativ cu masculii tineri (Fig. 2D).
Fig. 2. Țesuturile dentare și parodontale: A – secțiune longitudinală prin dinte, ligamentele

dento-alveolare și osul alveolar, colorație H-E; B – animalele tinere: expresie difuză a CML în
ligamentele dento-alveolare, IHC pentru CML; C – animalele adulte: expresie intensă a CML la
nivelul fibrelor de colagen din dentină, ligamentele dento-alveolare și osul alveolar, IHC pentru
CML; D – Comparația între nivelurile de expresie IHC a CML în țesuturile dentare și parodontale
la animalele tinere și adulte, femele și masculi.
În tegument, epidermul și foliculii piloși au prezentat o cantitate mai mare de

CML decât fibroblastele și fibrele colagene din derm (Fig. 3). La animalele tinere,
expresia CML a fost discretă (Fig. 3B). La masculii adulți expresia CML a fost
semnificativ mai mare în epiderm (p < 0,01) și în fibrele de colagen din derm (p <
0,001) (Fig. 3C). La femelele adulte, expresia CML a fost semnificativ crescută în
tisulară
celulele epiteliale (p < 0,05), în fibroblaste (p < 0,05) și în fibrele de colagen (p < 0,001)
comparativ cu femelele tinere.
Nu au existat diferențe semnificative între femelele și masculii de aceeași vârstă,
privind expresia CML în țesuturile investigate (Fig. 3D).
Fig. 3. Tegument: A – epidermul și dermul, colorație H-E; B – animalele tinere: expresia discrete a
CML în epiderm și derm, IHC pentru CML; C – animalele adulte: expresie intensă a CML la nivelul
epidermului și a foliculilor piloși, IHC pentru CML; D – Comparația între nivelurile de expresie
IHC a CML în epidermul și dermul animalelor tinere și adulte, femele și masculi.
În acest studiu, expresia mai intensă a CML în țesuturile cavității orale a fost
asociată cu vârsta animalelor, ceea ce sugerează implicarea în procesele de
îmbătrânire. Mai mult, în cadrul studiilor clinice, determinarea expresiei CML în
țesuturile cavității orale care sunt prelevate cu ocazia diverselor manopere terapeutice
(țesuturile dentare în cazul extracțiilor, gingia în cazul gingivectomiei) poate fi folosită
ca o metodă pentru evaluarea proceselor de îmbătrânire și pentru a stabili riscul de a
dezvolta anumite boli generale asociate vârstei.
AGEs sunt implicați în inflamația cronică de intensitate redusă, cu producerea
efectelor negative dependente de doză și de timpul de expunere care alterează funcția
diverselor țesuturi și organe, conducând la instalarea și progresia bolilor sistemice24.
Având în vedere valoarea AGEs ca biomarkeri, studiile viitoare se vor concentra

pe investigarea influenței nivelurilor salivare ale CML asupra acumulării în țesuturile
cavității orale și implicarea în diverse afecțiuni orale. Evaluarea nivelurilor salivare ale
AGEs la scaunul pacientului ar putea fi o nouă abordare în diagnosticul, prognosticul și
tratamentul bolilor sistemice care au la bază meta-inflamația24, 25.
1.2. Expresia imunohistochimică a carboximetil lizinei în

gingie la pacienții parodontopați
CML, unul dintre AGEs, poate fi considerată un biomarker asociat stresului
oxidativ și al degradării proteinelor. Acumularea CML conduce la modificări tisulare
ireversibile, iar prin interacțiunea cu RAGE, CML exercită un efect pro-inflamator, și
astfel joacă un rol important în procesele inflamatoare acute și cronice 49. Este
recunoscut faptul că unul dintre mecanismele implicate în evoluția bolii parodontale
asociate diabetului zaharat are la bază acumularea de AGEs în gingie, ceea ce induce
stres oxidativ local 50.
Scopul acestui studiu a fost de a determina prezența Nε-carboximetil lizinei (Nε-
CML) în gingie la pacienții cu parodontită cronică.
Studiul a fost aprobat de Comisia de Etică a UMF „Iuliu Hațieganu”
(93/08.03.2017), Cluj Napoca, și s-a obținut consimțământul informat al pacientului
înainte de prelevarea probelor.
Specimenele tisulare cuprinzând gingia liberă au fost prelevate, în urma
intervenției de gingivectomie, de la 8 pacienți cu diverse grade de severitate a bolii
parodontale. Țesuturile au fost prelucrate histologic pentru a fi examinate la
microscopul optic utilizând metoda uzuală în colorația H-E și imunohistochimia pentru
CML.
După prelevare, țesuturile au fost fixate cu soluție de formaldehidă tamponată
10% timp de 24 h, apoi au fost incluse în parafină. S-au efectuat secțiuni seriate de 3
µm care au fost colorate cu H-E. Pentru IHC, secțiunile au fost incubate la 4°C cu
anticorpul monoclonal mouse (NF-1G) anti Carboxymethyl Lysine (ab30917; Abcam,
UK).
După aplicarea anticorpului secundar, secțiunile au fost incubate cu DAB LSAB
System-HRP kit (Code K0679, Dako, Denmark). Apoi, secțiunile au fost spălate cu apă
distilată și colorate cu hematoxilină Mayer timp de 5 min. Controlul negativ pentru
fiecare probă a fost realizat prin înlocuirea anticorpului primar cu IgG1 mouse
Negative Control.
S-a urmărit evaluarea semicantitativă a expresiei CML în epiteliu, în endoteliul
de la nivelul microcirculației, în fibroblaste, în celulele inflamatoare mononucleare și în
fibrele de colagen. Intensitatea colorației pentru anticorpul monoclonal anti-CML a fost
cuantificată utilizând un sistem de acordare a patru scoruri, în funcție de intensitatea
eacției IHC: 0 – lipsa reacției ; 1 – reacție slab pozitivă; 2 – reacție moderat pozitivă; 3 –
reacție intens pozitivă, conform unui studiu anterior48.
Rezultatele examinării histologice în colorația H-E au indicat distrucții ale
epiteliului și diverse grade de inflamație cronică la nivelul corionului gingival, cu
prezența infiltratelor inflamatoare cu celule mononucleare, edem, hemoragie și liza
fibrelor de colagen (Fig. 4A, 5A, 5B și 6A).
tisulară
Colorația IHC a evidențiat diferite grade de acumulare a CML la nivelul
epiteliului și corionului, în celulele conjunctive, în celulele inflamatoare și în fibrele de
colagen (Tabelul I și Fig. 4B, 4C, 5C, 6B și 6C).
Fig. 4. Aspectul microscopic al gingiei prelevate de la pacientul nr. 4 (cu parodontită cronică
stadiul 4): A – Inflamație cronică moderată la nivelul corionului gingival, caracterizată prin
prezența infiltratului inflamator perivascular și interstițial (săgețile) col. H-E; B – Expresia CML
la nivelul celulelor endoteliale (săgeata discontinuă) IHC pentru CML; C – expresia CML în
celulele epiteliale (săgeata neagră) și în celulele mononucleare (săgeata albă) IHC pentru CML
stadiul 3): A - Inflamație cronică severă la nivelul corionului gingival, caracterizată prin prezența
unui infiltrat inflamator dens perivascular și interstițial (săgețile negre) col. H-E; B – congestie
intensă, edem și hemoragie (săgeata neagră) col. HE; C – Expresie intensă a CML în celulele
mononucleare (săgeata albă) și mai redusă în polimorfonucleare și fibroblaste (săgețile
discontinue) IHC pentru CML
stadiul 3): A - Inflamație cronică ușoară spre moderată, cu celule inflamatoare organizate în
focare izolate la nivelul corionului gingival (săgețile) și fibroză subepitelială (săgețile negre
discontinue) col. HE; B – Expresia CML la nivelul celulelor mononucleare (săgețile albe
discontinue) IHC pentru CML; C – expresia mai redusă a CML în neutrofile, celulele endoteliale,
fibroblaste (săgețile albe groase) și în celulele mononucleare (săgețile negre groase) IHC pentru
CML
Scorurile acordate conform immunoreactivității pentru CML în celulele

epiteliale, conjunctive și în fibrele de colagen au fost comparate cu severitatea
distrucțiilor tisulare cu diagnosticate pe baza criteriilor clinice (Tabelul I).
tisulară
Tabelul I. Imunoreactivitatea pentru CML în specimenele gingivale în funcție de stadiul
parodontitei cronice
Scorul IHC pentru expresia CML

Pacient Diagnosticul
nr. parodontal Celule
Celule Celule Fibre de
Fibroblaste inflamatoare
epiteliale endoteliale colagen
mononucleare
Parodontită
1 2 3 2 3 2
cronică stadiul 2
Parodontită
2 1 1 1 2 1
cronică stadiul 2
Parodontită
3 1 2 1 2 1
cronică stadiul 2
Parodontită
4 1 3 2 3 3
cronică stadiul 4
Parodontită
7 2 3 1 3 2
cronică stadiul 4
Parodontită
9 1 3 2 3 2
cronică stadiul 3
Parodontită
10 2 3 2 3 3
cronică stadiul 3
Parodontită
11 1 2 2 3 2
cronică stadiul 3
S-a observat existența unei corespondențe între acumularea CML la nivel tisular,
gradul de inflamație gingivală decelat la examenul histologic și stadiul parodontitei
cronice diagnosticat pe baza criteriilor clinice (Tabelul I).
Aceste rezultate sugerează implicarea AGEs în patogeneza bolii parodontale
prin medierea distrucțiilor tisulare la nivelul parodonțiului. Acest studiu pilot va fi
continuat cu studii clinice extinse pe un număr mai mare de pacienți parodontopați, iar
rezultatele examenului histologic vor fi corelate cu valorile salivare și serice ale CML,
pentru a stabili rolul de biomarker al CML în boala parodontală.
1.3. Implicarea stresului oxidativ în patogeneza bolii

parodontale induse pe model animal
În cadrul reacției inflamatoare declanșate de microorganismele
parodontopatogene, evenimentul principal este recrutarea și activarea
polimorfonuclearelor neutrofile (PMN) și macrofagelor la nivelul țesuturilor
parodontale 51, 52. PMN activate eliberează cantități crescute de specii reactive ale
oxigenului (ROS – Reactive Oxygen Species), care induc apariția stresului oxidativ local
și mediază distrucțiile tisulare parodontale 53,54.
Recent, numeroase studii au demonstrat că inflamația parodontală este strâns

asociată cu anumite boli sistemice, printre care bolile cardio-vasculare, afecțiunile
respiratorii cronice și diabetul zaharat, în care inflamația cronică joacă un rol
important; mai mult, numitorul comun în patogeneza tuturor acestor boli este
implicarea stresului oxidativ 55, 56, 57, 58, 59.
Totuși, unele mecanisme implicate în progresia parodontitei cronice, cum ar fi
variația nivelurilor serice ale parametrilor stresului oxidativ, sunt incomplet elucidate.
A fost emisă ipoteza conform căreia stresul oxidativ inițiat la nivelul leziunilor
parodontale ar putea fi o cauză importantă a inflamației sistemice. Studiile care au
investigat stresul oxidativ în parodontopatii au raportat niveluri crescute ale
biomarkerilor în sângele periferic al pacienților parodontopați comparativ cu indivizii
sănătoși 60, 61. Însă evoluția în dinamică a biomarkerilor stresului oxidativ pe parcursul
progresiei parodontitei cronice nu a fost deocamdată stabilită.
Modelele experimentale sunt utilizate pentru a stabili o legătură esențială între
ipoteze și studiile clinice 62. Deși modelele animale furnizează informații utile, în
anumite patologii este controversată posibilitatea translatării la pacienții umani a
rezultatelor obținute 63. Una dintre aceste patologii este boala parodontală, o afecțiune
tipic umană, în cadrul căreia mecanismele complexe implicate în inițierea și progresia
inflamației parodontale nu pot fi reproduse în mod identic la animalele de
experiență62.
Scopul studiului efectuat a fost urmărirea în dinamică a nivelurilor serice ale
markerilor stresului nitro-oxidativ: nitriții și nitrații totali (NOx), statusul oxidativ total
(TOS), capacitatea antioxidantă totală (TAC) și indicele de stres oxidativ (OSI) 64.
Protocolul studiului experimental a fost aprobat de Comisia de etică a Universității de
Experimentul a fost efectuat pe 15 șobolani Wistar adulți, masculi, cu greutatea
cuprinsă între 200 și 250 g. Animalele au fost anesteziate prin administrarea
intramusculară de ketamină 50 mg/kg corp și xilazină 20 mg/kg corp. Leziunile
gingivale au fost efectuate cu ajutorul unei chiurete parodontale Gracey introduse la
nivelul șanțului gingival și care a fost deplasată circular în jurul coletului dintelui
pentru a detașa epiteliul joncțional de pe suprafața dintelui 65. Aceste leziuni au fost
repetate timp de 16 zile, iar progresia inflamației parodontale a fost urmărită zilnic
(D1-D16). În zilele D1, D3, D6, D8 și D16 a fost recoltat sânge pentru dozarea
markerilor stresului nitro-oxidativ.
Sângele a fost prelevat prin puncție retro-orbitară, și colectat în vaccutainere
fără anticoagulat. După coagulare, sângele a fost centrifugat și serul a fost prelucrat
pentru măsurarea nivelurilor NOx, TOS și TAC; pe baza TOS și TAC a fost calculat OSI.
Probele de ser au fost filtrate prin filtre de 10 kDa (Sartorius AG, Goettingen,
Germania) și proteinele au fost extrase cu o soluție de metanol : dietileter 3:1
(volum:volum).
Sinteza de oxid nitric (NO) a fost determinată indirect cu ajutorul reacției Griess.
Nitratul a fost redus la nitrit prin reacția a 100 μL de supernatant din serul filtrat și
extras cu 100 μL din soluția 8 mg/mL clorură de vanadiu III (VCl3); apoi, au fost
adăugați reactivii Griess : 50 μL soluție 2% de dietil eter sulfanilamidă (SULF) și 50 μL
soluție 0.1% N-(1-Naftil) etilen-diamină-diclorhidrat (NEDD). Proba a fost incubată 30
de minute la 37°C și absorbanța a fost citită la 540 nm. Concentrația NOx în ser a fost
tisulară
determinată cu ajutorul unei curbe de nitrit de sodiu și a fost exprimată ca nitriți
μmol/L 66.
TOS a fost evaluat cu un test colorimetric care a măsurat oxidarea ionilor feroși
la ioni ferici în mediul acid, în prezența a diferite specii de oxygen 67. Apoi, ionii ferici au
fost detectați prin reacția cu xylenol orange. Măsurătorile au fost standardizate cu
peroxid de hidrogen (H2O2) utilizat ca specie oxidativă, iar rezultatele au fost
exprimate în μmol H2O2 Equiv./L.
TAC a fost măsurată utilizând un test colorimetric care a monitorizat rata de
producere a radicalului hidroxil prin reacția Fenton și modificările de absorbanță a
culorii radicalilor dianisidil 68. Prin adăugarea unei probe de ser, antioxidantul prezent
în ser inhibă reacțiile oxidante inițiate de radicalii hidroxil. Inhibarea oxidării
dianisidilului nu permite schimbarea culorii, astfel măsurându-se TAC în ser. Acest test
a fost calibrat utilizând troloxul și rezultatele au fost exprimate în mmol trolox
Equiv/L.
OSI a fost calculat ca rapotul dintre TOS și TAC : OSI (unitate arbitrară) = TOS
(μmol H2O2 Equiv/L) / TAC (mmol trolox Equiv/L) 69.
Măsuratorile au fost efectuate cu ajutorul unui spectrofotometru Jasco V-530
UV-Vis (Jasco International Co., Ltd., Tokyo, Japonia).
Pentru analiza statistică s-a utilizat softul R 3.0.2. Rezultatele au fost exprimate
ca medie ± deviație standard (SD). Distribuția normală a datelor a fost stabilită cu
testul Shapiro-Wilk. Comparațiile între momente au fost făcute cu testul ANOVA și
testul post-hoc Tukey. Valorile p < 0.05 au fost considerate semnificative statistic.
Corelația statistică a fost evaluată cu ajutorul testelor de corelație Pearson și
Spearman.
Evaluarea stresului oxidativ pe parcursul inducerii patologiei parodontale s-a
efectuat prin măsurarea în dinamică a parametrilor serici. Rezultatele au indicat o
creștere constantă a valorilor NOx, TOS și OSI, creșterea fiind accentuată până în ziua a
3-a (D3) și mai lentă ulterior. TAC nu a prezentat modificări semnificative (p > 0,05)
(Figura 7, Tabelul II).
Figura 7. Evoluția parametrilor stresului nitro-oxidativ pe parcursul celor 16 zile de

progresie a parodontitei experimentale. NOx = nitriți și nitrați totali; TOS = status oxidant total;
TAC = capacitate antioxidantă totală; OSI = indicele de stres oxidativ, în 5 momente: D1- ziua 1,
D3 – ziua 3, D6 – ziua 6, D8 – ziua 8, D16 – ziua 16.
Tabelul II. Nivelurile serice ale markerilor stresului oxidativ pe parcursul inducerii
parodontitei experimentale.
Valorile sunt exprimate ca medie ± SD a cinci determinări. NOx = nitriți și nitrați totali;
TOS = status oxidant total; TAC = capacitate antioxidantă totală; OSI = indicele de stres oxidativ,
în 5 momente: D1- ziua 1, D3 – ziua 3, D6 – ziua 6, D8 – ziua 8, D16 – ziua 16.
Nivelurile serice ale NOx au fost semnificativ mai scăzute în prima zi (D1) prin
comparație cu celelalte momente : D3, D6, D8 și D16 (p < 0,001). În plus, nivelurile
serice ale NOx au fost semnificativ mai reduse în ziua a 3-a (D3), comparativ cu zilele
D6, D8 și D16 (p < 0,001).
Nivelurile TOS au fost semnificativ reduse în prima zi (D1) comparativ cu zilele
D3 (p < 0,05), D6 (p < 0,05), D8 (p < 0,001), și D16 (p < 0,05). În plus, nivelurile serice
ale TOS au fost semnificativ crescute în ziua D8 compativ cu D3 și D6 (p < 0,05).
tisulară
Nivelurile serice ale OSI au fost semnificativ scăzute în ziua D1 comparativ cu
zilele D3 (p < 0,05), D6 (p < 0,05), D8 (p < 0,001), și D16 (p < 0,05). În plus, nivelurile
serice ale TAC au fost semnificativ crescute în ziua D8 comparativ cu D3 și D6 (p <
0,05).
Pe parcursul celor 16 zile de inducere a patologiei parodontale, s-a observat o
corelație înalt semnificativă între OSI și TOS (r = 0,99). În ziua D6, s-a observat o
corelație între nivelul seric al NOx și nivelurile TOS (r = 0,65) și OSI (r = 0,64).
Rezultatele acestui studiu au demonstrat creșterea nivelurilor markerilor
stresului oxidativ pe parcursul progresului patologiei parodontale induse la șobolan.
Stresul nitro-oxidativ este indus de producerea în exces a ROS 70, în asociere cu
creșterea sintezei de NO prin intermediul sintetazei inductibile a oxidului nitric (iNOS -
inducible Nitric Oxide Synthase) 71. Producerea, în cantități crescute, a speciilor
reactive ar putea fi asociată cu o scădere a capacității antioxidante. Din acest motiv,
este indicat ca stresul notro-oxidativ să fie evaluat prin măsurarea ROS, NO și TAC 72.
În acest studiu, pentru a stabili severitatea și progresia parodontitei cronice
induse la șobolan, au fost utilizate teste globale de evaluare a stresului nitro-oxidativ.
Sinteza NO a fost măsurată indirect prin cuantificarea nitraților și nitriților în ser 73,
nivelurile ROS au fost măsurate prin determinarea TOS, iar capacitatea antioxidantă a
fost stabilită prin TAC66-68, 72.
Din moment ce rezultatele finale depind de raportul dintre producerea ROS și
mecanismele antioxidante, determinarea OSI a fost, de asemenea, urmărită68.
Acest studiu a fost primul care a determinat, în dinamică, nivelurile serice ale
parametrilor stresului nitro-oxidativ ca indicatori ai progresiei distrucțiilor
parodontale în parodontita experimentală la șobolan. Nivelurile serice ale NOx, TOS,
TAC și OSI sunt considerate markeri ai stresului nitro-oxidativ 74, 75 și pot fi utilizate
pentru a stadializa progresia afecțiunii 76.
În momentul inițial, nivelurile serice ale NOx, TOS și OSI au fost scăzute, însă în
zilele următoare au crescut gradual odată cu instalarea inflamației parodontale,
sugerând apariția stresului nitro-oxidativ local și sistemic. Compararea valorilor
markerilor în diferitele momente pe parcursul evoluției parodontitei a demonstrat o
creștere progresivă și diferențe semnificative în cazul intervalelor mai mari de timp
dintre examinări: zilele D3-D8, D6-D16 și D8-D16. La încheierea experimentului,
valorile markerilor au atins valorile maxime, corespunzătoare disrucțiilor parodontale
severe. Totuși, TAC nu a fost influențată de progresia inflamației parodontale.
Rezultatele acestui studiu sugerează că nivelurile serice ale NOx, TOS și OSI, markeri ai
stresului oxidativ, ar putea fi dozate pentru stabilirea stadiului de evoluție a
parodontitei cronice64. Aceste rezultate se bazează pe studiile publicate în articolele:
Boșca AB et al., 201465 și Boșca AB et al., 201664.
În perspectivă, sunt necesare studii clinice suplimentare pentru a valida inter-
relația dintre stresul nitro-oxidativ și severitatea parodontitei cronice și pentru a
stabili dacă valorile serice ale acestor markeri ar putea fi utilizate ca metode de
diagnostic clinic al diverselor forme de boală parodontală.
1.4. Eficiența tratamentului antioxidant în parodontita

experimentală
Patogeneza complexă a parodontitei cronice presupune deopotrivă prezența
plăcii bacteriene și implicarea răspunsului imuno-inflamator al organismului gazdă.
Prin urmare, dezvoltarea unor terapii de modulare a răspunsului gazdei care să fie
utilizate ca adjuvante ale terapiei antimicrobiene reprezintă obiectivul cercetărilor
recente 77.
Stresul nitro-oxidativ local este unul dintre mecanismele responsabile de
distrucțiile țesuturilor parodontale și resorbția osului alveolar, ceea ce duce la
mobilizarea și pierderea dinților.
Antioxidații înlătură radicalii liberi și previn distrucțiile tisulare colaterale
cauzate de stresul oxidativ, astfel acționând ca agenți terapeutici și profilactici 78.
Turmericul, condimentul de culoare galbenă obținut din rizomii plantei
Curcuma longa, o plantă perenă din familia Zingiberaceae, care este cultivată în Asia de
sud-est, a fost utilizat în medicina tradițională ayurvedică încă din secolul al XIX-lea
î.Hr. 79. Curcumina izolată din turmeric și descrisă ca diferuloilmetan este un polifenol,
componentul primar al curcuminoizilor, care includ și derivații curcuminei:
demetoxicurcumina și bisdemetoxi-curcumina 80, 81.
În decursul ultimelor șase decenii, numeroase studii clinice, experimentale și in
vitro au investigat proprietățile farmacologice, farmacokinetice și farmacodinamice ale
curcuminei16. Rezultatele acestor studii au raportat efectele anti-inflamatoare,
antioxidante, antibacteriene, antivirale, antifungice și antitumorale ale curcuminei16, 82,
83, și au demonstrat eficiența terapeutică în diverse patologii, inclusiv în parodontita
cronică 84, 85.

Studiile au demonstrat că, după administrarea orală, curcumina este supusă
conjugării și reducerii la nivel hepatic și gastro-intestinal cu formarea de metaboliți
care nu prezintă activitate farmacologică 86.
În cadrul acestui studiu a fost evaluat efectul antioxidant al curcuminei și a fost
comparată eficiența diverselor metode de administrare a curcuminei în parodontita
experimentală la șobolan 87. Au fost determinate și comparate nivelurile serice ale
parametrilor stresului oxidativ în funcție de modul de administrare a curcuminei ca
terapie singulară sau asociată cu piperina. Rezultatele studiului au fost publicate în
lucrarea Boșca AB et al., 201587.
Protocolul experimentului a fost aprobat de Comisia de etică a Universității de
Experimentul a fost efectuat pe 25 șobolani Wistar-Bratislava masculi, adulți, cu
greutatea cuprinsă între 200 și 250 g, cărora le-a fost indusă patologia parodontală
prin fixarea unor ligaturi în jurul coletului incisivilor inferiori. Pentru plasarea
ligaturilor, animalele au fost anesteziate prin administrare intramusculară de ketamină
50 mg/kg corp și xilazină 20 mg/kg corp. Ligaturile au fost realizate cu fir de mătase
suturat la gingie și menținute timp de 14 zile. Progresia inflamației parodontale a fost
monitorizată zilnic.
După inducerea parodontitei, ligaturile au fost îndepărtate și animalele au fost
randomizate în cinci loturi a câte cinci animale, în funcție de tratamentul administrat:
lotul 1 (PER) – parodontită netratată; lotul 2 (OC) – parodontită tratată cu curcumină
administrată oral; lotul 3 (OCP) - parodontită tratată cu curcumină și piperină
tisulară
administrate oral; lotul 4 (OCPLC) - parodontită tratată cu curcumină și piperină
administrate oral asociate cu curcumina administrată local; lotul 5 (LC) – parodontită
tratată cu curcumină administrată local.
Administrarea pe cale orală a curcuminei și piperinei a fost realizată prin gavaj
intra gastric, curcumină în doza de 1 g/kg corp, și piperină 5 mg/kg corp, utilizând
uleiul de floarea-soarelui ca vehicul. Administrarea locală a curcuminei a fost realizată
sub forma unui gel muco-adeziv aplicat la nivelul leziunilor gingivale în cantitate de 0,1
ml.
Pentru aplicarea locală, curcumina sub formă de pudră a fost încorporată într-
un gel muco-adeziv cu concentrația de 2% curcuminoizi. Gelul a prezentat proprietățile
reologice și de adeziune in vitro adecvate pentru aplicarea pe gingie și în sulcusul
gingival. Vâscozitatea gelului a fost evaluată cu un viscometru Brookfield DVIII Ultra.
Proprietățile de muco-adeziune in vitro au fost determinate prin metoda de detașare
mucozală, utilizând un dispozitiv experimental 88.
Tratametul a fost administrat zilnic, timp de 10 zile, iar după încheierea
tratamentului, a fost recoltat sânge pentru realizarea testelor de determinare a
markerilor stresului nitro-oxidativ: NOx, TOS, TAC și OSI. Probele de sânge au fost
prelucrate conform protocolului descris anterior, în cadrul sub-capitolului 1.3.
Valorile serice ale NOx, TOS, TAC și OSI după tratament (Tabelul III) au fost
comparate la cele cinci loturi de studiu (Fig. 8).
Tabelul III. Efectul tratamentului cu curcumină asupra markerilor stresului nitro-

oxidativ.
Valorile sunt exprimate ca medie ± SD a cinci determinări. NOx = nitriți și nitrați totali;
TOS = status oxidant total; TAC = capacitate antioxidantă totală; OSI = indicele de stres oxidativ;
PER = lotul parodontită netratată; OC = parodontită tratată cu curcumină administrată oral; OCP
= parodontită tratată cu curcumină și piperină administrate oral; OCPLC = parodontită tratată cu
curcumină și piperină administrate oral asociate cu curcumina administrată local; LC =
parodontită tratată cu curcumină administrată local.
Nivelurile serice ale NOx au fost semnificativ mai reduse la loturile tratate cu
curcumină administrată oral: OC (p<0,01), OCP (p<0,001) și OCPLC (p<0,001),
comparativ cu lotul PER. Nu au existat diferențe semnificative între lotul PER și lotul
tratat cu curcumină administrată local (LC) (p>0,05) și nici între loturile tratate cu
curcumină, indiferent de forma de administrare (p>0,05) (Fig. 8).
Fig. 8. Comparație între valorile parametrilor stresului nitro-oxidativ în funcție de

tratamentul administrat. NOx = nitriți și nitrați totali; TOS = status oxidant total; TAC =
capacitate antioxidantă totală; OSI = indicele de stres oxidativ; PER = lotul parodontită netratată;
OC = parodontită tratată cu curcumină administrată oral; OCP = parodontită tratată cu
curcumină și piperină administrate oral; OCPLC = parodontită tratată cu curcumină și piperină
administrate oral asociate cu curcumina administrată local; LC = parodontită tratată cu
curcumină administrată local.
Nivelurile serice ale TOS au fost semnificativ reduse la lotul OC tratat cu

curcumină administrată oral (p<0,001) și la lotul OCP tratat cu curcumină administrată
oral asociată cu piperină (p<0,01) comparativ cu lotul PER. În plus, valorile TOS au fost
semnificativ crescute la lotul OCPLC comparativ cu lotul OC (p<0,05) (Fig. 8).
Nivelurile serice ale TAC au fost semnificativ crescute la lotul OC tratat cu
curcumină administrată oral comparativ cu lotul PER (p<0,01) și lotul LC (p<0,05) (Fig.
8).
Valorile serice ale OSI au fost semnificativ mai scăzute la lotul OC tratat cu
curcumină administrată oral (p<0,001) și la lotul OCP tratat cu curcumină administrată
oral și piperină (p<0,01) comparativ cu lotul PER. În plus, valorile OSI au fost
semnificativ crescute la lotul OCPLC comparativ cu lotul OC (p<0,05) (Fig. 8).
La lotul PER, a existat o corelație pozitivă înalt semnificativă între valorile serice
ale OSI și valorile TOS (r = 0,99) și TAC (r = 0,80), între valorile TOS și valorile TAC (r =
0,81). De asemenea, a existat o corelație negativă semnificativă între valorile NOx și
valorile OSI (r = – 0,78), TOS (r = – 0,79) și TAC (r = – 0,83).
La lotul OC, a existat o corelație pozitivă înalt semnificativă între valorile serice
ale OSI și TOS (r = 0,99), și o corelație slabă a valorilor OSI cu valorile TAC (r = 0,53) și
TOS (r = 0,53).
La lotul OCP, a existat o corelație pozitivă înalt semnificativă între valorile serice
ale OSI și TOS (r = 0,99), NOx (r = 0,70) și TAC (r = 0,81). În plus, valorile NOx au fost
corelate cu valorile TOS (r = 0,69).
tisulară
La lotul OCPLC, valorile OSI au fost corelate cu valorile TOS (r = 0,99) și TAC (r =
0,60). In plus, valorile TOS au fost corelate cu valorile TAC (r = 0,60).
La lotul LC, valorile OSI au fost corelate pozitiv cu valorile TOS (r = 0,99) negativ
cu valorile NOx (r = – 0,69).
Studiul nostru a fost primul care a evaluat parametrii stresului nitro-oxidativ ca
indicatori ai valorii terapeutice a curcuminei administrate în parodontita indusă
experimental prin ligatură la șobolan. Rezultatele studiului au indicat absența efectelor
adverse ale curcuminei, indiferent de calea de administrare.
Având în vedere biodisponibilitatea redusă a curcuminei 89, 90, datorită
absorbției gastro-intestinale reduse, metabolismului intens și excreției crescute 91, 92, în
studiul nostru am administrat doze mai mari de curcumină, comparativ cu alte studii în
care au fost administrate doze de 30 – 100 mg/kg corp85, 93 și respectiv 500 mg/kg
corp 94.
De asemenea, am luat în considerare faptul că absorbția redusă a curcuminei se
datorează parțial caracterului hidrofob 95, 96, așadar am utilizat uleiul de floarea-
soarelui ca vector pentru administrarea curcuminei pe cale orală.
Nivelurile serice ale NOx, TOS, TAC și OSI sunt considerate markeri ai stresului
nitro-oxidativ74, 75 și pot fi utilizate pentru evaluarea efectului antioxidant al
curcuminei în funcție de doză și calea de administrare76. Rezultatele noastre au
demonstrat că curcumina administrată oral în doza de 1 g/kg corp a optimizat
semnificativ nivelurile paramentrilor strsului nitro-oxidativ. Curcumina administrată
ca agent terapeutic unic a manifestat un efect antioxidant semnificativ prin reducerea
NOx, TOS și OSI, precum și prin creșterea TAC, comparativ cu lotul netratat.
Pe de altă parte, în studiul nostru am asociat curcumina cu piperină pentru
administrarea orală, având în vedere faptul că anumiți adjuvanți, cum este piperina,
inhibă glucuronidarea curcuminei și astfel au capacitatea de a crește nivelul de
absorbție și biodisponibilitatea acesteia 97.
În experimentul pe care l-am efectuat, asocierea curcuminei administrate oral
cu piperina a redus semnificativ NOx, TOS și OSI comparativ cu lotul PER dar nu a
crescut semnificativ nivelurile TAC. În plus, nu a existat o diferență semnificativă între
șobolanii tratați exclusiv cu curcumină comparativ cu cei tratați cu combinația
curcumină plus piperină. Așadar, piperina asociată curcuminei nu a contribuit
semnificativ la creșterea eficienței terapeutice a curcuminei. O posibilă limitare a
studiului de față ar putea fi doza redusă de piperină, insuficientă pentru creșterea
nivelului seric al curcuminei și pentru un efect farmacologic semnificativ.
Corelațiile dintre parametri au sugerat că, la lotul netratat, stresul nitro-oxidativ
a fost rezultatul sintezei excesive de ROS și NO, precum și a deficienței TAC.
Tratamentul oral cu curcumină a indus o scădere concomitentă a OSI și TOS.
Curcumina asociată cu piperina a optimizat semnificativ corelația dintre OSI și TOS, NO
și TAC. Aceste rezultate sugerează că asocierea piperinei cu curcumina este indicată
chiar dacă nu au fost diferențe semnificative privind valorile NOx, TOS și OSI între
loturile OC și OCP.
Pentru administrarea locală, curcumina a fost înglobată într-un gel muco-adeziv
care prezintă aderență la mucoasa orală și remanență pe o perioadă extinsă, astfel
permițând eliberarea prelungită a ingredientelor active în țesuturile gingivale. Prin
aplicarea topică a gelului cu curcumină, la lotul LC nu s-a obținut un efect inhibitor
asupra stresului nitro-oxidativ comparativ cu lotul netratat. În plus, asocierea
tratamentului local cu cel oral la lotul OCPLC nu a avut un efect potențator semnificativ
față de lotul OCP. Aceste rezultate indică faptul că limitările acestui preparat ar putea
consta în cantitatea redusă de curcumină care a fost încorporată, din cauza
caracterului hidrofob al curcuminei și vâscozității gelului.
În concluzie, curcumina administrată oral, fie ca terapie unică, fie asociată cu
piperina ca adjuvant, a redus semnificativ nivelul sistemic al stresului nitro-oxidativ în
parodontita experimentală la șobolan. Tratamentul local nu a influențat parametrii
serici ai stresului nitro-oxidativ și nu a prezentat un efect antioxidant suplimentar când
a fost asociat curcuminei administrate oral.
Proprietățile terapeutice ale curcuminei o recomandă pentru tratamentul a
numeroase afecțiuni care prezintă stresul nitro-oxidativ ca una dintre componentele
patogenetice. Însă un aspect important este identificarea unor forme de administrare
sau a unor combinații ale curcuminei cu anumiți vectori care să optimizeze absorbția și
biodisponibilitatea curcuminei.
Prin urmare, studiile noastre vor fi continuate cu investigarea efectului
antioxidant al unor derivați sau analogi sintetici ai curcuminei, precum și eficiența
curcuminei administrate oral sub formă de lipozomi în parodontita cronică
experimentală. De asemenea, vom optimiza formula de preparare a gelului muco-
adeziv destinat aplicării locale, astfel încât să se obțină o concentrație superioară de
curcumină și o eficiență crescută.
În plus, pe model animal, vom investiga efectul antioxidant al unor extracte
vegetale și a unor complexe de extracte vegetale care nu au mai fost utilizate în
parodontita cronică, pentru a determina eficiența terapeutică și posibilitatea utilizării
în studiile clinice.
2. Răspunsul celulelor stem parodontale umane la

factorii patogenetici și eficiența in vitro a
antioxidanților naturali
Progresul înregistrat în ultimii ani în domeniul cercetării celulelor stem a
permis standardizarea unor metode de izolare și caracterizare a celulelor obținute din
diverse țesuturi și organe, inclusiv din parodonțiu. Celulele stem izolate din țesuturile
parodontale sunt celule stem adulte, denumite și celule stem somatice sau celule stem
mezenchimale. Aceste celule sunt multipotente, caracterizate prin capacitatea de auto-
reînnoire și diferențiere înspre un subset de lineaje celulare, în cadrul mezodermului 98,
99, 100, 101.
La nivelul parodonțiului, celulele stem mezenchimale joacă roluri esențiale în

menținerea integrității structurale și asigurarea reparației după leziuni, dar nu e pe
deplin cunoscută implicarea acestor celule în procesele patologice, cum ar fi inflamația.
S-a demonstrat că celulele rezidente adulte, inclusiv fibroblastele gingivale și cele din
ligamentul dento-alveolar, sunt capabile să sintetizeze enzime proteolitice, cum ar fi
MMP, și inhibitorii lor, TIMP, în condiții normale 102, 103.
Țesuturile parodontale sunt supuse unui stres mecanic continuu și susceptibile
la distrucții din cauza produșilor biofilmului bacterian, a citokinelor proinflamatoare și
enzimelor proteolitice secretate de celulele inflamatoare și celulele rezidente103. În
tisulară
plus, anumiți factori toxici, cum ar fi nicotina, amplifică distrucțiile tisulare asociate
bolii parodontale. Numeroase studii in vitro au demonstrat că nicotina inhibă
proliferarea fibroblastelor gingivale și influențează diferențierea miofibroblastelor 104,
105, 106 însă mecanismele patogenetice care stau la baza efectului citotoxic al nicotinei
nu sunt pe deplin cunoscute.

În boala parodontală, aplicarea topică a unor agenți terapeutici cu efect asupra
celulelor stem rezidente, capabili să moduleze formarea de radicali liberi intracelulari
și activarea enzimelor proteolitice, ar putea fi luată în considerare ca metodă adjuvată
a tratamentului convențional.
2.1. Izolarea și caracterizarea celulelor stem mezenchimale de

la nivelul țesuturilor parodontale umane
2.1.1. Metode de prelevare și prelucrare a țesuturilor parodontale
umane în vederea obținerii celulelor stem mezenchimale
Procedurile de prelevare a țesuturilor parodontale au fost conforme cu
standardele etice ale comisiilor de cercetare instituțional și național, cu Declarația de la
Helsinki, din 1964 și cu ultimele amendamente sau standarde etice corespunzătoare.
Protocolul clinic a fost aprobat de Comisia de Etică a Universității de Medicină și
Farmacie “Iuliu Hatieganu”, Cluj-Napoca (343/2.10.2014). Pacienții au confirmat
participarea la acest studiu prin semnarea unui consimțământ informat. Grupul de
studiu a inclus 4 pacienți cu vârste cuprinse între 18 și 58 de ani, care nu prezentau
comorbidități și nici procese patologice sau infecțioase asociate dinților. Țesuturile
parodontale au fost recoltate de la nivelul dinților indicați pentru extracție în scop
ortodontic sau terapeutic.
În vederea utilizării celulelor stem parodontale umane în studii in vitro, am luat
în considerare următoarele aspecte: (i) specimenele prelevate au reprezentat țesuturi
lipsite de procese patologice, de dimensiune corespunzătoare care să permită
obținerea unui număr semnificativ de celule; (ii) am folosit metode standardizate
pentru izolarea, propagarea în cultură și stocarea celulelor, precum și medii de cultură
specifice; (iii) celulele au fost caracterizate fenotipic prin imunocitochimie și
citometrie în flux, și genetic prin Real-Time Polymerase Chain Reaction (RT-PCR); (iv)
am testat capacitatea celulelor de a se diferenția înspre lineajele osteogenic,
condrogenic și neurogenic.
Țesuturile parodontale prelevate au fost: gingia, ligamentul gingival, ligamentul
parodontal și osul alveolar. După prelevare, specimenele tisulare au fost introduse în
tuburi Falcon de 50 ml cu mediu de cultură simplu pentru celule stem mezenchimale:
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F-12) 1:1 cu 10%
ser fetal bovin (Fetal Calf Serum – FCS), 1% antibiotice (Penicilină și Streptomicină),
1% L-Glutamină, 1% aminoacizi ne-esențiali (Non-essential amino acids – NEA) și au
fost păstrate la 4°C până în momentul prelucrării 100, 101, 107.
În laborator, fragmentele de țesut au fost spălate cu soluție fostfat salină
tamponată (Phosphate Buffered Saline – PBS) pentru îndepărtarea mediului în care au
fost păstrate. Apoi, specimenele au fost dezinfectate cu alcool 70% timp de 15 sec. și
spălate cu PBS pentru neutralizarea efectului alcoolului.
Prelucrarea mecanică a fost diferită, în funcție de tipul de țesut. Pentru
țesuturile moi, prelucrarea a constat în fragmentarea cu foarfeci sterile, după care
fragmentele au fost introduse în tuburi Falcon de 15 ml, în mediu de cultură, și

centrifugate la 1100 rotații/min timp de 7 minute. În cazul țesutului osos dur,
fragmentarea s-a făcut cu cleștele „ciupitor de os”, iar fragmentele au fost suspendate
în FCS pe plăci Petri și menținute timp de 2 ore în incubator la 37°C, în atmosferă cu
5% CO2 și grad de umiditate 99%107.
În continuare, pentru izolarea celulelor stem mezenchimale, s-a folosit metoda
explantului: fragmentele tisulare au fost păstrate în mediu de cultură complet pentru
celule stem mezenchimale, în atmosferă umedă și 5% concentrație de CO2. Mediul de
cultură complet pe care l-am folosit a avut următoarea compoziție: DMEM 4500 cu
conținut ridicat de glucoză/F-12 HAM în proporție de 1:1, suplimentat cu 20% FCS,
2mM L-Glutamină, 1% NEA, 1% antibiotice (Penicilină 100 U/ml și Streptomicină 100
µg/ml), 55 μM beta-mercaptoetanol, 1 mM piruvat de sodiu. Apariția celulelor migrate
din explant și aderate la baza flask-urilor a fost urmărită zilnic. Aceste metode au fost
publicate în capitolul de carte: Ilea A. et al., 2016.
2.1.2. Tipuri de celule stem mezenchimale derivate din țesuturile
parodontale umane
Cele patru tipuri de celule stem mezenchimale obținute din țesuturile
parodontale umane au fost: celulele din corionul gingival (Gingival Tissue Stem Cells –
GTSCs), celulele din ligamentul gingival (Gingival Ligament Stem Cells – GLSCs),
celulele din ligamentul parodontal (Periodontal Ligament Stem Cells – PDLSCs) și
celulele din osul alveolar (Alveolar Bone Stem Cells – ABSCs).
GTSCs au fost izolate din fragmente de gingie care au cuprins marginea gingivală
liberă, recoltată prin gingivectomie în urma unei extracții alveoloplastice. GLSCs au fost
izolate din ligamentul gingival reprezentat de fibrele ligamentare dento-gingivale și
circulare de la nivelul coletului dentar. PDLSCs au fost izolate din ligamentul
parodontal care a cuprins fibrele ligamentare dento-alveolare din treimea medie a
rădăcinii. Ligamentele gingival și parodontal au fost detașate de pe suprafața dintelui
prin raclare cu ajutorul unei chiurete parodontale Gracey. ABSCs au fost izolate din
septul osos inter-radicular 100, 101, 107.
În cultura primară, GTSCs au apărut după 8 zile, GLSCs și PDLSCs au fost
identificate după 5 și respectiv 6 zile, iar ABSCs au apărut după 11 zile (Fig. 9).
tisulară
Fig. 9. Aspectul celulelor stem parodontale umane în cultura primară, la microscopul cu
fază inversată: A – celulele din corionul gingival (GTSCs); B – celulele din ligamentul gingival
(GLSCs); C – celulele din ligamentul parodontal (PDLSCs); D – celulele din osul alveolar (ABSCs)
Un aspect particular a fost observat în cultura primară de ABSCs. Odată cu
dezvoltarea celulelor, pe suprafața recipientului au apărut depozite amorfe de
precipitat cu dimensiune variabilă și de culoare alb-sidefie. Examinate la microscopul
optic cu obiectivele de 20x și 40x, precipitatele au prezentat o structură cristalină (Fig.
10A și 10B). Examinarea la microscopul electronic de baleiaj și analiza EDAX (Energy-
dispersive X-ray spectroscopy analysis) au relevat faptul că structura depozitelor era
formată din cristale de clorură de Na (NaCl), care au precipitat pe substratele organice
reprezentate, probabil, de proteinele din matricea osoasă (Fig. 10C, 10D și 10E). La
pasajele următoare, aceste depozite nu s-au mai observat 108. Aceste rezultate au fost
publicate în lucrarea Ilea A et al, 2019108.
Fig. 10. A și B – aspectul precipitatelor în cultura primară de celule stem mezenchimale

din osul alveolar (ABSCs) la microscopul cu fază inversată; C – aspectul precipitatelor în
microscopie electronică de baleiaj (500 µm); D – cristalele de material precipitat au o
arhitectură care sugerează NaCl – microscopie electronică de baleiaj (5 µm); E – analiza EDAX
(Energy-dispersive X-ray spectroscopy analysis) pentru cuantificarea elementelor prezente în
precipitatele din cultura celulară
Ulterior apariției primelor celule migrate din explant, proliferarea celor patru
tipuri de celule a fost intensă, astfel că a fost atinsă subconfluența după 21 de zile
pentru GTSCs, 9 zile pentru GLSCs, 15 zile pentru PDLSCs și 18 zile pentru ABSCs,
moment în care a fost realizat primul pasaj. Mediul a fost schimbat la 3 sau 4 zile, iar
după atingerea confluenței celulelor pe flask, acestea au fost repasate. Celulele au
prezentat morfologie de tip fibroblastic (Fig. 11) și au fost realizate pasaje succesive
pentru propagarea în culturi.
Fig. 11. Aspectul celulelor stem parodontale umane la primul pasaj, la microscopul cu
fază inversată: A – celulele din corionul gingival (GTSCs); B – celulele din ligamentul gingival
(GLSCs); C – celulele din ligamentul parodontal (PDLSCs); D – celulele din osul alveolar (ABSCs)
Celulele și-au menținut rata de proliferare crescută și la pasaje avansate. Pe

măsură ce au devenit mai numeroase, celulele au fost împărțite în proporție de 1:3 și
păstrate la gheață, la -80°C sau în azot.
2.1.3. Metode de caracterizare a celulelor stem mezenchimale din
parodonțiul uman
Caracterizarea celulelor stem mezenchimale presupune investigarea expresiei
unor antigene specifice denumite markeri, care se găsesc fie pe suprafața celulei –
markeri de suprafață, fie în interiorul celulei – markerii intracelulari.
Conform Societății Internaționale de Terapie Celulară, criteriile minimale pentru
definirea celulelor stem multipotente mezenchimale sunt următoarele: (i) capacitatea
de a adera la suprafețele de plastic în condiții standard de cultură; (ii) expresia în
proporție de peste 95% pentru markerii: CD73 (Cluster of Differentiation), CD90 și
CD105 și lipsa de expresie a CD45, CD34, CD14 sau CD11b, CD79alfa sau CD19 și
moleculele de suprafață HLA-DR; (iii) posibilitatea de a se diferenția in vitro în
osteoblaste, adipocite, condroblaste sau celule neuronale 109.
Moleculele de diferențiere CD (cluster of differentiation), SSEA-1 (Stage-Specific
Embryonic Antigen - 1) și fosfataza alcalină (Alkaline phosphatase – ALP) sunt markeri
de suprafață. Alături de aceștia, sunt descriși și factori de transcripție, cum ar fi: Nanog,
Oct ¾ ș i Sox-2, care indică stadiul nediferențiat al celulelor stem mezenchimale.
2.1.3.1. Caracterizarea fenotipică prin immunocitochimie și citometrie în flux
Cele patru tipuri de celule stem mezenchimale izolate din țesuturile parodontale
au fost caracterizate prin colorații imunocitochimice utilizând următorii anticorpi:
CD34 Fluorescein isothiocyanate (FITC), CD44 FITC, CD29 Phycoerythrina (PE), CD49e
PE, CD45 FITC, CD117 PE, CD29 PE, SSEA-1 FITC, Sox-2 FITC, Oct ¾ FITC, Nanog FITC
și ALP FITC.
Celulele au fost cultivate pe lame cu godeuri în număr de 20×104 celule/godeu.
După 48 h, celulele au fost fixate cu soluție 4% de formaldehidă diluată cu PBS. Celulele
tisulară
au fost permeabilizate prin tratare cu soluție 0,1% de Triton X-100 diluată cu PBS timp
de 20 min. la temperatura camerei. Prentru blocarea legării nespecifice a anticorpilor,
s-a folosit soluția 10% de albumină serică bovină (BSA – Bovine Serum Albumine)
diluată cu PBS timp de 20 min. la temperatura camerei. În continuare, legarea
anticorpilor a fost realizată prin incubarea celulelor la întuneric și 4°C timp de 60 min.
în prezența anticorpilor primari, urmată de trei spălări cu PBS. Apoi, celulele au fost
incubate cu anticorpii secundari (la o diluție de 1:50) timp de 45 min. la temperatura
camerei. Nucleii au fost colorați cu mediul de montare DAPI (4',6-Diamidine-2'-
phenylindole dihydrochloride). Celulele au fost examinate cu un microscop Zeiss
Axiovert cu fază inversată, în fluorescență, utilizând filtre de 488 nm, 360 nm, și 560
nm. Imaginile au fost preluate cu o cameră AxioCam MRC. Celulele au prezentat
expresie pentru markerii specifici de celule stem mezenchimale: SSEA-1, Sox-2, Oct ¾,
Nanog, ALP, CD44, CD73, CD29, și CD 49e. Celulele nu au exprimat CD117, CD34 și
CD45.
Expresia markerilor a fost investigată și prin citometrie în flux. Celulele, în
număr de 10 x 105 au fost imunomarcate cu: CD34 FITC, CD44 FITC, CD29 PE, CD49 PE,
CD117 PE, CD73 PE și CD45 FITC. Pentru probele de martor negativ, celulele au fost
incubate cu IgG1 FITC și IgG1 PE. Expresia markerilor a fost evaluată cu un citometru
în flux BD FACS Canto II – 6, utilizând soft-ul BD FACS Diva, versiunea 6.1.3.
Rezultatele au fost similare celor de la citometria în flux; celulele au exprimat, în
proporție variabilă, markerii: CD44, CD73, CD29, și CD49, dar nu au prezentat expresie
pentru: CD117, CD34 și CD45 (Tabelul IV)101.
Tabelul IV. Expresia markerilor în celulele stem mezenchimale derivate din

parodonțiul uman determinată prin citometrie în flux
Procentul de expresie a markerilor
Celule
CD44 CD73 CD29 CD49 CD117 CD34 CD45
GTSCs 79,2% 85,9% 71,7% 79,1% 1,9% 0,5% 0,8%
GLSCs 93,4% 96,8% 93,1% 91,1% 2,4% 0,5% 0,8%
PDLSCs 90,6% 97,0% 93,5% 92,3% 1,0% 0,7% 1,3%
ABSCs 91,1% 94,8% 50,2% 89,2% 0,8% 0,1% 0,1%
GTSCs – celulele derivate din corionul gingival; GLSCs – celulele derivate din ligamentul
gingival; PDLSCs – celulele derivate din ligamentul parodontal; ABSCs – celulele derivate din osul
alveolar
2.1.3.2. Caracterizarea genetică

Caracterizarea genetică a celulelor a utilizat metoda RT-PCR pentru a demonstra
expresia genelor care codifică markerii specifici celulelor stem mezenchimale și care
susțin diferențierea acestor celule înspre anumite lineaje. Genele investigate au fost:
proteina morfogenetică osoasă 4 (BMP4 – Bone Morphogenetic Protein 4), factorul
neurotrofic derivat din creier (BDNF – Brain-Derived Neurotrophic Factor), Noggin,
Nanog, Sox-2, Rex-1 și Oct ¾.
Celulele au fost tratate cu soluție TRIzol și procesate pentru extracția ARN prin
metoda clasică cu fenol-cloroform. Pentru analiza cantitativă a ARN-ului extras din cele
patru tipuri de celule a fost utilizat spectrofotometrul NanoDrop ND-1000 și pentru
analiza calitativă s-a folosit bioanalizorul Agilent 2100. Pentru determinările
ulterioare, au fost selectate doar probele de ARN cu numărul de integritate (RIN – RNA
integrity number) mai mare de 8. Pentru fiecare probă, s-a realizat sinteza de ADN
complementar – cADN, folosind 500 ng de ARN total, cu kit-ul Transcriptor First Strand
cDNA Synthesis, conform protocolului indicat de producător. Probele de cADN diluate
în proporție de 1:10 au fost amplificate pentru fiecare genă cu kit-ul LightCycler
TaqMan Master în aparatul LightCycler 480 Roche Instrument. Valorile Ct calculate cu
metoda Absolute Quantification/Second Derivative max și nivelul de expresie a fiecărei
gene au fost recalculate cu metoda 2-Ct. Genele cu valoarea Ct mai mare de 35% au fost
interpretate ca având expresie negativă 101.
Analiza genetică a comparat celulele stem parodontale cu celulele stem
mezenchimale din corionul placentar și cu osteoblastele din țesutul osos uman. RT-
PCR a indicat expresia Oct ¾ în GTSCs, GLSCs și ABSCs, expresia Sox-2 în PDLSCs,
expresia BDNF și Nanog în toate tipurile celulare, expresia Noggin în GLSCs, PDLSCs și
ABSCs, expresia BMP4 în GLSCs (Tabelul V)
Tabelul V. Expresia genică a markerilor în celulele stem mezenchimale derivate

din parodonțiul uman determinată prin RT-PCR
Procentul de expresie a markerilor
Celule
Noggin Nanog Sox-2 BMP4 BDNF Oct ¾ Rex-1
GTSCs negativ 33,64% negativ negativ 28,88% 34,18% negativ
GLSCs 30,61% 32,68% negativ 34,47% 26,33% 32,99% negativ
PDLSCs 33,75% 26,35% 32,01% negativ 26,35% negativ negativ
ABSCs 32,59% 29,34% negativ negativ 27,12% 30,09% negativ
GTSCs – celulele derivate din corionul gingival; GLSCs – celulele derivate din ligamentul
gingival; PDLSCs – celulele derivate din ligamentul parodontal; ABSCs – celulele derivate din osul
alveolar; BMP4 – proteina morfogenetică osoasă 4, BDNF – factorul neurotrofic derivat din
creier
2.1.3.3. Capacitatea de diferențiere înspre lineajele condrogenic, osteogenic și
neurogenic
Una dintre caracteristicile celulelor stem mezenchimale este capacitatea de a se
diferenția înspre tipuri celulare adulte, în condițiile cultivării pe anumite medii
inductoare, care conțin factori de creștere specifici.
Pentru diferențierea osteogenică, cele patru tipuri de celule au fost inițial
cultivate pe mediu complet pentru celule stem mezenchimale timp de 24 h, iar apoi
mediul complet a fost înlocuit cu mediu osteogenic complex: DMEM cu conținut crescut
de glucoză/F12 HAM (proporție 1:1) suplimentat cu 10% FCS, 1% antibiotice
(Penicilină 100 U/ml și Streptomicină 100 µg/ml), 2 mM L-Glutamină, 1% NEA, 10 mM
β-glicerol fosfat, 50 μg/ml acid ascorbic, 10 nM dexametazonă, 10 ng/ml BMP2 (Bone
Morphogenetic Protein2). Mediul a fost schimbat la intervale de 2 – 3 zile, iar
concentrația de BMP2 a fost redusă progresiv, și apoi eliminată, pentru a favoriza
mineralizarea. Celulele au fost menținute în cultură timp de 10 zile.
Pentru diferențierea neurogenică, celulele au fost cultivate inițial pe mediul
complet pentru celule stem mezenchimale timp de 24 h, iar apoi mediul complet a fost
înlocuit cu mediul N1: DMEM cu conținut crescut de glucoză/F12 HAM (proporție 1:1),
1% antibiotice (Penicilină 100 U/ml și Streptomicină 100 µg/ml), 2 mM L-Glutamină,
1% NEA, 10 ng/ml factor epidermal de creștere (EGF – Epidermal Growth Factor), 10
tisulară
ng/ml factor de creștere al fibroblastelor (bFGF – basic Fibroblast Growth Factor) și
suplimente specifice pentru diferențierea neurogenică: N2 și B27. Celulele au fost
menținute în acest mediu timp de 2 zile, iar apoi mediul N1 a fost înlocuit cu mediul
N2: DMEM cu conținut crescut de glucoză/F12 HAM (proporție 1:1), 1% antibiotice
(Penicilină 100 U/ml și Streptomicină 100 µg/ml), 2 mM L-Glutamină, 1% NEA,
supliment N2, supliment B27, 0,5 mM IBMX (3-isobutil-1-methil-xanthine), 10mM
nicotinamidă, și 10 ng/ml factor de creștere nervoasă (NGF – Nerve Growth Factor), în
care celulele au fost menținute timp de 8 zile. Mediul a fost schimbat la intervale de 2 –
3 zile.
Pentru diferențierea condrogenică, celulele au fost cultivate pe plăci care nu
permit adeziunea și mențin celulele în suspensie. Mediul inductor a avut următoarea
compoziție: DMEM cu conținut crescut de glucoză/F12 HAM (proporție 1:1), 50 μg/ml
acid ascorbic, 10 nM dexametazonă, 1mM piruvat de sodiu, 10 ng/ml TGF-β3
(Transforming Growth Factor beta-3), 1% ITS (insulin, transferina, selenium). Celulele
au fost menținute în cultură timp de 10 zile.
După perioada de menținere în mediile inductoare specifice, celulele au fost
fixate cu 4% paraformaldehidă și diferențierea celulară a fost evaluată prin colorare
imunocitochimică cu anticorpi caracteristici pentru fiecare lineaj, inclusiv prin colorare
cu Alcian blue. Anticorpii primari folosiți au fost: pentru diferențierea osteogenică –
osteopontin (OP) anti-human mouse IgG1 și ALP anti-human mouse IgG1, diluție 1:50;
pentru diferențierea neurogenică: p-Nestin Texas red (TR), diluție 1:50, rabbit anti-
human IgG1anti – neurofilamente (NF) FITC, diluție 1:200 și rabbit anti-human
IgG1anti- GFAP (proteina glială fibrilară acidă - glial fibrillary acidic protein), diluție
1:200; pentru diferențierea condrogenică: anti-human rabbit 2A collagen FITC, diluție
1:50.
Metoda de colorație Alcian blue a fost următoarea: celulele au fost fixate cu 4%
paraformaldehidă, spălate de trei ori cu PBS, incubate timp de 30 min. cu soluție 1%
Alcian blue (1% Alcian blue 8 GX în soluție de acid acetic glacial 3%, ajustată la
pH=2,5); apoi, celulele au fost spălate cu PBS. Probele au fost examinate la microscopul
optic.
Rezultatele diferențierii osteogenice au indicat o expresie variabilă a OP și ALP,
în funcție de originea celulelor. GLSCs și PDLSCs au prezentat cea mai intensă expresie,
în timp ce GTSCs și ABSCs au prezentat o expresie mai redusă a OP și ALP, demonstrată
printr-un număr mai mic de celule colorate 101(Fig. 12).
Fig. 12. Imagini de miscroscopie optică în fluorescență a celulelor stem mezenchimale

parodontale imunomarcate pentru osteopontin (OP) – FITC și fosfataza alcalină (ALP) – FITC și
contracolorare a nucleilor cu DAPI, după 10 zile de inducere a diferențierii osoase; GTSCs –
celulele derivate din corionul gingival; GLSCs – celulele derivate din ligamentul gingival; PDLSCs
– celulele derivate din ligamentul parodontal; ABSCs – celulele derivate din osul alveolar;
Magnificație - 200x
Diferențierea neurogenică a demonstrat o expresie variabilă a markerilor

specifici neuronali în cele patru tipuri de celule. GTSCs, PDLSCs și ABSCs au prezentat o
expresie crescută a GFAP, dar GLSCs au avut o expresie mai redusă. GTSCs au fost
pozitive pentru p-Nestin, în timp ce GLSCs, PDLSCs și ABSCs au fost intens pozitive
pentru NF101 (Fig. 13).

parodontale imunomarcate pentru proteina glială fibrilară acidă (GFAP) – FITC, P-Nestin Texas
Red și neurofibrile (NF) – FITC și contracolorare a nucleilor cu DAPI; GTSCs – celulele derivate
din corionul gingival; GLSCs – celulele derivate din ligamentul gingival; PDLSCs – celulele
derivate din ligamentul parodontal; ABSCs – celulele derivate din osul alveolar; Magnificație -
200x
La diferențierea condrogenică, GLSCs au prezentat cea mai intensă expresie a

colagenului de tip 2A, în timp ce GTSCs, PDLSCs și ABSCs au avut un număr mai redus
de celule pozitive101 (Fig. 14.).

parodontale imunomarcate pentru colagen tip 2A – FITC și contracolorare a nucleilor cu DAPI;
tisulară
colorație Alcian blue; GTSCs – celulele derivate din corionul gingival; GLSCs – celulele derivate
din ligamentul gingival; PDLSCs – celulele derivate din ligamentul parodontal; ABSCs – celulele
derivate din osul alveolar; Magnificație - 200x
Rezultatele obținute la colorația cu Alcian blue nu au relevat pozitivitate pentru

niciunul dintre cele patru tipuri celulare101 (Fig. 14).
2.2. Mecanisme patogenetice induse de lipopolizaharidul de
Porphyromonas gingivalis și nicotină în celulele stem derivate din
parodonțiul uman
LPS-Pg este implicat în patogeneza parodontitei cronice prin două mecanisme
principale: activarea răspunsului imun și generarea stresului oxidativ 110. Activarea
răspunsului imun se produce prin semnalizarea receptorilor transmembranari toll-like
(TLRs – Toll-Like Receptors), în principal TLR2 și parțial TLR4, urmată de activarea
factorilor de transcripție cum ar fi Nuclear Factor-kappa B (NF-κB)110, 111. NF-κB
activat este translocat în nucleu și se leagă de gene țintă determinând creșterea
producerii chemokine, citokine proinflamatoare și enzime proteolitice cum sunt
MMPs 112. În plus, NF-κB este un factor redox-sensibil implicat în producerea de specii
reactive ale oxigenului și azotului (ROS/RNS) 113. Acumularea intracelulară a radicalilor
liberi generează stress oxidativ și alterează funcțiile celulelor stem parodontale,
inclusiv proliferarea, diferențierea sau adeziunea, și inițiază moartea celulară3, 114. La
nivel celular, stresul oxidativ determină disfuncții celulare prin alterarea lipidelor,
proteinelor și ADN-ului, care conduc la moartea celulară prin necroză, autofagie sau
apoptoză. Combinate, aceste mecanisme induc, în mod direct, distrucții tisulare
parodontale. În plus, rezorbția osului alveolar este inițiată de ROS care activează
moleculele de semnalizare intracelulare implicate în osteoclastogeneză 115.
Nicotina, principalul alcaloid din compoziția tutunului, influențează
interacțiunea dintre organismul gazdă și bacteriile parodontopatogene6, motiv pentru
care fumatul a fost asociat cu o incidență crescută a formelor severe ale bolii
parodontale, caracterizate prin rezorbția osoasă accentuată și reducerea volumului
osului alveolar nou format. Studii recente au demonstrat că efectul nociv al nicotinei
asupra parodonțiului are la bază multiple mecanisme: induce stres oxidativ,
influențează răspunsul inflamator local, și promovează distrucțiile tisulare prin:
inhibarea creșterii fibroblastelor gingivale și sintezei de colagen, favorizarea
colagenolizei și reducerea capacității osteoblastelor de a forma matrice extracelulară
mineralizată5, 6, 105, 106.
Colagenul este componenta majoră a matricii extracelulare în țesuturile
conjunctive care formează parodonțiul. Fibrele de colagen conferă anumite funcții
specifice gingiei, ligamentelor dento-alveolare și osului alveolar, iar liza colagenului
este esențial implicată în patogeneza bolii parodontale 116. Degradarea colagenului în
țesuturile parodontale este, parțial, rezultatul alterării interacțiunii dintre celulele
rezidente și matricea extracelulară, care implică producerea de citokine
proinflamatoare, enzime și factori de creștere. Secreția enzimelor proteolitice, în
special a MMPs, amplifică distrucțiile tisulare asociate parodontitei cronice 117, 118, 119.
MMPs reprezintă o familie largă de endopeptidaze care degradează proteinele
din matricea extracelulară; această familie de enzime cuprinde cinci grupe:
colagenazele, stromelizinele, matrilizinele, MMPs de tip membranar și alte MMPs.
MMP-2 (gelatinaza A) și MMP-9 (gelatinaza B) sunt enzime capabile să degradeze mai
multe tipuri de colagen (IV, V, VII, IX, and X), inclusiv colagenul denaturat (gelatina) și
proteinele matriceale non-colagene 120, 121. MMPs sunt secretate de celulele
inflamatoare (macrofage, polimorfonucleare și limfocite) și de celulele rezidente,
inclusiv celulele epiteliale, fibroblastele, și celulele endoteliale, sub influența
citokinelor proinflamatoare121, 122, 123.
Activitatea proteolitică a MMPs este contrabalansată de inhibitori endogeni
specifici, TIMPs (Tissue Inhibitors of Metalloproteinases)122. TIMPs se leagă de
situsurile active ale enzimei și compun complexe bimoleculare, astfel blocând activarea
MMPs prin autoliză118, 124. Așadar, echilibrul dintre MMPs și inhibitorii specifici este
esențial pentru remodelarea tisulară122, 102.
Majoritatea MMPs sunt secretate în formă inactivă, ca proenzime, și sunt
activate în mediul extracelular sau în proximitatea membranei celulare de către alte
MMPs (MMP-3) sau serin-proteinaze: tripsina, plasmina, cathepsina G și elastaza122.
În parodontita cronică, patogenii parodontali inițiază multiple căi de
semnalizare intracelulare, inclusiv JNK, p38, factorul nuclear-κB (NF-κB) și proteina
activatoare-1 (AP-1), ceea ce duce la secreția de MMPs 125, 126. Numeroase studii au
demonstrat creșterea nivelurilor și activarea MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-8, MMP-9,
MMP-14 în fibroblatele gingivale și din ligamentele dento-alveolare în răspuns la
lipopolizaharidele patogenilor Porphyromonas gingivalis și A. actinomycetemcomitans
127, 118, 128, 122, 125, 129. Mai mult, TIMP-1 poate fi degradat de supernatantul culturilor de
Porphyromonas gingivalis 118, 127.

În aceste condiții, TIMP nu este prezent în cantități suficiente pentru a reduce
nivelurile patologice ale MMPs 130. Astfel, dezechilibrul MMP/TIMP, care conduce la
degradarea intensă a colagenului, este unul dintre mecanismele patogenetice implicate
în parodontita cronică117, 116, 121, 102. Prin urmare, agenții terapeutici eficienți în
controlarea secreției MMPs și/sau în producerea de TIMP ar putea fi luați în
considerare ca opțiuni în terapia parodontală 131.
2.2.1. Efectul oxidant indus de lipopolizaharidul de Porphyromonas
gingivalis în culturile de celule stem parodontale
Într-un studiu in vitro, am investigat, în dinamică, producerea de radicali liberi
în patru tipuri de celule stem mezenchimale izolate din țesuturile parodontale umane
după stimularea cu LPS-Pg.
Pentru a urmări producerea de radicali liberi intracelulari, am folosit testul
clorometilfluorescein diacetat CM-FDA (Abcam). CM-FDA difuzează prin membrana
celulelor vii și mediază o reacție a glutation S-transferazei pentru a produce compuși
fluorescenți 132. Unitățile de fluorescență au fost măsurate la 485 nm excitație și 528
nm emisie cu un cititor de microplăci Biotek Synergy 2. Intensitatea fluorescenței din
fiecare godeu a fost interpretată ca un indicator al nivelurilor intracelulare ale
radicalilor liberi.
Cele patru tipuri de celule au fost cultivate pe plăci de 96 de godeuri (2x104
celule în 200 µl DMEM/godeu). După 24 h, celulele au proliferat și au atins
subconfluența. Mediul de cultură din godeuri a fost îndepărtat și s-au efectuat trei
spălări cu PBS îmbogățit cu Ca2+ și Mg2+. Apoi, 100 µl de soluție CM-FDA (5 µg/ml în
PBS cu Ca2+ și Mg2+) au fost adăugați în fiecare godeu și plăcile au incubate la întuneric,
37°C și 5% CO2 timp de cinci min. Soluția de CM-FDA a fost îndepărtată și plăcile au
fost spălate de două ori cu PBS. Apoi, în fiecare godeu s-au adăugat 100 µl de mediu de
tisulară
cultură și s-a efectuat prima citire, considerată ca moment inițial, la 0 min (0’). Ulterior,
s-a efectuat stimularea cu LPS-Pg (Invivogen).
Pentru stimularea cu LPS-Pg, soluția stoc de LPS-Pg în apă liberă de endotoxine
(1 mg/ml) a fost diluată pentru a obține cele șase doze folosite: L1=100 ng/ml, L2=250
ng/ml, L3=500 ng/ml, L4=1 µg/ml, L5=2,5 µg/ml și L6=5 µg/ml. Diluțiile de LPS-Pg au
fost adăgate în fiecare godeu, iar apoi plăcile au fost incubate la întuneric, la 37°C și 5%
CO2 timp de 15 min, pentru a iniția formarea de radicali liberi. În acel moment, a fost
efectuată cea de-a doua citire (15’). Apoi, plăcile au fost menținute la întuneric, la
gheață și au fost efectuate a treia citire (30’), a patra citire (45’) și a cincea citire (60’),
fiecare la un interval de 15 min, până la 60 min. Prin păstrarea plăcilor la 0°C, a fost
întârziată activarea mecanismelor redox. Toate valorile citite la 15’, 30’, 45’ și 60’ au
fost comparate cu momentul inițial 0’.
Datele au fost analizate cu GraphPad Prism 5 software (La Jolla, CA, SUA).
Nivelurile intracelulare ale radicalilor liberi și producerea secvențială de radicali liberi
a fost evaluată cu one-way ANOVA, urmată de testul de comparație Dunnet (p < 0,05).
Pentru comparațiile între dozele de LPS-Pg și între cele patru tipuri de celule s-au
utilizat two-way ANOVA și Bonferroni post-test (p < 0,05).
Pentru fiecare tip celular, au fost urmărite două aspecte: (1) nivelurile
radicalilor liberi intracelulari în funcție de doza de LPS-Pg și timpul determinării; (2)
evoluția în dinamică a producerii de radicali liberi intracelulari după stimularea LPS-
Pg. În plus, a fost comparat răspunsul celor patru tipuri de celule la LPS-Pg.
În toate cele patru tipuri de celule, stimularea cu LPS-Pg a indus o creștere
continuă și semnificativă a nivelurilor radicalilor liberi. Această creștere a fost mai
importantă când au fost utilizate doze mai mari de LPS-Pg și când timpul de expunere a
fost mai lung. Producerea de radicali liberi a fost mai pronunțată în primele 30 min,
urmată de o creștere mai discretă până la 60 min (Fig. 15). ABSCs au prezentat cel mai
intens răspuns, cu cele mai înalte niveluri de radicali liberi, iar GLSCs și PDLSCs au avut
cele mai scăzute niveluri; GTSCs au prezentat un răspuns intermediar la stimularea cu
LPS-Pg (Fig. 15; Tabelul VI).
Fig. 15. Evoluția nivelurilor radicalilor liberi intracelulari în cele patru tipuri de celule stem
parodontale umane după stimularea cu LPS-Pg. * - comparativ cu Ctrl. negativ; # - comparativ cu
0’ pentru LPS-Pg. *p<0.05; **p<0.01; ***p<0.001; #p<0.05; ##p<0.01; ###p<0.001 LPS-Pg,
lipopolizaharid de Porphyromonas gingivalis; GTSCs – celulele derivate din corionul gingival;
GLSCs – celulele derivate din ligamentul gingival; PDLSCs – celulele derivate din ligamentul
parodontal; ABSCs – celulele derivate din osul alveolar; L1, 100ngLPS-Pg/ml; L2, 250ngLPS-
Pg/ml; L3, 500ngLPS-Pg/ml; L4, 1µgLPS-Pg/ml; L5, 2.5µgLPS-Pg/ml; L6, 5µgLPS-Pg/ml
Cele patru tipuri de celule au prezentat niveluri semnificativ diferite ale

radicalilor liberi intracelulari, în funcție de doza de LPS-Pg și de timpul de expunere
(Tabelul VI).
Tabelul VI Nivelurile radicalilor liberi intracelulari în cele patru tipuri de celule stem
parodontale umane după stimularea cu LPS-Pg
Celule Moment Unități de fluorescență Media±SD
GTSCs Ctrl. L1 L2 L3 L4 L5 L6
Negativ 100ng/ml 250ng/ml 500ng/ml 1µg/ml 2.5µg/ml 5µg/ml
0’ 5936±302.7 6056±171.8 5851±71.58 5907±202.7 5972±167.7 5989±82.66 5942±194.6
15’ 5944±261.6 6155±185.4 6267±341.8 6343±361.1 6496±441.7 6612±191.0 6937±268.7

**#
30’ 6194±110.0 6408±170.7 6579±116.0 7076±73.90 7213±253.5 7438±223.9 7777±377.3

# *** ### ***## ***## ***###
45’ 6452±278.9 6682±314.3 7249±169.5 7267±28.71 7401±281.7 7617±125.0 8271±426.2
# ### **### **### ***### ***###
tisulară
60’ 6718±321.9 7300±372.2 7436±401.5 7737±418.4 8128±124.3 8212±749.1 8779±595.6
### ### ### *### **### ***###
GLSCs Ctrl. L1 L2 L3 L4 L5 L6
0’ 5936±302.7 6056±171.8 5851±71.58 5907±202.7 5972±167.7 5989±82.66 5942±194.6
15’ 5944±261.6 6155±185.4 6267±341.8 6343±361.1 6496±441.7 6612±191.0 6937±268.7

**#
30’ 6194±110.0 6408±170.7 6579±116.0 7076±73.90 7213±253.5 7438±223.9 7777±377.3
# *** ### ***## ***## ***###
45’ 6452±278.9 6682±314.3 7249±169.5 7267±28.71 7401±281.7 7617±125.0 8271±426.2
# ### **### **### ***### ***###
60’ 6718±321.9 7300±372.2 7436±401.5 7737±418.4 8128±124.3 8212±749.1 8779±595.6
### ### ### *### **### ***###
PDLSCs Ctrl. L1 L2 L3 L4 L5 L6
0’ 6004±120.5 6266±241.2 6263±182.5 6161±117.6 6289±215.8 6162±133.2 6193±100.2
15’ 6118±92.19 6536±123.7 6535±60.62 6779±291.5 6786±558.9 6982±358.4 7084±226.6

# ## * ## **#
30’ 6314±238.2 7085±139.3 7044±91.82 7264±258.0 7309±573.7 7294±196.1 7352±445.5

### ### * ### ** ** ### **#
45’ 6359±223.1 7167±123.5 7147±101.4 7271±107.8 7389±591.7 7383±202.0 7452±457.5
* ### * ### *### ** ** ### ** ##
60’ 6375±245.6 7152±131.6 7227±96.29 7300±107.1 7454±599.1 7450±196.4 7475±484.1
* ### * ### * ### ** ** ### ** ##
ABSCs Ctrl. L1 L2 L3 L4 L5 L6
0’ 10348±316.4 10375±553.2 10597±914.1 10788±865.2 10480±479.6 10396±450.7 10547±362.1
15’ 10511±436.8 11071±412.4 11135±665.4 11559±623.0 12018±490.0 12093±1439 12112±1265

# #
30’ 10606±194.9 12254±449.4 12257±695.7 12347±301.2 12772±526.9 13054±348.0 13331±488.0

** ## ** # ** ### ***## *** # *** ##
45’ 10751±130.4 12359±420.3 12397±696.6 12779±185.3 13240±875.3 13217±328.3 13594±1743
### # * ### * ## * ## **##
60’ 10708±480.2 12534±431.5 12668±741.1 12783±45.08 13335±833.4 13465±404.3 13758±656.6
** ### **## ** ### *** ## *** ## ***##
* - comparativ cu Ctrl. negativ; # - comparativ cu 0’ pentru LPS-Pg. *p<0.05; **p<0.01;

***p<0.001; #p<0.05; ##p<0.01; ###p<0.001 LPS-Pg, lipopolizaharid de Porphyromonas
gingivalis; GTSCs – celulele derivate din corionul gingival; GLSCs – celulele derivate din
ligamentul gingival; PDLSCs – celulele derivate din ligamentul parodontal; ABSCs – celulele
derivate din osul alveolar; L1, 100ngLPS-Pg/ml; L2, 250ngLPS-Pg/ml; L3, 500ngLPS-Pg/ml; L4,
1µgLPS-Pg/ml; L5, 2.5µgLPS-Pg/ml; L6, 5µgLPS-Pg/ml
Din punct de vedere clinic, țesuturile parodontale nu sunt în mod egal expuse și
afectate de LPS-Pg. În stadiile inițiale, endotoxina difuzează prin epiteliul sulcular în
corionul gingival și în ligamentul parodontal, ceea ce determină instalarea gingivitei.
Pe măsură ce boala parodontală progresează, LPS-Pg difuzează mai profund în spațiul
periodontal, afectând ligamentul parodontal și în osul alveolar adiacent.
Conform datelor actuale, acest studiu este primul care monitorizează
producerea în dinamică a radicalilor liberi intracelulari în patru linii de celule stem
mezenchimale parodontale umane în condițiile stimulării cu LPS-Pg.
Rezultatele noastre au indicat că LPS-Pg a indus o creștere a nivelurilor ROS
intracelulari dependentă de doză și de timp în cele patru linii celulare. Nivelurile
radicalilor liberi au fost mai mari la dozele mai mari și după o expunere mai
îndelungată. În primele 30 min s-a observat o creștere intensă a ROS, iar până la 60
min creșterea a fost treptată, probabil datorită activării mecanismelor antioxidante

celulare, care au contracarat producerea de radicali liberi.
Cele patru tipuri de celule parodontale au prezentat specificitate privind
producerea de ROS după stimularea cu LPS-Pg. Rezultatele au indicat faptul că ABSCs
și GTSCs au fost mai sensibile la LPS-Pg în timp ce GLSCs și PDLSCs au fost mai
rezistente. Aceste date sugerează că osul alveolar și țesutul gingival au mecanisme
redox mai puțin eficiente și au o capacitate mai redusă de adaptare la stresul oxidativ.
Astfel, producerea de radicali liberi intracelulari poate reprezenta un important
mechanism patogenetic în resorbția osoasă și în gingivită. În mod contrar, ligamentul
gingival și ligamentul parodontal par să fie mai bine adaptate la stresul oxidativ indus
de patogenii parodontali.
În concluzie, stimularea cu LPS-Pg a indus o creștere continuă, dependentă de
doză și de timpul de expunere a nivelurilor ROS intracelulari în GTSCs, GLSCs, PDLSCs
și ABSCs. În funcție de țesutul de origine, celulele stem mezenchimale parodontale
umane au prezentat răspunsuri specifice la stimularea cu LPS-Pg.
2.2.2. Efectul citotoxic indus de nicotină în culturile de celule stem
parodontale
Pentru acest studiu, au fost folosite cele patru tipuri celulare izolate din
parodonțiul uman: GTSCs (celulele din corionul gingival), GLSCs (celulele din
ligamentul gingival), PDLSCs (celulele din ligamentul parodontal) și ABSCs (celulele
din osul alveolar), conform protocolului descris în cadrul subcapitolului 2.1.
Celulele au fost cultivate pe plăci cu 96 de godeuri, în număr de 2x104 celule în
200 μl de mediu complet pentru celulele stem mezenchimale. După incubare timp de
24 h, celulele au atins o confluență de 75-80%, și au fost expuse la nicotină, timp de 24
h și 48 h. Din soluția stoc de nicotină (20 mM) au fost realizate nouă diluții seriate cu
apă liberă de endotoxine (în proporție de 1:1, 1:10, 1:50 și 1:100) iar concentrațiile
folosite în studiu au fost următoarele: N1=31,125 μM, N2=15,5625 μM, N3=6,225 μM,
N4=3,1125 μM, N5=1,55625 μM, N6=1,245 μM, N7=0,6225 μM, N8=0,31125 μM,
N9=0,155625 μM. Toate experimentele au fost desfășurate în triplicat101.
Pentru evaluarea efectului citotoxic al nicotinei, a fost utilizat testul 3-(4,5-
dimetiltiazol-2yl)-2,5- difeniltetrazoliumbromidă (MTT). După expunerea la nicotină,
mediul de cultură a fost îndepărtat și în fiecare godeu s-au adăugat 100μl soluție de
reactiv MTT (1 mg/ml în soluție Hanks fără fenol roșu). MTT este o sare de tetrazolium
care se transformă sub acțiunea oxidoreductazelor mitocondriale într-un compus
formazan colorat în violet. Astfel, celulele viabile se colorează și pot fi examinate la
microscopul optic. Cristalele de formazan sunt insolubile în soluție apoasă, așadar
DMSO a fost utilizat ca solvent pentru a obține o reacție de culoare. După 1h de
incubare la 37°C la întuneric, supernatantul din fiecare godeu a fost înlocuit cu 150 μl
de DMSO. Densitatea optică (optical density - OD) a fost măsurată la o lungime de undă
de 570 nm cu un cititor de plăci Biotek Synergy (Winooski, VT, USA) și a fost
interpretată ca un indicator al activității metabolice și viabilității celulare.
Examinarea histologică a celulelor a fost realizată cu un microscop optic cu fază
inversată Zeiss Axiovert D1 (Carl Zeiss International, GmbH, Germany), prevăzut cu un
condensator PlasDIC, cu obiectivul de 20X, iar imaginile au fost preluate cu o cameră
AxioCam MRC.
tisulară
Valorile OD din godeurile expuse la nicotină au fost comparate cu OD din
godeurile menținute în mediu fără nicotină. De asemenea, au fost comparate cele patru
tipuri de celule din punctul de vedere al răspunsului la nicotină. Analiza datelor s-a
realizat cu one-way ANOVA, urmată de testul de comparație multiplă Tukey (valoarea
p < 0,05), utilizând soft-ul GraphPad Prism 5 (La Jolla, CA, USA).
În studiul nostru, testul MTT a fost folosit pentru a evalua activitatea
mitocondrială prin care se poate determina, în mod indirect, viabilitatea celulelor. În
plus, colorația cu MTT permite vizualizarea celulelor în culturi la microscopul optic cu
fază inversată. Examenul microscopic a furnizat informații suplimentare privind
aspectele morfologice asociate morții celulare (modificarea formei celulelor și a
prelungirilor, prezența semnelor de autofagie), pentru explicarea mecanismelor
patogenetice care stau la baza efectului citotoxic al nicotinei.
Rezultatele acestui studiu au indicat că citotoxicitatea nicotinei a fost
dependentă de doză și de timpul de expunere. De asemenea, cele patru tipuri de celule
parodontale umane au avut un răspuns diferit la nicotină101.
Nicotina în concentrații mari (între 3,112 μM și 31,125 μM) a avut un efect
citotoxic intens, atât la 24 h cât și la 48 h asupra tuturor celulelor (Fig. 16). În schimb,
concentrațiile mai reduse au fost mai bine tolerate și au avut efecte diferite după 24 h
și 48 h, în funcție de tipul celular. La expunerea timp de 24 h, nicotina în concentrație
de 0,622 μM – 1,556 μM a redus discret viabilitatea GTSCs, GLSCs ș i PDLSCs; însă după
48 h, efectul a fost intens citotoxic101. Concentrațiile mici (între 0,155 μM ș i 0,311 μM)
nu au afectat celulele, ci au stimulat proliferarea. În schimb, ABSCs au fost intens
afectate de nicotină, atât în doze medii, cât și mici (între 0,3112 μM și 1,556 μM), după
24 h; însă, după 48 h, numărul de celule a devenit comparabil cu martorul. ABSCs au
prezentat o sensibilitate mai crescută față de nicotină, comparativ cu celelalte tipuri
celulare. GLSCs și PDLSCs au avut răspunsuri similare, iar GTSCs au fost mai rezistente
la efectul citotoxic al nicotinei (Fig. 16).
Fig. 16 Efectul citotoxic al nicotinei asupra celulelor stem parodontale umane după o expunere
de 24 h și 48 h; GTSCs – celulele derivate din corionul gingival; GLSCs – celulele derivate din
ligamentul gingival; PDLSCs – celulele derivate din ligamentul parodontal; ABSCs – celulele
derivate din osul alveolar; N1=31,125 μM, N2=15,5625 μM, N3=6,225 μM, N4=3,1125 μM,
N5=1,55625 μM, N6=1,245 μM, N7=0,6225 μM, N8=0,31125 μM, N9=0,155625 μM; OD –
densitatea optică; (*) – p<0,05; (**) – p<0,01; (***) – p<0,001.
La examenul microscopic, cele patru tipuri celulare au prezentat aspecte

histologice asemănătoare după expunerea la concentrații identice de nicotină. În
godeurile cu concentrații mari de nicotină (15,562 μM – 31,125 μM), celulele nu s-au
colorat cu reactivul MTT, ceea ce demonstrează absența celulelor viabile. Mai mult, nu
s-au observat modificări morfologice, sugerând moartea celulară imediată.
Concentrațiile intermediare (3,112 μM – 6,225 μM) au determinat moartea majorității
celulelor din godeuri. În celulele viabile după 24 h s-au observat modificări
morfologice și semne de autofagie, iar după 48 h aceste celule nu și-au mai păstrat
viabilitatea. Concentrațiile mai reduse (0,622 μM – 1,556 μM) au permis menținerea
viabilității după 24 h și 48 h, dar au indus autofagia în toate celulele. Concentrațiile cele
mai mici (0,155 μM – 0,311 μM) nu au afectat morfologia celulelor și nici nu s-au
observat vezicule de autofagie intracelulare. În schimb s-a remarcat o creștere a
densității celulare (Fig. 17).
Fig. 17 Aspectul în microscopie optică celulelor stem parodontale umane după expunerea la
nicotină timp de 24 h și 48 h; GTSCs – celulele derivate din corionul gingival; GLSCs – celulele
derivate din ligamentul gingival; PDLSCs – celulele derivate din ligamentul parodontal; ABSCs –
celulele derivate din osul alveolar; N1=31,125 μM, N2=15,5625 μM, N3=6,225 μM, N4=3,1125
μM, N5=1,55625 μM, N6=1,245 μM, N7=0,6225 μM, N8=0,31125 μM, N9=0,155625 μM;
Magnificație - 200x
tisulară
Aceste observații au confirmat faptul că autofagia este unul din mecanismele
patogenetice induse de nicotină la nivel celular. Autofagia este un proces alternativ de
catabolism celular care, în condiții normale, permite degradarea și reciclarea
organitelor sau incluziunilor intracelulare. Este totodată un mecanism asociat cu
moartea celulară programată, iar în condiții patologice, degradarea componentelor
celulare mediată de autofagozomi și lizozomi determină morbiditatea și moartea
celulară 133. În studiul nostru, apariția autofagiei sub efectul dozelor medii de nicotină
în celulele stem parodontale poate fi interpretată ca un proces de reparație pentru
menținerea viabilității celulare. Aceste rezultate au fost publicate în lucrarea Moga M
et al., 2016101.
Semnificația clinică a rezultatelor acestui studiu constă în faptul că celulele stem
mezenchimale din diversele nișe în cadrul parodonțiului au un rol esențial în
regenerarea tisulară, iar efectul citotoxic al nicotinei alterează turn-over-ul și funcțiile
țesuturilor parodontale. Ca o consecință, pacienții fumători sunt mai susceptibili la
distrucții severe ale parodonțiului și mai puțin receptivi la terapia parodontală. Un alt
aspect cu semnificație clinică este localizarea celulelor stem și modul în care țesuturile
parodontale sunt expuse la nicotină în timpul fumatului. Parodonțiul superficial,
inclusiv celulele din corionul gingiei și din ligamentele gingivale sunt în mod direct
afectate de nicotina din aerul inhalat, în schimb celulele din țesuturile parodonțiului
profund, cum sunt cele din ligamentele dento-alveolare sau din osul alveolar sunt
afectate în mod indirect, de nicotina care ajunge la acest nivel prin intermediul
afluxului sanguin.
Conform datelor din literatură, acesta este primul studiu care a comparat
citotoxicitatea indusă de diferite doze de nicotină asupra mai multor tipuri de celule
stem mezenchimale izolate din parodonțiul uman101. Rezultatele studiului nostru
susțin importanța instituirii unor mijloace terapeutice individualizate pentru o
abordare mai eficientă a bolii parodontale la pacienții fumători.
2.2.3. Efectul lipopolizaharidului de Porphyromonas gingivalis și
nicotinei asupra diferențierii osoase a celulelor stem derivate din
parodonțiul uman
Integritatea tisulară și regenerarea parodonțiului sunt asigurate de celulele
stem mezenchimale prezente în țesuturile parodontale. Bacteriile parodontopatogene
și substanțele toxice exogene exercită multiple efecte negative asupra funcțiilor
celulare și alterează capacitatea regenerativă a țesuturilor parodontale. Din acest
motiv, în cadrul inflamației cronice a parodonțiului, regenerarea și reparația nu se
desfășoară normal, ceea ce amplifică distrucțiile tisulare, inclusiv resorbția osului
alveolar. Reparația osoasă se pare că este asigurată de celulele stem prezente în osul
alveolar și în nișele adiacente, cum sunt: corionul gingival și ligamentul parodontal.
Scopul studiului nostru a fost investigarea modului în care LPS-Pg și nicotina
influențează diferențierea osoasă și potențialul osteogenic al celulelor stem
parodontale umane. Am evaluat diferențierea osoasă a celulelor stem parodontale
umane prin procesul de mineralizare utilizând colorația cu Alizarin red, care
evidențiază prezența depozitelor de calciu, și prin expresia unor markeri ai lineajului
osteogenic: osteopontina (OP) și osteocalcina (OC).
Cele 4 tipuri de celule stem parodontale umane au fost însămânțate pe plăci cu
96 de godeuri : 2×104 celule/godeu, în 200 µl/mediu complet pentru celule stem
mezenchimale, timp de 24 h. Apoi, mediul de cultură a fost înlocuit cu mediul

osteogenic simplu cu următoarea compoziție: DMEM cu conținut crescut de
glucoză/F12 HAM (proporție 1:1) suplimentat cu 10% FCS, 1% antibiotice (Penicilină
100 U/ml și Streptomicină 100 µg/ml), 2 mM L-Glutamină, 1% NEA, 10 mM β-glicerol
fosfat, 50 μg/ml acid ascorbic, 10 nM dexametazonă. Concomitent, a fost inițiată și
expunerea la LPS-Pg și nicotină.
Concentrațiile folosite în acest studiu au fost următoarele : pentru LPS-Pg -
L1=2.5 µg/ml, L2=5 µg/ml și L3=10 µg/ml, iar pentru nicotină - N1=2.5 µM, N2=5 µM
și N3=10 µM. Fiecare tip cellular a fost expus la cele 3 doze de LPS-Pg (L1, L2 și L3) și
respectiv la cele 3 doze de nicotină (N1, N2 și N3), precum și la combinațiile de LPS-Pg
+ nicotină: L1+N1, L2+N2 și L3+N3.
Pentru acest experiment a fost folosit mediul osteogenic simplu, fără a fi
adăugată proteina morfogenică osoasă BMP-4, întrucât într-un studiu anterior s-a
observat că aceasta inhibă formarea proteinelor osoase. Celulele au fost menținute în
cultură timp de 21 de zile, iar mediul a fost schimbat la fiecare 2 – 3 zile. Dozele de LPS-
Pg și nicotină au fost repetate de fiecare dată când mediul a fost schimbat. După 21 de
zile, celulele au fost fixate cu formaldehidă 4% și a fost evaluată diferențierea
osteogenică. Depozitele de calciu în matricea extracelulară au fost determinate prin
colorația cu Alizarin red, iar expresia proteinelor osoase OP și OC a fost investigată
prin colorații imunocitochimice. Experimentele au fost triplicate.
Alizarin red este un derivat al antrachinonei care formează cu calciul un
compus chelat colorat în roșu intens. Colorarea matricii extracelulare a fost observată
la un microscop cu fază inversată Zeiss Axiovert. În plus, depozitele de calciu au fost
evaluate cantitativ prin măsurarea densității optice a supernatantului din fiecare
godeu după tratarea cu clorură de cetilpiridinium (CPC). Intensitatea culorii a fost
înregistrată cu un cititor de plăci BioTeck Synergy 2 la lungimea de undă de 562 nm și
a fost interpretată ca un indicator al procesului de mineralizare.
Dozele mari de LPS-Pg au inhibat formarea depozitelor de calciu în culturile de
GTSCs, PDLSCs și ABSCs. Nicotina a inhibat semnificativ procesul de mineralizare în
culturile de ABSCs. Expunerea la combinația de LPS-Pg și nicotină a inhibat
semnificativ producerea de matrice extracelulară mineralizată în culturile de PDLSCs și
ABSCs, dar a stimulat procesul de mineralizare în cultura de GLSCs. (Fig. 18).
tisulară
Fig. 18. Efectul LPS-Pg și nicotinei asupra depunerii de matrice extracelulară mineralizată în
culturile de celule stem parodontale umane ; GTSCs – celulele derivate din corionul gingival;
GLSCs – celulele derivate din ligamentul gingival; PDLSCs – celulele derivate din ligamentul
parodontal; ABSCs – celulele derivate din osul alveolar; LPS-Pg - L1=2.5 µg/ml, L2=5 µg/ml și
L3=10 µg/ml ; nicotină - N1=2.5 µM, N2=5 µM și N3=10 µM ; OD – densitatea optică; (*) –
p<0,05; (**) – p<0,01; (***) – p<0,001
La comparația între tipurile celulare, s-a observat că GLSCs au prezentat cea

mai intensă mineralizare, în schimb ABSCs au fost cele mai afectate de expunerea la
nicotină și la combinația de LPS-Pg și nicotină (Fig. 19).
Fig. 19. Comparație între tipurile de celule stem parodontale umane privind depunerea de
matrice extracelulară mineralizată după expunerea la LPS-Pg și nicotină ; GTSCs – celulele
derivate din corionul gingival; GLSCs – celulele derivate din ligamentul gingival; PDLSCs –
celulele derivate din ligamentul parodontal; ABSCs – celulele derivate din osul alveolar; OD –
densitatea optică
Pentru imunocitochimia privind expresia proteinelor osoase au fost folosiți

anticorpi primari OP anti-human mouse IgG1 și OC anti-human mouse IgG1. După
legarea cu anticorpii secundari corespunzători IgG1 marcați Texas red pentru OP și
FITC pentru OC, probele au fost contracolorate cu DAPI pentru evidențierea nucleilor
și au fost examinate la un microscop cu fază inversată Zeiss Axiovert în fluorescență
utilizând filtrele de 488 nm și respectiv 546 nm. Imaginile au fost preluate cu o cameră
AxioCam MRC.
Rezultatele au indicat că, în GTSCs, dozele mari de LPS-Pg, toate dozele de
nicotină și combinația de LPS-Pg și nicotină au inhibat expresia OC. Nicotina crescut
expresia OP, cu intensitate mai mare la doza mai mică (Fig. 20).
Fig. 20. Expresia proteinelor osoase osteocalcină – OC - FITC și osteopontină – OP –

Texas red în celulele derivate din corionul gingival – GTSCs; LPS-Pg - L1=2,5 µg/ml, L2=5 µg/ml
și L3=10 µg/ml ; nicotină - N1=2,5 µM, N2=5 µM și N3=10 µM
În GLSCs, dozele mici de LPS-Pg și nicotina au crescut expresia OC, iar

combinația de LPS-Pg și nicotină în toate cele trei doze a crescut expresia OP (Fig. 21).
tisulară

Texas red în celulele derivate din ligamentul gingival – GLSCs; LPS-Pg - L1=2,5 µg/ml, L2=5
µg/ml și L3=10 µg/ml ; nicotină - N1=2,5 µM, N2=5 µM și N3=10 µM
În PDLSCs, toate tratamentele au scăzut expresia OC, însă dozele mici de LPS-
Pg, nicotina și combinația de LPS-Pg și nicotină au crescut expresia OP (Fig. 22).

Texas red în celulele derivate din ligamentul parodontal – PDLSCs; LPS-Pg - L1=2,5 µg/ml, L2=5
µg/ml și L3=10 µg/ml ; nicotină - N1=2,5 µM, N2=5 µM și N3=10 µM
În ABSCs, dozele mari de LPS-Pg și dozele mici de nicotină și combinația de

LPS-Pg și nicotină au crescut expresia OP, dar au inhibat expresia OC (Fig. 23).

Texas red în celulele derivate din osul alveolar – ABSCs; LPS-Pg - L1=2,5 µg/ml, L2=5 µg/ml și
L3=10 µg/ml ; nicotină - N1=2,5 µM, N2=5 µM și N3=10 µM
În concluzie, LPS-Pg și nicotina au influențat, în mod dependent de doză,

capacitatea de diferențiere osoasă a celulelor stem parodontale umane. În funcție de
originea lor, celulele au prezentat răspunsuri variate la expunerea la LPS-Pg și nicotină
în condițiile cultivării în mediul inductor osteogenic.
2.3. Eficiența terapeutică in vitro a antioxidanților naturali

Cunoștințele actuale privind patogeneza bolii parodontale au condus la
dezvoltarea unor concepte terapeutice noi, menite să contrabalanseze stresul oxidativ,
unul dintre mecanismele responsabile de distrucția țesuturilor parodontale7, 134.
Prin urmare, tot mai mare accent se pune pe terapia antioxidantă care constă în
administrarea locală a substanțelor farmaceutice sau fitochimice naturale capabile să
neutralizeze radicalii liberi și să prevină distrucțiile țesuturilor parodontale 135, 136.
2.3.1. Efectul curcuminei și epigallocatechin-gallate asupra
celulelor stem parodontale umane
Curcumina are o istorie îndelungată: a fost folosită în medicina Ayurvedică79.
Curcumina, un polifenol descris biochimic ca diferuloilmetan, este componentul
principal al turmericului, condimentul galben obținut din rizomii plantei Curcuma
longa 80.
EGCG este cea mai importantă dintre catechinele extrase din Camellia sinensis
137. Acest compus polifenolic și catechinele asociate sunt responsabile de efectele
benefice ale ceaiului verde 138, 139.

tisulară
Numeroase studii clinice, experimentale și in vitro au cercetat eficiența
curcuminei 84, 85 și EGCG 140, 141, 142 în terapia parodontală și le-au recomandat ca agenți
profilactici sau terapeutici siguri și fără efecte secundare.
Totuși, mecanismele de acțiune și efectul acestor substanțe asupra celulelor din
țesuturile parodontale sunt incomplet cunoscute.
Celulele stem sunt bine reprezentate în țesuturile parodontale, inclusiv în gingie,
ligamentele dento-alveolare și osul alveolar, și au un important potențial terapeutic 143.
Datorită capacității de proliferare și diferențiere, aceste celule joacă un rol esențial în
regenerarea țesuturilor afectate de progresia bolii parodontale143, 144.
Activarea răspunsului imuno-inflamator declanșat de bacteriile
parodontopatogene duce la creșterea nivelurilor de citokine, enzime și radicali liberi în
țesuturile parodontale7, 136. Acești factori care fac parte din mecanismele de apărare a
organismului gazdă față de patogeni sunt responsabile de distrucțiile tisulare
colaterale, care au ca rezultat liza ligamentelor parodontale, pierderea atașamentului
gingival, necroza cementului și rezorbția osului alveolar7, 134, 145.
Prin urmare, noile tendințe în terapia parodontală se concentrează pe
contracararea acestor mecanisme utilizând agenți de modulare a răspunsului gazdei,
prin administrarea sistemică sau locală a unor substanțe farmaceutice sau
fitochimice11, 146. Aceste substanțe sunt capabile să restaureze echilibrul biologic prin
controlul eliberării de cytokine pro-inflamatoare, prin blocarea activității enzimelor
sau prin neutralizarea radicalilor liberi11, 135.
Studiile clinice și experimentale au demonstrat că antioxidanții administrați
local, cum ar fi curcumina și EGCG, pot înlătura radicalii liberi din țesuturile
parodontale și astfel pot preveni distrucțiile tisulare cauzate de stresul oxidativ16, 17, 138,
147, 148, 85.
Totuși, aceste fitoterapeutice ar putea influența homeostazia locală prin

afectarea capacității regeneratoare a celulelor stem rezidente. Așadar, efectul in vitro al
substanțelor fitochimice asupra celulelor stem parodontale ar trebui evaluat înainte de
orice aplicații clinice.
În acest studiu, am investigat influența curcuminei și EGCG asupra viabilității și
proliferării celulelor stem parodontale umane izolate din ligamentul gingival,
ligamentul parodontal și osul alveolar inter-radicular100.
Celulele stem mezenchimale utilizate în acest studiu au fost izolate din
țesuturile parodontale prelevate chirurgical de la nivelul dinților extrași în scop
ortodontic. Din țesutul osos din septul inter-radicular al molarilor de minte au fost
izolate celulele stem ABSCs (Alveolar Bone Stem Cells). Din ligamentul gingival de la
nivelul zonei cervicale au fost izolate celulele stem GLSCs (Gingival Ligament Stem
Cells), iar din ligamentul parodontal din treimea medie a rădăcinii molarilor de minte
parțial sau complet erupți au fost izolate celulele stem PDLSCs (Periodontal Ligament
Stem Cells).
Protocolul de obținere a culturilor celulare a fost descris în sub-capitolul 2.1.
Pentru tratamentele celulare, au fost folosite următoarele extracte vegetale:
curcumina pudră ≥ 94% (conținut de curcuminoizi), ≥ 80% (curcumină) și EGCG pudră
≥ 80% achiziționate de la Sigma-Aldrich. Soluțiile stoc au fost preparate cu curcumină
în DMSO (5 mM), curcumină în alcool absolut (5 mM) și EGCG în apă liberă de
endotoxine (20 mM) Soluțiile stoc au fost diluate cu apă liberă de endotoxine în
vederea obținerii concentrațiilor folosite pentru tratamentele celulare.
Celulele au fost însămânțate pe plăci cu 96 de godeuri (2x104 celule în 200μl

DMEM/godeu); după 24h, celulele au atins confluența de 75-80%. Apoi, celulele au fost
tratate cu diluții seriate de curcumină în DMSO (la 2, 5, 10, 25, 50, 100, 150, 250, și 500
μM), sau curcumină în alcool (la 0,1, 0,5, 1, 5, 10, 25, 50, și 100 μM), sau EGCG în apă
liberă de endotoxine (la 0,1, 1, 5, 10, 25, 50, 75, 100 și 200 μM) timp de 24h. Pentru
tratamentul cu curcumină, soluțiile de 10% DMSO și 5% alcool au fost utilizate ca
martor (Ctrl). Toate experimentele au fost derulate în triplicat.
Efectul cytotoxic al curcuminei în DMSO, curcuminei în alcool și EGCG a fost
determinat cu testul MTT, conform protocolului descris în sub-capitolul 2.2.
S-a făcut, de asemenea, o examinare histologică: plăcile au fost examinate la un
microscop optic Zeiss Axiovert – iar imaginile au fost preluate cu o cameră AxioCam
MRC la magnificația de 200X.
Valorile au fost analizate cu GraphPad Prism 5 software (La Jolla, CA, USA).
Efectul cytotoxic al curcuminei în DMSO, al curcumin în alcool, și EGCG a fost evaluat cu
one-way ANOVA, urmată de Tukey’s Multiple Comparison Test (valoarea p <0,05).
Rezultatele privind citotoxicitatea curcuminei și EGCG au relevat efecte
dependente de doză asupra viabilității celor trei linii celulare studiate.
Tratmentele cu 10% DMSO și curcumină în DMSO în concentrație cuprinsă între
100 μM și 500 μM au redus semnificativ viabilitatea în toate cele trei linii celulare,
comparativ cu Ctrl și cu concentrațiile mai mici (p<0,01). În cazul GLSCs și PDLSCs,
dozele mai mici de curcumină în DMSO nu au avut un efect diferit față de Ctrl. Contrar,
în cazul ABSCs, concentrațiile de 2 μM până la 50 μM curcumină în DMSO redus
semnificativ viabilitatea celulară comparativ cu Ctrl (p<0,001). Totuși, concentrațiile
cuprinse între 2 μM și 25 μM au crescut semnificativ activitatea celulară în GLSCs
(p<0,001), PDLSCs (p<0,01) și ABSCs (p<0,05) în comparație cu concentrațiile de 100-
500 μM curcumină în DMSO (Fig. 24).
Fig. 24. Efectul solutiei de curcumină în DMSO asupra celulelor derivated in parodonțiul uman.
Comparație între doze. GLSCs – celulele stem derivate din ligamentul gingival; PDLSCs – celulele
stem derivate din ligamentul parodontal; ABSCs – celulele stem derivate din osul alveolar. OD –
Rezultatele examenului microscopic au indicat faptul că tratamentul cu

curcumină 100-500 μM în DMSO a determinat moartea celulară în toate cele trei linii.
În GLSCs și PDLSCs, soluția 50 μM de curcumină a determinat o reducere ușoară a
numărului de celule, în timp ce concentrațiile de curcumină în DMSO cuprinse între 2
μM și 25 μM au indus proliferarea. În ABSCs, concentrațiile de 2-50 μM au determinat o
reducere a numărului de celule comparativ cu Ctrl (Fig. 25).
tisulară
Fig. 25. Aspectul microscopic al colorației MTT care demonstrează efectul soluției de curcumină
în DMSO asupra celulelor stem parodontale umane 200X. GLSCs – celulele stem derivate din
ligamentul gingival; PDLSCs – celulele stem derivate din ligamentul parodontal; ABSCs – celulele
stem derivate din osul alveolar.
Tratamentul cu alcool 5% a determinat o creștere discretă a numărului de

GLSCs, dar a redus viabilitatea PDLSCs și ABSCs. În GLSCs, soluția de curcumină în
alcool 100 μM a redus semnificativ numărul de celule comparativ cu Ctrl (p<0,001).
Tratamentul cu curcumină în concentrație de 0,1 μM - 50 μM nu a avut un efect diferit
față de Ctrl, dar a crescut semnificativ viabilitatea celulară comparativ cu soluția 100
μM (p<0,001). În plus, concentrația de 50 μM curcumină în alcool a crescut
semnificativ proliferarea celulară comparative cu concentrațiile 10 μM și 5 μM
(p<0,05). În PDLSCs și ABSCs, nu au existat diferențe semnificative nici între Ctrl și
tratmente, nici între diferitele concentrații (Fig. 26).
Fig. 26. Efectul curcuminei dizolvate în alcool asupra celulelor derivate din parodonțiul uman.
Comparație între concentrații. GLSCs – celulele stem derivate din ligamentul gingival; PDLSCs –
celulele stem derivate din ligamentul parodontal; ABSCs – celulele stem derivate din osul
alveolar. OD – densitate optică; (*) – p<0,05; (**) – p<0,01; (***) – p<0,001.
Examenul microscopic a arătat că, în GLSCs, concentrația de 100 μM curcumină

în alcool a determinat o importantă moarte celulară, dar dozele mai mic au indus o
ușoară proliferare. În PDLSCs, concentrațiile de curcumină 0,5 μM – 100 μM au redus
numărul de celule, dar concentrația de 0,1 μM curcumină a indus o proliferare
asemănătoare cu Ctrl. În ABSCs, s-a observat o reducere a numărului de celule pentru
toate concentrațiile de curcumină (Fig. 27).
în alcool asupra celulelor stem parodontale umane 200X. GLSCs – celulele stem derivate din
În GLSCS, concentrațiile de EGCG 200 μM, 100 μM, 75 μM și 10 μM au indus o

proliferare semnificativă (p<0,05); celelalte concentrații nu au determinat diferențe
seminificative față de Ctrl. Nu au fost observate diferențe semnificative între
concentrațiile de EGCG. În PDLSCs, tratamentul cu EGCG a determinat o proliferare mai
puțin accentuată, dar nu au existat diferențe semnificative față de Ctrl, sau între
diferitele concentrații. În ABSCs, concentrația de 200 μM EGCG a crescut semnificativ
proliferarea celualră față de Ctrl (p<0,01), dar dozele mai mici nu au avut un efect
semnificativ. Totuși, concentrațiile de 0,1- 100 μM EGCG scăzut semniifcativ
proliferarea celulară comparativ cu concentrația 200 μM (p<0,001) (Fig. 28).
Fig. 28. Efectul EGCG asupra celulelor derivate din parodonțiul uman. Comparație între
concentrații. GLSCs – celulele stem derivate din ligamentul gingival; PDLSCs – celulele stem
derivate din ligamentul parodontal; ABSCs – celulele stem derivate din osul alveolar. OD –
densitate optică; (*) – p<0,05; (**) – p<0,01; (***) – p<0,001.
Examenul microscopic a indicat o ușoară creștere a numărului de GLSCs, la

concentrațiile mai mari de EGCG, dar în PDLSCs nu s-a observat un efect semnificativ.
În ABSCs, concentrația de 200 μM EGCG a indus proliferarea, dar concentrațiile mai
mici au determinat o scădere discretă a numărului de celule (Fig. 29).
tisulară
în alcool asupra celulelor stem parodontale umane 200X. GLSCs – celulele stem derivate din
Acest studiu a demonstrat că citotoxicitatea curcuminei și EGCG asupra celulelor

stem mezenchimale derivate din parodonțiul uman este dependentă de doză și de
originea celulelor.
Pentru tratamentele celulare, au fost preparate soluții utilizând curcumină sub
formă de pudră standardizată și EGCG liofilizat. Curcumina este lipofilică și insolubilă
în soluțiile apoase 149, 150, așadar au fost folosite DMSO și alcoolul ca solvenți pentru
pudra de curcumină. EGCG este solubil în apă, iar pentru prepararea soluțiilor utilizate
a fost folosită apa liberă de endotoxine.
În cadrul testului MTT au fost comparate densitățile optice ale godeurile cu
celule tratate cu Ctrl. – în care celulele sunt suspendate în DMEM, fără alt tratament – și
au fost comparate diferitele concentrații curcumină și respectiv EGCG. Pentru
curcumină, au fost utilizate două godeuri martor: 10% DMSO (DMSO Ctrl.) și 5% alcool
(Alcool Ctrl); aceste soluții au fost echivalente cu cele ami mari concentrații ale
solventului curcuminei (10% DMSO pentru 500 μM curcumină și 5% alcool pentru 100
μM curcumină), și au fost utilizate pentru a estima în ce măsură toxicitatea a fost
cauzată de solvent sau de curcumină. A fost comparată și toxicitatea celor doi solvenți,
pentru a stabili care este cel mai potrivit pentru tratamentele ulterioare. Curcumina în
DMSO la concentrații mari (100-500 μM) a avut un efect citotoxic semnificativ asupra
celor trei tipuri de celule. Citotoxicitatea a fost comparabilă cu cea a DMSO Ctrl.;
așadar, acest efect s-a datorat solventului.
Pe de altă parte, curcumina în alcool a fost mai puțin toxică: soluția 100 μM a
redus semnificativ viabilitatea GLSCs, dar a fost mai bine tolerată de PDLSCs și ABSCs.
Mai mult, Alcool Ctrl. nu a indus o diferență semnificativă privind viabilitatea celulară
comparativ cu Ctrl.
Rezultatele noastre au indicat că, pentru a utiliza concentrații mari de
curcumină, alcoolul este un solvent mai potrivit.
Concentrațiile mai mici de curcumină în DMSO și în alcool au fost discret diferite
de Ctrl, dar au indus efecte diferite, în funcție de tipul de celule.
GLSCs au fost afectate doar de concentrația 50 μM de curcumină în DMSO, în
timp ce concentrațiile de 2 μM – 25 μM curcumină în DMSO și 0,1 μM – 25 μM de
curcumină în alcool au stimulat proliferarea celulară; cea mai intensă prolieferare a
fost indusă de concentrația 50 μM curcumină în alcool. În cazul PDLSCs, concentrația
50 μM de curcumină în DMSO și concentrațiile 0,5 μM – 25 μM curcumină în alcool au
scăzut discret numărul celulelor, dar soluțiile 2 μM – 25 μM curcumină în DMSO și 0,1

μM curcumină în alcool au fost mai puțin toxice. ABSCs au fost cele mai vulnerabile,
astfel încât toate concentrațiile de curcumină în DMSO și în alcool au indus moartea
celulelor.
În schimb, tratamentul cu EGCG a determinat o creștere a viabilității și
proliferării celulare comparative cu curcumina. Dozele mari de EGCG au indus
proliferarea GLSCs și ABSCs, dar dozele mai mici nu au influențat semnificativ
viabilitatea celulară comparativ cu Ctrl.
Aspectele microscopice au fost concordante cu rezultatele testului MTT și au
furnizat informații suplimentare privind morfologia celulelor. Cristalele de formazan
prezente în mitocondriile celulelor viabile au permis stabilirea densității celulare și
apreciarea activității metabolice a celulelor. În godeurile tratate cu concentrații mai
mici de curcumină și cu concentrații mai mari de EGCG, celulele au prezentat o
densitate mai mare și au conținut numeroase mitocondrii în citoplasma perinucleară.
Celulele tratate cu doze mai mari de curcumină au suferit apoptoză, aspect sugerat de
absența mitocondriilor și alterarea morfologiei celulare.
În plus, cristalele de curcumină au fost observate în godeurile tratate cu
concentrațiile de 50 μM și 100 μM curcumină în alcool, și au fost absente în godeurile
cu concentrațiile mai mici de curcumină în alcool și în DMSO. Aceste observații au
demonstrat că DMSO a fost un solvent mai efficient pentru curcumină comparativ cu
alcoolul. Culoarea intensă de curcumină la concentrațiile mai mari a crescut OD și a
afectat rezultatele testului MTT, determinând rezultate nereale privind viabilitatea
celulelor. Examenul microscopic complementar a indicat că celulele tratate cu
concentrațiile 250 μM și 500 μM de curcumină în DMSO nu au fost viabile.
Pentru a fi eficiente in vitro, substanțele fitochimice trebuie să mențină
constantă activitatea metabolică a celulelor și să prevină atât apoptoza, cât și
proliferarea exagerată. Conform rezultatelor noastre, aceste concentrații ar trebui să se
încadreze între 1 μM și 5 μM pentru soluția de curcumină în alcool și respectiv între 5
μM și 25 μM pentru soluția de EGCG în apa liberă de endotoxine.
În concluzie, curcumina și EGCG au avut, in vitro, efecte dependente de doză
asupra celulelor stem derivate din parodonțiul uman. În concentrație mare, curcumina
a avut un efect citotoxic, iar EGCG a fost mai bine tolerat. Dozele mici de curcumină și
EGCG au indus o creștere sau o scădere discretă a proliferării și activității metabolice a
celulelor. În funcție de origine, celulele au prezentat răspunsuri selective: ABSCs au
fost cele mai sensibile la curcumină și EGCG, comparativ cu GLSCs și PDLSCs. Pentru
utilizarea unor concentrații mai mari de curcumină, alcoolul este un solvent mai
potrivit decât DMSO. Rezultatele acestui studiu au fost publicate în lucrarea Boșca AB
et al., 2015100.
Aceste rezultate susțin continuarea studiilor privind eficiența clinică a
curcuminei și EGCG ca adjuvanți în terapia parodontală.
producerii radicalilor liberi sub influența lipopolizaharidului de
Porphyromonas gingivalis în culturile de celule stem parodontale
umane
Pe baza premisei că stresul oxidativ reprezintă unul dintre mecanismele
patogenetice care conduc la distrucțiile tisulare parodontale, abordările terapeutice
tisulară
actuale se concentrează pe substanțele medicamentoase și fitochimice antioxidante
care neutralizează radicalii liberi, prevenind apariția leziunilor parodontale135.
Curcumina (CURC), principalul polifenol din planta Curcuma longa80 și
Epigallocatechin-3-gallat (EGCG), cea mai potentă catechină extrasă din Camellia
sinensis 137, s-au dovedit antioxidanți eficienți în diferite patologii15, 16, 151. Însă există
puține date privind efectul protector al acestor compuși împotriva stresului oxidativ
indus de patogenii parodontali în celulele stem parodontale.
În cadrul unui studiu in vitro, am investigat eficiența tratamentului cu CURC și
EGCG în modularea producerii de radicali liberi intracelulari în patru tipuri de celule
stem parodontale umane care au fost în prealabil stimulate cu LPS-Pg.
După stimularea cu cele șase doze de lipopolizaharid de Porphyromonas
gingivalis - LPS-Pg (L1-L6) conform protocolului descris la sub-sub-capitolul 2.2.1,
celulele au fost tratate cu CURC și EGCG (Sigma Aldrich).
Soluțiile stoc de CURC în etanol absolut (5 mM) și EGCG în apă liberă de
endotoxine (20 mM) au fost diluate cu apă liberă de endotoxine. Conform observațiilor
din studiile anterioare, am decis să utilizăm următoarele concentrații: CURC 12,5
µM/godeu și EGCG 50 µM/godeu.
Producerea de radicali liberi a fost evaluată prin metoda CM-FDA – conform
protocolului descris la sub-sub-capitolul 2.2.1.
După expunerea la LPS-Pg, CURC și EGCG au fost adăugate în godeuri, iar plăcile
au fost păstrate la întuneric și 0°C. Citirile au fost efectuate la fiecare 15 min, până la 60
min. Efectul CURC și EGCG a fost evaluat prin compararea unităților de fluorescență
înregistrate la 30 min, 45 min și 60 min cu valorile înregistrate la 15 min, care a fost
momentul initial al tratamentului cu CURC și EGCG, după stimularea cu LPS-Pg, luând
în considerare fluorescența intrinsecă a CURC 152, a fost utilizat și un control pentru
CURC (CURC-ctrl). De asemenea, a fost utilizat și un EGCG-ctrl. Toate experimentele au
fost realizate în triplicat.
Datele obținute au fost analizate cu GraphPad Prism 5 software (La Jolla, CA,
SUA). Nivelurile intracelulare ale radicalilor liberi și producerea secvențială de radicali
liberi au fost evaluate cu one-way ANOVA, urmată de testul de comparație Dunnet (p <
0,05). Pentru comparațiile între celulele netratate și cele tratate cu CURC și EGCG și
pentru comparațiile între cele patru tipuri de celule s-au utilizat two-way ANOVA și
Bonferroni post-test (p < 0,05).
Pentru fiecare tip celular, a fost urmărită evoluția în dinamică a nivelurilor de
radicali liberi intracelulari după stimularea LPS-Pg și tratamentele cu CURC și EGCG. În
plus, au fost comparate tratamentele cu CURC și EGCG și răspunsul celor patru tipuri
de celule la aceste tratamente.
La tratamentul cu CURC și EGCG, nivelurile radicalilor liberi intracelulari au fost
mai reduse, dar evoluția în dinamică a producerii de radicali liberi a urmat o curbă
similară stimulării cu LPS-Pg, în toate tipurile celulare (Fig. 30 și 31).
Cele patru tipuri de celule au prezentat niveluri de radicali liberi intracelulari
semnificativ diferite, în funcție de tratament și de timpul de expunere. La tratamentul
cu CURC și EGCG după stimularea cu LPS-Pg, ABSCs au prezentat cea mai semnificativă
reducere a nivelurilor de radicali liberi. GTSCs au fost mai sensibile la tratament,
comparativ cu GLSCs și PDLSCs. Nu a existat diferență semnificativă privind răspunsul
GLSCs și PDLSCs la CURC și EGCG după stimularea cu LPS-Pg (Tabelele VII și VIII).
În GTSCs, tratamentul cu CURC și EGCG a redus semnificativ nivelurile

radicalilor liberi intracelulari la stimularea cu dozele mari de LPS-Pg (L4, L5 și L6)
după 60 min. CURC și EGCG au avut efecte similare de inhibare a formării radicalilor
liberi în GTSCs. (Fig. 30 și 31; Tabelele VII și VIII).
În GLSCs, tratamentul cu LPS-Pg + CURC a redus semnificativ nivelurile
radicalilor liberi intracelulari la stimularea cu LPS-Pg în dozele L1, L2, L3, L4 și L5 dar
nu și pentru L6 (Fig. 30 ; Tabelul VII). La tratamentul LPS-Pg + EGCG, în GLSCs
nivelurile radicalilor liberi au scăzut semnificativ la diferitele momente urmărite. În
GLSCs, efectul inhibitor al EGCG asupra stresului oxidative a fost mai intens decât al
CURC (Fig. 31; Tabelul VIII).
În PDLSCs stimulate cu LPS-Pg, tratamentele cu CURC și EGCG au scăzut
semnificativ nivelurile radicalilor liberi la fiecare moment investigat. Nu au existat
diferențe semnificative între efectele CURC și EGCG asupra PDLSCs (Fig. 30 și 31;
Tabelele VII și VIII).
În ABSCs, după tratamentele cu LPS-Pg + CURC și LPS-Pg + EGCG, nivelurile
radicalilor liberi au scăzut semnificativ la toate dozele de LPS-Pg și în toate momentele.
Nu au fost diferențe semnificative între efectele LPS-Pg + CURC și LPS-Pg + EGCG
asupra ABSCs (Fig. 30 și 31; Tabelele VII și VIII).
mezenchimale derivate din parodonțiul uman după stimularea cu LPS-Pg și tratamentul cu
CURC. LPS-Pg, lipopolizaharid de Porphyromonas gingivalis; CURC – curcumină ; GTSCs - celulele
stem derivate din corionul gingival; GLSCs – celulele stem derivate din ligamentul gingival;
PDLSCs – celulele stem derivate din ligamentul parodontal; ABSCs – celulele stem derivate din
osul alveolar; L1, 100 ng LPS-Pg/ml; L2, 250 ng LPS-Pg/ml; L3, 500 ng LPS-Pg/ml; L4, 1 µg LPS-
Pg/ml; L5, 2,5 µg LPS-Pg/ml; L6, 5 µg LPS-Pg/ml
tisulară
Tabelul VII. Nivelurile radicalilor liberi intracelulari în cele patru tipuri de celule stem
mezenchimale derivate din parodonțiul uman după stimularea cu LPS-Pg și tratamentul
cu CURC 12.5 µM
Celule Moment Unități de fluorescență Media±SD
GTSCs CURC L1 L2 L3 L4 L5 L6
Ctrl. 100ng/ml 250ng/ml 500ng/ml 1µg/ml 2.5µg/ml 5µg/ml
0’ 6025±455.5 5982±169.2 6089±51.63 6090±63.72 5971±89.63 5973±244.9 5946±407.2
15’ 6055±335.4 6167±192.6 6281±99.14 6328±284.6 6418±223.1 6622±342.1 7092±258.8
30’ 6194±110.0 6385±140.8 6434±85.68 6658±573.2 7259±170.6 7328±202.3 7539±199.5

***## ***# ***
45’ 6452±278.9 6636±331.0 6818±226.0 7202±605.6 7386±129.2 7532±305.7 8185±107.5
*### **## ***##
60’ 6718±321.9 7243±191.5 7321±299.8 7536±301.3 7579±285.6 7818±120.5 8344±172.8
### *### **# **### ***## ***###
GLSCs CURC L1 L2 L3 L4 L5 L6
0’ 5954±151.7 6033±35.64 6076±17.44 6026±13.65 6059±34.56 6066±54.52 6079±65.04
15’ 6148±110.5 6147±59.50 6257±100.7 6513±245.8 6891±1149 6972±506.8 7159±206.1
30’ 6519±458.3 6569±407.3 7085±52.26 7277±40.15 7282±159.9 7518±57.38 7585±116.4

### ## ** ** ***
45’ 6633±458.0 6597±105.1 6833±164.0 7129±178.5 7461±329.5 8051±219.9 8009±104.5
## # ** ***## ***
60’ 6629±427.0 6748±159.7 6977±150.7 7027±235.5 7411±286.3 7657±104.3 7888±587.2
### # * **# **
PDLSCs CURC L1 L2 L3 L4 L5 L6
0’ 6079±346.9 6260±308.3 6202±148.1 6133±56.36 6176±62.75 6208±206.6 6234±240.7
15’ 5960±316.8 6525±73.06 6501±153.8 6714±216.4 6786±282.9 6933±252.6 7066±197.9
30’ 6314±238.2 6765±131.0 6946±166.5 7110±215.0 7191±92.14 7196±319.8 7247±150.8

**# ** *** *** ***
45’ 6359±223.1 6826±102.9 7042±150.6 7166±71.44 7260±232.1 7290±63.22 7388±158.4
*** # *** *** *** ***
60’ 6375±245.6 6777±242.3 7095±246.9 7104±203.3 7125±260.8 7202±204.3 7294±432.1
* # * * * **
ABSCs CURC L1 L2 L3 L4 L5 L6
0’ 10195±572.3 10474±107. 10396±436.2 10717±891. 10876±1610 10816±102 10041±125.
15’ 10317±55.3 11055±106 11241±235.3 11544±502. 12035±232.7 12081±375. 12181±205.
30’ 10606±194.9 11826±653. 11928±113.5 12158±130. 12356±194.5 12506±430. 12801±302.

** ***
** *** *** ***
45’ 10751±130.4 12146±259. 12293±823.8 12487±522. 12838±192.6 13098±364. 13291±519.
** *** ##
* ** ***# ***#
60’ 10708±480.2 12222±118. 12555±530.1 12627±401. 13081±206.6 13103±234. 13356±325.
*** # *** ###
*** *** # *** # *** ##
(*) - comparativ cu CURC Ctrl; (#) comparativ cu 15’ pentru tratamentul cu CURC. (*) p<0.05;
(**) p<0.01; (***) p<0.001; (#) p<0.05; (##) p<0.01; (###) p<0.001 LPS-Pg, lipopolizaharid de
Porphyromonas gingivalis; CURC – curcumină ; GTSCs - celulele stem derivate din corionul
gingival; GLSCs – celulele stem derivate din ligamentul gingival; PDLSCs – celulele stem derivate
din ligamentul parodontal; ABSCs – celulele stem derivate din osul alveolar; L1, 100 ng LPS-
Pg/ml; L2, 250 ng LPS-Pg/ml; L3, 500 ng LPS-Pg/ml; L4, 1 µg LPS-Pg/ml; L5, 2,5 µg LPS-Pg/ml;
L6, 5 µg LPS-Pg/ml
mezenchimale derivate din parodonțiul uman după stimularea cu LPS-Pg și tratamentul cu
EGCG. LPS-Pg, lipopolizaharid de Porphyromonas gingivalis; CURC – curcumină ; GTSCs - celulele
stem derivate din corionul gingival; GLSCs – celulele stem derivate din ligamentul gingival;
PDLSCs – celulele stem derivate din ligamentul parodontal; ABSCs – celulele stem derivate din
osul alveolar; L1, 100 ng LPS-Pg/ml; L2, 250 ng LPS-Pg/ml; L3, 500 ng LPS-Pg/ml; L4, 1 µg LPS-
Pg/ml; L5, 2,5 µg LPS-Pg/ml; L6, 5 µg LPS-Pg/ml
Tabelul VIII. Nivelurile radicalilor liberi intracelulari în cele patru tipuri de celule stem
mezenchimale derivate din parodonțiul uman după stimularea cu LPS-Pg și tratamentul
cu EGCG 50 µM
Celul Moment Unități de fluorescență Media±SD
e
GTSC EGCG L1 L2 L3 L4 L5 L6
s Ctrl. 100ng/ml 250ng/ml 500ng/ml 1µg/ml 2.5µg/ml 5µg/ml
0’ 5936±302.7 6006±333.3 6017±346.7 6051±289.2 5977±46.61 6041±246.6 6040±56.71
15’ 6051±213.0 6165±138.4 6247±235.4 6366±150.7 6471±269.9 6650±147.4 7023±154.8
30’ 6194±110.0 6323±125.5 6424±164.9 6614±345.2 7079±221.3 7479±370.7 7540±373.3

**# ***# ***
45’ 6452±278.9 6786±248.7 7009±166.0 7139±183.7 7242±55.01 7540±381.4 7980±260.6

# # *# **## ***# ***##
60’ 7618±321.9 7258±195.2 7378±213.4 7565±370.6 7579±159.4 7789±264.7 8361±97.70
## *## **## **### ***## ***###
GLSCs EGCG L1 L2 L3 L4 L5 L6
tisulară
0’ 5986±130.8 5963±164.0 6025±24.34 6055±33.87 6067±113.9 5923±194.9 6052±114.7
15’ 6143±56.45 6303±116.7 6422±331.2 6448±95.77 6788±227.4 7123±148.0 7178±207.7
30’ 6519±458.3 6759±101.9 6838±281.0 6768±201.5 7053±232.1 7204±482.6 7257±365.9
45’ 6633±458.0 6846±486.6 6982±290.8 7018±103.0 7173±246.3 7357±461.7 7509±427.9
60’ 6629±427.0 6938±695.7 7015±305.6 7074±149.0 7165±339.6 7367±439.2 7188±435.3
PDLS EGCG L1 L2 L3 L4 L5 L6
Cs Ctrl. 100ng/ml 250ng/ml 500ng/ml 1µg/ml 2.5µg/ml 5µg/ml
0’ 5937±201.6 6159±127.6 6086±70.88 6106±65.04 6230±205.2 6181±169.2 6133±171.6
15’ 5951±70.94 6485±49.39 6567±307.1 6774±43.65 6629±123.8 6947±19.73 6998±215.3
30’ 6314±238.2 6767±157.7 6865±327.0 7059±11.2 7154±118.7 7224±335.3 7238±565.5

* * *
45’ 6359±223.1 6805±144.4 6813±89.77 6826±151.6 6905±32.9 7166±547.5 7382±217.0
* **
60’ 6375±245.6 6620±172.4 6773±48.42 6976±103.7 7153±125.4 7171±574.0 7229±482.3
* * *
ABSC EGCG L1 L2 L3 L4 L5 L6
s Ctrl. 100ng/ml 250ng/ml 500ng/ml 1µg/ml 2.5µg/ml 5µg/ml
0’ 10185±231. 10307±398. 10567±250.1 10678±386.6 10881±777. 10328±949. 10550±620.

8 4 6 9 5
15’ 10444±209. 12015±125. 11272±829.7 11641±963.7 11109±252. 11928±460. 12103±263.
8 8 2 5 2
30’ 10606±194. 11914±562. 12048±43.19 12088±26.26 12399±1116 12708±622. 12935±1932
9 9 8
45’ 10751±130. 12256±1012 12309±311.4 12493±381.0 12945±153. 12974±178. 13206±292.
4 ** ** ** 0 6 6
*** *** ***
60’ 10708±480. 12302±1092 12525±437.8 12511±488.7 13110±265. 13104±505. 13307±435.
2 * ** ** 8 1 5
*** ** # ***#
(*) - comparativ cu EGCG Ctrl; (#) comparativ cu 15’ pentru tratamentul cu EGCG. (*) p<0.05;
(**) p<0.01; (***) p<0.001; (#) p<0.05; (##) p<0.01; (###) p<0.001 LPS-Pg, lipopolizaharid de
Porphyromonas gingivalis; CURC – curcumină ; GTSCs - celulele stem derivate din corionul
din ligamentul parodontal; ABSCs – celulele stem derivate din osul alveolar; L1, 100 ng LPS-
Pg/ml; L2, 250 ng LPS-Pg/ml; L3, 500 ng LPS-Pg/ml; L4, 1 µg LPS-Pg/ml; L5, 2,5 µg LPS-Pg/ml;
L6, 5 µg LPS-Pg/ml
În plus, EGCG a menținut niveluri ale radicalilor liberi mai reduse în toate liniile
celulare, comparativ cu CURC. Totuși, nu au existat diferențe semnificative între
tratamentele cu LPS-Pg + CURC și LPS-Pg + EGCG. (Tabelele VII și VIII)
Cele patru tipuri celulare au prezentat diferențe semnificative în funcție de
treatment și de timpul de expunere. La stimularea cu LPS-Pg și tratamentul cu CURC și
EGCG, ABSCs au prezentat cea mai important reducere a nivelurilor radicalilor liberi
comparativ cu celelalte tipuri celulare. GTSCs au fost mai sensibile decât GLSCs și
PDLSCs. Nu au existat diferențe semnificative între răspunsul GLSCs și PDLSCs la CURC
și EGCG după stimularea cu LPS-Pg (Tabelele VII și VIII).
Aceste aspecte ar putea fi explicate prin prisma observațiilor din studiile
precendente, care au indicat diferențele privind activitatea metabolică și răspunsul la
diferite substanțe, precum CURC, EGCG, LPS-Pg și nicotina 100, 101.
Studiul nostru este primul care a urmărit în dinamică nivelurile radicalilor
liberi intracelulari în patru linii de celule stem mezenchimale derivate din parodonțiul
uman pentru a evalua efectul antioxidant al CURC și EGCG după stimularea cu LPS-Pg.
CURC și EGCG au inhibat producerea de radicali liberi după stimularea cu LPS-Pg,

având un rol protector împotriva stresului oxidativ.
Întrucât LPS-Pg determină producerea de radicali liberi în celulele stem
mezenchimale derivate din parodonțiul uman, strategiile terapeutice ar trebui să se
concentreze pe inhibarea inițierii stresului oxidativ prin optimizarea sistemelor
antioxidante. Eficiența terapiilor antioxidante poate fi limitată de anumiți factori. În
primul rând, oxidanții endogeni au roluri fiziologice esențiale și astfel, nu ar fi benefică
inhibarea completă a producerii radicalilor liberi. În al doilea rând, antioxidanții
prezintă specificitate în funcție de oxidant, așadar sunt eficienți doar în neutralizarea
anumitor specii reactive implicate în mecanismele patogenetice. În plus, antioxidanții
nu pot restaura integritatea țesuturilor alterate de stresul oxidativ 153. Așadar, eficiența
terapeutică depinde de utilizarea agenților oxidanți potriviți, care sunt destinați
speciilor reactive specifice. De asemenea, dozele și durata tratamentului trebuie
stabilite în mod corect, în funcție de tipul de celule stem mezenchimale derivate din
parodonțiul uman: în zonele profunde ale pungilor parodontale, în contact cu osul
alveolar, ar trebui folosite doze mai mici; pe gingie, CURC și EGCG ar putea fi applicate
sub forma unor geluri mucoadezive cu o eliberare lentă a ingredientelor active. Pentru
aplicarea în pungile parodontale superficiale și în sulcusul gingival, antioxidanții pot fi
incluși în matrici biodegradabile care permit eliberarea lentă și gradual a substanței,
astfel asigurând concentrația optimă, pentru o perioadă de timp bine definită 154, 155.
În celulele stem mezenchimale umane studiate, după stimularea cu LPS-Pg și
tratamentul cu CURC și EGCG, ROS au continuat să fie produși, dar în cantitate mai
redusă față de celulele netratate, ceea ce sugerează un efect antioxidant. Totuși, au
existat diferențe privind eficiența tratamentului în diferitele tipuri celulare. EGCG a
controlat eficient producerea de radicali liberi în toate tipurie celulare, în timp ce
CURC a fost mai eficientă în GTSCs, PDLSCs și ABSCs. De asemenea, cele patru tipuri
celulare au avut răspunsuri diferite la CURC și EGCG. Tratamentul cu CURC și EGCG a
fost mai eficient în GLSCs și PDLSCs, dar ABSCs au fost cele mai afectate. GTSCs au
prezentat răspunsuri intermediare la CURC și EGCG. La compararea efectelor CURC și
EGCG, în tratamentul cu LPS-Pg + CURC, nivelurile ROS au fost discret mai mari
comparative cu LPS-Pg + EGCG, sugerând că EGCG ar putea fi un antioxidant mai
eficient decât CURC. Explicația ar fi că, datorită proprietății hidrofobe, moleculele de
CURC prezintă o captare celulară mai redusă154, în timp ce moleculele de EGCG sunt
hidrofile și au o rată de acumulare intracelulară crescută155. O altă explicație este că
EGCG neutralizează în mod efficient ROS, însă CURC contrabalansează alte mecanisme
patogenetice care sunt bazate pe interacțiuni complexe și prezintă ținte moleculare
cum ar fi: factori de transcripție, factori de creștere, proteinkinazele și citokinele
proinflamatoare16.
Rezultatele noastre au indicat că CURC și EGCG au fost bine tolerate de cele
patru tipuri de celule stem mezenchimale umane, și nu au indus apoptoza când au fost
utilizate în doze terapeutice. CURC și EGCG au redus producerea de radicali liberi
intracelulari sub influența LPS-Pg în celulele stem mezenchimale umane, exercitând un
rol protector împotriva stresului oxidativ. În funcție de origine, celulele stem
mezenchimale au prezentat răspunsuri specifice la stimularea cu LPS-Pg și la
tratamentul cu CURC și EGCG. Așadar, dezvoltarea unor terapii locale bazate pe
proprietățile CURC și EGCG ar putea optimiza rezultatele terapiei parodontale și ar
permite un management mai eficient al pacienților parodontopați.
tisulară
efectului citotoxic indus de nicotină în culturile de celule stem
Pentru acest studiu au fost selectate două doze de nicotină care să nu exercite
un efect citotoxic intens, ținând cont de rezultatele studiului anterior101, iar
concentrațiile de curcumină și EGCG folosite pentru tratarea celulelor au fost stabilite
pe baza observațiilor anterioare, astfel încât să nu inducă o proliferare marcată a
celulelor100.
Efectul protector al curcuminei și EGCG a fost interpretat prin menținerea
viabilității și proliferării celulelor stem mezenchimale umane, evaluate cu ajutorul
testului MTT.
Cele patru linii celulare (GTSCs, GLSCs, PDLSCs, ABSCs) au fost cultivate pe plăci
cu 96 de godeuri (2x104 celule ı̂n 200 μl mediu complet în fiecare godeu) ș i incubate
timp de 24 h pentru ca monostraturile de celule să ajungă la subconfluență. Ulterior,
celulele au fost tratate timp de 24 h și 48 h cu două doze de nicotină: N1 = 1,245 μM ș i
N2 = 0,31125 μM, corespunză toare concentrațiilor N6 ș i respectiv N8 din studiul
anterior101 și câte două doze de curcumină: C1 = 1 μM, C2 = 1,25 μM, respectiv EGCG:
E1 = 2 μM, E2 = 2,5 μM. Experimentele au fost efectuate ı̂n triplicat.
Testul MTT, efectuat conform protocolului descris anterior în cadrul sub-sub-
capitolul 2.2.2, a demonstrat efecte diferite ale tratamentului cu curcumină și EGCG la
expunerea la nicotină după 24 h și 48 h, în funcție de doză.
În cazul GTSCs, concentrația C2 de curcumină a crescut semnificativ (p<0,05)
viabilitatea celulară și a fost mai eficientă decât concentrația C1 (p<0,001) după 24 h
de expunere la doza N1 de nicotină. De asemenea, curcumina C1 a fost mai eficientă
decât concentrația E1 de EGCG (p<0,05) în cazul celulelor expuse la doza N2 de
nicotină, iar curcumina C2 a fost mai eficientă decât E2 asupra celulelor expuse la N1
(p<0,01) (Fig. 32). După 48 h, curcumina C2 a crescut semnificativ viabilitatea celulelor
expuse la dozele N1 (p<0,001) și N2 (p<0,001) și a fost mai eficientă decât concentrația
C1 (p<0,001) în cazul expunerii la N1(p<0,001) și decât concentrația E2 de EGCG în
cazul celulelor expuse la dozele N1 și N2 de nicotină (p<0,001) (Fig. 33).
Fig. 32. Efectul Curcuminei și EGCG asupra celulelor stem mezenchimale derivate din
parodonțiul uman expuse la nicotină timp de 24h. GTSCs - celulele stem derivate din corionul
din ligamentul parodontal; ABSCs – celulele stem derivate din osul alveolar; N1 = 1,245 μM ș i N2
= 0,31125 μM, curcumină: C1 = 1 μM, C2 = 1,25 μM, EGCG: E1 = 2 μM, E2 = 2,5 μM; OD –
În cazul GLSCs, tratamentele cu curcumină și EGCG nu au avut efect semnificativ

după 24 h. După 48 h, curcumina C2 a fost mai eficientă decât concentrația C1 (p<0,01)
asupra celulelor expuse la doza N1 de nicotină (Fig. 33).
La 24 h, concentrația C2 de curcumină a crescut semnificativ viabilitatea PDLSCs
după expunerea la dozele de nicotină N1 (p<0,001) și N2 (p<0,05) și a fost mai
eficientă decât concentrația C1 combinată cu N1 (p<0,001). De asemenea, curcumina
C2 a fost mai eficientă decât concentrația E2 de EGCG (p<0,001) în cazul celulelor
expuse la doza N1 de nicotină (Fig. 32). După 48 h, concentrația E2 de EGCG a fost mai
eficientă (p<0,05) decât E1 asupra celulelor expuse la doza N2 de nicotină (Fig. 33).
După 24 h, concentrația E1 de EGCG a fost mai eficientă asupra ABSCs expuse la
doza N1 de nicotină (p<0,05) comparativ cu doza N2 Fig. 32. După 48 h, concentrația
C2 de curcumină a crescut semnificativ viabilitatea celulară după expunerea la doza N2
de nicotină (p<0,05). Concentrația C1 de curcumină a fost mai eficientă (p<0,01) decât
concentrația E1 de EGCG asupra celulelor expuse la doza N2 de nicotină (Fig. 33).
tisulară
Fig. 33. Efectul Curcuminei și EGCG asupra celulelor stem mezenchimale derivate din
parodonțiul uman expuse la nicotină timp de 48h. GTSCs - celulele stem derivate din corionul
din ligamentul parodontal; ABSCs – celulele stem derivate din osul alveolar; N1 = 1,245 μM ș i N2
= 0,31125 μM, curcumină: C1 = 1 μM, C2 = 1,25 μM, EGCG: E1 = 2 μM, E2 = 2,5 μM; OD –
Rezultatele obținute au indicat efectul protector al antioxidanților naturali,

demonstrat prin creș terea viabilității celulare. Ambele tratamente au contracarat
efectul citotoxic al nicotinei însă curcumina a fost mai eficientă decâ t EGCG. În general,
tratamentele au fost mai eficiente când a fost folosită concentrația mai mare de
substanță și ı̂n combinație cu doza mică de nicotină .
2.4. Metode inovative de potențare a efectului terapeutic al

antioxidanților naturali asupra celulelor stem mezenchimale
derivate din parodonțiul uman
Sistemele de administrare controlată optimizează biodisponibilitatea prin
prevenirea degradării premature a substanței active, creșterea captării intracelulare și
menținerea concentrației în limitele eficienței terapeutice.
Nanostructurile compuse din lipide amfifile naturale sau sintetice sunt sisteme
biocompatibile și biodegradabile, utilizate pentru administrarea diverselor substanțe
medicamentoase 156. Dintre acestea, lipozomii s-au dovedit a fi nanovectori cu
numeroase avantaje, printre care: creșterea stabilității moleculelor încapsulate,
optimizarea efectului farmacokinetic prin reducerea eliminării și prin prelungirea

timpului de menținere în circulație156.
Eficiența terapeutică a curcuminei are anumite limitări legate de
biodisponibilitatea și stabilitatea reduse, precum și necesitatea administrării unor
doze mari 157.
Pentru a contracara dezavantajele legate de absorbția și captarea celulară
reduse, au fost utilizate variate sisteme și metode de administrare a curcuminei și au
fost sintetizați analogi ai curcuminei care au fost testați în diverse patologii 158.
În decursul deceniilor anterioare, au fost utilizați lipozomii, dispersia solidă,
emulsiile, miceliile, nanogelurile și microsferele, cu scopul de a compensa limitările
curcuminei 159. Numeroase studii au demonstrat că încapsularea în lipozomi a
optimizat semnificativ stabilitatea moleculei și a crescut activitatea biologică a
curcuminei 160.
Studii recente s-au concentrat pe identificarea unei “super curcumine” cu
proprietăți superioare curcuminei naturale. Analogii curcuminei și derivații lor au avut
efecte terapeutice variate: antioxidante, cardioprotectoare, antidiabetice,
antimutagene, și anticarcinogene, demonstrate în numeroase studii in vitro și in vivo 161.
EGCG prezintă o eficiență terapeutică limitată din cauza oxidării și instabilității
care determină o biodisponibilitate redusă în cadrul sistemelor biologice, indiferent de
calea de administrare. În plus, prezența numeroaselor grupări fenolice predispune
molecula de EGCG la diverse reacții metabolice, cum ar fi glucuronidarea și metilarea,
ceea ce determină un profil farmacokinetic nefavorabil, la administrarea pe cale orală.
Includerea EGCG în lipozomi protejează molecula de degradare, astfel crescând
concentrația și absorbția la nivelul țintei terapeutice156.
2.4.1. Lipozomii cu curcumină și epigallocatechin-gallate
Lipozomii sunt vezicule sferice alcătuite din unul sau mai multe straturi
fosfolipidice duble, între care se află încapsulată o fracție apoasă. Lipozomii pot
transporta atât componente hidrofile, cât și hidrofobe, prin înglobarea lor în faza
internă apoasă și respectiv în straturile duble lipidice. Lipozomii au fost obținuți prin
metoda hidratării filmului lipidic 162. Fosfolipidele, împreună cu colesterolul și
curcumina s-au dizolvat în 10 ml etanol, iar soluția organică a fost introdusă într-un
balon cu fund rotund. Solventul organic a fost evaporat într-un rotavapor la 45°C și 80
rpm. Filmul a fost hidratat cu ser fiziologic pH=5 pentru curcumină, respectiv cu
soluție apoasă de EGCG pH=5. Filmul lipidic s-a omogenizat la 100 rpm și 45°C, timp de
20 min pentru curcumină și respectiv 80 rpm și 45°C, timp de 15 min, pentru EGCG.
După preparare, lipozomii au fost separați de substanța rămasă neîncorporată prin
centrifugare. Ulterior, lipozomii au fost extrudați prin membrane de policarbonat cu
diametrul porilor de 800, 600, 400, respectiv 200 nm de câte trei ori. Lipozomii
rezultați au fost caracterizați, determinându-se dimensiunea, polidispersia, potențialul
zeta, concentrația de curcumină și respectiv EGCG încorporată și eficiența încorporării.
Rezultatele obținute la caracterizarea lipozomilor au indicat următoarele valori:
pentru curcumină: dimensiunea: 173,7±3,188 nm; indicele de polidispersie:
0,065±0,043; potențialul Zeta: -44,5±1,31 mV; concentrația de curcumină încorporată:
1741,51 µg/ml; eficiența încorporării: 93,10%, iar pentru EGCG: dimensiunea: 161 nm;
indicele de polidispersie: 0,092; potențialul Zeta: -54,6 mV; concentrația de EGCG
încorporat: 188,47 µg/ml; eficiența încorporării: 58,74 %
tisulară
În studiul nostru, lipozomii cu curcumină (L-CURC) și lipozomii cu EGCG (L-
EGCG) au fost testați pe celulele stem mezenchimale izolate din ligamentul parodontal
(PDLSCs). Lipozomii au fost studiați din punctul de vedere al citotoxicității și al
activității antioxidante după expunerea celulelor la LPS-Pg, iar efectele au fost
comparate cu curcumina și respectiv EGCG libere.
2.4.1.1. Efectul biologic al lipozomilor cu curcumină și epigallocatechin-
gallate
Într-un studiu preliminar, am testat efectul biologic al substanțelor incluse în
lipozomi, folosind următoarele patru concentrații în mediul de cultură din godeuri:
curcumina lipozomală (L-CURC): 6,25 µM, 12,5 µM, 25 µM și 50 µM, respectiv EGCG
lipozomal (L-EGCG): 10 µM, 25 µM, 50 µM și 100 µM. Efectele au fost comparate cu
aceleași concentrații de CURC și EGCG libere.
Rezultatele testului MTT au demonstrat că curcumina și EGCG incluse în
lipozomi au prezentat un efect citotoxic dependent de doză, în comparație cu controlul
și cu substanța liberă.
Efectul citotoxic al L-CURC a fost semnificativ mai intens la concentrațiile mai
mari, dar nu și la concentrația cea mai mică. L-CURC a prezentat un efect citotoxic
semnificativ mai intens comparabil cu controlul la concentrațiile 25 µM (p<0,001) și 50
µM (p<0,001) și cu CURC liberă la concentrațiile 12,5 µM (p<0,05), 25 µM (p<0,01) și
50 µM (p<0,001) (Fig. 34).
Fig. 34. Efectul citotoxic al curcuminei libere (CURC) și lipozomale (L-CURC) asupra
celulelor stem mezenchimale umane izolate din ligamentul parodontal; * p<0,05; ** p<0,01; ***
p<0,001
În schimb, L-EGCG nu a prezentat un efect citotoxic semnificativ față de control

și față de EGCG liber. Dozele mai mari de L-EGCG (50 µM și 100 µM) au determinat o
ușoară reducere a viabilității celulare (Fig. 35).
Fig. 35. Efectul citotoxic al EGCG liber (EGCG) și lipozomal (L-EGCG) asupra celulelor stem
mezenchimale umane izolate din ligamentul parodontal
Aceste rezultate sugerează o captare intracelulară mai mare a substanțelor

incluse în lipozomi, ceea ce a determinat un efect biologic mai intens. Luând în
considerare aceste observații, în experimentele următoare am folosit doze mai mici de
curcumină și EGCG lipozomale.
2.4.1.2. Eficiența lipozomilor cu curcumină și epigallocatechin-gallate în
modularea efectului oxidant al lipopolizaharidul de Porphyromonas gingivalis
in vitro
În cadrul unui studiu in vitro, am evaluat eficiența tratamentului antioxidant cu
curcumină și EGCG incluse în lipozomi în culturile de celule stem mezenchimale umane
izolate din ligamentul parodontal (PDLSCs) care au fost în prealabil stimulate cu LPS-
Pg pentru a induce producerea de radicali liberi intracelulari.
Celulele au fost însămânțate pe plăci cu 96 de godeuri și, după 24 h necesare
aderării de baza godeurilor și proliferării, au fost tratate cu LPS-Pg în concentrație de
15 µg/ml, conform protocolului descris la sub-sub-capitolul 2.2.1, pentru inducerea
stresului oxidativ. Celulele au fost tratate cu șase concentrații de curcumină și EGCG
sub formă liberă (CURC și EGCG) și de lipozomi (L-CURC și L-EGCG). Concentrațiile
pentru CURC și L-CURC au fost: 1,25 µM, 2,5 µM, 5 µM, 6,25 µM, 12,5 µM și 25 µM, iar
pentru EGCG și L-EGCG concentrațiile au fost: 2,5 µM, 5 µM, 10 µM, 20 µM, 25 µM și 50
tisulară
µM. Lipozomii cu curcumină și EGCG au fost preparați conform protocolulul descris în
sub-sub-capitolul 2.4.1.
La 15 minute după stimularea cu LPS-Pg, tratamentele cu CURC, L-CURC, EGCG
și L-EGCG au fost adăugate în godeuri, iar plăcile au fost păstrate la întuneric și 0°C.
Pentru a urmări în dinamică nivelurile de radicali liberi intracelulari, citirile au fost
efectuate la 15 min (15’), 30 min (30’) și 60 min (60’). Efectul antioxidant a fost evaluat
prin compararea unităților de fluorescență înregistrate la 15 min, 30 min și 60 min cu
valorile înregistrate în momentul inițial (0’) al tratamentului cu CURC, L-CURC, EGCG și
L-EGCG, după stimularea cu LPS-Pg. Toate experimentele au fost realizate în triplicat.
Producerea de radicali liberi a fost evaluată prin metoda DC-FDA, folosind un
protocol similar metodei cu CM-FDA, care a fost descris la subcapitolul 2.2.1.
Rezultatele obținute au indicat o creștere intensă a nivelurilor radicalilor liberi
intracelulari după expunerea la LPS-Pg și o creștere graduală după tratamentul cu
CURC și EGCG libere și incluse în lipozomi (Fig. 1 și 2). De asemenea, s-a observat
reducerea nivelurilor radicalilor liberi intracelulari la tratamentele aplicate, în funcție
de doză și de timpul de expunere (Tabelele IX-XII).
Pentru toate dozele de CURC, creșterea nivelurilor de radicali liberi a fost mai
accentuată în primele 15 min față de momentele ulterioare, comparativ cu LPS-Pg (Fig.
36A). La tratamentul cu L-CURC, creșterea nivelurilor radicalilor liberi a fost mai lentă,
cu diferențe mai reduse între momente, comparativ cu CURC (Fig. 36B).
Fig. 36. Evoluția nivelurilor radicalilor liberi intracelulari în celulele stem umane derivate din ligamentul
parodontal după stimularea cu LPS-Pg și tratamentul cu: (A) CURC și (B) L-CURC. LPS-Pg - lipopolizaharid de
Porphyromonas gingivalis; CURC – curcumină; L-CURC – lipozomi cu curcumină; 0’ – momentul inițial al
tratamentului cu CURC; 15’, 30’, 60’ – momentele ulterioare de determinare a nivelurilor radicalilor liberi
intracelulari
Scăderi semnificative ale nivelurilor radicalilor liberi intracelulari s-au observat

la tratamentul cu CURC în doze de 1,25 µM la 15 min (p<0.05) și 30 min (p<0.05) și de
6,25 µM la 15 min (p<0.01) și 60 min (p<0.05) după expunerea la LPS-Pg (Tabelul IX).
Tabelul IX. Nivelurile radicalilor liberi intracelulari în celulele stem umane derivate din
ligamentul parodontal după stimularea cu LPS-Pg și tratamentul cu CURC
Tim LPS-Pg LPS-Pg + LPS-Pg + LPS-Pg + LPS-Pg + LPS-Pg + LPS-Pg +
p Ctrl. CURC CURC CURC CURC CURC CURC
1.25 µM 2.5 µM 5 µM 6.25 µM 12.5 µM 25 µM
0’ 2018±95.3 1787±49.5 1949±41.7 2068±65.9 1914±74.3 2049±43.6 2035±86.5

8 6 7 2 0 6
*
15’ 2566±123. 2125±91.0 2394±46.1 2560±204. 2211±15.9 2559±113. 2534±130.
4 8 3 6 5 9 3
* **
30’ 2776±132. 2299±82.6 2602±79.9 2770±238. 2428±60.5 2737±79.2 2708±177.
5 6 6 4 0 5
*
60’ 3030±196. 2460±129. 2763±85.3 2949±294. 2669±267. 3022±88 2934±206.
2 4 4 5 2 9
*
(*) – comparativ cu LPS-Pg Ctrl; LPS-Pg, lipopolizaharid de Porphyromonas gingivalis; CURC –
curcumină; (*) p<0.05; (**) p<0.01; 0’ – momentul inițial al tratamentului cu CURC; 15’, 30’, 60’ –
momentele ulterioare de determinare a nivelurilor radicalilor liberi intracelulari
Lipozomii cu CURC au redus semnificativ nivelurile radicalilor liberi

intracelulari la concentrațiile de 1.25 µM la 15 min (p<0.05), 30 min (p<0.01), 60 min
(p<0.001), și 2.5 µM la 60 min (p<0.05) (Tabelul X).
Tabelul X. Nivelurile radicalilor liberi intracelulari în celulele stem umane derivate din
ligamentul parodontal după stimularea cu LPS-Pg și tratamentul cu L-CURC
Tim LPS-Pg LPS-Pg LPS-Pg LPS-Pg LPS-Pg LPS-Pg LPS-Pg
p Ctrl. + L-CURC + L-CURC + L-CURC + L-CURC + L-CURC + L-CURC
1.25 µM 2.5 µM 5 µM 6.25 µM 12.5 µM 25 µM
0’ 2018±95.3 1750±44.5 1918±54.1 2082±269. 2085±192. 2102±61.8 2088±37.0
8 2 1 9 0 1 7
*
15’ 2566±123. 2099±93.3 2351±128. 2665±450. 2576±285. 2649±150. 2618±90.5
4 3 4 5 7 1 8
*
30’ 2776±132. 2116±17.0 2466±122. 2912±572. 2766±307. 2840±184. 2786±93.2
5 1 6 0 2 4 2
**
60’ 3030±196. 2259±49.3 2596±155. 3170±737. 3002±354. 3108±226. 3045±82.6
2 6 1 8 4 5 6
*** *
(*) – comparativ cu LPS-Pg Ctrl; LPS-Pg, lipopolizaharid de Porphyromonas gingivalis; L-CURC –
lipozomi cu curcumină; (*) p<0.05; (**) p<0.01; (***) p<0.001; 0’ – momentul inițial al
tratamentului cu L-CURC; 15’, 30’, 60’ – momentele ulterioare de determinare a nivelurilor
radicalilor liberi intracelulari
După primele 15 min de tratament, când producerea de radicali liberi a fost mai
intensă sub influența LPS-Pg, EGCG și L-EGCG au menținut o creștere mai lentă la 30
min și 60 min (Fig. 37 A și B).
tisulară
Fig. 37. Evoluția nivelurilor radicalilor liberi intracelulari în celulele stem umane derivate din
ligamentul parodontal după stimularea cu LPS-Pg și tratamentul cu: (A) – EGCG și (B) – L-EGCG.
LPS-Pg - lipopolizaharid de Porphyromonas gingivalis; EGCG – epigallo-catechine gallate; L-EGCG
– lipozomi cu epigallo-catechine gallate; 0’ – momentul inițial al tratamentului cu EGCG; 15’, 30’,
60’ – momentele ulterioare de determinare a nivelurilor radicalilor liberi intracelulari
Toate dozele de EGCG au redus semnificativ nivelurile radicalilor liberi imediat

după aplicarea în culturile celulare, iar concentrația 20 µM a avut un efect prelungit la
15 min (p<0.05) (Tabelul XI).
Tabelul XI. Nivelurile radicalilor liberi intracelulari în celulele stem umane derivate din
ligamentul parodontal după stimularea cu LPS-Pg și tratamentul cu EGCG
Tim LPS-Pg LPS-Pg + LPS-Pg + LPS-Pg + LPS-Pg + LPS-Pg + LPS-Pg +
p Ctrl. EGCG EGCG EGCG EGCG EGCG EGCG
2.5 µM 5 µM 10 µM 20 µM 25 µM 50 µM
0’ 921.0±21. 809.3±23.8 814.7±14.2 816.0±14.1 794.7±10.2 798.0±13.7 811.3±44.0
7 6 2 8 6 5 2
* * * ** ** *
15’ 1354±105. 1239±11.3 1256±52.7 1262±27.7 1182±35.4 1189±53.5 1245±93.1
7 7 0 5 4 0 7
*
30’ 1468±38.7 1465±23.2 1476±73.0 1483±33.0 1385±37.0 1360±66.5 1424±63.3
4 9 8 1 7 7 8
60’ 1684±53.6 1714±47.5 1705±79.5 1723±37.9 1641±10.6 1568±110. 1625±116.
7 7 4 9 9 8 7
(*) – comparativ cu LPS-Pg Ctrl; LPS-Pg, lipopolizaharid de Porphyromonas gingivalis; EGCG –
epigallo-catechine gallate; (*) p<0.05; (**) p<0.01; 0’ – momentul inițial al tratamentului cu
EGCG; 15’, 30’, 60’ – momentele ulterioare de determinare a nivelurilor radicalilor liberi
intracelulari
Lipozomii cu EGCG au redus semnificativ nivelurile intracelulare ale radicalilor

liberi în momentul inițial, iar dozele 20 µM, 25 µM și 50 µM au fost eficiente și după 15
min de expunere la LPS-Pg (p<0,05) (Tabelul XII).
Tabelul XII. Nivelurile radicalilor liberi intracelulari în celulele stem umane derivate din
ligamentul parodontal după stimularea cu LPS-Pg și tratamentul cu L-EGCG
Timp LPS-Pg LPS-Pg + LPS-Pg + LPS-Pg + LPS-Pg + LPS-Pg + LPS-Pg +
Ctrl L-EGCG L-EGCG L-EGCG L-EGCG L-EGCG L-EGCG
2.5 µM 5 µM 10 µM 20 µM 25 µM 50 µM
0’ 921.0±21. 789.7±7.23 848.3±24.0 821.3±43.8 817.0±31.4 803.7±59.5 804.0±47

7 4 1 4 8 ** .03
** * * * **
15’ 1354±10 1197±26.21 1261±41.68 1231±46.46 1176±33.50 1165±75.4 1169±50.
5.7 * 4 09
* *
30’ 1468±38. 1373±51.78 1463±62.65 1448±43.10 1388±45.13 1327±88.7 1319±57.
74 6 06
60’ 1684±53. 1645±30.41 1684±75.97 1661±29.91 1638±34.67 1564±113. 1518±42.
67 5 85
(*) – comparativ cu LPS-Pg Ctrl; LPS-Pg, lipopolizaharid de Porphyromonas gingivalis; L-EGCG –
lipozomi cu epigallo-catechine gallate; (*) p<0.05; (**) p<0.01; 0’ – momentul inițial al
tratamentului cu L-EGCG; 15’, 30’, 60’ – momentele ulterioare de determinare a nivelurilor
radicalilor liberi intracelulari
În acest studiu, s-a observat că cele două substanțe au avut efecte antioxidante
în doze diferite: CURC și L-CURC au fost eficiente în doze mai mici, în timp ce toate
dozele de EGCG și L-EGCG au au avut efect antioxidant. În plus, au existat diferențe în
ceea ce privește momentul în care eficiența terapeutică a fost maximă: pentru CURC și
L-CURC, efectul a fost mai tardiv. În schimb, EGCG și L-EGCG au avut efect imediat după
adăugarea în culturile celulare, iar dozele mai mari au avut efect prelungit. Atât CURC,
cât și EGCG incluse în lipozomi au avut un efect antioxidant mai intens față de
substanțele libere.
Pentru a completa datele din acest studiu preliminar, va fi evaluat efectul in vitro
al lipozomilor și pe alte linii celulare. Efectul antioxidant in vitro va fi evaluat și după
expunerea la nicotină, iar ca metode se vor utiliza: determinarea nivelurilor superoxid
dismutazei (SOD), imunocitochimia pentru expresia iNOS, și dozarea MMPs. În
continuare, viitoarele cercetări vor evalua efectul terapeutic in vitro al lipozomilor cu
curcumină și EGCG asupra capacității de diferențiere osoasă a celulelor stem
mezenchimale derivate din parodonțiul uman, după expunerea la nicotină și LPS-Pg.
2.4.2. Analogii sintetici ai curcuminei
În patogeneza bolii parodontale, reacția imuno-inflamatoare locală induce o
producere în exces a citokinelor pro-inflamatoare și a MMPs117, 130, 163, 164. MMPs sunt
enzime proteolitice endogene care, în condiții fiziologice, joacă roluri esențiale în
turnover-ul matricii extracelulare și activitatea lor este controlată de inhibitorii tisulari
specifici (tissue inhibitors of metalloproteinases – TIMPs)118, 124, 127, 130. Celulele
rezidente parodontale sunt capabile să secrete cantități importante de MMPs latente,
dar degradarea matricei extracelulare nu se produce decât dacă enzimele sunt
activate118, 127. În condiții patologice, nivelurile crescute ale MMPs active și
dezechilibrul dintre MMPs și TIMPs sunt responsabile de evoluția proceselor
inflamatoare cronice117, 164.
În prezent, este recunoscut faptul că parodontita cronică progresează datorită
activității litice a MMPs care degradează colagenul și conduce la distrucții tisulare
parodontale. Numeroase studii au demonstrat că colagenazele (MMP-1 și MMP-13) și
gelatinazele (MMP-2 și MMP-9) sunt enzimele cheie implicate în degradarea matricei
extracelualre parodontale în cursul parodontitei cronice116, 121, 122, 128. TIMP-1 joacă un
rol essential în turnover-ul tisular prin regalrea strictă a activității acestor MMPs în
țesuturile parodontale116, 117, 122, 164. Așadar, agenții terapeutici care controlează
tisulară
secreția și activarea MMPs, și totodată reglează echilibrul dintre MMPs și TIMPs ar
putea fi utili pentru prevenirea și tratamentul parodontitei cronice164.
Curcumina, un polifenol obținut din rizomii platei Curcuma longa, a fost studiată
intens în ultimele decenii și s-a dovedit a fi eficientă în diverse patologii16, inclusiv în
boala parodontală. Mecanismele acțiunii curcuminei implică multiple căi de
semnalizare și molecule țintă cu rol în funcția celulară, enzime antioxidante și MMPs17,
146, prin controlul asupra activității TIMPs165. În tratamentul bolii parodontale,
aplicarea locală a curcuminei poate fi benefică datorită proprietăților antioxidante și

anti-inflamatoare87, 165, 166; în plus, prin controlul activării MMPs146 și TIMP-1 167,
curcumina poate limita distrucțiile tisulare parodontale 146.
În timp ce curcumina naturală a fost intens studiată în patologia orală,
potențialul terapeutic al curcuminelor sintetice este o direcție nouă de cercetare.
Studiile anterioare au fost conduse numai pe modele animale, și s-au axat pe alte căi
moleculare 93, 168.
Conform International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC),
curcumina naturală este definită ca (1E,6E)-1,7-bis(4-hidroxi-3-metoxifenil)hepta-1,6-
dienă-3,5-dionă 169. Studii recente ale membrilor din echipa noastră de cercetare s-au
concentrat pe sinteza a 15 analogi natural-identici ai curcuminei. Acești compuși s-au
dovedit eficienți împotriva celulelor tumorale umane, dat totodată au avut efecte
imunomodulatoare asupra limfocitelor normale 170, 171. Penru acest studiu au fost
selectați cinci din acești compuși, pe baza acțiunii citotoxice mai reduse asupra
celulelor tumorale. Curcumina Sintetică1 (CurcS1) a fost (1E,6E)-1,7-bis(3,4-
dimetoxifenil)hepta-1,6-dienă-3,5-dionă172. Curcuminoizii CurcK3, CurcK4, CurcK10 și
CurcK11 au fost obținuți prin condensarea Knoevenagel. CurcK3 și CurcK4 au fost
derivați din 1,7-bis(4-hidroxi-3-metoxifenil)hepta-1,6-dienă-3,5-dionă; diferența
dintre aceștia fiind că CurcK4 are două grupări metoxifenil. CurcK10 și CurcK11 sunt
structuri de tipul 1,7-bis (4-hidroxi-3-etoxifenil)hepta-1,6-dienă-3,5-dionă, iar în acest
caz CurcK11 a fost curcuminoidul cu două grupări etoxifenil (Tabelul XIII) 172.
Tabelul XIII. Formulele chimice și structura analogilor sintetici ai curcuminei

Compusul Formula chimică Structura
(1E,6E)-1,7-bis(4-hidroxi-3-
Curc
metoxifenil)hepta-1,6-dienă-3,5-dionă
(1E,6E)-1,7-bis(3,4-
CurcS1 dimetoxifnil)hepta-1,6-dienă-3,5-
dionă
Derivat de
CurcK3
1,7-bis(4-hidroxi-3-
metoxifenil)hepta-1,6-dienă-3,5-dionă
Derivat de
CurcK4 1,7-bis(4-hidroxi-3-
metoxifenyl)hepta-1,6-dienă-3,5-
dionă
Derivat de
CurcK10
1,7-bis(4-hidroxi-3-etoxifenil)hepta-
1,6-dienă-3,5-dionă
Derivat de
CurcK11 1,7-bis(4-hidroxi-3-etoxifenil)hepta-
1,6-dienă-3,5-dionă
Curc, curcumina naturală; CurcS1, Curcumina Sintetică 1; CurcK3, curcumina Knoevenagel -3;
CurcK4, curcumina Knoevenagel -4; CurcK10, curcumina Knoevenagel -10; CurcK11, curcumina
Knoevenagel -11
Conform studiilor anterioare, CurcS1 a exercitat o citotoxicitate crescută asupra

celulelor HT-29 izolate din carcinomul de colon și celulele A2780 izolate din celulele
tumorale ovariene; contrar, CurcS1 a avut un efect mai puțin citotoxic asupra
limfocitelor. Produșii de condensare Knoevenagel: CurcK3, CurcK4, CurcK10 și
CurcK11 s-au dovedit intens citotoxici asupra celulelor HT-29 din carcinomul de colon.
Efectul citotoxic al celor cinci analogi sintetici ai curcuminei a fost asociat cu captarea
inracelulară crescută și cu reglarea enzimelor intracelulare implicate în stresul
oxidativ171, 172.
Pe baza acestor rezultate, în acest studiu am testat activitatea acestor
curcuminoizi sintetici asupra unor linii celulare normale izolate din țesuturile
parodontale umane și am comparat aceste efecte cu curcumina naturală pentru a
verifica trei ipoteze: (1) dat fiind că acestea sunt celule stem mezenchimale normale,
celulele stem parodontale ar putea avea răspunsuri diferite la curcuminele sintetice,
față de celulele epiteliale tumorale care au fost testate în prealabil; (2) efectul citotoxic
al analogilor sintetici ai curcuminei ar putea fi comparabil cu al curcuminei naturale,
dar captarea celulară să fie mai mare; (3) curcuminele sintetice ar putea fi eficiente în
reglarea echilibrului dintre enzimele proteolitice (MMP-2 și MMP-9) și inhibitorii lor
endogeni (TIMP-1); astfel, acești compuși ar putea fi agenți terapeutici eficienți 173.
La momentul actual, acesta este primul studiu in vitro care cercetează efectul
analogilor sintetici ai curcuminei asupra celulelor stem mezenchimale derivate din
țesuturile orale umane. Rezultatele au fost publicate în lucrarea Boșca AB et al., 2019.
Scopul acestui studiu a fost determinarea efectului in vitro al cinci analogi
sintetici ai curcuminei asupra sintezei MMP-2, MMP-9 (în formă latentă și activă) și a
TIMP-1 de către patru tipuri de celule stem mezenchimale izolate din parodonțiul
uman174.
tisulară
2.4.2.1. Efectul biologic al analogilor sintetici ai curcuminei
Celulele stem mezenchimale utilizate în acest studiu au fost izolate și
caracterizate conform metodei descrise în paragraful I.2.1.
Pentru tratamentele celulare, s-au folosit curcumina naturală (Curc) și cinci
analogi sintetici ai curcuminei: curcumina sintetică 1 (CurcS1), și curcuminoizii
obținuți prin condensarea Knoevenagel: CurcK3, CurcK4, CurcK10 și CurcK11. Au fost
preparate soluțiile stoc în etanol absolut, conform masei moleculare și a solubilității
compușilor, după cum urmează: Curc – 5 mM, CurcS1 – 5 mM, CurcK3 - 10 mM, CurcK4
- 10 mM, CurcK10 - 10 mM și CurcK11 - 10 mM. Soluțiile stoc au fost ulterior diluate cu
apă liberă de endotoxine pentru a obține concentrațiile utilizate pentru tratamentele
celulare: 250 µM, 100 µM, 50 µM, 25 µM și 10 µM. Celulele netratate au fost cultivate în
mediu complet pentru celulele stem mezenchimale și au fost considerate ca martor
pentru fiecare linie celulară (Ctrl.). Curcumina sub formă de pudră ≥ 94% conținut de
curcuminoizi, și ≥ 80% curcumină, etanolul absolut și apa liberă de endotoxine au fost
achiziționate de la Sigma Aldrich, St Louis, MO, SUA.
Viabilitatea celulară în condițiile tratamentului cu Curc și cu analogii sintetici ai
curcuminei a fost evaluată folosind testul MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2il)-2,5-
difeniltetrazoliumbromidă) (Sigma Aldrich)101. Acest test colorimetric se bazează pe
capacitatea celulelor viabile de a transforma reactivul MTT în formazan, o substanță de
culoare violet intens, viabilitatea celulară fiind direct proporțională cu intensitatea
optică a probelor101. Pentru măsurarea densităților optice (OD) ale supernatanților s-a
folosit cititorul de plăci Synergy2 de la BioTek, Winooski, VT, USA. Experimentele au
fost efectuate în triplicat, și au fost făcute trei măsurători independente pentru fiecare
din cele patru linii celulare studiate, și pentru fiecare concentrație a curcuminei
naturale și a curcuminelor sintetice. Viabilitatea și proliferarea celulelor în condițiile
tratamentului cu cele cinci doze din fiecare compus a fost comparată cu celulele
netratate – martorul (Ctrl.) și cu aceleași doze de Curc.
Datele au fost analizate cu programul Prism 5 software (GraphPad Software, La
Jolla, CA, USA). One-way ANOVA, urmat de testul de comparație multiplă Dunnett
(valoarea p <0,05) a fost utilizat pentru compararea OD a probelor. Analiza de regresie
lineară XY a fost utilizată pentru a calcula media și deviația standard și curba hill slope
în intervalul de confidență 95%. Hill slope este un parametru matematic care se referă
la unghiul liniei de regresie care a fost obținut prin regresia lineară.
Rezultatele studiului au indicat o scădere semnificativă a viabilității la toate
liniile celulare, comparativ cu Ctrl (Tabelul XIV).
Tabelul XIV. Ratele de inhibare a creșterii celulare induse de curcumină și analogii

sintetici ai curcuminei asupra celor patru linii de celule stem studiate
Datele reprezintă inhibarea creșterii estimate, pentru fiecare linie celulară, cu ajutorul regresiei
lineare a relației dintre concentrația curcuminei sau a analogilor curcuminei în soluțiile stoc (0,
10, 25, 50, 100, sau 250 µM) și creșterea celulară rezultată. Toate estimările (coeficientul de
4
regresie b și SDb) sunt multiplicate cu 10 . Valorile negative ale coeficientului de regresie indică
o scădere a viabilității pentru toate liniile celulare. Toate valorile au fost semnificativ mai scăzute
decât Ctrl; *P < 0.001; †P < 0.01; ‡P < 0.05.
Ctrl, celule cultivate în mediu complet pentru culturile de celule stem mezenchimale; Curc,
curcumina naturală; CurcS1, Curcumina Sintetică 1; CurcK3, curcumina Knoevenagel -3; CurcK4,
curcumina Knoevenagel -4; CurcK10, curcumina Knoevenagel -10; CurcK11, curcumina
Knoevenagel -11.
În toate cele patru linii celulare, analogii sintetici ai curcuminei în doze mari au
indus o moarte celulară semnificativă, în comparație cu celulelel netratate, dar în doze
mai reduse au fost bine tolerați. GLSCs și PDLSCs au fost cele mai afectate; contrar,
ABSCs au fost cele mai rezistente (Fig. 38). În plus, compușii sintetici au avut un efect
dependent de doză asupra viabilității și proliferării celulare, în comparație cu Curc. În
cazul GTSCs, proliferarea a fost stimulată de CurcK10 în concentrație de 100 µM, și
inhibată de CurcK4 în concentrație de 50 µM. Citotoxicitatea celorlaltor curcumine
sintetice a fost similară cu a Curc. În cazul GLSCs, seria de CurcK 3, 4, 10 și 11 la
concentrații cuprinse între 10 și 50 µM au fost uneori mai toxice decât Curc, dar peste
100 µM, acești compuși nu au fost semnificativ mai toxici decât Curc. Toate dozele de
CurcS1 au crescut discret viabilitatea GLSCs comparativ cu Curc. În cazul PDLSCs,
CurcS1 și CurcK10 în concentrație de 250 µM au indus proliferarea; în doze cuprinse
între 10 și 100 µM, toxicitatea CurcS1 a fost comparabilă cu a Curc, dar CurcK3, 4, 10 și
11 au indus moartea celulară. În cazul ABSCs, curcuminele sintetice și Curc au avut
citotoxicitate comparabilă (Fig. 38).
tisulară
Fig. 38. Efectul dependent de doză al curcuminei și analogilor sintetici ai curcuminei

asupra viabilității și proliferării celulare; pentru GTSCs, GLSCs și PDLSCs, toate dozele de analogi
ai curcuminei au scăzut viabilitatea, dar pentru ABSCs, dozele mici de CurcS1, CurcK10 și
CurcK11 au indus o proliferare discretă față de Ctrl. Seriile de CurcK au fost mai toxice decât
Curc asupra GLSCs și PDLSCs, dar citotoxicitatea acestora a fost comparabilă cu a Curc asupra
GTSCs și ABSCs. CurcS1 nu a avut efecte semnificativ diferite comparativ cu Curc; barele de
eroare indică deviația standard; GTSCs – celulele stem derivate din țesutul gingival; GLSCs –
celulele stem derivate din ligamentul gingival; PDLSCs – celulele stem derivate din ligamentul
parodontal; ABSCs – celulele stem derivate din osul alveolar; *** p<0.001; ** p<0.01; * p<0.05
comparativ cu Ctrl; ### p<0.001; ## p<0.01; # p<0.05 comparativ cu Curc.
2.4.2.2. Acumularea intracelulară a analogilor sintetici ai curcuminei

Acumularea intracelulară a fost evaluată printr-o metodă bazată pe proprietățile
fluorescente ale compușilor.
Celulele au fost cultivate pe plăci cu 24 de godeuri, tratate cu soluții de Curc și
analogi ai curcuminei în concentrație de 10 µM timp de 24h. Mediul de cultură a fost
îndepărtat, apoi s-au efectuat spălări repetate cu soluție salină tamponată (phosphate
buffered saline - PBS) (Sigma Aldrich); la sfârșit, în fiecare godeu au fost adăugați 200
µl de PBS. Ținând cont că Curc și analogii curcuminei au o fluorescență intrinsecă 174,
acumularea intracelulară a fost determinată prin măsurători fluorimetrice utilizând un
cititor de plăci Synergy2 (BioTek) la lungimea de undă de 485 nm, iar pentru
examinarea celulelor s-a utilizat un microscop cu fază inversată și fluorescență
Observer D1, cu filtru de 488 nm (Carl Zeiss, Oberkochen, Germania). Experimentele
au fost efectuate în triplicat pentru soluția 10 µM de Curc și pentru fiecare curcumină

sintetică și au fost făcute trei măsurători independente pentru cele 4 linii celulare.
Jolla, CA, USA). One-way ANOVA, urmată de testul de comparație multiplă Dunnett
(valoarea p <0,05) a fost utilizat pentru compararea unităților de fluorescență. Analiza
de regresie lineară XY a fost utilizată pentru a calcula media și deviația standard și
curba hill slope în intervalul de confidență 95%.
Rezultatele studiului au relevat diferențe semnificative privind captarea
curcuminelor sintetice în comparație cu Curc. Toate liniile celulare au încorporat o
cantitate semnificativ mai mare de CurcS1 și o cantitate semnificativ mai mică de
CurcK3 decât Curc. CurcK4, 10 și 11 au prezentat o acumulare intracelulară variabilă în
cele patru linii celulare, comparativ cu Curc (Tabelul XV și Fig. 39).
Tabelul XV. Captarea analogilor sintetici ai curcuminei vs. curcumina naturală pentru cele
patru linii de celule stem parodontale studiate
Curc, curcumina naturală; CurcS1, Curcumina Sintetică 1; CurcK3, curcumina Knoevenagel -3;
CurcK4, curcumina Knoevenagel -4; CurcK10, curcumina Knoevenagel -10; CurcK11, curcumina
Knoevenagel -11
Datele au fost estimate, pentru fiecare linie celulară, cu ajutorul regresiei lineare a relației dintre
diferențele (analogii sintetici ai curcuminei vs. curcumina naturală) în concentrațiile curcuminei
sau analogilor curcuminei în soluțiile stoc (0, 10, 25, 50, 100, sau 250 µM) și acumularea
intracelulară rezultată. Toate estimările (coeficientul de regresie b și SDb) sunt multiplicate cu
104. Valorile pozitive ale coeficientului de regresie indică o creștere a acumulării intracelulare, în
timp ce valorile negative indică o scădere a conținutului intracelular de curcuminoizi. *P < 0.001;
†P < 0.01; ‡P < 0.05 comparativ cu Curc. Ctrl, celule cultivate în mediu complet pentru culturile
de celule stem mezenchimale; Curc, curcumina naturală; CurcS1, Curcumina Sintetică 1; CurcK3,
curcumina Knoevenagel -3; CurcK4, curcumina Knoevenagel -4; CurcK10, curcumina
Knoevenagel -10; CurcK11, curcumina Knoevenagel -11.
tisulară
Fig. 39 . Comparația între acumularea intracelulară a curcuminei naturale (Curc; 10 µM) și a

analogilor sintetici ai curcuminei (10 µM) în celulele stem mezenchimale derivate din
parodonțiul uman. Comparativ cu concentrarea intracelulară a Curc, concentrarea Curcuminei
Sintetice 1 (CurcS1) a fost semnificativ crescută, iar a curcuminei Knoevenagel -3 (CurcK3) a fost
semnificativ scăzută, în toate liniile celulare. Acumularea intracelulară a curcuminei
Knoevenagel -4 (CurcK4) și a curcuminei Knoevenagel -10 (CurcK10) a fost crescută în ABSCs,
iar acumularea curcuminei Knoevenagel -11 (CurcK11) a fost mai mare în ABSCs și în GTSCs.
GTSCs – celulele stem derivate din țesutul gingival; GLSCs – celulele stem derivate din ligamentul
gingival; PDLSCs – celulele stem derivate din ligamentul parodontal; ABSCs – celulele stem
derivate din osul alveolar. Barele reprezintă mediile, și barele de eroare indică SD. ***P < 0,001;
**P < 0,01; *P < 0,05 comparativ cu Curc
2.4.2.3. Eficiența analogilor sintetici ai curcuminei în modularea balanței

dintre metaloproteinazele matriceale și inhibitorii tisulari
Pentru determinarea prezenței formelor de pro-enzimă sau enzimă activată, și
pentru dozarea nivelurilor acestora, s-a efectuat zimografia pe gelatină pentru MMP-2
și MMP-9.
Celulele au fost cultivate pe plăci cu 24 de godeuri, tratate cu analogi ai
curcuminei în concentrație 10 µM; după 24h, supernatantul a fost prelevat și utilizat
pentru a efectua zimografia pe gelatină în vederea detectării MMP-2 și MMP-9 și testul
ELISA pentru măsurarea nivelurilor TIMP-1. Dat fiind că MMP-2 și MMP-9 sunt
proteine extracelulare, activitatea proteolitică în supernatantul culturii celulare a fost
determinată prin zimografia pe gelatină 175. Conform protocolului testului Bradford
pentru proteine 176, probele diluate la 20 μg cu soluție tampon Laemlli (Tris-HCl 62,5
mM, 25% glicerol, 2% sodiu dodecilsulfat) au fost supuse electroforezei în 10% gel de
poliacrilamidă co-polimerizat cu 1 mg / ml gelatină la 100 V timp de 120 min. După
electroforeză, gelurile au fost spălate cu soluție Triton 2,5% X100 timp de 1h, apoi
incubate peste noapte la 37°C în 50 mM soluție tamponată Tris-HCl, pH=7,4, care
conține 5 mM CaCl2, 200 mM NaCl și 0,02% Brij-35. Activitatea MMPs a fost detectată
după colorarea gelului cu Coomassie Brilliant Blue G-250, ca bezi transparente pe
fondul albastru-închis; benzile transparente au reprezentat zonele unde enzima a
digerat substratul. CaCl2, Brij-35, și CBBR-250 au fost achiziționați de la Merck,
Darmstadt, Germania; NaCl, Tris-HCl, sodiu dodecilsulfatul, poliacrilamida și gelatina
de la Sigma-Aldrich, Steinheim, Germania; glicerolul de la Consors, București, România
și Triton-X100 de la Serva, Heidelberg, Germania. Cuantificarea densitometrică a fosrt
efectuată cu un analizor de imagine utilizând programul Bio-1D (de la Vilber-Lourmat,
Marne-la-Vallée, Franța). Benzile au fost confirmate cu un marker enzimatic standard.
Experimentele au fost efectuate în triplicat și trei măsurători independente au fost
făcute pentru cele patru linii celulare tratate cu cele cinci curcumine sintetice.
Luând în considerare citotoxicitatea compușilor și numărul variabil de celule
din godeuri, pentru fiecare probă, concentrația de proteină a fost măsurată, apoi
diluată pentru a normaliza valorile și activitatea MMPs a fost exprimată ca unități
arbitrare per µg de proteină.
Secreția de TIMP-1 a fost evaluată cu un kit ELISA pentru TIMP-1 uman (de la
Boster Biological Technology, Fremont, CA, USA). Soluțiile standard au fost prepate
conform indicațiilor manufacturierului. În fiecare godeu au fost adăugați 100 µl de
probă sau de soluție standard și apoi plăcile au fost incubate timp de 90 min. la 37°C.
Conținutul plăcii a fost îndepărtat și apoi 100 µl de anticop anti-TIMP biotinilat au fost
adăugați în fiecare godeu. După 1h de incubare la 37°C, placa a fost spălată de trei ori
cu PBS. Ulterior, s-au adăugat 100 µl de soluție ABC și apoi placa a fost incubată din
nou. După cinci cicluri de spălare cu PBS, s-a adăugat agentul de progresie a culorii
TMB, iar după 25 min. soluția de oprire; Porbele au fost supuse imadiat măsurătorii
colorimetrice la 450/540 nm și datele cantitative au fost obținute după procesarea
valorilor absorbției cu programul magellan software aferent cititorului de microplăci
Sunrise (Tecan Group, Männedorf, Switzerland). Experimentele au fost efectuate în
triplicat și trei măsurători independente au fost făcute pentru cele patru linii celulare
tratate cu cele cinci curcumine sintetice.
Jolla, CA, USA). One-way ANOVA, urmată de testul de comparație multiplă Dunnett
(valoarea p <0,05) a fost utilizată pentru compararea nivelurilor pro-MMP-2 și TIMP-1.
Coeficientul de corelație Pearson a fost utilizat pentru a determina corelația dintre
nivelurile pro-MMP-2 și TIMP-1.
Rezultatele obținute au indicat prezența pro-MMP-2 (72 kDa) în mediul de
cultură al celor patru tipuri de celule stem parodontale tratate cu curcuminele sintetice
în mod prevalent în cazul GLSCs și PDLSCs. Nu a existat o secreție detectabilă de pro-
MMP-9 (92 kDa), MMP-2 activă (66 kDa) și MMP-9 activă (83 kDa) (Fig. 40).
tisulară
Fig. 40. Rezultatele zimografiei privind efectul analogilor sintetici ai curcuminei (10 μM) asupra
secreției pro-matrix metaloproteinazelor (MMPs) 2 și 9 în celulele stem mezenchimale derivate
din parodonțiul uman. Benzile de liză corespunzătoare pro-MMP-9, MMP-2 activă, și MMP-9
activă au fost foarte slabe și practic nu au putut fi cuantificate; benzile mai intense de liză
corespunzătoare pro- MMP-2 au fost detectate în toate liniile celulare. GTSCs – celulele stem
derivate din țesutul gingival; GLSCs – celulele stem derivate din ligamentul gingival; PDLSCs –
alveolar; CurcS1, Curcumina Sintetică 1; CurcK3, curcumina Knoevenagel -3; CurcK4, curcumina
Knoevenagel -4; CurcK10, curcumina Knoevenagel -10; CurcK11, curcumina Knoevenagel -11
Au existat diferențe semnificative statistic privind nivelurile de pro-MMP-2 în

supernatant după tratamentul cu curcuminele sintetice comparativ cu celulele
netratate. CurcS1 și CurcK11 au redus eficient nivelurile pro-MMP-2 în GTSCs, în timp
ce CurcK3, 4, și 10 au fost eficiente în culturile de GTSCs și GLSCs (Fig. 41).
Fig. 41. Reprezentarea grafică a rezultatelor zimografiei pentru pro- MMP-2. Curcumina Sintetică
1 (CurcS1) și curcumina Knoevenagel -11 (CurcK11) au crescut semnificativ nivelurile de pro-
MMP-2 în GLSCs, PDLSCs, și ABSCs, dar au scăzut semnificativ nivelurile de pro-MMP-2 în GTSCs.
Curcuminele Knoevenagel 3, 4, și 10 au crescut nivelurile de pro-MMP-2 în PDLSCs și ABSCs, dar

au scăzut semnificativ secreția de pro-MMP-2 în GTSCs și GLSCs. GTSCs – celulele stem derivate
din țesutul gingival; GLSCs – celulele stem derivate din ligamentul gingival; PDLSCs – celulele
stem derivate din ligamentul parodontal; ABSCs – celulele stem derivate din osul alveolarBarele
reprezintă mediile, iar barele de eroare indică SD. ***P < 0,001 comparativ cu celulele cultivate
în mediu complet pentru celulele stem mezenchimale (Ctrl)
Curcuminoizii au crescut nivelurile TIMP-1 în toate tipurile de celule. CurcK3 și

4 au fost eficiente în creșterea nivelurilor TIMP-1 în culturile de GTSCs și GLSCs, în
timp ce CurcK10 a fost mai eficient în cazul GTSCs. CurcS1 și CurcK11 au influențat
discret nivelurile TIMP-1 în toate tipurile de celule (Fig. 42).
Fig. 42 Nivelurile de inhibitor tisular al metaloproteinazelor (TIMP)- 1 în supernatantul

culturilor celulare ca rezultat al tratamentului cu analogii sintetici ai curcuminei (10 μM).
Curcumina Knoevenagel -3 (CurcK3) și curcumina Knoevenagel -4 (CurcK4) au crescut
semnificativ nivelurie de TIMP-1 în GTSCs și GLSCs, în timp ce curcumina Knoevenagel -10
(CurcK10) a crescut semnificativ nivelurie de TIMP-1 în GTSCs. Curcumina Sintetică 1 (CurcS1)
și curcumina Knoevenagel -11 (CurcK11) nu au avut un efect semnificativ. GTSCs – celulele stem
derivate din țesutul gingival; GLSCs – celulele stem derivate din ligamentul gingival; PDLSCs –
alveolar. Barele reprezintă media, iar barele de eroare indică SD. ***P < 0,001; **P < 0,01; *P <
0,05 comparativ cu celulele cultivate în mediu complet pentru celulele stem mezenchimale
(Ctrl).
A existat o corelație inversă semnificativă între nivelurile pro-MMP-2 și TIMP-1
induse de tratamentul cu analogii sintetici ai curcuminei în culturile de GTSCs și GLSCs;
în schimb, nu a existat corelație în culturile de PDLSCs și ABSCs (Fig. 43).
tisulară
Fig. 43. Corelația dintre nivelurile de pro- matrix metaloproteinază(MMP)-2 și inhibitor tisular
al metaloproteinazelor (TIMP)-1 în supernatantul celor patru linii celulare la tratmentul cu
analogii sintetici ai curcuminei; în GTSCs și GLSCs, a existat o corelație inversă semnificativă, în
timp ce în PDLSCs și ABSCs nu a existat o corelație. GTSCs – celulele stem derivate din țesutul
din ligamentul parodontal; ABSCs – celulele stem derivate din osul alveolar. *P < 0,05
În acest studiu au fost evaluate nivelurile MMP-2, MMP-9 (pro-enzime și enzime

active) și TIMP-1 în supernatantul de culturi celulare pentru a stabili capacitatea
analogilor sintetici ai curcuminei de a controla echilibrul dintre enzimele proteolitice și
inhibitorii tisulari produși de celulele stem mezenchimale derivate din parodonțiul
uman 174.
Testul MTT a indicat faptul că citotoxicitatea depinde de structura chimică a
compușilor și de concentrațiile utilizate în tratamente. Structura curcuminelor
sintetice a influențat, de asemenea, acumularea intracelulară, comparativ cu curcumina
naturală.
CurcS1 a avut o structură asemănătoare curcuminei naturale; prin urmare, nu a
existat o diferență semnificativă între citotoxicitatea CurcS1 și a Curc. Totuși, prezența
grupărilor metoxi în poziția 4 a grupărilor fenil din pozițiile 1 și 7 a fost favorabilă
pentru captarea mai bună a CurcS1. În seria de CurcK, derivatul fenil adițional legat la
al 4-lea atom de carbon și atomii de oxigen legați sub formă de grupări carbonil în
pozițiile 3 și 5 pe lanțul heptan par să fie responsabili de citotoxicitatea crescută și
captarea celulară mai redusă comparativ cu Curc și CurcS1. Din seria CurcK, CurcK10 și
CurcK11 au fost mai puțin toxici, deoarece au avut grupări funcționale etoxifenil legate
de lanțul heptan față de grupările metoxifenil în CurcK3 și CurcK4. În plus, CurcK3 și

CurcK10 au avut o grupare etoxi voluminoasă grefată pe al treilea fenil, care ar pute fi
un impediment în internalizarea celulară.
Mai mult, cele patru tipuri celulare au prezentat răspunsuri diferite, în funcție
de originea lor. GLSCs și PDLSCs au fost cele mai sensibile la tratamentul cu analogii
curcuminei datorită ratei crescute de proliferare și a metabolismului mai intens,
comparativ cu GTSCs și ABSCs.
Rezultatele noastre sugerează că unele curcumine sintetice ar putea fi folosite ca
agenți terapeutici care să înlocuiască Curc în tratamentul in vitro al celulelor stem
derivate din parodonțiu. CurcS1 a avut o citotoxicitate redusă și o captare celulară
crescută. În concentrații reduse, CurcK10 și 11 au demonstrat un efect in vitro
comparabil cu al Curc asupra GTSCs, ABSCs și GLSCs; doar PDLSCs au fost discret
afectate.
Zimografia a demonstrat că atât Ctrl cât și celulele tratate cu curcuminele
sintetice au prezentat o singură bandă de liză pro-MMP-2, în timp ce formele active de
MMP-2 și MMP-9 nu au fost prezente. Analogii sintetici ai curcuminei au avut diverse
efecte asupra sintezei MMPs și TIMP-1 în culturile de celule stem mezenchimale
derivate din parodonțiul uman. Curcuminoizii nu au indus o sinteză detectabilă de pro-
MMP-9, dar au influențat sinteza de pro-MMP-2 și TIMP-1; totuși, MMP-2 și MMP-9 nu
au fost prezente în forma activă. Compușii nu au determinat activarea enzimelor, dar
au redus nivelurile pro-MMP-2; așadar, aceste substanțe nu au indus un fenotip
inflamator în celulele stem mezenchimale derivate din parodonțiul uman. CurcK3, 4 și
10 au fost cele mai eficiente în reducerea nivelurile pro-MMP-2 în timp ce CurcS1 a fost
mai puțin eficientă. Totuși, întrucât cele cinci curcumine sintetice au indus o creștere
semnificativă a nivelurilor TIMP-1, acești compuși ar putea fi eficienți în controlul
activității proteolitice. Corelația inversă dintre pro-MMP-2 și TIMP-1 în culturile de
GTSCs și GLSCs indică faptul că aceste celule au fost cele mai responsive la tratamentul
cu curucmine sintetice. Aceste rezultate sugerează că curcuminele sintetice au avut un
efect comparabil cu al curcuminei naturale privind controlul activității MMP-2 și
sinteza de TIMP-1.
În continuare, investigarea mecanismelor care stau la baza efectului
curcuminelor sintetice ar putea furniza noi perspective privind posibila utilizare
pentru tratamentul local al parodontitei cronice.
În concluzie, dozele mici de analogi sintetici ai curcuminei au prezentat o
citotoxicitate redusă și o acumulare intracelulară eficientă în culturile de celule stem
mezenchimale derivate din parodonțiul uman. Compușii au indus răspunsuri variabile
în ceea ce privește reducerea nivelurilor de pro-MMP-2 în culturile de celule, în funcție
de structura chimică și de originea celulelor. Toți acești analogi ai curcuminei au
influențat balanța pro-MMP-2/TIMP-1 prin creșterea sintezei TIMP-1. Curcuminoizii
natural-identici, în particular CurcS1 și CurcK11, au avut un efect mai țintit decât
curcumina naturală și au perspective promițătoare în vederea folosirii ca metodă
adjuvantă în terapia parodontală.
În perspectivă, vom derula studii in vitro pentru a investiga efectul analogilor
sintetici ai curcuminei în prezența lipopolizaharidului de Porphyromonas gingivalis și
posibilul rol protector împotriva altor mecanisme patogenetice în boala parodontală,
inclusiv stresul oxidativ și produșii finali de glicare avansată. Mai mult, studii
tisulară
experimentale pe modele animale și trialuri clinice ar putea stabili eficacitatea
terapeutică a acestor compuși utilizați ca adjuvanți în tratamentul bolii parodontale.
3. Efectul biologic al matricilor din Titan cu structură

poroasă utilizate în ingineria tisulară osoasă
Implantele medicale prezintă o aplicabilitate crescută în domeniul chirurgiei
maxilo-faciale. Timp de decenii, au fost utilizate implante realizate din aliaje solide și
dense, care prin rigiditatea lor au determinat forțe mecanice crescute, ducând la
rezorbția osoasă și pierderea implantelor 177. Pentru a reduce efectele negative ale
implantelor, cercetările recente s-au concentrat pe dezvoltarea unor biomateriale și
structuri poroase caracterizate atât prin rezistență, cât și prin greutate redusă,
proprietăți care conferă acestor materiale premise favorabile interacțiunii cu sistemele
biologice și deschid noi perspective în ingineria tisulară 178.
Dezvoltarea unor matrici personalizate, cu structură poroasă pe bază de Ti, care
să prezinte caracteristici mecanice superioare și proprietăți osteoinductoare și
osteoconductoare ar fi soluția pentru a obține o regenerare avansată a țesutului osos21.
Condițiile pe care trebuie să le îndeplinească un implant medical sunt următoarele: (1)
să se adapteze tridimensional defectului osos; (2) să fie realizat dintr-un material
biocompatibil; (3) morfologia și condiționarea suprafeței să fie favorabile
atașamentului și proliferării celulelor osoase; (4) să aibă proprietăți mecanice similare
osului; (5) arhitectura, inclusiv porozitatea, să permită dezvoltarea țesutului osos și a
vascularizației în ochiurile rețelei21.
Tehnica SLM este, în prezent, cea mai utilizată pentru fabricarea matricilor din
biomateriale, inclusiv din aliajele de Ti, întrucât permite obținerea unor implante cu
anumite proprietăți mecanice prin reproducerea exactă și controlată a parametrilor
morfologici: structura tridimensională, porozitatea, forma și dimensiunea porilor 179.
Ti este unul dintre materialele cele mai des folosite pentru realizarea
implantelor medicale, datorită rezistenței mecanice și a biocompatibilității. În plus,
suprafețele matricilor de Ti au posibilitatea de a fi modificate prin variate metode de
condiționare chimică sau tratament termic, pentru creșterea biocompatibilității,
prevenirea adeziunii microbiene și optimizarea proprietăților biomecanice180.
Modificarea suprafeței implantelor de Ti prin condiționare cu hidroxiapatită
(HAP) crește capacitatea osteoinductivă și osteoconductivă 180 și stimulează
diferențierea osteoblastică 181. În plus, structura poroasă a matricilor de Ti este
favorabilă adeziunii, creșterii și proliferării celulare, ceea ce asigură un contact strâns
între țesutul osos și implant.
3.1. Capacitatea de osteointegrare in vivo a matricilor poroase

din Ti obținute prin topire selectivă cu laser
Datele din literatură privind influența dimensiunii porilor asupra osteointegrării
matricilor de Ti sunt contradictorii. În urma unui studiu histomorfometric,
Vasconcellos et al. au raportat că dimensiunea optimă a porilor este cuprinsă în
intervalul 180-300 μm 182. Pentru a stabili dacă o dimensiune mai mare a porilor este
favorabilă osteointegrării și pentru a urmări efectul condiționării suprafeței
implantelor, am efectuat un studiu in vivo, în care am folosit matrici de Ti cu pori de 0,8

mm și 1 mm, iar matricile au avut suprafața de Ti nemodificat (Ti) și respectiv Ti
condiționat cu nano-hidroxiapatită îmbogățită cu siliciu (Ti+nano-HapSi)20. Studiul a
fost aprobat de Comisia de Etică a Universității de Medicină și Farmacie „Iuliu
Hațieganu”, Cluj-Napoca, nr. 165/20.04.2016.
Matricile din Ti produse prin tehnica SLM au avut forma unor discuri cu
diametrul de 5 mm și două dimensiuni ale porilor: 0,8 mm și respectiv 1 mm. Din
fiecare tip de matrici, jumătate au fost acoperite superficial cu nano-HapSi prin metoda
de precipitare: matricile au fost imersate în suspensie de nano-HapSi în apă timp de 15
min și uscate timp de 3 h la 105°C, procedură repetată de 3 ori. La final, matricile au
fost uscate timp de 1 h la 450°C20.
Implantele au fost inserate în defectele osoase produse la iepuri rasa California,
la nivelul treimii proximale a femurului. Iepurii (n=6) au primit două implante: Ti și
Ti+nano-HapSi, cu pori de 0,8 mm (n=3) și de 1 mm (n=3). Fragmentele de os cu
implantele au fost prelevate la 2, 4 și 6 luni și au fost prelucrate pentru examinare în
microscopie optică (colorațiile H-E și tricromică Goldner) și în microscopie electronică
de baleiaj (SEM - Scanning Electron Microscopy)20.
Rezultatele examenului microscopic au indicat vindecarea prin osificare
endocondrală după 2 luni, cu prezența unei zone de cartilaj hialin la interfața cu
implantul și țesut osos primar, imatur, în zonele profunde (Fig. 44).
Fig. 44. Aspectul microscopic al țesutului dezvoltat în jurul implantului de Ti cu pori de 1 mm,
după 2 luni: A – țesut cartilaginos la interfața cu implantul (săgeata subțire) și os primar în zona
profundă (săgeata groasă); B – cartilajul hialin cu condrocite mari în lacune (săgeata punctată);
osul primar cu travee osoase subțiri și areole intercomunicante (vârful de săgeată); colorație
tricromică Goldner
După 4 luni, vindecarea osului la situsul implantului a fost completă, cu

formarea de os secundar, matur, care prezenta structură lamelară. În plus, la interfața
cu implantul, osul avea o suprafață indentată, ceea ce sugerează proliferarea țesutului
osos în porii matricei, un semn de osteointegrare eficientă (Fig. 45 și Fig. 46).
tisulară
Fig. 45. Aspectul microscopic al țesutului dezvoltat în jurul implantului de Ti, cu pori de 0,8 mm
după 4 luni: A – țesut osos spongios cu travee groase (săgeata subțire) și areole cu măduvă
osoasă (săgețile groase); fractura țesutului osos proliferat în porii matricii (asterisc) B –
osteocite inactive în lacune (săgețile punctate) și osteoblaste pe suprafața traveelor osoase
(vârfurile de săgeată); colorație H-E
În funcție de tipul de matrice, țesutul osos nou format a avut morfologie și

arhitectură diferite: implantul de Ti a determinat formarea de os spongios (Fig. 45), în
timp ce matricile de Ti+nano-HapSi au indus formarea de os compact cu structură
densă (Fig. 46). Aceste rezultate sugerează că procesul de reparație osoasă a fost mai
eficient în cazul implantelor cu suprafața condiționată Ti+nano-HapSi20.
Fig. 46. Aspectul microscopic al țesutului dezvoltat în jurul implantului de Ti+nano-HapSi, cu

pori de 0,8 mm după 4 luni: A – țesut osos compact cu osteoane (săgețile subțiri); țesutul osos
proliferat în porii matricii a rămas intact (asteriscuri) B – osteocite active în lacune (săgețile
punctate) și lamele osoase concentrice în jurul canalelor Havers (vârfurile de săgeată); colorație
H-E
Imaginile SEM ale matricilor înainte de implantare au prezentat aspectul

suprafeței și dimensiunea porilor (Fig. 47), iar analiza EDX a indicat compoziția celor
două tipuri de implante: matricile Ti au conținut: Ca (calciu), Ti și O (oxigen), iar
matricile Ti+nano-HapSi au conținut: Ti, C (carbon), Ca, O și P (fosfor) (Fig. 48).
Fig. 47. Aspectul SEM al matricilor înainte de implantare
Fig. 48. Spectrul EDX înainte de implantare: A – matricile de Ti; B – matricile de Ti+nano-HapSi
La 4 luni după implantare, SEM a demonstrat atașamentul inițial și proliferarea

celulelor pe suprafața matricii (Fig. 49), cu diferențe în funcție de condiționarea
suprafeței și dimensiunea porilor. Pe matricile din Ti, celule de tipul fibroblast-like au
proliferat în spațiile dintre particulele de Ti, în timp ce pe matricile de Ti+nano-HapSi,
celulele au acoperit în întregime suprafața, și au extins prelungiri citoplasmatice în
contact cu cristalele de HAP. În plus, porii de 0,8 mm au conferit un suport mai bun
celulelor care s-au dezvoltat pe suprafața lor20.
tisulară
Fig. 49. Imaginile SEM ale implantelor după 4 luni: A, E, I, M – suprafața implantului parțial
acoperită de celule fibroblast-like (asteriscuri); B-D și J-L: celule proliferate între particulele de
Ti (vârfurile de săgeată); F-H și N-P – celule aplatizate cu procese citoplasmatice atașate de
suprafața implantului (săgețile subțiri)
După 6 luni, celulele de tip fibroblast-like au proliferat intens atât pe suprafața

implantului, cât și în interiorul porilor. Mai mult, celulele au secretat matrice
extracelulară care a înglobat celulele și a umplut spațiile din interiorul matricii (Fig.
50).
Fig. 50. Imaginile SEM ale implantelor după 6 luni: A, E, I, M – suprafața implantului complet
acoperită de celule fibroblast-like și matrice extracelulară (asteriscuri); B-D și J-L: celule
proliferate în interiorul matricii, fără a umple complet porii (vârfurile de săgeată); F-H și N-P –
numeroase celule fibroblast-like și fibre atașate ferm de suprafața implantului (săgețile subțiri)
Arhitectura țesutului format în pori a fost diferită în funcție de tipul de implant:

matricile de Ti au fost asociate cu o dispunere laxă a celulelor și fibrelor, în timp ce
matricile Ti+nano-HapSi au conținut un țesut mai bine structurat, cu un număr mai
mare de celule și fibre mai dens împachetate, în special în porii de 0,8 mm (Fig.
I.3.1.7)20. În plus, analiza EDX a indicat că implantele au conținut N (azot) și S (sulf), pe
lângă Ti, C, Ca, O și P, ceea ce a sugerat formarea de biomolecule (Fig. 51)20.
Fig. 51. Distribuția elementelor din compoziția implantelor după 6 luni: A – matricea de Ti; B –
matricea de Ti+nano-HapSi
Aceste rezultate preliminare au indicat că implantele de Ti obținute prin tehnica

SLM au fost bine osteointegrate in vivo. Implantele cu suprafața condiționată cu nano-
HapSi și porii mai mici au favorizat formarea de țesut osos și au optimizat procesul de
osteointegrare. Integrarea implantelor a fost graduală, cu proliferarea intensă a
țesutului osos pe suprafața și în interiorul matricii la 6 luni după implantare.
Rezultatele au fost publicate în lucrarea Ilea A. et al., 201920.
În cadrul unor studii viitoare, va fi evaluat secvențial procesul de osteointegrare
și vor fi testate mai multe tipuri de matrici, pentru a stabili limitele dimensiunii porilor
care să permită osteointegrarea fără a afecta proprietățile fizice ale implantului. În
plus, va fi evaluat tipul de condiționare superficială care să optimizeze
biocompatibilitatea materialului și să asigure răspunsul cel mai favorabil din partea
țesutului receptor.
3.2. Biocompatibilitatea in vitro a matricilor din Ti

condiționate cu nano-hidroxiapatită
Una dintre metodele recente de optimizare a implanturilor de Ti în vederea
ingineriei tisulare este vitalizarea prin grefarea celulelor stem mezenchimale (MSCs)
pe suprafața matricii și utilizarea diverșilor factori de creștere pentru a orienta
diferențierea celulară înspre lineajul specific țesutului receptor21.
În acest studiu, am investigat biocompatibilitatea matricilor de Ti obținute prin
tehnica SLM și influența condiționării suprafeței cu HAP asupra proliferării celulelor
tisulară
stem mezenchimale umane. În plus, am urmărit să stabilim care dintre diferitele tipuri
celulare izolate din țesuturile cavității orale are cea mai mare capacitate de a prolifera
și se a se diferenția înspre lineajul osteoblastic, la cultivarea în mediu osteoinductor și
în prezența matricilor de Ti pur și Ti condiționat cu HAP (Ti-HAP)21. Studiul a fost
aprobat de Comisia de Etică a Universității de Medicină și Farmacie „Iuliu Hațieganu”,
Cluj-Napoca, nr. 195/ 10.05.2016.
Matricile de Ti obținute prin tehnica SLM au avut forma unor discuri cu
diametrul de 5 mm și o structură poroasă, cu pori de 600 μm. O parte din matrici au
fost condiționate cu HAP prin imersarea în soluție de HAP, timp de 10 min, in vacuum
la 100 mbar, urmată de uscare în cuptor la 60°C și 110°C. Toate matricile au fost
sinterizate timp de 1 h, la 600°C și apoi sterilizate timp de 2 h la 160°C21.
Celulele stem mezenchimale au fost izolate din pulpa dentară, papila apicală,
osul alveolar inter-radicular și osul tuberozitar, conform metodei descrise în
subcapitolul I.2.1.1 și au fost caracterizate fenotipic și genetic21. Înainte de
însămânțarea pe matrici, celulele au fost colorate cu un colorant fluorescent, PKH 26
(Fluorescent Cell Linker Kits, Sigma Aldrich, Darmstadt, Germania). Pentru stimularea
diferențierii osteogenice, celulele au fost cultivate în mediu osteogenic simplu, conform
protocolului descris în sub-sub-capitolul 2.1.3. Pentru studiul efectului citotoxic, a
proliferării celulare și a adeziunii celulelor la suprafața matricilor s-a efectuat testul
Alamar blue. Rezaunina, un colorant non-fluorescent, este redusă la rezorufină (un
compus fluorescent roșu) în celulele active metabolic, iar intensitatea fluorescenței
depinde de numărul de celule viabile. Măsurarea unităților de fluorescență s-a făcut cu
un cititor de plăci Synergy 2 BioTek, la excitație de 540 nm și emisie de 620 nm.
Celulele au fost examinate și numărate cu un microscop Zeiss Axiovert la diferite
intervale: 2 h, 24 h, 48 h, 7 zile și 18 zile. Formarea depozitelor de Ca a fost evaluată cu
metoda Alizarin red, descrisă în subcapitolul I.2.2.3, la 18 zile după cultivarea pe
matricile de Ti pur și Ti-HAP.
Examinarea SEM a demonstrat că suprafețele matricilor Ti-Hap au fost mai
rugoase decât ale matricilor din Ti pur, fiind acoperite de cristale de HAP (Fig. 52)21.
Fig. 52. Imaginea SEM a suprafeței matricilor studiate: A – matricea de Ti pur (magnificație
500x); B – matricea de Ti-HAP (magnificație 500x)
Biocompatibilitatea matricilor a fost demonstrată de prezența celulelor viabile

pe întreaga durată a experimentului; în plus, suprafața matricilor a favorizat adeziunea
și proliferarea celor patru tipuri de celule (Fig. 53)21.
Fig. 53. Imaginea de microscopie optică în fluorescență a MSCs derivate din osul alveolar inter-
radicular marcate cu PKH26 atașate pe suprafața matricilor de Ti la diferite intervale de timp: A
– 24 h, B – 48 h; C – 7 zile; D – 18 zile
Rezultatele testului Alamar blue au indicat că proliferarea celulară a fost mai

intensă în cazul matricilor Ti-HAP, însă fără diferență semnificativă statistic (Fig. 54)21.
tisulară
Fig. 54. Testul Alamar blue pentru evaluarea viabilității și proliferării celulare la 48 h, 7 zile și 18
zile. Legenda: Ti – matricile de Ti pur; Ti-HAP – matricile de Ti condiționate cu HAP; DP –
celulele izolate din pulpa dentară; AP – celulele izolate din papila apicală; IR - celulele izolate din
osul alveolar inter-radicular; T - celulele izolate din osul tuberozitar
După 18 zile, procesul de mineralizare a fost mai intens în culturile cu matrici

Ti-HAP și pentru celulele izolate din osul alveolar inter-radicular (Fig. 55)21.
Fig. 55. Colorația cu Alizarin red pentru evidențierea procesului de mineralizare în culturile de
celule după 18 zile: A – cristalele de Ca relevate prin colorația specială; galben: T+Ti; verde:
T+Ti-HAP; roșu: IR+Ti; albastru: IR+Ti-HAP; portocaliu: DP+Ti; violet: DP+Ti-HAP; albastru-
tisulară
închis: AP+Ti; roz: AP+Ti-HAP; B – comparație între cantitatea de săruri de Ca, în funcție de tipul
celular și de condiționarea matricilor; Legenda: Ti – matricile de Ti pur; Ti-HAP – matricile de Ti
condiționate cu HAP; DP – celulele izolate din pulpa dentară; AP – celulele izolate din papila
apicală; IR - celulele izolate din osul alveolar inter-radicular; T - celulele izolate din osul
tuberozitar
În literatură, acesta a fost primul studiu in vitro care a comparat mai multe
tipuri de celule stem mezenchimale umane izolate din țesuturile orale din perspectiva
potențialului osteogen indus de matricile de Ti pur sau condiționate cu HAP, obținute
prin tehnica SLM21. Rezultatele au fost publicate în lucrarea: Ilea A. et al., 201921.
În concluzie, celulele mezenchimale izolate din țesuturile cavității orale au
potențialul de a optimiza regenerarea osoasă, când sunt însămânțate pe matrici de Ti
netratate sau cu suprafața condiționată cu HAP, obținute prin SLM. Celulele osoase din
septul inter-radicular au prezentat o mare capacitate de proliferare și diferențiere
osoasă. Matricile de Ti, în special cele condiționate cu HAP au indus o mineralizare
precoce și în perspectivă ar putea avea aplicabilitate clinică în domeniul ingineriei
tisulare21.
4. Aspecte microscopice în modificările de volum ale

gingiei cu diverse etiologii
Modificările prin creșterea în volum a gingiei sunt reprezentate de hiperplazie și
hipertrofie, cu cauze variate. Din punctul de vedere al etiologiei, aceste leziuni pot
prezenta o componentă inflamatoare (în gingivita indusă de placa bacteriană), pot fi de
natură infecțioasă (bacteriană, virală sau fungică), pot fi asociate unor stări fiziologice
(tulburări hormonale legate de pubertate și sarcină) sau unor factori iritativi locali
(trauma ocluzală sau factori iatrogeni), pot reprezenta manifestarea orală a unor
patologii sistemice (diabet zaharat, leucemie) sau pot fi secundare tratamentului
medicamentos al unor boli generale (cu antihipertensive, antiepileptice și
imunosupresoare). Pentru stabilirea diagnosticului și decizia terapeutică, este
necesară abordarea interdisciplinară a pacientului în contextul patologiilor sistemice,
precum și completarea examenului clinic cu examinări paraclinice, inclusiv biopsia și
evaluarea aspectelor histologice ale leziunii.
4.1. Modificările de volum induse de terapia cu blocante ale

canalelor de Calciu
Blocantele canalelor de calciu reprezintă o clasă de medicamente cu efect
hipotensiv prin inhibarea influxului de ioni de Ca prin membrana celulară a fibrelor
musculare netede, a fibrelor musculare cardiace și a țesutului excitoconductor. Prin
aceste mecanisme, se produce relaxarea musculaturii netede din peretele vascular, cu
vasodilatație, reducerea forței și vitezei de contracție a miocardului, ceea ce determină
scăderea tensiunii arteriale. Impactul oral al terapiei cu blocante ale canalelor de Ca
este recunoscut prin creșterea de volum a gingiei. Din această grupă de medicamente,
Nifedipinul este cel mai des implicat în hiperplazia gingivală indusă medicamentos 183.
Clinic, creșterea de volum a gingiei se observă în relație cu dinții sau implantele

dentare, dar nu și în zonele edentate. Poate fi localizată sau generalizată, cu severitate
variată: de la formele ușoare, caracterizate prin creșterea papilei interdentare, până la
formele severe, cu afectarea extinsă a gingiei marginale și fixe. Histologic, epiteliul
gingival este îngroșat prin proliferarea celulară, dar și datorită inhibării apoptozei și
creșterii duratei de viață a celulelor epiteliale. Formarea crestelor epiteliale alungite
este rezultatul interacțiunii epitelio-mezenchimale și a factorilor locali care
controlează epidermopoieza și expresia unor integrine la nivelul celulelor epiteliale 184.
La nivelul corionului se pot observa proliferarea fibroblastelor și fibroză.
În cazul unui pacient de 57 ani, modificările de volum gingival au apărut pe
fondul tratamentului cu Nifedipin 10 mg/zi pentru hipertensiunea arterială. Patologia
asociată a pacientului a inclus diabetul zaharat de tip II, tratat cu Xiofor 1000 mg/zi,
obezitate de grad I, hepatită virală B, vene varicoase și ulcere la nivelul membrelor
inferioare, tratate cu Detralex 2 x 500 mg/zi 185.
La examenul endo-oral, s-a observat creșterea generalizată de volum a gingiei,
cu acoperirea parțială a coroanelor dentare în zona frontală a arcadelor maxilară și
mandibulară, cu ulcerații și sângerare spontană în zonele supuse impactului ocluzal
(Fig. 56 A).
Fig. 56. Aspectul clinic endo-oral al hiperplaziei gingivale induse de Nifedipin; A –

creșterea de volum a gingiei în zona frontală a arcadelor, cu diferite dimensiuni ale
papilelor interdentare și ulcerații; B – extracția molarului 1.7 și excizia gingiei
hiperplaziate; C – specimenele de gingie care au fost prelucrate histologic
În cadrul planului de tratament, s-a realizat remodelarea gingivală prin

gingivectomia țesuturilor hiperplaziate (Fig. 56 B), iar specimenele de gingie (Fig. 56
C) au fost prelucrate și examinate microscopic în colorație tricromică Goldner (Fig.
57).
Modificările histologice observate la nivelul gingiei au fost corelate cu patologia
sistemică și cu efectele tratamentului cu Nifedipin. Pe versantul gingival extern,
epiteliul oral a prezentat hiperplazie, keratinizarea stratului superficial, acantoza
straturilor bazal și spinos, cu formarea de creste epiteliale extinse profund în corion
(Fig. 57 A și B). Corionul profund a prezentat fibroză, cu numeroase fibre colagene
dispuse în fascicule groase și proliferarea fibroblastelor (Fig. 57 C) iar vasele au
prezentat pereți îngroșați și lumen îngustat (Fig. 57 C). Zonele de infiltrat inflamator
cronic au fost localizate în corionul papilar și perivascular Fig. 57 D).
Epiteliul sulcular de pe versantul intern al gingiei, care a venit în contact cu
suprafața lucrării protetice, a prezentat suprafața ulcerată, acoperită de depozite
necrotico-fibrinoide, și creste epiteliale subțiri, alungite în corion (Fig. 57 E și 57 F).
Procesul inflamator local s-a manifestat prin prezența unui număr mare de celule
tisulară
inflamatoare: polimorfonucleare neutrofile, macrofage și limfocite migrate în epiteliul
sulcular și concentrate în jurul vaselor de neoformație din corionul papilar (Fig. 57 F).
Aceste rezultate au fost publicate în capitolul de carte Băbțan et al., 2020185.
Fig. 57. Aspectele histologice ale specimenelor de gingie hiperplaziată: A – imagine de ansamblu
a gingiei; B – epiteliul oral cu zone de keratinizare și creste epiteliale adânci; C – corionul cu arii
de fibroză și vase cu peretele îngroșat; D – infiltrat inflamator în jurul vaselor din corion; E –
epiteliul sulcular ulcerat, cu depozite necrotico-fibrinoide și creste epiteliale alungite; F – vase
situate superficial în corionul papilar și infiltrat inflamator în corion și epiteliu; colorație
tricromică Goldner
Diagnosticul prezumtiv al acestor leziuni se bazează pe aspectul clinic și

asocierea cu tratamentul cu blocante ale canalelor de Ca, iar diagnosticul de precizie se
pune pe baza examinărilor microscopice.
Pentru prevenirea hiperplaziei gingivale asociate tratamentului cu Nifedipin,
este necesară o abordare multidisciplinară a afecțiunilor generale și orale. O primă
opțiune terapeutică este adaptarea medicației antihipertensive, prin înlocuirea
blocantelor canalelor de Ca cu o altă clasă de medicamente, cum ar fi: inhibitorii
enzimei de conversie, β-blocantele sau diureticele, substanțe care nu prezintă efecte
secundare la nivelul mucoasei orale184. Managementul pe termen lung al hiperplaziei
gingivale induse medicamentos impune metode non-chirurgicale de controlare a
proceselor inflamatoare locale și chirurgicale de excizie a țesuturilor hiperplaziate186.
Tratamentul stomatologic include măsuri de combatere a plăcii bacteriene și a
inflamației locale, prin igienă orală efectuată de pacient (periaj, clătiri cu substanțe
antiseptice) și prin igiena profesională: detartraj, planare radiculară, îndepărtarea
lucrărilor protetice și obturațiilor necorespunzătoare care favorizează iritația cronică a
gingiei186, 186. În cazul în care schimbarea medicației antihipertensive nu aduce
ameliorări ale manifestărilor orale, sau în situația unei creșteri excesive a volumului
gingival care interferează cu funcțiile aparatului dento-maxilar, se impune tratamentul
chirurgical de gingivectomie clasică, cu bisturiul, cu laser sau electrochirurgie186, 187.
4.2. Modificările de volum în infecția cu cu virusul Papilloma

uman
Virusul Papilloma uman (HPV) face parte din familia Papillomaviridae care
include 16 genuri diferite. Este un virus cu tropism epitelial, fiind responsabil de
infecții ale tegumentului și mucoasei cavității orale, căilor respiratorii superioare și
tractului ano-genital. Genurile alfa și beta sunt asociate carcinogenezei la nivelul
tegumentului și mucoaselor 188. De asemenea, infecțiile cu HPV pot fi recurente 189.
Leziunile produse de HPV în cavitatea orală pot fi benigne: papilomul oral cu
celule scuamoase, hiperplazia epitelială focală (boala Heck), condilomul acuminat,
veruca vulgară, sau maligne: carcinomul oral cu celule scuamoase și adenocarcinomul
de glande salivare 189.
Aspectele clinice sunt sugestive pentru etiologia virală: leziunile sunt de tip
papilomatos sau sesil, în condițiile unei ceșteri lente. Identificarea unor veruci cutanate
la nivelul mâinilor sau în alte zone poate fi utilă în diagnostic.
În cazul unui pacient în vârstă de 9 ani care s-a prezentat în cadrul
Departamentului de Reabilitare Orală, la examenul clinic endo-oral, a fost decelată o
formațiune vegetantă, localizată la nivelul marginii gingivale libere și a gingiei atașate
corespunzătoare dintelui 2.1., atât pe versantul vestibular cât și palatinal. Leziunea
prezenta un aspect sesil, cu bază largă de implantare, cu suprafața neregulată, fără
modificări de culoare sau ulcerații. Examenul radiologic a indicat absența modificărilor
osoase subiacent leziunii (Fig. 58) 190. Leziunea a fost excizată și a fost pelucrată
histologic în vederea examenului microscopic.
tisulară
Fig. 58. Aspectele clinic și radiologic ale papilomului: A – pe versantul vestibular: leziune cu
suprafața papilară la nivelul marginii gingivale libere a dintelui 2.1. și mici leziuni viloase
localizate pe gingial fixă (săgețile); B - pe versantul palatinal: leziune cu suprafața verucoasă,
extinsă de la marginea liberă a gingiei înspre fibro-mucoasa palatinală; C – obiceiul vicios de
interpunere a buzei inferioare; D – ocluzia adâncă frontală cu treaptă sagitală; E –
ortopantomografie care a prezentat dentiția mixtă, concordantă cu vârsta pacientului; F –
radiografie retroalveolară la nivelul lui 2.1. care a demonstrat absența modificărilor osului
alveolar adiacent leziunii
Examenul histologic a permis stabilirea diagnosticului de papilom scuamos oral

și a relevat prezența modificărilor citopatice caracteristice infecției cu HPV: koilocitoză
la nivelul straturilor spinos și superficial, diskeratoză, hiperkeratoză și acantoză (Fig.
59)190. Aspectul papilomatos s-a datorat crestelor epiteliale adânci și papilelor
conjunctive pronunțate. Pe versantul extern al gingiei libere s-au observat papile
conjunctive înalte și epiteliul cu semne de acantoză și koilocitoză în straturile
superficiale. Pe versantul intern al gingiei s-au observat focare inflamatoare dense
asociate epiteliului sulcular și proliferarea crestelor epiteliale extinse în corion (Fig. 59
A). Acantoza epiteliului oral s-a manifestat prin hiperplazia difuză a celulelor din
straturile bazal și spinos (Fig. 59 B). Adiacent epiteliului oral s-au observat focare
inflamatoare limfo-plasmocitare și tulburări ale microcirculației de tipul vasodilatației
și stazei (Fig. 59 C). Celulele din epiteliul sulcular au prezentat distrofie, edem și
disjuncție intercelulară; în epiteliu s-au observat celule inflamatoare migrate:
macrofage și polimorfonucleare. În corion erau prezente focare inflamatoare cu
mononucleare (Fig. 59 D). Aspectele caracteristice ale infecției cu HPV în epiteliul oral
au inclus: koilocitoza, în care celulele epiteliale au prezentat nuclei picnotici și halouri

perinucleare (Fig. 59 E), precum și diskeratoza și nucleii multipli (Fig. 59 F)190.
Fig. 59. Aspectul microscopic al papilomului scuamos oral: A – secțiune transversală prin
marginea gingivală liberă: suprafața papilomatoasă a leziunii, cu acantoză și koilocitoză a
epiteliului oral și cu infiltrat inflamator dens asociat epiteliului sulcular și prezența crestelor
epiteliale pe versantul intern; B – epiteliul oral cu semne de acantoză; C – focare inflamatoare
cronice în corion; D – diferite grade de distrofie și disjuncție intercelulară în epiteliul sulcular;
infiltrat inflamator în corion; E – koilocitoza celulelor din epiteliul oral; F – diskeratoză și
prezența nucleilor multipli în epiteliul oral; colorație tricromică Goldner
Tratamentul chirurgical a presupus excizia leziunii cu o margine de siguranță de

1 mm și în profunzime până la nivelul periostului osului alveolar191.
Infecțiile orale cu tipurile 6 și 11 de HPV prezintă un risc oncologic redus, însă
tipurile 16, 18, 31, 32 și 52 pot fi co-factori în carcinogeneza orală 191, 192, motiv pentru
care este necesară determinarea tipului de HPV. În acest caz, rezultatele RT-PCR au
fost pozitive pentru tipurile 6/11, și negative pentru tipurile cu risc crescut191.
Rezultatele acestui studiu au fost publicate în lucrarile: Ilea A. et al., 2015189 și Ilea A. et
al., 2016190.
În concluzie, diagnosticul de papilom oral consecutiv infecției cu HPV poate fi
suspicionat pe baza examenului clinic local (aspectul caracteristic al leziunii) și general
(asocierea altor leziuni verucoase tegumentare) și a datelor anamnestice. Examenul
histopatologic este necesar pentru completarea diagnosticului și pentru a exclude alte
leziuni proliferative, cum ar fi carcinomul scuamos oro-faringian. În plus, etiologia
tisulară
virală trebuie confirmată prin determinarea genotipului viral, iar tipul de HPV este
esențial în stabilirea abordării terapeutice și a evaluărilor periodice.
4.3. Modificările de volum în leziunile granulomatoase ale

cavității orale
Granuloamele cu celule gigante sunt leziuni reactive hiperplazice asociate cu
diferite țesuturi ale cavității orale. Sunt descrise două entități, după localizare, etiologie
și evoluția clinică: granulomul periferic și granulomul central 193, 194.
Granulomul periferic cu celule gigante (peripheral giant cells granuloma -
PGCG), denumit și epulis, este o leziune relativ comună a cavității orale care apare prin
proliferarea țesuturilor moi, ca o consecință a traumei locale sau a iritației cronice.
Este localizat la nivelul gingiei, mucoasei alveolare, mucoperiostului sau parodonțiului,
în raport strâns cu dinții 195. PGCG poate să apară la orice vârstă, prezintă o evoluție
lentă, asimptomatică și activitate osteolitică redusă 196.
Granulomul central cu celule gigante (central giant cells granuloma - CGCG) se
dezvoltă în oasele maxilare ca reacție față de factori necunoscuți; în unele cazuri, a fost
asociat cu implantele dentare și cu procesele inflamatoare sau hemoragiile intraosoase.
CGCG sunt mai frecvente la copii și tineri, iar din punctul de vedere al evoluției, pot fi
non-agresive, cu creștere lentă, sau agresive, caracterizate prin creștere accentuată și
osteoliză, ceea ce conduce la complicații locale, durere intensă și risc mare de
recurență197.
Deși prezintă etiologie și evoluție diferite, PGCG și CGCG au aceleași
caracteristici histologice.
Din punct de vedere histologic, PGCG nu este un neoplasm, ci un tip particular
de inflamație cronică, denumită inflamație granulomatoasă. Acest tip de leziune se
caracterizează prin prezența unor celulele mononucleare (mononuclear cells - MCs),
derivate din lineajul monocit-macrofag196. Ca răspuns față de diverși corpi străini, MCs
fuzionează și formează celule gigante multinucleate (multinucleated giant cells -
MGCs) 197, care au dimensiuni de 40 – 50 μm și conțin până la 50 de nuclei196.
Pentru a studia aspectele particulare ale MGCs în PGCG, au fost prelevate
specimene gingivale de la doi pacienți care prezentau leziuni exofitice localizate la
nivelul gingiei, în zone supuse traumei ocluzale (Fig. 60 A) sau în zonele de retenție a
detritusurilor alimentare sau plăcii bacteriene (Fig. 60 B) 198, 199.
La examinarea intraorală, leziunea s-a prezentat sub forma unei mase sesile cu
bază largă de implantare, în zona retroincisivă (Fig. 60 A) sau avea un aspect pediculat,
adiacent resturilor radiculare ale dintelui 4.6 (Fig. 60 C). Radiologic, s-a observat o
radiotransparență a septului osos interdentar 1.1 și 2.1 (Fig. 60 B), respectiv a osului
alveolar corespunzător rădăcinilor dintelui 4.6 și supradimensionarea spațiului
parodontal (Fig. 60 D) 189, 199.
Fig. 60. Aspectele clinice și radiologice ale PGCG: A – PGCG localizat pe palatul dur, retroincisiv; B
– radiografia retroalveolară care prezintă o radiotransparență a septului osos interdentar 1.1 și
2.1; C – PGCG asociat resturilor radiculare ale dintelui 4.6; D – detaliu al ortopantomografiei cu
radiotransparență a crestei alveolare și lărgirea spațiului parodontal. PGCG – granulom periferic
cu celule gigante
La examenul histologic, PGCG a prezentat o structură bine delimitată, fiind

alcătuit din numeroase MCs și MGCs dispersate într-o stromă conjunctivă cu
vascularizație bogată (Fig. 61 A)189, 199. Capilarele de la periferie au fost asociate cu
focare hemoragice, hematii extravazate și depozite de hemosiderină (Fig. 61 B)189, 199.
Pe suprafața leziunii, epiteliul prezenta zone de hiperkeratoză și zone de ulcerație
acoperite de depozite fibrinoid - necrotice asociate cu un infiltrat inflamator cronic în
profunzime (Fig. 61 C, D)199.
tisulară
Fig. 61. Aspectul microscopic al PGCG: A – leziune bine delimitată, neîncapsulată localizată la
nivelul corionului gingival; B – vase asociate cu hemoragie interstițială; C și D – ulcerație a
epiteliului gingival (săgeata) și focare de infiltrat inflamator cronic (asterisc); colorație
tricromică Goldner; PGCG – granulom periferic cu celule gigante
MCs se aflau în strânsă legătură cu MGCs și au prezentat o morfologie

heterogenă, cu formă ovalară sau alungită, asemănătoare celulelor mezenchimale sau
fibroblastelor tinere (Fig. 62 A)199. MGCs au fost distribuite neuniform în stroma
conjunctivă, printre MCs și celulele inflamatoare; în unele zone, MGCs au fost prezente
în vecinătatea vaselor sanguine (Fig. 62 B)199. MGCs au prezentat o morfologie variată,
privind dimensiunea, cantitatea și culoarea citoplasmei, numărul și aspectul nucleilor
(Fig. 62 C)198, 199. Au fost observate două tipuri principale de MGCs. MGCs active au fost
mari, cu formă neregulată, citoplasma abundentă acidofilă și nuclei multipli, eucromi
distribuiți în întreaga citoplasmă. MGCs inactive aveau dimensiuni mai reduse,
citoplasma întunecată și nucleii hipercromi, condensați în centrul celulei, ceea ce a
sugerat diferite stadii de apoptoză (Fig. 62 D)198, 199. Coexistența MGCs active și
apoptotice în cadrul PGCG sugerează că aceste celule au un ciclu de viață
unidirecțional: se formează prin fuzionarea MCs, ating potențialul funcțional maxim,
apoi degenerează; în final, MGCs sunt eliminate și înlocuite de alte celule nou
formate199. Aceste rezultate au fost publicate în lucrările: Boșca AB et al., 2015198 și
Boșca AB et al., 2018199.
Fig. 62. Aspectul microscopic al MCs și MGCs în PGCG: A – MCs ovalare și fusiforme în stroma
conjunctivă a leziunii (săgețile); B – MGCs distribuite neuniform în întreaga leziune (asterisc); C
– MCs asociate MGCs cu aspect heterogen; D – cele două tipuri de MGCs: active, cu citoplasma
abundentă și numeroși nuclei eucromi, și inactive, cu citoplasma condensată și nucleii
hipercromi; colorație tricromică Goldner; MCs – celule mononucleare; MGCs – celule gigante
multinucleate; PGCG – granulom periferic cu celule gigante
Deși MGCs sunt elementul histologic caracteristic al granuloamelor cavității

orale, activitatea biologică și implicarea în mecanismele patogenetice în cadrul acestor
leziuni nu sunt pe deplin cunoscute. Numeroase dovezi susțin ideea conform căreia
MGCs nu sunt celule funcționale principale în cadrul granuloamelor, ci elemente
reactive, secundare, care se formează prin fuzionarea MCs de tip monocit/macrofag
diferențiate în precursori osteoclastici sub influența citokinelor197. În schimb, MCs sunt
elementele principale. Pe de o parte, acestea compun compartimentul proliferativ al
leziunii și prin diferențierea lor, dau naștere MGCs; pe de altă parte, MCs sunt
responsabile de activitatea biologică a granulomului (Fig. 63)199, 200.
tisulară
Fig. 63. Mecanismele care stau la baza activității biologice a MGCs; citokinele și factorii de
creștere eliberați de celulele mononucleare de tip fibroblast/osteoblast și macrofag/histiocit
sunt implicați în recrutarea, proliferarea, diferențierea, fuzionarea și activarea osteoclastelor;
enzimele proteolitice secretate de osteoclaste induc rezorbția osoasă; ATP6V0d2: Adenosine-
triphosphatase (ATPase), H+ transporting, lysosomal 38 kDa, V0 subunit d2; bFGF: Basic
fibroblast growth factor; c-Src: Proto-oncogene tyrosine-protein kinase Src; DC-STAMP:
Dendritic cell- specific transmembrane protein; IL: Interleukin; M-CSF: Macrophage colony-
stimulating factor; MCs: celule mononucleare; MGCs: celule gigante multinucleare; MMP-9:
Metaloproteinaza-9; RANK: Receptor activator of nuclear factor kappa-Β; RANKL: RANK ligand;
Syk: Spleen tyrosine kinase; TGF-β: Transforming growth factor-beta; TNF-α: Tumor necrosis
factor-alpha; TRAP: Tartrate-resistant acid phosphatase; VEGF: Vascular endothelial growth
factor; VNR αvβ3: Vitronectin receptor αvβ3.
Dat fiind că PGCG și CGCG sunt leziuni reactive, cu aceleași mecanisme

patogenetice și aspecte histologice comune, principala diferență între acestea este
localizarea și evoluția clinică. Prin urmare, în abordarea terapeutică a celor două tipuri
de leziuni trebuie să se țină cont de localizare, extindere și riscul de recurență.
La momentul actual, există unele aspecte incomplet elucidate privind
histogeneza și mecanismele care favorizează diferențierea și activarea MCs și a MGSc
în granuloamele cavității orale. În perspectivă, cercetările privind inter-relația dintre
mecanismele patogenetice și evoluția clinică vor facilita dezvoltarea unor protocoale
terapeutice complexe, care să combine tratamentul chirurgical cu anumite metode
adjuvante (de ex. administrarea de corticosteroizi, calcitonină, interferon sau
bisfosfonați) 201, pentru un management mai eficient al granuloamelor orale.
5. Metode de evaluare a metainflamației la nivelul

cavității orale în contextul afecțiunilor sistemice
AGEs sunt implicați în inflamația cronică de intensitate joasă care stă la baza
sindromului metabolic. Deși numeroase studii au demonstrat o asociere strânsă între
acumularea AGEs și apariția sau agravarea bolilor metabolice, deocamdată nu s-a
introdus utilizarea de rutină a metodelor de cuantificare a AGEs pentru diagnosticul
sau monitorizarea afecțiunilor generale sau orale24, 25. Există două surse principale de
AGEs: exogeni și endogeni. Sursa exogenă este reprezentată de: dieta care conține
dAGEs (dietary AGEs) formați în timpul prelucrării alimentelor la temperaturi înalte
uscate, expunerea la radiații ultraviolete, microunde, ultrasunete și compușii din fumul
de țigară. AGEs endogeni sunt formați prin glicarea proteinelor în cadrul unui profil
metabolic tipic, caracterizat prin stres oxidativ, hiperglicemie și hiperlipidemie.
Progresul în cunoașterea la nivel molecular a proceselor fiziopatologice care
acompaniază afecțiunile induse de AGEs a condus la recunoașterea rolului CML în
metainflamație și procesele mediate de stresul oxidativ34.
Alterările tisulare induse de AGEs în diferite țesuturi au fost atribuite efectelor
pro-oxidant și inflamator. Efectele biologice ale AGEs sunt exercitate prin două
mecanisme: unul independent de receptor, care constă în alterarea structurii
proteinelor și perturbarea metabolismului matricii extracelulare, și altul dependent de
receptor, care implică interacțiunea cu receptorul RAGE. Această interacțiune
determină activarea în cascadă a unor căi de semnalizare intracelulare, care conduc la
activarea NF-κB (factorul nuclear κB) și translocarea acestuia în nucleu, unde va
induce transcripția genelor pentru citokinele pro-inflamatoare, factorii de creștere și
moleculele de adeziune, cu producerea consecutivă de promotori ai inflamației. În plus,
interacțiunea dintre AGEs și receptorii RAGE activează NAD(P)H oxidaza, un complex
de enzime care produc superoxid, și astfel crește nivelul stresului oxidativ
intracelular34.
Datorită acumulării continue a AGEs exogeni și endogeni în țesuturi și fluidele
biologice, acești compuși sunt considerați biomarkeri ai procesului de îmbătrânire. Se
consideră că AGEs joacă un rol în modificările tegumentare asociate îmbătrânirii
deoarece AGEs se acumulează în matricea extracelulară stabilind legături cu fibrele de
colagen și elastină și astfel afectează elasticitatea pielii. AGEs alterează funcțiile
celulare prin glicarea proteinelor, iar interacțiunea AGEs-RAGE inițiază mecanismele
patogenetice inflamatoare la nivel local 202.
Manifestările orale ale bolilor sistemice sunt ușor de recunoscut la examenul
clinic și pot fi utile în screening-ul, diagnosticul și controlul afecțiunii de bază, pentru
optimizarea calității vieții pacientului. Deși majoritatea afecțiunilor orale sunt
consecința mecanismelor patogenetice inițiate de microorganismele plăcii bacteriene,
țesuturile orale pot prezenta modificări cauzate de patologiile care afectează
predominant alte sisteme sau organe 203. Numeroase studii au demonstrat prezența
manifestărilor orale asociate diverselor boli sistemice, cum ar fi: bolile cardiovasculare,
diabetul sau hipertensiunea, care sunt încadrate în sindromul metabolic 204. Cele mai
frecvente leziuni ale mucoasei orale în bolile sistemice sunt ulcerațiile și plăcile albe.
Ulcerațiile pot fi asociate infecțiilor, dermatozelor, bolilor hematologice, gastro-
intestinale și maligne. Plăcile albe sunt reprezentate de candidoză, lichenul plan,
tisulară
leukoplazia și hiperkeratozele de cauză necunoscută204. Totuși, există și manifestări
discrete care nu pot fi decelate clinic, sub forma unor modificări morfologice ale
celulelor epiteliale descuamate de la nivelul mucoasei orale208. Citologia exfoliativă
este considerată o metodă non-invazivă care oferă posibilitatea examinării celulelor
epiteliale orale pentru diagnosticul sau screening-ul diverselor patologii. În studiul
nostru, am folosit această metodă și am obținut citoblocuri din celulele epiteliale orale
pentru a detecta prezența modificărilor morfologice celulare în colorație H-E.
La nivelul tegumentului din regiunea cervico-facială, ultrasonografia de înaltă
frecvență (HFU) poate evalua procesele fiziologice, cum este îmbătrânirea, sau
patologice: tumorile benigne sau maligne, inclusiv modificările mai discrete asociate
unor patologii generale care au ca numitor comun metainflamația. Una dintre
tendințele moderne este translatarea investigației HFU de la tegument la mucoasa
orală. În studiul clinic condus în cadrul proiectului SALIVAGES, am folosit această
metodă de examinare pentru evaluarea metainflamației la nivelul țesuturilor cavității
orale.
Diagnosticul clinic este, adesea, stabilit pe baza unor proceduri invazive pentru
determinarea biomarkerilor serici specifici anumitor stări patologice. Deși biomarkerii
serici sunt considerați cei mai relevanți pentru diagnostic 205, cercetările recente s-au
concentrat asupra identificării și evaluării biomarkerilor din diverse alte fluide
biologice: salivă, secreția sudoripară sau lacrimală 206, 207. În vederea identificării sau
cuantificării unor compuși, biosenzorii salivari prezintă avantajul contactului
permanent cu saliva, datorită dimensiunii mici a senzorilor electrochimici sau optici
care sunt incluși în dispozitivele intra-orale, cum ar fi gutierele. Acești biosenzori oferă
posibilitatea monitorizării pacienților prin intermediul unui transmițător wireless și a
unui dispozitiv de colectare a datelor 208.
5.1. Citoblocul de mucoasă orală

Citologia exfoliativă, datorită preciziei și eficienței, prezintă aplicabilitate ca
metodă de diagnostic în diverse afecțiuni, inclusiv în leziunile mucoasei orale.
Evaluarea microscopică a celulelor exfoliate de la nivelul mucoasei orale și incluse într-
un citobloc poate furniza date suplimentare privind aspectele morfologice asociate
unor boli cronice, cum sunt diabetul zaharat și hipertensiunea arterială, sau poate
indica prezența modificărilor precoce în leziunile neoplazice orale. Patogeneza acestor
afecțiuni este infuențată de numeroși factori genetici și de risc, și este adesea asociată
stilului de viață. Măsurile de screening în cadrul populației permit detectarea precoce a
acestor boli și prevenirea complicațiilor sau a altor patologii asociate, care reduc
calitatea vieții. Screening-ul este indicat pentru observarea modificărilor citologice din
mucoasa aparent normală, și este util în special la pacienții fumători și consumatori de
alcool, cu un important risc de apariție a leziunilor premaligne și maligne.
Citoblocurile prezintă numeroase avantaje față de frotiuri, care trebuie
prelucrate imediat, nu pot fi păstrate timp îndelungat și nu permit efectuarea anumitor
colorații speciale. Prin comparație cu biopsia, citoblocul pe bază de citologie exfoliativă
este o metodă de screening non-invazivă, recoltarea este nedureroasă și bine tolerată
de pacienți. În plus, manopera de recoltare este reproductibilă, este facilă și fezabilă în
cabinet de către medicul stomatolog. Metoda permite prelevarea unui număr suficient
de celule pentru decelarea modificărilor citologice 209. În situațiile în care citologia
exfoliativă indică modificări de tip malign sau cu potențial malign, este necesară
completarea datelor prin realizarea unui examen histopatologic bazat pe biopsie.
În cadrul unui studiu clinic, am prelevat celule epiteliale descuamate din
mucoasa orală și am examinat aspectele microscopice în colorație H-E pentru a evalua
modificările legate de patologia generală și stilul de viață. Studiul a fost prezentat în
capitolul de carte Boșca AB et al., 2020209.
Au fost examinate specimenele prelevate de la 4 pacienți. Pentru fiecare pacient,
au fost înregistrate datele antropometrice (Tabelul XVI), patologiile generale și datele
referitoare la: alimentație, consumul de tutun și alcool. Toți pacienții au fost
nefumători, iar pacienții cu numerele 42 și 45 nu au prezentat patologii generale și nu
au consumat alcool. Pacientul nr. 36 a menționat ca antecedente patologice
hipertensiunea arterială, hepatomegalia și tiroidectomia, și a declarat consumul de
băuturi spirtoase zilnic, de mai multe ori. Pacientul nr. 43 nu a prezentat boli generale,
și a declarat consumul ocazional de vin.
Tabelul XVI. Datele antropometrice ale pacienților și patologiile generale asociate

Pacient Gen Vârstă Înălțime Greutate BMI Grăsime Grăsime Masa
(ani) (cm) (kg) corporală viscerală musculară
36 F 53 163 94,4 35,5 50,6% 12 21,6%
42 F 25 158 54,9 22 32,4% 4 27,7%
43 F 68 155 64,4 26,8 35,2% 9 28,4%
45 F 32 157 63,7 25.8 37,4% 6 27,1%
Celulele epiteliale au fost prelevate cu ajutorul unui dispozitiv Citobrush prin

mișcări ușoare de raclare a mucoasei orale de pe fața internă a obrajilor, buzelor și de
pe fața ventrală a limbii (Fig. 64A).
Fig. 64. Citologia exfoliativă a celulelor epiteliale orale: A - Prelevarea celulelor epiteliale cu
dispozitivul Citobrush; B și C – Suspendarea celulelor epiteliale în soluția PapSpinTM
Celulele au fost suspendate într-un tub Falcon de 15 ml, în 3 ml de soluție

PapSpinTM (Fig. 64 B și 64 C) și centrifugate timp de 10 min. la 600 rotații/minut.
Celulele epiteliale au sedimentat pe baza tubului iar supernatantul a fost eliminat prin
tisulară
decantare. Pentru fixarea celulelor, s-au adăugat 3 ml de alcool absolut și apoi
conținutul a fost vortexat pentru resuspendarea celulelor și re-centrifugat timp de 10
min. la 600 rotații/minut, iar supernatantul rezultat a fost decantat. După fixare,
celulele au fost incluse în HistoGelTM. În tub au fost adăugați 300 ml de HistoGelTM
lichefiat, tubul a fost vortexat pentru omogenizarea conținutului, și prin centrifugare
timp de 10 min. la 600 rotații/minut s-a obținut sedimentarea celulelor la baza tubului
(Fig. 65).
Fig. 65. Prelucrarea celulelor epiteliale din mucoasa orală pentru obținerea
citoblocurilor: A – fixarea cu alcool; B- centrifugarea timp de 10 min. la 600 rotații/minut; C –
celulele sedimentate la baza tubului falcon; D – adăugarea HistoGelTM lichefiat; E – celulele
sedimentate în HistoGelTM
Tuburile au fost păstrate la -20°C pentru solidificare până la prelucrarea

histologică. Blocurile de HistoGelTM au fost extrase din tuburi și incluse în parafină
pentru obținerea citoblocurilor (Fig. 66).
Fig. 66. Obținerea blocurilor de parafină pe baza preparatului de HistoGelTM: A –

preparatul de HistoGelTM înghețat; B – conul de HistoGelTM extras din tubul Falcon; C –
includerea conului de HistoGelTM în parafină
Preparatele de citobloc au fost secționate cu microtomul la grosimea de 5 μm

și au fost colorate cu H-E. Aspectele histopatologice au fost corelate cu datele
antropometrice și cu patologia generală asociată. Imaginile microscopice au
demonstrat prezența celulelor epiteliale din straturile superficial și intermediar, cu
diferite modificări morfologice ale nucleilor și citoplasmei, precum și prezența unor
colonii microbiene. Celulele din stratul superficial au prezentat nuclei picnotici, iar cele
din stratul intermediar au avut nuclei ovalari, mai mari, eucromi. În cazul pacientului
36, s-a observat creșterea numărului de celule din stratul intermediar, iar celulele
superficiale au avut citoplasma condensată și diametrul mai redus (Fig. 67).
tisulară
Fig. 67. Aspectul microscopic al preparatelor de citobloc de mucoasă orală care demonstrează
modificările morfologice ale celulelor epiteliale descuamate; A – pacientul 36: prezența celulelor
superficiale cu nuclei picnotici și citoplasma condensată și a unui număr mare de celule din
stratul intermediar, cu nucleii eucromi nucleolați; colonii microbiene asociate celulelor
epiteliale; B – pacientul 42: celule superficiale de aspect normal, cu nuclei hipercromi; C –
pacientul 43: celule superficiale cu nucleii hipercromi și citoplasma granulară; D – pacientul 45:
celule superficiale aplatizate și colonii microbiene
Aceste rezultate preliminare au indicat, în trei dintre cazuri, aspecte normale ale
celulelor superficiale și intermediare din epiteliul mucoasei orale, fără modificări care
ar putea suspiciona prezența unor leziuni premaligne sau maligne. La pacientul 36,
este posibil ca modificările procesului de maturare celulară să fie asociate consumului
de alcool.
Datele obținute prin citologia exfoliativă sunt corelate cu turnover-ul fiziologic
al epiteliului mucoasei orale, care presupune o exfoliere constantă a celulelor. În
specimenele prelevate cu Cytobrush, sunt prezente celule epiteliale din stratul
superficial și intermediar. Consumul de tutun și alcool este asociat cu reducerea
dimensiunii celulare și apariția unui număr mai mare de celule parabazale pe frotiurile
de citologie exfoliativă 210. În cazul leziunilor maligne, pe preparate pot apare și celule
din stratul bazal, datorită pierderii coeziunii intercelulare, iar raportul nucleu-
citoplasmă este considerat principalul semn de malignitate 211. Analiza cantitativă
bazată pe evaluarea anumitor parametri, cum sunt: aria nucleară, aria citoplasmatică și
raportul dintre aria nucleară și citoplasmatică cresc sensibilitatea citologiei exfoliative
pentru diagnosticul precoce al cancerului oral. Aceste analize cantitative sunt precise,
obiective și reproductibile 212.
În perspectivă, studiul va include un număr mai mare de pacienți, iar pe baza

preparatelor de citobloc din mucoasa orală vor fi efectuate colorații imunohistochimice
pentru a evalua acumularea intracelulară a CML și a altor AGEs asociați
metainflamației la pacienții cu sindrom metabolic.
5.2. Ultrasonografia de înaltă frecvență

Glicarea este unul din mecanismele endogene ale procesului de îmbătrânire care
se produce spontan în timp, dar poate fi patologică în diabet, insuficiența renală și
inflamație 213. Reacția de glicare este accelerată în condiții de hiperglicemie și stres
oxidativ, ceea ce explică implicarea acesteia în patogeneza complicațiilor diabetului și
în îmbătrânire203. Stresul oxidativ joacă un rol important în formarea și acumularea
AGEs, fiind implicat în progresia bolilor cronice, inclusiv diabetul zaharat și
îmbătrânire. Stresul oxidativ este alimentat de generarea în exces a ROS prin auto-
oxidarea glucozei și prin legarea covalentă, non-enzimatică, a moleculelor de glucoză la
proteinele circulante, ceea ce duce la formarea de AGEs215.
AGEs prezintă niveluri tisulare crescute în bolile degenerative asociate
îmbătrânirii, iar la pacienții diabetici determină alterările vasculare care conduc la
vasculopatia diabetică215. Sunt descrise trei mecanisme principale prin care AGEs
induc distrucții ale matricii extracelulare și celulelor, contribuind astfel la îmbătrânire
și bolile asociate vârstei: (i) acumularea și legarea AGEs la componentele matricii, în
special la fibrele colagene și elastice, determină scăderea elasticității țesutului
conjunctiv; (ii) glicarea proteinelor intracelulare alterează funcțiile celulare; (iii)
interacțiunea AGEs cu receptorii specifici RAGE declanșează activarea mecanismelor
inflamatoare, generarea ROS și apoptoza 214. Scăderea elasticității tisulare afectează în
mod particular vasele sanguine, și s-a demonstrat că nivelurile serice ale CML sunt
corelate cu rigiditatea vasculară la persoanele în vârstă 215. Alterarea echilibrului dintre
sinteza și degradarea matricii extracelulare prin glicarea proteinelor afectează
rezistența mecanică a accelerează îmbătrânirea tegumentului 216. La bolnavii cu
sindrom metabolic, alterarea fibrelor de colagen induce modificări ale dermului, care
pot fi determinate prin examinarea ecografică. La nivel tegumentar, glicarea
colagenului și acumularea AGEs pot fi evidențiate și măsurate cu HFU datorită
fluorescenței structurilor afectate26, 217. În plus, expunerea tegumentului la fumul de
țigară favorizează producerea de ROS. Toate aceste mecanisme conduc la manifestările
clinice asociate îmbătrânirii cutanate, proces care poate fi evaluat prin HFU.
În cadrul proiectului SALIVAGES, într-un studiu clinic care a inclus 102 pacienți,
am utilizat HFU pentru a investiga existența unei corelații între parametrii ecografici ai
țesuturilor moi din zona maxilo-facială și starea de sănătate a pacienților. Au fost
comparate diferențele dintre parametrii morfologici evaluați prin HFU în zonele
expuse radiațiilor ultraviolete (luând ca reper tegumentul din zona zigomatică) și
zonele non-expuse (mucoasa orală de pe fața internă a buzei inferioare) la pacienții
sănătoși și cei cu sindrom metabolic, luând în considerare fenotipul cutanat evaluat
conform clasificării Fitzpatrick, procesul de îmbătrânire și fumatul. Studiul a fost
aprobat de Comisia de Etică a Universității de Medicină și Farmacie „Iuliu Hațieganu”,
Cluj-Napoca, nr. 93/08.03.2017 și a fost obținut consimțământul informat al
pacienților înrolați în studiu. Acest studiu a fost publicat în capitolul de carte Băbțan
AM et al., 2020217 și în lucrările: Băbțan AM et al., 201928 și Băbțan AM et al., 201827.
tisulară
Pentru evaluarea stării de sănătate, au fost determinați parametrii
antropometrici și serologici și au fost înregistrate afecțiunile asociate sindromului
metabolic: tensiunea arterială, bolile cardiovasculare, dislipidemia și diabetul tip I sau
II. Investigațiile ecografice au fost efectuate cu un aparat DUB® cutis, Taberna Pro
Medicum, Im Dorf, L€uneburg și o sondă de 22 MHz. Structurile evaluate au cuprins:
epidermul, dermul și hipodermul din zona expusă radiațiilor UV (Fig. 68) și respectiv
epiteliul oral, corionul și submucoasa din zona non-expusă (Fig. 69). Parametrii
ecografici măsurați au fost: grosimea, numărul de pixeli (px) și densitatea țesuturilor.
Fig. 68. Aspectul ecografic al tegumentului din zona zigomatică: 1 – folia care acoperă
transductorul; 2 – stratul de gel; 3 – epidermul; 4 – dermul superficial; 5 – dermul profund; 6 –
hipodermul; 7 – mușchiul zigomatic
Fig. 69. Aspectul ecografic al mucoasei orale de pe fața internă a buzei inferioare: 1 – folia care
acoperă transductorul; 2 – stratul de gel; 3 – epiteliul mucoasei; 4 – corionul; 5 – submucoasa; 6
– glande salivare minore; 7 – mușchiul orbicular al buzei
La pacienții cu boli cardiovasculare și hipertensiune arterială, densitatea

țesuturilor a fost semnificativ scăzută. Aceste modificări pot fi explicate prin faptul că
bolile cardiovasculare se asociază cu un status pro-inflamator caracterizat prin
producerea de interleukine (IL-1, IL-6, IL-17, IL-18), TGF-β și TNF-α. Citokinele pro-
inflamatoare controlează remodelarea tisulară prin stimularea degradării matricii
extracelulare și favorizează producerea de AGEs, peroxidarea lipidelor și formarea
ROS 218.
La bolnavii cu sindrom metabolic s-a observat o reducere semnificativă a
grosimii epidermului și dermului față de pacienții clinic sănătoși și odată cu înaintarea
în vârstă. Rezultate similare au fost raportate în literatură și explicate prin activarea
mecanismelor pro-inflamatoare și reducerea neurostimulării și hidratării
tegumentului 219, 220.
Pacienții fumători și în special cei vârstnici au prezentat o grosime crescută a
dermului, număr mai mare de pixeli și densitate mai scăzută a dermului și țesutului
subcutanat în comparație cu nefumătorii. Aceste modificări pot fi explicate prin
glicarea proteinelor structurale, alterarea colagenului și scăderea numărului de
fibroblaste.
Nu au existat diferențe semnificative ale parametrilor ecografici la pacienții cu
diabet zaharat față de pacienții sănătoși. În ceea ce privește densitatea tisulară, nu au
fost observate corelații semnificative cu vârsta sau cu starea de sănătate. Indicele de
masă corporală (BMI) a fost corelat semnificativ cu densitatea epidermului. La
pacientele de gen feminin, densitatea epidermului a fost semnificativ mai scăzută, iar
densitatea țesutului subcutanat a fost mai mare decât la pacienții de gen masculin. De
asemenea, la femei dermul a fost semnificativ mai gros și a prezentat un număr mai
redus de pixeli.
La nivelul zonei zigomatice pacienții cu fenotip cutanat IV au prezentat o
grosime semnificativ mai mare a dermului și un număr mai mare de pixeli comparativ
cu fenotipurile II și III. În plus, epiteliul mucoasei orale a fost semnificativ mai gros și a
prezentat un număr de pixeli mai mare la pacienții cu fenotip cutanat IV. În studiile
publicate în literatură, metodele colorimetrice și spectrofotometrice utilizate pentru a
determina cromoforii tegumentari (melanina și hemoglobina) la diferite fenotipuri
cutanate au relevat faptul că indivizii cu fenotip IV au avut melanozomi mai mari, mai
numeroși și mai dispersați, comparativ cu fenotipurile mai deschise 221, 222. Această
particularitate poate fi asociată cu grosimea epidermului și cu protecția crescută a
dermului față de radiațiile UV, motiv pentru care dermul este mai elastic și mai
rezistent la procesele de îmbătrânire 223.
Diferențele privind densitatea tisulară se datorează alterării fibrelor de colagen
și deshidratării matricii extracelulare, care conduc la pierderea elasticității și formarea
cutelor funcționale. Metainflamația este evidențiată la nivel tisular prin modificările
structurale și scăderea densității, aspecte determinate cu ajutorul HFU, și astfel poate fi
apreciată starea generală de sănătate. Stabilirea unor asocieri între afecțiunile generale
și aspectele ecografice ale tegumentului și mucoasei orale ar permite implementarea
HFU ca metodă de diagnostic paraclinic în sindromul metabolic și în bolile asociate
vârstei.
Având în vedere faptul că structura mucoasei orale poate fi influențată de
compoziția salivei, direcțiile viitoare de cercetare se vor concentra asupra asocierii
tisulară
dintre modificările structurale determinate ecografic și markerii salivari ai
metainflamației cuantificați cu ajutorul senzorilor intraorali.
5.3. Biosenzorii salivari

Utilizarea salivei umane pentru diagnosticul diverselor patologii și pentru
monitorizarea tratamentului prezintă numeroase avantaje: (i) prelevarea este facilă și
poate fi realizată de personalul medical sau de către pacienți; (ii) recoltarea este
rapidă, convenabilă și nu necesită recipiente sau medii specifice care să prevină
degradarea, saliva nefiind susceptibilă la transformări; (iii) stocarea și transportul sunt
mai fezabile comparativ cu alte probe biologice; (iv) riscul de contaminare a
pacienților sau a personalului medical este redus 224.
Prin definiție, biosenzorii sunt dispozitive medicale care identifică sau cuantifică
diverse reacții biologice sau chimice prin generarea de semnale proporționale cu
concentrația analitului studiat 225. În medicină, biosenzorii sunt folosiți pentru
monitorizarea evoluției bolilor, dezvoltarea unor medicamente, detectarea unor
substanțe toxice, a unor microorganisme patogene sau a unor markeri în fluidele
biologice: sânge, urină sau salivă226.
Numeroși compuși prezenți în salivă pot fi luați în considerare ca analiți pentru
senzorii intra-orali pentru a investiga starea de sănătate orală și generală a unui
individ225. În prezent, există senzori electrochimici pentru analiza unor componenți ai
salivei: glucoza, ureea, citokinele, mucinele și AGEs. Mai mult, s-a demonstrat că
nivelurile salivare ale anumitor compuși sunt corelate cu concentrațiile plasmatice.
Prin urmare, există un interes considerabil privind utilizarea biosenzorilor
intra-orali pentru monitorizarea în timp real a diverșilor parametri, cum ar fi: pH-ul,
temperatura 226 sau metaboliții 227.
În cadrul proiectului SALIVAGES, Horizon 2020, a fost propus un senzor optic
intra-oral dezvoltat în jurul unei fibre optice de plastic (POF – plastic optical fiber).
Configurația geometrică a POF a fost sub forma literei D, fiind șlefuită lateral, pentru a
expune miezul fibrei, care ghidează lumina. Geometria senzorului presupune, de
asemenea, un cuplaj în T, radiația optică fiind aplicată vertical la nivelul zonei șlefuite a
fibrei (Fig. 70)31. În laborator au fost testate două prototipuri ale senzorului optic
propus: un senzor cu zonă de detecție punctuală (Fig. 70 A) și un senzor cu o arie de
detecție extinsă (Fig. 70 B).
Fig. 70. Cele două tipuri de senzori optici intra-orali propuși de Farago et al.: A - Senzorul
optic cu arie de detecție punctuală, alcătuit dintr-o sursă de lumină LED și o fibră optică șlefuită
în forma literei D, lumina fiind cuplată lateral. Câmpul evanescent specific luminii cuplate
interacționează cu analitul; B - Prototipul senzorului optic intra-oral cu arie de detecție extinsă,
în care fibra optică a fost șlefuită pe o lungime mai mare, iar sursa LED incidentă a fost aplicată
lateral și distribuită pe întreaga suprafață de detecție
Analitul prezent la nivelul ariei de detecție filtrează lumina incidentă și astfel

modifică parametrii radiației transmise. Prin comparație cu senzorul punctual,
prototipul cu aria extinsă permite detecția de-a lungul întregii fibre șlefuite (Fig. 70 B).
Identificarea analiților, care în acest caz sunt compușii de interes din salivă, se
realizează pe baza semnăturii spectrale, respectiv prin analiză spectrometrică31.
Cei doi senzori optici au fost integrați în gutiere (Fig. 71) și testați în laborator
pentru detectarea prezenței vinului în salivă. Au fost analizate câte 4 sortimente de vin
alb și respectiv de vin roșu31.
Fig. 71. Realizarea practică a prototipurilor de senzori optici intra-orali integrați în gutiere: A –
senzorul punctual care prezintă o sursă LED și fibra optică inclusă într-o gutieră laterală; B –
senzorul cu arie extinsă, care prezintă o fibră cu emisie laterală și o fibră cu emisie la
extremitate, dispuse în paralel și incluse într-o gutieră frontală; sursa care alimentează axial
fibra de emisie este situată în exteriorul senzorului
Analiza culorii vinurilor s-a realizat prin înregistrarea și evaluarea spectrelor de

absorbție ale vinurilor la lungimi de undă din spectrul vizibil, cu ajutorul senzorilor
optici propuși în acest studiu (Fig. 72). Aceste valori au fost comparate cu spectrele
înregistrate cu spectrometrul KMAK SV210031.
tisulară
Fig. 72. Testarea senzorilor optici pentru analiza culorii vinului: a – senzorul punctual; b –
senzorul cu arie extinsă
Senzorii propuși au înregistrat spectre de absorbție și vârfuri spectrale

caracteristice, asemănătoare cu spectrele tipice obținute cu alte metode de
spectrometrie și au prezentat particularități specifice tipului de vin. Vinurile albe au
avut vârfurile spectrale cuprinse în intervalul 420-480 nm, iar vinurile roșii au avut
absorbțiile maxime la 520 nm, o lungime de undă care este caracteristică culorii roșii
datorită antocianilor și respectiv la 420 nm, caracteristică culorii galbene, datorită
taninurilor și flavonoizilor (Fig. 73)31.
Fig. 73. Spectrele de absorbție ale vinurilor albe (panelul de sus) și roșii (panelul de jos)
înregistrate cu senzorii optici: linia albastră – senzorul punctual, linia portocalie – senzorul cu
arie de detecție extinsă și linia verde – metoda spectrometrică standard
Spectrele de absorbție ale vinurilor înregistrate cu biosenzorii propuși și cu

spectrometrul au fost asemănătoare spectrelor caracteristice ale vinurilor, cu vârfurile
spectrale tipice. Mai mult, spectrele au prezentat diferențe în funcție de sortimentul de
vin examinat, astfel permițând diferențierea vinurilor pe baza semnăturii spectrale.
Spectrele de absorbție măsurate cu senzorii optici propuși au prezentat o bună
rezoluție privind lungimea de undă și amplitudinea, astfel încât să exprime culoarea
vinurilor prin următorii parametri: intensitate, cromaticitate și luminozitate31.
În concluzie, acest prototip de senzor optic a prezentat bune proprietăți
spectrale privind selectivitatea față de diferite tipuri de vin, așadar poate fi folosit la
detectarea intra-orală a vinului și stabilirea calității acestuia. Implementarea
senzorului pe bază de fibră optică prezintă numeroase avantaje datorită flexibilității
care face posibilă purtarea intra-orală prin integrarea într-o gutieră. Acest biosenzor a
fost prezentat în lucrarea Farago P. et al., 201931.
Pe baza rezultatelor testelor, acest biosenzor are un mare potențial pentru
aplicații biomedicale în vederea monitorizării în timp real a consumului de băuturi sau
alimente, cu scopul de a urmări formarea de biomarkeri salivari care ar putea indica
prezența unei stări patologice31.
Luând în considerare rolul de biomarkeri al AGEs salivari, ar fi posibilă
monitorizarea în timp real a acestor compuși și determinarea relației dintre consumul
de vin și producerea AGEs, pentru evaluarea factorilor de risc în bolile asociate dietei24,
25. În contextul monitorizării pacientului, corelarea datelor înregistrate cu un senzor
electrochimic și senzorul optic propus de Farago et al. ar permite stabilirea profilului

biochimic și imunologic al salivei.
În perspectivă, dezvoltarea unei mari varietăți de biosenzori intra-orali ar
constitui o abordare inovativă în cadrul medicinei preventive și în elaborarea unor
terapii individualizate, pentru optimizarea calității vieții. Unul dintre exemple ar fi
biosenzorul pentru detectarea nicotinei în salivă și monitorizarea non-invazivă a
consumului de tutun, în cadrul terapiei de substituție nicotinică și renunțarea la
fumat 228. De asemenea, un biosenzor care măsoară concentrația salivară a produșilor
de metabolism, cum este CO2, ar putea fi inclus într-un dispozitiv oral de avansare a
mandibulei pentru terapia apneei obstructive de somn209.
6. Discuţii generale
În patogeneza bolii parodontale sunt implicate mecanisme complexe care
mediază inflamația parodontală și favorizează progresia distrucțiilor tisulare.
Tendințele moderne în terapia parodontală promovează modularea mecanismelor
patogenetice care țin de răspunsul organismului gazdă față de patogenii parodontali.
Studiile in vitro, experimentale și clinice pe care le-am desfășurat au demonstrat
rolul diverșilor factori patogenetici și eficiența terapeutică a antioxidanților naturali.
Implicarea stresului nitro-oxidativ în parodontita indusă experimental a fost
demonstrată prin creșterea graduală a nivelurilor serice ale markerilor: statusul
oxidativ total (TOS), capacitatea antioxidantă totală (TAC), nitriții și nitrații totali
(NOx) și indicele de stres oxidativ (OSI), pe parcursul instalării inflamației parodontale.
În cadrul studiilor clinice, determinarea imunohistochimică a carboximetil lizinei
(CML) în țesuturile gingivale la pacienții cu parodontită cronică a indicat niveluri
crescute de expresie, care au fost corelate cu stadiul parodontitei cronice diagnosticat
pe baza criteriilor clinice și cu gradul de inflamație gingivală decelat la examenul
histologic. În plus, pe model animal, s-a observat expresia mai intensă a CML în
țesuturile cavității orale a fost asociată cu vârsta, ceea ce sugerează implicarea
produșilor finali de glicare avansată (AGEs) în procesul de îmbătrânire. În parodontita
experimentală la șobolan, curcumina administrată oral, fie ca terapie unică, fie asociată
cu piperina ca adjuvant, a redus semnificativ nivelul stresului nitro-oxidativ sistemic.
Tratamentul local cu curcumină nu a influențat nivelurile markerilor serici ai stresului
nitro-oxidativ și nu a prezentat un efect antioxidant suplimentar când a fost asociat
curcuminei administrate oral.
În practica stomatologică, utilizarea celulelor stem obținute din diverse țesuturi
ale cavității orale deschide noi perspective privind posibilitatea de a dezvolta terapii
celulare în cadrul medicinei regenerative. Pe de altă parte, studiile in vitro permit
clarificarea mecanismelor patogenetice implicate în diferite afecțiuni orale și testarea
răspunsului celular la diverse substanțe, în vederea elaborării unor terapii inovative. În
studiile pe care le-am efectuat, am izolat patru tipuri de celule stem mezenchimale
derivate din parodonțiul uman: celulele din corionul gingival, celulele din ligamentul
gingival, celulele din ligamentul parodontal și celulele din osul alveolar. Pentru
caracterizarea acestor celule, am demonstrat expresia markerilor specifici folosind
imunocitochimia și citometria în flux, precum și metode genetice - RT-PCR și am
tisulară
determinat capacitatea de diferențiere înspre lineajele: osteogenic, condrogenic și
neurogenic.
În culturile celulare, LPS-Pg a indus producerea de radicali liberi, iar nicotina a
exercitat un efect citotoxic dependent de doză și de timpul de expunere. LPS-Pg și
nicotina au influențat, în mod dependent de doză, capacitatea de diferențiere osoasă a
celulelor stem mezenchimale derivate din parodonțiul uman în condițiile cultivării în
mediul inductor osteogenic. Aceste efecte au fost demonstrate prin evidențierea
prezenței depozitelor de calciu în mediul de cultură și prin expresia unor markeri ai
lineajului osteogenic: osteopontina și osteocalcina. În funcție de originea lor, celulele
au prezentat răspunsuri variate la expunerea la LPS-Pg și nicotină.
În continuare, am investigat influența curcuminei (CURC) și epigallocatechin-
gallate (EGCG) asupra viabilității și proliferării celulelor stem mezenchimale derivate
din parodonțiul uman și efectul terapeutic după expunerea la LPS-Pg și nicotină. Cele
două substanțe au avut efecte dependente de doză: în concentrație mare, curcumina a
avut un efect citotoxic, iar EGCG a fost mai bine tolerat. Dozele mici de CURC și EGCG au
influențat discret proliferarea și activitatea metabolică a celulelor. În funcție de origine,
celulele au prezentat răspunsuri selective: celulele derivate din osul alveolar au fost
cele mai sensibile la CURC și EGCG.
Antioxidanții naturali au avut un efect protector împotriva stresului oxidativ
indus de LPS-Pg, demonstrat prin scăderea nivelurilor intracelulare ale radicalilor
liberi de oxigen. Ambele substanțe au determinat o creșterea a viabilității celulelor
expuse la nicotină, însă CURC a fost mai eficientă decâ t EGCG. În general, tratamentele
au fost mai eficiente când a fost folosită concentrația mai mare de CURC sau EGCG, și ı̂n
combinație cu doza mică de nicotină .
Pentru a optimiza efectele terapeutice ale antioxidanților naturali, am obținut
lipozomi cu CURC (L-CURC) și EGCG (L-EGCG) pe care i-am testat în culturile de
celulele stem mezenchimale izolate din ligamentul parodontal. Lipozomii au fost
studiați din punctul de vedere al citotoxicității și al activității antioxidante după
expunerea celulelor la LPS-Pg, iar efectele au fost comparate cu CURC și respectiv
EGCG libere. S-a observat că cele două substanțe au avut efecte antioxidante în doze
diferite: CURC și L-CURC au fost eficiente în doze mai mici, în timp ce toate dozele de
EGCG și L-EGCG au avut efect antioxidant. În plus, au existat diferențe în ceea ce
privește momentul în care eficiența terapeutică a fost maximă: pentru CURC și L-CURC,
efectul a fost mai tardiv. În schimb, EGCG și L-EGCG au avut efect imediat după
adăugarea în culturile celulare, iar dozele mai mari au avut efect prelungit. Atât CURC,
cât și EGCG incluse în lipozomi au avut un efect antioxidant mai intens față de
substanțele libere.
În plus, am determinat efectul in vitro al cinci analogi sintetici ai curcuminei
privind sinteza de MMP-2, MMP-9 (în formă latentă și activă) și a TIMP-1 în culturile
de celule stem mezenchimale izolate din parodonțiul uman. Pentru determinarea și
dozarea nivelurilor MMP-2 și MMP-9 sub formă de pro-enzimă sau enzimă activată, s-
a efectuat zimografia pe gelatină, iar nivelurile TIMP-1 au fost determinate prin tehnica
ELISA. Analogii sintetici ai curcuminei au prezentat citotoxicitate și captare
intracelulară dependente de structura chimică și de concentrațiile utilizate în
tratamente. Curcuminele sintetice nu au indus o sinteză detectabilă de pro-MMP-9, dar
au influențat sinteza de pro-MMP-2; totuși, MMP-2 și MMP-9 nu au fost prezente în
forma activă. În plus, au crescut nivelurile TIMP-1 în toate tipurile de celule. Prin
modularea balanței dintre enzimele proteolitice și inhibitorii tisulari, unii curcuminoizi

au perspective promițătoare în vederea folosirii ca metodă adjuvantă în terapia
parodontală.
Biocompatibilitatea matricilor de Ti obținute prin tehnica SLM a fost testată in
vivo, pe model animal, și in vitro, pe culturi de celule stem mezenchimale izolate din
țesuturile dentare. Pentru evaluarea osteointegrării și pentru a urmări efectul
condiționării suprafeței și a dimensiunii porilor, am folosit matrici cu suprafața de Ti
nemodificat (Ti) și respectiv Ti condiționat cu nano-hidroxiapatită îmbogățită cu siliciu
(Ti+nano-HapSi) și cu pori de 0,8 mm și 1 mm. Implantele au fost inserate în defectele
osoase produse la iepuri, la nivelul treimii proximale a femurului, iar fragmentele de os
cu implantele au fost prelevate la 2, 4 și 6 luni și au fost prelucrate pentru examinare în
microscopie optică și în microscopie electronică de baleiaj (SEM). Procesul de
vindecare a fost dependent de timpul de menținere a implantului: după 2 luni s-a
observat osificarea endocondrală cu prezența cartilajului hialin adiacent implantului,
iar la 4 luni vindecarea a fost completă, cu formarea de os la nivelul defectului. De
asemenea, condiționarea suprafeței implantelor a influențat procesul de osteogeneză,
acesta fiind mai eficient în cazul implantelor cu suprafața condiționată Ti+nano-HapSi.
Imaginile SEM ale matricilor au confirmat aceste observații și, în plus, au indicat faptul
că porii de 0,8 mm au conferit un suport mai bun celulelor care s-au dezvoltat pe
suprafața și în interiorul implantelor.
Studiul in vitro a demonstrat că matricile de Ti pur și cele cu suprafața
condiționată cu HAP, obținute prin SLM au prezentat biocompatibilitate în culturile de
celule mezenchimale izolate din țesuturile cavității orale și au optimizat formarea de
matrice mineralizată. Celulele osoase din septul inter-radicular însămânțate pe aceste
matrici au prezentat o mare capacitate de proliferare și diferențiere osoasă. În special
matricile condiționate cu HAP au indus o mineralizare precoce.
Modificările prin creșterea în volum a gingiei prezintă aspecte microscopice
variate, în funcție de etiologie. Consecutiv tratamentului cu Nifedipin, s-a observat
hiperplazia epiteliului oral, cu acantoză și formarea de creste epiteliale profunde,
fibrozarea corionului și ulcerații ale epiteliului sulcular, asociate cu un infiltrat
inflamator în corionul papilar. Leziunea produsă de HPV la nivelul gingiei a fost un
papilom scuamos oral, caracterizat prin koilocitoză la nivelul straturilor spinos și
superficial, diskeratoză, hiperkeratoză și acantoză. La nivelul leziunilor
granulomatoase ale cavității orale au fost observate celule mononucleare și celule
gigante multinucleate, distribuite neuniform în stroma conjunctivă, printre celule
inflamatoare.
Inter-relația dintre patologia orală și afecțiunile sistemice face posibilă
detectarea anumitor modificări morfologice în țesuturile cavității orale și evaluarea
anumitor biomarkeri în salivă, care ar putea fi interpretați pentru diagnosticul
metainflamației în cadrul sindromului metabolic. Evaluarea microscopică a celulelor
exfoliate de la nivelul mucoasei orale și incluse în citoblocuri a demonstrat prezența
celulelor epiteliale din straturile superficial și intermediar, cu diferite modificări
morfologice ale nucleilor și citoplasmei, precum și prezența unor colonii microbiene.
Diverse afecțiuni cronice, cum ar fi diabetul zaharat și hipertensiunea, consumul de
tutun și alcool și leziunile orale maligne pot fi asociate cu modificări caracteristice ale
celulelor epiteliale orale. Astfel, citologia exfoliativă orală poate fi luată în considerare
ca o metodă de screening facilă și non-invazivă pentru diagnosticul precoce sau
tisulară
monitorizarea acestor afecțiuni. Ultrasonografia de înaltă frecvență (HFU) a mucoasei
orale și a tegumentului feței au demonstrat prezența unor modificări ale parametrilor
ecografici evaluați: densitatea țesuturilor, grosimea epidermului și dermului, respectiv
a epiteliului și corionului mucoasei orale, în funcție de vârstă, gen, patologia generală,
consumul de tutun și expunerea la radiațiile UV. Stabilirea unor asocieri între
afecțiunile generale și aspectele ecografice ale tegumentului și mucoasei orale ar
permite implementarea HFU ca metodă de diagnostic paraclinic în sindromul
metabolic și în bolile asociate vârstei. Saliva este cel mai accesibil biofluid care poate fi
obținut prin metode facile și non-invazive în cabinetul stomatologic, iar utilizarea unor
senzori intra-orali cu scopul de a urmări formarea de biomarkeri salivari care ar putea
indica prezența unei stări patologice.
7. Concluzii generale
1. Boala parodontală a indus stres nitro-oxidativ local și sistemic, iar nivelurile serice
ale markerilor stresului oxidativ au fost corelate cu severitatea inflamației
parodontale induse experimental.
2. Stresul nitro-oxidativ local și sistemic și acumularea AGEs în țesuturile parodontale
sunt factori implicați în patogeneza parodontopatiilor.
3. Tratamentul antioxidant cu curcumină administrată pe cale orală a redus
semnificativ nivelul sistemic al stresului nitro-oxidativ în parodontita
experimentală.
4. Celulele stem mezenchimale pot fi izolate din diverse țesuturi ale cavității orale în
cadrul manoperelor terapeutice curente.
5. Celulele stem mezenchimale derivate din parodonțiul uman pot fi utilizate pentru
investigarea mecanismelor patogenetice în parodontopatii și pentru testarea
eficienței terapeutice a unor substanțe medicamentoase sau extracte vegetale.
6. În culturile celulare, LPS-Pg a indus producerea de radicali liberi, iar nicotina a
exercitat un efect citotoxic dependent de doză și de timpul de expunere.
7. Expunerea la LPS-Pg și nicotină a influențat capacitatea de diferențiere osoasă
celulelor stem mezenchimale derivate din parodonțiul uman.
8. Antioxidanții naturali investigați: curcumina și EGCG au fost bine tolerați de cele
patru tipuri de celule stem mezenchimale derivate din parodonțiul uman, și nu au
indus apoptoza când au fost utilizați în doze terapeutice.
9. Curcumina și EGCG au redus producerea de radicali liberi intracelulari sub
influența LPS-Pg în celulele stem mezenchimale derivate din parodonțiul uman,
exercitând un rol protector împotriva stresului oxidativ.
10. Antioxidanții naturali investigați: curcumina și EGCG au contracarat efectul
citotoxic al nicotinei, curcumina fiind mai eficientă decâ t EGCG.
11. În culturile de celule stem mezenchimale derivate din parodonțiul uman, curcumina
și EGCG incluse în lipozomi au redus stresul oxidativ indus de LPS-Pg iar efectul
antioxidant a fost mai intens față de substanțele libere.
12. Analogii sintetici ai curcuminei, folosiți în dozele mici, au prezentat citotoxicitate
redusă și acumulare intracelulară eficientă în culturile de celule stem
mezenchimale derivate din parodonțiul uman.
13. Curcuminele sintetice au fost eficiente în controlul activității proteolitice și au

stimulat sinteza de TIMP-1; datorită acestor efecte, unii curcuminoizi ar putea fi
folosiți ca agenți terapeutici.
14. Implantele de Ti obținute prin tehnica SLM au fost bine osteointegrate in vivo;
implantele cu suprafața condiționată cu nano-HapSi și porii mai mici au fost mai
eficiente în stimularea formării de țesut osos.
15. Matricile de Ti pur și cele condiționate cu HAP au favorizat diferențierea osoasă
și mineralizarea in vitro și, asociate cu celule stem mezenchimale din cavitatea
orală, ar putea avea aplicabilitate clinică în domeniul ingineriei tisulare.
16. Modificările de volum ale gingiei prezintă aspecte microscopice caracteristice
care completează examenul clinic în vederea stabilirii diagnosticului și orientării
deciziei terapeutice.
17. Citologia exfoliativă a mucoasei orale poate furniza date suplimentare privind
aspectele morfologice asociate unor boli cronice sau poate indica prezența
modificărilor precoce în cancerul oral.
18. Metainflamația poate fi evidențiată non-invaziv la nivel tisular prin modificarea
parametrilor ecografici determinați cu ajutorul HFU și permite aprecierea stării
generale de sănătate.
19. Senzorii intra-orali permit monitorizarea biomarkerilor salivari și sunt utili
pentru diagnosticul non-invaziv și monitorizarea afecțiunilor cavității orale și a
bolilor generale.
20. Datorită metodei facile, non-invazive și a costului redus, dozarea markerilor
salivari, citologia exfoliativă orală și examinarea ultrasonografică a mucoasei
orale ar putea fi implementate ca mijloace de screening pentru diagnosticul
diverselor boli generale.
8. Originalitatea şi contribuţiile inovative ale tezei

O contribuție la studiul mecanismelor implicate în patogeneza bolii parodontale
a fost demonstrarea acumulării CML în țesuturile cavității orale la șobolan în funcție de
vârstă și a expresiei imunohistochimice a CML în țesuturile gingivale la pacienții
parodontopați, pentru a stabili valoarea de biomarkeri ai AGEs.
În parodontita experimentală la șobolan, studiul nostru a fost primul care a
urmărit evoluția în dinamică a biomarkerilor stresului nitro-oxidativ pe parcursul
progresiei afecțiunii și care a evaluat parametrii stresului nitro-oxidativ ca indicatori ai
valorii terapeutice a curcuminei. În plus, am comparat eficiența mai multor căi de
administrare a curcuminei, iar pentru administrarea locală am folosit o formulare
inovative; curcumina a fost înglobată într-un gel muco-adeziv care prezintă aderență la
mucoasa orală și remanență pe o perioadă extinsă, astfel permițând eliberarea
prelungită a ingredientelor active în țesuturile gingivale.
În studiile in vitro, aspectul de noutate a fost investigarea în dinamică a
producerii de radicali liberi intracelulari sub influența LPS-Pg. De asemenea, am
studiat efectul citotoxic al nicotinei și inhibarea diferențierii osoase exercitate de LPS-
Pg și nicotină, precum și eficiența terapeutică a unor antioxidanți naturali: curcumina
și EGCG, asupra a patru tipuri de celulele stem mezenchimale derivate din țesuturile
parodontale umane. În plus, am testat efectul unor formulări inovative: lipozomii cu
tisulară
curcumină și EGCG, și al unor analogi sintetici ai curcuminei în culturile de celule stem
mezenchimale derivate din parodonțiul uman. La momentul actual, acesta este primul
studiu in vitro care cercetează efectul analogilor sintetici ai curcuminei asupra
celulelor stem derivate din țesuturile orale. În plus, rezultatele noastre sugerează că,
datorită captării intracelulare crescute și prin efectul de modulare a activării enzimelor
proteolitice, unele curcumine sintetice ar putea fi utilizate în scop terapeutic, ca
alternativă la curcumina naturală.
Implantele de Ti folosite în studiile privind biocompatibilitatea in vivo și in vitro
au fost obținute printr-o tehnică modernă, de topire selectivă laser. Studiul
experimental a demonstrat importanța condiționării suprafeței și a dimensiunii porilor
în procesul de osteointegrare, iar studiul in vitro a fost primul care a comparat
potențialul osteogen al mai multor tipuri de celule stem mezenchimale umane izolate
din țesuturile orale, sub influența matricilor de Ti pur sau condiționate cu HAP.
Citologia exfoliativă orală, ultrasonografia mucoasei orale și a structurilor
asociate și monitorizarea compoziției salivei cu ajutorul senzorilor intra-orali
reprezintă noi abordări ale examinării orale pe care le-am utilizat în studiile clinice.
Citologia exfoliativă orală facilitează observarea modificărilor citologice din mucoasa
aparent normală, și este utilă în special la pacienții fumători și consumatori de alcool,
cu un important risc de apariție a leziunilor premaligne și maligne. În plus, acumularea
intracelulară a unor biomarkeri, cum sunt AGEs asociați metainflamației ar permite
evaluarea stării de sănătate la pacienții cu sindrom metabolic. HFU este o metodă
imagistică modernă, utilă pentru determinarea modificărilor morfologice ale mucoasei
orale și tegumentului feței, iar stabilirea unor asocieri între afecțiunile generale și
aspectele ecografice ar permite implementarea HFU ca metodă de diagnostic paraclinic
în sindromul metabolic și în bolile asociate vârstei. Senzorul optic inovator
funcționează pe bază de detecție spectrală cu ajutorul unei fibre optice și prezintă
avantajul posibilității de a fi integrat într-o gutieră intra-orală, pentru monitorizarea în
timp real a biomarkerilor din salivă.
tisulară
CARIERA ACADEMICĂ ȘI
PROFESIONALĂ
tisulară
1. Cariera academică
Am devenit membru al comunității academice a Universității de Medicină și
Farmacie „Iuliu Hațieganu” din Cluj-Napoca, în octombrie 2003, ca asistent universitar
la Disciplina de Histologie. Din martie 2009 până în octombrie 2019 am ocupat funcția
de șef de lucrări, iar în prezent sunt conferențiar la Disciplina de Histologie.
Activitatea didactică desfășurată până în prezent la Disciplina de Histologie a
constat în lucrări practice și cursuri cu studenții din anul I de la Facultatea de Medicină
Dentară, liniile de predare în limbile română, engleză și franceză la Disciplina
Histologia cavității orale și a sistemelor și cu studenții din anul II de la Facultatea de
Medicină, liniile de predare în limbile română, engleză și franceză la Disciplina
Histologie. Am predat cursul opțional „The Use of Stem Cells for Cell Therapy and
Tissue Engineering” destinat studenților din anul II, Medicină în limba engleză. De
asemenea, am efectuat lucrări practice cu studenții din anul I de la Facultatea de
Asistență Medicală Generală și Radiologie și Imagistică. Am participat în calitate de
colaborator la cursul postuniversitar destinat rezidenților din specialitatea de
Anatomie Patologică și am susținut cursul intitulat „Histologia și patologia glandei
tiroide și suprarenalei” în anii 2014, 2016 și 2018. Am participat la organizarea
workshop-urilor destinate studenților: „Basic techniques in Histology Laboratory –
hands-on” în cadrul Medicalis 2019 la Disciplina de Histologie, și tinerilor medici:
„Metode de evaluare a AGEs (Advanced Glycation End products) în biofluide și
țesuturi” în cadrul Zilelor Universității de Medicină și Farmacie, 2018 și „Nutriția ca
factor determinant în dezvoltarea aparatului dento-maxilar” în cadrul Congresului
Internațional „Nutriția – Medicina viitorului” (NMFIC 2019) la Disciplina de Reabilitare
Orală, Sănătate Orală și Management, Facultatea de Medicină Dentară.
Am participat ca și colaborator, autor sau coordonator la elaborarea a 18 cărți
cu destinație universitară, în limbile română, engleză și franceză: 16 cursuri și exerciții
de Histologie pentru studenți (dintre care două ca autor coordonator și 14 colaborator
sau autor), și două caiete de lucrări practice.
Cărți cu destinație universitară în edituri naționale - autor coordonator:
1. General Histology. Evaluation exercises. Editors: Constantin Anne-Marie,
Boș ca Adina Bianca. Authors: Constantin Anne-Marie, Boș ca Adina
Bianca, Mihu Carmen, Criș an Maria, Ș uș man Sergiu, Ș ovrea Alina,
Mă rginean Mariana, Melincovici Carmen, Jianu Mihaela, Moldovan Ioana,
Coneac Andrei. Contributors: Mocan Lavinia, Suflețel Rada. Editura
Medicală Universitară ”Iuliu Hațieganu” Cluj-Napoca 2018. ISBN 978-
973-693-867-2
2. Special Histology. Evaluation exercises. Editors: Boș ca Adina Bianca,
Constantin Anne-Marie. Authors: Boș ca Adina Bianca, Constantin Anne-
Marie, Mihu Carmen, Criș an Maria, Ș uș man Sergiu, Ș ovrea Alina,
Mă rginean Mariana, Melincovici Carmen, Jianu Mihaela, Moldovan Ioana,
Coneac Andrei. Contributors: Mocan Lavinia, Suflețel Rada. Editura
Medicală Universitară ”Iuliu Hațieganu” Cluj-Napoca, 2018. ISBN 978-
973-693-875-7
Cărți cu destinație universitară în edituri naționale – colaborator sau autor:

1. Histologie Generala. Vol. I. Carmen Mihaela Mihu, Maria Crisan, Mariana
Marginean, Alina Sovrea. colab. Carmen Melincovici, Anne Marie Chindris,
Bianca Bosca Editura Medicala Universitara “Iuliu Hatieganu”, Cluj-
Napoca, 2006 ISBN (10) 973-693-197-8, (13): 978-973-693-197-0
2. Histologie Vol. II, Carmen Mihaela Mihu, Maria Crisan, Mariana
Marginean, Alina Sovrea, Carmen Melincovici, Bianca Bosca , Anne-Marie
Constantin. Editura Medicala Universitara “Iuliu Hatieganu”, Cluj-Napoca,
2012 ISBN 978-973-693-486-5
3. General Histology : Tissues Maria Crisan, Carmen Mihaela Mihu, Carmen
Melincovici, Bianca Bosca, Anne Marie Constantin, Andrei Coneac, Ioana
Moldovan. Editura Medicala Universitara “Iuliu Hatieganu”, Cluj-Napoca,
2013 ISBN 978-973-693-554-1
4. Exercices d’Histologie. Alina Sovrea, Carmen Mihaela Mihu, Adina Bianca
Boșca, Ioana Moldovan, Andrei Coneac, Luca di Natale. Ed. Digital Data,
Cluj-Napoca, 2014. ISBN 978-973-7768-88-9
5. General histology : Organs. Maria Crisan, Carmen Mihaela Mihu, Carmen
Melincovici, Bianca Bosca, Anne Marie Constantin, Andrei Coneac, Ioana
Moldovan, Hana Decean . Editura Medicala Universitara “Iuliu
Hatieganu”, Cluj-Napoca, 2015 ISBN 978-973-693-648-7.
6. Histologie. Tissus. Alina Sovrea, Carmen Mihaela Mihu, Mariana
Marginean, Carmen Melincovici, Sergiu Susman, Bianca Bosca, Ioana
Moldovan, Anne Marie Constantin, Daniel Pirici, Eleonora Dronca.
Editura Medicala Universitara “Iuliu Hatieganu”, Cluj-Napoca, 2015
ISBN 978-973-693-636-4.
7. Exercices d’Histologie 2. Alina Sovrea, Carmen Mihaela Mihu, Anne Marie
Constantin, Adina Bianca Boșca, Ioana Moldovan, Mihaela Elena Jianu,
Eleonora Dronca. Ed. Digital Data, Cluj-Napoca, 2017. ISBN : 978-973-
7768-94-0.
8. Histologie generala. Evaluare semestriala. Coordonator: Constantin Anne-
Marie, Autori: Constantin Anne-Marie, Mihu Carmen, Criș an Maria, Ș ovrea
Alina, Ș uș man Sergiu, Mă rginean Mariana, Melincovici Carmen, Boș ca
Adina Bianca, Jianu Mihaela, Moldovan Ioana, Coneac Andrei.
Colaboratori: Lavinia Mocan Rada Suflețel Editura Medicală Universitară
”Iuliu Hațieganu” Cluj-Napoca, 2018 ISBN 978-973-693-866-5
9. Exercices d’Histologie 2. Alina Ș ovrea (Autor Coordonator), Carmen Mihu,
Maria Crisan, Bianca Boș ca, Anne-Marie Constantin, Carmen Melincovici,
Mihaela Jianu, Andrei Coneac, Rada Sufletel Editura Digital Data Cluj-
Napoca, 2018 ISBN 978-973-7768-97-1
10. Histologie de la cavité buccale Alina Ș ovrea (Autor Coordonator), Bianca
Boș ca, Anne-Marie Constantin, Carmen Georgiu, Aranka Ilea, Eleonora
Dronca, Tony Granmont Editura Digital Data Cluj-Napoca, 2018 ISBN
978-973-7768-98-8
11. Histologie specială. Evaluare semestriala. Coordonator: Constantin Anne-
Marie, Autori: Constantin Anne-Marie, Mihu Carmen, Criș an Maria, Ș ovrea
Alina, Ș uș man Sergiu, Boș ca Adina Bianca, Melincovici Carmen,
tisulară
Mă rginean Mariana, Jianu Mihaela, Coneac Andrei, Mocan Lavinia.
Colaboratori: Rada Suflețel, Lupean Roxana. Editura Medicală
Universitară ”Iuliu Hațieganu” Cluj-Napoca, 2019 ISBN 978-973-693-904-
4
12. Noțiuni elementare de histologie generală și specială. Ghid de studiu
adresat studenților de Medicină Dentară. Coordonator: Jianu Elena
Mihaela, Autori: Mihu Carmen Mihaela, Criș an Maria, Ș ovrea Alina,
Ș uș man Sergiu, Boș ca Adina Bianca, Mă rginean Mariana, Melincovici
Carmen, Constantin Anne-Marie, Jianu Elena Mihaela, Coneac Andrei,
Mocan Lavinia, Moldovan Ioana, Suflețel Rada. Editura Colorama, Cluj-
Napoca, 2019 ISBN 978-606-9056-15-8
13. Exerciții de Histologie pentru studenții Facultă ții de Asistență Medicală
Alina Ș OVREA (autor coordonator), Carmen MIHU, Bianca BOȘ CA,
Carmen MELINCOVICI, Mariana MA� RGINEAN, Anne-Marie CONSTANTIN,
Mihaela JIANU, Ioana MOLDOVAN, Andrei CONEAC, Rada SUFLETEL.
Editura Digital Data Cluj-Napoca, 2020. ISBN 978-973-7768-81-0.
14. Histologie – Note de Curs - Carmen MELINCOVICI (autor coordonator),
Carmen Mihaela MIHU, Maria CRIȘAN, Alina ŞOVREA, Sergiu ȘUȘMAN,
Adina Bianca BOȘCA, Mariana MĂRGINEAN, Carmen MELINCOVICI, Anne-
Marie CONSTANTIN, Elena Mihaela JIANU, Ioana MOLDOVAN, Roxana-
Adelina LUPEAN, Rada SUFLEȚEL. Editura COLORAMA, ISBN 978-606-
9056-68-4, 2021.
Cărți cu destinație universitară în edituri naționale – Caiete de lucrări practice –
autor:
1. Histologie- Caiet pentru lucrari practice vol I. Coordonator: Carmen
Mihaela Mihu. Autori: Maria Crisan, Alina Sovrea, Mariana Marginean,
Carmen Melincovici, Bianca Bosca, Sergiu Susman, Anne Marie
Constantin, Andrei Coneac, Ioana Moldovan, Mihaela Marina Editura
Colorama, Cluj-Napoca 2014 ISBN 978-606-93807-4-1
2. Histologie- Caiet pentru lucrari practice vol II. Coordonator: Carmen
Mihaela Mihu. Autori: Maria Crisan, Alina Sovrea, Mariana Marginean,
Carmen Melincovici, Bianca Bosca, Sergiu Susman, Anne Marie
Constantin, Andrei Coneac, Mihaela Marina Editura Colorama, Cluj-
Napoca 2014 ISBN 978-606-93807-4-1
Am pregătit materiale didactice: cursuri și lucrări practice în format power
point, scheme și desene, preluarea de imagini ale preparatelor histologice pentru
realizarea unor atlasuri didactice. De asemenea, m-am implicat activ în evaluarea
cunoștințelor studenților prin elaborarea întrebărilor pentru testele de pe parcursul
semestrului și a subiectelor de examen, prin corectarea testelor și lucrărilor scrise și
prin organizarea seminariilor orale din cadrul examenelor practice.
Am coordonat elaborarea lucrărilor de licență ale studenților de la Facultățile de
Medicină și Medicină Dentară. De asemenea, sunt tutore de an al Seriei 2, Facultatea de
Medicină anul III, linia de predare în limba engleză.
Am făcut parte din comisiile organizate în cadrul Universității cu ocazia
examenelor de simulare a admiterii, admitere, licență și rezidențiat și în cadrul
Disciplinei de Histologie la concursurile de ocupare a posturilor didactice.
Activitatea științifică și de cercetare s-a concretizat până în prezent prin

studiile doctorale, desfășurarea studiilor clinice, experimentale și in vitro în cadrul
proiectelor de cercetare și participarea efectivă la manifestări științifice și conferințe
naționale și internaționale, workshop-uri și mese rotunde cu prezentări orale și poster.
Din decembrie 2012 dețin titlul de Doctor în Științe Medicale, Domeniul
Medicină Dentară, în urma susținerii Tezei de Doctorat cu titlul „Cercetări privind rolul
factorilor imunologici în etiologia bolii parodontale și posibilitățile de tratament”.
Am făcut parte din colectivul de cercetători al unor granturi câștigate prin
competiții interne în cadrul Universității, competiții naționale și internaționale.
Am participat ca membru în 2 granturi/proiecte de cercetare naţionale câștigate
prin compeţie:
1. Grant național Parteneriate 2008 nr. 41077. Titlul: „PLACSTEM Celulele
stem placentare, o sursă alternativă pentru terapia celulară”. Valoare
proiect: 2.000.000 lei. Perioada: 2008-2011.
2. Grant PN-III-P2-2.1-PED-2019-3664. Contractul de finantare nr.
348PED/2020. Titlul “Matrici inteligente personalizate pentru
regenerarea tisulară și controlul metainflamației”. Valoare proiect:
300.000 lei. Perioada: 2020-2022.
Am participat ca membru într-un grant/proiect de cercetare internaţional
câștigat prin compeţie:
Grant ERANET-ORIZONT 2020 Contract de finanțare nr 25/2017. Titlul:
„Abordări tehnologice inovative pentru validarea AGEs salivare (Produșilor Finali de
Glicozilare Avansată) ca noi biomarkeri în evaluarea factorilor de risc în bolile
relaționate cu dieta”. Valoare proiect: 899.998 lei. Perioada: 2017-2020.
În 2014 am câștigat, în cadrul competiției European Social Found Human
Resources Development Operational Programme 2007-2013, project no.
POSDRU/159/1.5/138776, Titlul: „Model colaborativ instituțional pentru translarea
cercetării științifice biomedicale în practica clinică - TRANSCENT”, beneficiar:
Universitatea de Medicină și Farmacie „Iuliu Hațieganu”, Cluj-Napoca, România,
calitatea de membru grupul țintă - bursier postdoctorand și am derulat proiectul
individual de cercetare: „Evaluarea stresului nitro-oxidativ în patogeneza
parodontitelor cronice si posibilitățile terapeutice”, în perioada: 2014-2015.
În 2016 am câștigat, în cadrul competiției de granturi interne organizate de
Universitatea de Medicină și Farmacie „Iuliu Hațieganu”, Cluj-Napoca, și am condus în
calitate de director, proiectul:
Grant intern UMF Cluj-Napoca nr. 4944/16/08.03.2016. Titlul: „Efectul terapeutic al
Curcuminei și Epigallocatechin-gallate asupra răspunsului imuno-inflamator indus de
hipoxie și Porphyromonas gingivalis în celulele stem parodontale umane”. Valoare
proiect: 35.700 lei, în perioada: 2016-2018.
Am participat ca și autor la elaborarea a două cărți de specialitate în edituri

naționale:
1. Celulele stem - Notiuni fundamentale. Susman Sergiu, Mihu Carmen
Mihaela, Crisan Maria, Soritau Olga, Sovrea Alina, Marginean Mariana,
tisulară
Melincovici Carmen, Constantin Anne Marie, Bosca Bianca, Jianu Mihaela,
Moldovan Ioana, Coneac Andrei, Dronca Eleonora. Editura Medicala
Universitara “Iuliu Hatieganu”, Cluj-Napoca, 2016 ISBN 978-973-693-
723-1.
2. Astrocite și Astrocitoame Alina ŞOVREA (coordonator), Carmen MIHU,
Aranka ILEA, Bianca BOȘCA, Romana VULTURAR, Bianca SZABO, Carmen
CRIVII, Carmen GEORGIU, Renata VASIU, Carmen MELINCOVICI, Mariana
MĂRGINEAN, Anne-Marie CONSTANTIN, Mihaela JIANU, Adina CHIS,
Liliana RESIGA, Călin CAINAP, Ioan SZABO, Alexandra BURUIANASIMIC,
Rada SUFLETEL, Roxana LUPEAN, Maria BUNGĂRDEAN. Editura Digital
Data. ISBN 978-973-7768-82-7.
Am publicat, în calitate de autor, 18 capitole în cărți naționale:
1. Capitol de carte: Aranka Ilea, Adina Bianca Boșca, Radu Septimiu
Câmpian. ”Rolul factorilor de creștere în diferențierea osoasă a
celulelor stem mezenchimale” în cartea ”Cercetare în Medicina
Dentară, de la studii fundamentale spre domenii aplicative” , Editura
Colorama, Cluj-Napoca, 2015, pg. 260-270, ISBN 978-606-93891-6-4
2. Capitol de carte: Adina Bianca Boșca, Aranka Ilea, Radu Septimiu
Câmpian, Alina Elena Pârvu. ”Terapia de modulare a răspunsului
gazdei cu extracte vegetale în boala parodontală” în cartea ”Cercetare
în Medicina Dentară, de la studii fundamentale spre domenii
aplicative” , Editura Colorama, Cluj-Napoca, 2015, pg. 223-235, ISBN
978-606-93891-6-4
3. Capitol de carte: Adina Bianca Boșca, Aranka Ilea, Olga Sorițău, Radu
Septimiu Câmpian, Nausica Petrescu, Alina Elena Pârvu. ”Modalități de
optimizare a potențialului regenerativ al celulelor stem parodontale
umane” în cartea ”Cercetare în Medicina Dentară – proprietăți optice
ale dinților și materialelor dentare”, Editura Colorama, Cluj-Napoca,
2016, pg. 162-172, ISBN 978-606-8778-15-0
4. Capitol de carte: Ilea Aranka, Petrescu Nausica, Boșca Adina Bianca,
Sorițău Olga, Câmpian Radu Septimiu. ”Metode de izolare a celulelor
stem mezenchimale de la nivelul cavității orale, utile în testele de
citotoxicitate a materialelor dentare” în cartea ”Cercetare în Medicina
Dentară – proprietăți optice ale dinților și materialelor dentare”,
Editura Colorama, Cluj-Napoca, 2016, pg. 151-161, ISBN 978-606-8778-
15-0
5. Capitol de carte: Nausica Petrescu, Ilea Aranka, Boșca Bianca Adina,
Radu Septimiu Câmpian. ”Percepția aspectului estetic dento-facial” în
cartea ”Antropologie si Educație"-Andrei Kozma, Cristina Glavce,
Constantin Bălăceanu-Stolnici, Colecția Zilele Rainer, Editura Academiei
Române, București 2017, pg. 438- 442, ISBN 978-973-27-2758-4
6. Capitol de carte: Aranka Ilea, Bianca Adina Boșca, Nausica Petrescu, Dan
Buhățel, Anca Ionel, Claudia Feurdean, Andreea Pop, Radu Septimiu
Câmpian. ”The placebo phenomena in medical and socio-cultural
dimension” în cartea ”Antropologie si Educație"-Andrei Kozma, Cristina
Glavce, Constantin Bălăceanu-Stolnici, Colecția Zilele Rainer, Editura
Academiei Române, București 2017, pg. 399- 405, ISBN 978-973-27-

2758-4
7. Capitol de carte: Adina Bianca Boșca, Aranka Ilea, Nausica Petrescu.
”Celulele stem din perspectiva științifică și religioasă” în cartea
”Antropologie si Educație"-Andrei Kozma, Cristina Glavce, Constantin
Bălăceanu-Stolnici, Colecția Zilele Rainer, Editura Academiei Române,
București 2017, pg. 354- 360, ISBN 978-973-27-2758-4
8. Capitol de carte: Ilea Aranka, Adina Bianca Boșca, Anida Maria Băbţan,
Dan Buhăţel, Nausica Bianca Petrescu, Nicoleta Claudia Feurdean, Anca
Ionel, Arin Sava, Iulia Moldovan, Radu Septimiu Câmpian Starea de
edentaţie în dimensiunea bio-socio-culturală și demografică; Edentulous
status in bio-socio-cultural and demographic dimension. Antropologie si
demografie Colecția Zilele Rainer, Editura Academiei Române, București
2018; pg 191-197. ISBN 978-973-27-2901-4
9. Capitol de carte: Adina Bianca Boșca, Aranka Ilea, Anida Maria Băbţan,
Nausica Petrescu, Radu Septimiu Câmpian. Implicaţiile sociale ale
aspectului facial; Social implications of facial appearance. Antropologie si
demografie Colecția Zilele Rainer, Editura Academiei Române, București
2018; pg 103-108. ISBN 978-973-27-2901-4.
10. Capitol de carte: Anida-Maria Băbţan, Aranka Ilea, Adina Bianca Boșca,
Nausica Petrescu, Radu Septimiu Câmpian. Influenţa evoluţiei dietei
asupra sănătăţii umane în context demografic și al biodiversităţii
societăţii; The role of dietary advanced-glycation-ending-products
(DAGES) in oral health in demographic context and biodiversity of human
society, în cartea ”Antropologie si Demografie" - Andrei Kozma, Cristina
Glavce, Constantin Bălăceanu-Stolnici, Colecția Zilele Rainer, Editura
Academiei Române, București 2018, pg. 331- 341, ISBN 978-973-27-
2901-4
11. Capitol de carte: Boșca Adina Bianca, Ilea Aranka, Băbțan Anida-Maria,
Petrescu Nausica, Câmpian Radu Septimiu, Mihu Carmen Mihaela, Crișan
Maria, Șovrea Alina Simona, Melincovici Carmen Stanca, Constantin Anne
Marie, Cătană Andreea, Bogdan Felicia. Rolul factorilor genetici în bolile
asociate vârstei, în cartea ”Antropologie si Genetică" - Andrei Kozma,
Cristina Glavce, Constantin Bălăceanu-Stolnici, Colecția Zilele Rainer,
Editura Academiei Române, București 2019, pg. 31- 39, ISBN 978-973-27-
3067-6
12. Capitol de carte: Anida-Maria Băbțan, Aranka Ilea, Nausica Petrescu,
Bianca Adina Boșca, Radu Septimiu Câmpian. Implicații genetice în
patologia chistelor maxilare odontogene, în cartea ”Antropologie si
Genetică" - Andrei Kozma, Cristina Glavce, Constantin Bălăceanu-Stolnici,
Colecția Zilele Rainer, Editura Academiei Române, București 2019, pg. 21-
26, ISBN 978-973-27-3067-6
13. Capitol de carte: Anida-Maria Bă bțan, Bianca Boș ca, Anca Ionel, Radu
Septimiu Câ mpian, Claudia Feurdean, Aranka Ilea. Tulburări neurologice
în regiunea oro-maxilo-facială prin traumatism chimic în cursul
tratamentului endodontic. Cazuri clinice. Prezentă ri de medicală ș i
tisulară
chirurgie. Volumul VIII. Editura Bioflux, Cluj-Napoca, 2019, pg 7 – 27.
ISBN 978-606-8887-32-6; ISBN 978-606-8887-51-7
14. Capitol de carte: Bă bțan Anida-Maria, Boș ca Adina Bianca, Miclă uș Viorel,
Ruxanda Flavia, Rațiu Cristian Adrian, Ionel Anca, Ilea Aranka.
Hiperplazia gingivală indusă medicamentos. În cartea Cazuri clinice.
Prezentări de medicală și chirurgie. Volumul XII. p 31-48.
Coordonatori: Ș tefan Cristian Vesa, Antonia Eugenia Macarie. Editura
Bioflux, Cluj-Napoca, 2020. ISBN 978-606-8887-32-6; ISBN 978-606-
8887-82-1
15. Capitol de carte: Anida-Maria Bă bțan, Boș ca Adina Bianca, Rațiu Cristian
Adrian, Feurdean Nicoleta Claudia, Ilea Aranka Utilizarea derivaților
plachetari în tratamentul complicațiilor traumatismelor dento-
parodontale. În cartea Cazuri clinice. Prezentări de medicală și
chirurgie. Volumul XIV. p. 6-18 Coordonatori: Ș tefan Cristian Vesa,
Silvina Iluț. Editura Bioflux, Cluj-Napoca, 2020. ISBN 978-606-8887-32-6;
ISBN 978-606-8887-84-5
16. Capitol de carte: Anida-Maria Băbțan, Aranka Ilea, Bianca Nausica
Petrescu, Anca Ionel, Claudia Nicoleta Feurdean, Willi Andrei Uriciuc,
Adina Bianca Boșca, Maria Crișan, Codruța Ioana Mirică, Roxana Ioana
Bordea, Radu Septimiu Câmpian. Aplicații ale ultrasonografiei în
diagnosticul patologiei regiunii cervico-faciale, în cartea ”Antropologia
Mileniului III" - Andrei Kozma, Octavian Buda, Constantin Bălăceanu-
Stolnici, Colecția Zilele Rainer, Editura Academiei Române, București
2020, pg. 266- 271, ISBN 978-973-27-3200-7
17. Capitol de carte: Adina Bianca Boșca, Aranka Ilea, Marian Tăulescu, Mihai
Negru, Anida-Maria Băbțan, Nausica Petrescu, Claudia Nicoleta Feurdean,
Ioana Codruța Mirică, Alina Elena Pârvu, Elena Dinte, Carmen Mihaela
Mihu, Carmen Melincovici, Alina Simona Șovrea, Anne Marie Constantin,
Dan Buhățel, Anca Ionel, Arin Sava, Willi Andrei Uriciuc, Adela Cristina
Lazăr, Ioana Roxana Bordea, Andreea Simona Pop, Maria Crișan, Radu
Septimiu Câmpian. Valoarea diagnostică a citoblocurilor preparate
din mucoasa orală, în cartea ”Antropologia Mileniului III" - Andrei
Kozma, Octavian Buda, Constantin Bălăceanu-Stolnici, Colecția Zilele
Rainer, Editura Academiei Române, București 2020, pg. 272- 279, ISBN
978-973-27-3200-7
18. Capitol de carte: Ioana Roxana Bordea , Ondine Lucaciu, Adina Sîrbu, Dan
Buhățel, Anca Ionel, Adela Lazăr, Anida Băbțan, Nausica Petrescu, Willi
Uriciuc, Arin Sava, Claudia Feurdean, Alexandru Meșter, Codruța Mirică,
Ovidiu Aghiorghiesei, Simion Bran, Florin Onișor, Radu Septimiu
Câmpian, Bianca Boșca, Aranka Ilea,. Antropologia dezvoltării creierului
uman, în cartea ”Antropologia Mileniului III" - Andrei Kozma, Octavian
Buda, Constantin Bălăceanu-Stolnici, Colecția Zilele Rainer, Editura
Academiei Române, București 2020, pg. 67-71, ISBN 978-973-27-3200-7
Ca rezultat al cercetărilor, am publicat 91 de articole în rezumat în volume ale

unor congrese și simpozioane în țară și în străinătate, precum și 77 de articole in
extenso în reviste indexate ISI cu factor de impact (38 de articole, dintre care 19 autor
principal și 19 co-autor) și BDI (39 de articole, dintre care 23 autor principal și 16 co-
autor) din țară și din străinătate. Dintre aceste publicații, 7 articole au primit premiul
UEFISCDI - Planul Național de Cercetare, Dezvoltare și Inovare pentru perioada 2015-
2020, PNCDI III, P1 – Dezvoltarea sistemului național de cercetare-dezvoltare,
Subprogramul 1.1 - RESURSE UMANE, ”Premierea rezultatelor cercetării - articole”,
PN-III-P1-1.1-PRECISI.
În cadrul activității științifice, am participat la realizarea a 3 invenții care sunt în
curs de brevetare:
1. Ilea Aranka, Boșca Adina Bianca, Sorițău Olga, Guțiu Eugen, Câmpian
Radu Septimiu. ”Radăcină dentară artificială și procedeu de obținere a
acesteia din acid polylactic grefat cu celule stem mezenchimale” - nr.
OSIM - A 00135/27.02.2019.
2. Farago Paul, Gălătuș Ramona-Voichița, Groza Robert-Gheorghe, Băbțan
Anida Maria, Feurdean Nicoleta Claudia, Petrescu Bianca Nausica, Boșca
Adina Bianca, Ilea Aranka. „Senzor optic salivar realizat prin cuplarea
laterala a unei fibre optice cu emisie pe suprafata si a unei fibre optice
fluorescente integrat intr-un dispozitiv intra-oral” - nr. OSIM A
00136/27.02.2019
3. Tertiş Mihaela Claudia, Cristea Victoria Cecilia, Băbțan Anida-Maria,
Feurdean Nicoleta Claudia, Uriciuc Willi-Andrei, Boșca Adina Bianca, Ilea
Aranka. ”Senzor electrochimic imprimat pe suport planar integrat pe un
dispozitiv intra-oral pentru detecţia electrochimică directă şi simultană a
unor agenţi de glicare avansată din salivă” - nr. OSIM – A 2020
00171/01.04.2020A.
Dintre lucrările prezentate la congresele și conferințele naționale și
internaționale, unele au fost premiate, și am obținut 45 de medalii și distincții.
Am activat ca recenzor la reviste ISI și BDI din țară și străinătate:
• Medicine and Pharmacy Reports
• Journal of Human Nutrition and Dietetics
• Drug Development and Industrial Pharmacy
Sunt membru în Editorial Board of Inflammation în calitate de Review Editor al
jurnalului Frontiers in Immunology.
2. Cariera profesională
Am absolvit gimnaziul în anul 1989 la Școala Generală nr. 15 din Cluj-Napoca și
Liceul Teoretic nr. 1 în anul 1993. În urma examenului de admitere susținut în
septembrie 1993, am devenit studentă la Facultatea de Stomatologie, Universitatea de
Medicină și Farmacie „Iuliu Hațieganu”, Cluj-Napoca. Am absolvit studiile universitare
în anul 1999, cu media generală de promovare a anilor de studii 9,60 și m-am clasificat
a 7-a din cei 104 absolvenți ai promoției. Media pe care am obținut-o la examenul de
licență a fost 9,74. Între anii 2000 – 2001 am efectuat un an de stagiu în cadrul
Spitalului Clinic Județean Cluj, la Clinica de Chirurgie Maxilo-Facială și la cabinetul
stomatologic al Școlii „Ion Creangă” din Cluj-Napoca. În urma examenului de
rezidențiat susținut în noiembrie 2000, am urmat pregătirea în specialitatea
Stomatologie generală, în cadrul Spitalului Clinic Județean Cluj. În martie 2003 am
tisulară
promovat examenul cu media 9,37 și am devenit medic specialist în specialitatea
Stomatologie generală. În continuare, am acumulat experiență practică medicală în
mediul privat. Între anii 2003 și 2009 am desfășurat activitate medicală în cabinetul
stomatologic Happy Dent Clinic din Cluj-Napoca, iar din 2010 colaborez cu cabinetul
stomatologic AnaDent din Cluj-Napoca.
În cadrul formării profesionale, am urmat cursul de limbă franceză desfășurat la
Centrul Cultural Francez din Cluj-Napoca și am obținut diploma Diplôme Approfondi
de Langue Française (DALF), acordată de Ministère de l’Éducation Nationale de la
République Française în anul 2000, și cursul de limbă engleză, desfășurat la Centrul
Access din Cluj-Napoca și am obținut diploma First Certificate in English - Cambridge
ESOL Level 2 Certificate in ESOL International, University of Cambridge în anul 2013.
De asemenea, am urmat cursuri și workshop-uri organizate de Universitatea de
Medicină și Farmacie „Iuliu Hațieganu”, Cluj-Napoca: Problem Based Learning – 2013,
Strategies for Using IEEE Xplore, Open Access, How to Publish – 2014, Scientific
Writing – 2014, Writing in the Sciences – 2014, PRIME Partnerships in International
Medical Education – 2015, „Biblioteca digitală personală” – 2015, Redactarea MCQ
(Multiple Choice Questions)– 2017, Team Based Learning – 2017, Psihopedagogie –
2017, CADMED Platforma Moodle - 2019.
Sunt membru al următoarelor asociații științifice și profesionale: Colegiul
Medicilor Dentiști din România, Societatea Română de Morfologie și Societatea
Română de Biologie Celulară.
tisulară
PRINCIPALELE DIRECȚII DE
DEZVOLTARE A CARIEREI
ȘTIINȚIFICE, ACADEMICE ȘI
PROFESIONALE
tisulară
1. Principalele direcții de dezvoltare a carierei

științifice
Dezvoltarea activităților de cercetare științifică va fi bazată pe realizările
anterioare și constau în cercetări pe culturi celulare și studii experimentale și clinice.
Cercetările pe culturi celulare se vor desfășura la Centrul de Cercetări pentru
Genomică funcțională, biomedicină și medicină translațională. Scopul acestor cercetări
este de a stabili aplicabilitatea celulelor stem mezenchimale în terapia regenerativă a
țesuturilor cavității orale, de a evalua efectul citotoxic al unor materiale dentare noi și
de a testa eficiența unor substanțe medicamentoase sau a unor extracte vegetale în
vederea unor terapii locale în diverse afecțiuni ale mucoasei orale sau ale
parodonțiului.
Studiile experimentale se vor desfășura în cadrul proiectului PN-III-P2-2.1-PED-
2019-3664, “Matrici inteligente personalizate pentru regenerarea tisulară și controlul
metainflamației”, pe perioada: 2020-2022, sub conducerea Prof. Dr. Ilea Aranka în
calitate de director proiect. În cadrul acestui proiect, va fi elaborat un model
experimental de implantare a unei matrici inteligente pe model animal. Matricile
inteligente realizate pe bază de nanofibre de tipul Ag-HAP+Doxy/PLA și Ag-HAP-
Si+Doxy/PLA obținute prin electrospinning vor fi implantate la nivelul leziunilor
parodontale induse experimental pe model animal. După implantare, matricile vor fi
acoperite cu un sistem mucoadeziv care asigură stabilitatea și menținerea matricii.
Prin eliberarea Doxy pe o perioadă prelungită, se va obține un efect bactericid și
bacteriostatic la nivel parodontal. După această primă etapă, Doxy va fi înlocuită cu un
antibiotic țintit, stabilit în urma antibiogramei, în vederea obținerii de matrici
inteligente personalizate. Eficiența tratamentului va fi stabilită pe baza parametrilor
clinici, a aspectelor radiologice și a markerilor imunologici în ser și lichidul crevicular.
Voi participa la continuarea studiilor experimentale și clinice desfășurate în
cadrul proiectului COFUND-ERA-HDHL ERANET, Cooperarea Europeană și
Internațională - Subprogram 3.2 - Orizont 2020, Programul PNCDI III - Biomarkers for
Nutrition and Health. ”Innovative Technological Approaches for validation of Salivary
AGEs as novel biomarkers in evaluation of risk factors in diet-related diseases” -
SALIVAGES. P1-UMF ”Iuliu Hațieganu” Cluj-Napoca – director proiect: Prof. Dr. Ilea
Aranka, derulat pe perioada 2017-2020 la sediul Disciplinei de Reabilitare Orală. În
acest sens, mă voi implica în interpretarea și diseminarea rezultatelor privind
evaluarea inflamației cronice de intensitate joasă (metainflamația) prin dozarea sau
detectarea unor markeri prezenți în diferite fluide biologice: ser/plasmă, urină și
salivă.
În studiile pe care le-am desfășurat și le voi continua, am făcut parte din echipe
formate din cercetători și medici de diferite specialități, întrucât creșterea vizibilității,
impactului și prestigiului Facultății de Medicină și implicit al Universității de Medicină
și Farmacie „Iuliu Hațieganu” la nivel internațional prin publicații în reviste cu factor
de impact se poate realiza doar în cadrul unei echipe multidisciplinare și accesarea
facilităților tehnice de la Centrul de Genomică și Centrul de Cercetare MedFuture, din
cadrul Universității de Medicină și Farmacie „Iuliu Hațieganu” Cluj-Napoca.
Voi participa la manifestări științifice naționale și internaționale pentru

diseminarea rezultatelor cercetării, pentru perfecționarea mea profesională și pentru
stabilirea de contacte cu cercetători din alte centre universitare din țară și din
străinătate, în vederea schimbului de experiență și colaborării în viitoare proiecte de
cercetare.

academice
În cadrul activității didactice la Disciplina de Histologie, îmi propun să susțin
cursuri și lucrări practice de Histologie cu studenții Facultăților de Medicină și
Medicină Dentară în conformitate cu obiectivele educaționale și curiculare la
standarde cât mai înalte din punctul de vedere al conținutului și modului de predare,
cu actualizarea permanentă a cursurilor, precum și favorizarea comunicării informației
într-un mod interactiv.
Mai mult, intenționez să-mi optimizez calitățile de cadru didactic printr-o
abordare reflexivă și auto-evaluarea metodei de predare pe baza feedback-ului pe care
îl primesc din partea studenților. Evaluarea abilităților acumulate de studenți,
raportate la scopurile stabilite la începutul semestrului, va permite conștientizarea
îmbunătățirilor care se impun în privința propriilor mele performanțe didactice.
Evaluarea anonimă de la sfârșitul semestrului, care reflectă gradul de satisfacție,
părerile și recomandările studenților privind cursurile și lucrările practice este
deosebit de utilă pentru optimizarea modului de predare, astfel încât aptitudinile și
competențele acumulate de studenți să fie în concordanță cu nivelurile de cunoștințe
necesare ca bază pentru practica clinică.
Împreună cu colectivul Disciplinei de Histologie, voi elabora materiale didactice
care să le faciliteze studenților studiul pe parcursul semestrului și pregătirea pentru
examenele semestriale.
Pentru studenții Facultății de Medicină Dentară, linia de predare în limba
engleză, vom elabora o carte care să reprezinte un suport de curs actualizat, precum și
un volum de exerciții de Histologie, care să cuprindă întrebări cu răspuns la alegere și
care să le fie util pentru examenele teoretice din anul I.
Pentru studenții Facultăților de Medicină și Medicină Dentară, linia de predare
în limba engleză, vom edita caiete de lucrări practice care să conțină elementele de
diagnostic histologic pentru țesuturi și organe, completate cu imagini de preparate
histologice. În plus, cu ajutorul aparatului Digital Scanner Leica Biosystems din dotarea
Disciplinei de Histologie, vom realiza o bază de date cu preparate histologice scanate,
care va fi accesibilă studenților atât în timpul lucrărilor practice, cât și în timpul
destinat studiului individual, ceea ce le va facilita pregătirea pentru examenul practic.
În cadrul tutoriatului propun implicarea studenților în activități extrașcolare
care să crească coeziunea și comunicarea dintre studenți, cu facilitarea integrării
studenților străini.
tisulară

profesionale
În vederea dezvoltării profesionale, intenționez să particip activ la congrese,
cursuri postuniversitare și workshop-uri pentru a-mi actualiza în permanență
cunoștințele practice și teoretice din domeniul medicinei dentare, pe care ulterior să le
integrez în activitatea de cercetare fundamentală. De asemenea, voi efectua stagii de
pregătire pentru dobândirea unor competențe conexe practicii stomatologice și mă voi
implica în studii clinice în cadrul granturilor de cercetare la care voi participa. Voi
continua colaborarea cu cabinetele stomatologice private și voi promova examenul de
medic primar.
4. Capacitatea de a coordona echipe de cercetare

Pentru coordonarea eficientă a unei echipe de cercetare, voi încerca să identific
punctele tari ale fiecărui membru, astfel încât să-i atribui un rol corespunzător şi să-i
stimulez dezvoltarea prin creşterea încrederii în sine. Un alt aspect esențial pe care îl
voi lua în considerare este modul în care membrii echipei sunt compatibili și calitățile
lor sunt complementare, pentru a asigura o colaborare optimă în cadrul activităților pe
care le derulează. Totodată, voi încerca să institui măsuri menite să contracareze
punctele slabe identificate și să aplic strategii care să dezvolte competenţele necesare
pentru îndeplinirea obiectivelor stabilite.
5. Capacitatea de a gestiona și organiza activități

didactice
Cursurile se vor desfășura într-un climat pozitiv, confortabil, și voi stimula
interacțiunea dinamică pentru implicarea studenților în actul de predare-învățare,
ceea ce va facilita sinteza, analiza, aplicarea și reținerea noțiunilor discutate.
Comunicarea scopurilor cursului și a așteptărilor pe care profesorii le au de la studenți
ajută la utilizarea eficientă a materialelor teoretice pe care cadrul didactic le pune la
dispoziție și a aparaturii din dotarea laboratoarelor și a sălii de curs (preparatele
microscopice, microscoapele individuale, microscopul educațional, tabla interactivă)
pentru a dobândi nivelul corespunzător de cunoștințe de Histologie.
6. Capacitatea de explicare și facilitare a învățării

În predarea și explicarea noțiunilor de Histologie, un aspect esențial este
stimularea unei gândiri analitice și sintetice în vederea translatării cunoștințelor
fundamentale înspre practica clinică. Acest deziderat va fi atins prin implementarea
unor metode moderne de predare și învățare: învățarea prin rezolvarea de probleme
(problem based learning), învățarea în cadrul echipelor (team based learning), și
aplicarea unor strategii care să motiveze studenții să-și însușească noțiunile

fundamentale de Histologie, pe care să le integreze în cunoștințele acumulate anterior.
Dincolo de actul predării, studenții vor fi încurajați să caute informații în
conformitate cu cunoștințele lor anterioare, care reprezintă o bază importantă pentru
ceea ce urmează să învețe la Histologie și la Morfopatologie.
7. Capacitatea de explicare și facilitare a cercetării

Susținerea studenților și doctoranzilor în desfășurarea activității de cercetare
poate fi realizată prin asigurarea suportului material din laboratoarele de cercetare și
prin însușirea tehnicilor și manoperelor specifice domeniului cercetării. Studenții vor fi
încurajați să se implice în activitatea de cercetare și vor fi cooptați în echipele de
cercetare. Pentru atingerea obiectivelor propuse, planul de cercetare trebuie să fie
realist și flexibil, bazat pe o documentare temeinică privind stadiul actual al
cunoașterii în domeniul temei alese. În realizarea activităților aferente studiilor din
lucrarea de licență sau teza de doctorat, tinerii cercetători trebuie să dobândească
abilitățile de a concepe și de a conduce o cercetare independentă.
Pentru pregătirea lucră rilor de licență, studenții din anul V pregătesc referate
bazate pe documentarea prealabilă, care se pot constitui ca parte generală a lucrării
finale. Studenții din anul VI sunt sprijiniți pentru realizarea studiilor, interpretarea
rezultatelor și definitivarea contribuției personale. Iar pentru redactarea lucrării de
licenţă, respectiv a tezei de doctorat, studenții și doctoranzii vor fi îndrumați să
respecte regulile formulate de comunitatea științifică. Pregătirea în vederea susținerii
finale a lucrării de licență și a tezei de doctorat constă în prezentarea orală, sub formă
de Power Point, a premiselor care au stat la baza studiilor, a direcțiilor de cercetare și a
principalelor rezultate obținute, cu formularea succintă a discuțiilor și concluziilor.
tisulară
REFERINŢE
1 Eke PI, Dye BA, Wei L, Thornton-Evans GO, Genco RJ; CDC Periodontal Disease Surveillance
workgroup: James Beck (University of North Carolina, Chapel Hill, USA), Gordon Douglass
(Past President, American Academy of Periodontology), Roy Page (University of Washin).
Prevalence of periodontitis in adults in the United States: 2009 and 2010. J Dent Res.
2012;91(10):914–920.
2 Preshaw PM. Host response modulation in periodontics. Periodontol 2000. 2008;48:92-110.
3 Gölz L, Memmert S, Rath-Deschner B, et al. LPS from P. gingivalis and hypoxia increases
oxidative stress in periodontal ligament fibroblasts and contributes to periodontitis.

Mediators Inflamm. 2014;2014. doi:10.1155/2014/986264.
4 Graves D. Cytokines That Promote Periodontal Tissue Destruction. J Periodontol.
2008;79(8s):1585-1591. doi:10.1902/jop.2008.080183.
5 Shoji M, Tanabe N, Mitsui N, Suzuki N, Takeichi O, Katono T, Morozumi A, Maeno M.
Lipopolysaccharide enhances the production of nicotine-induced prostaglandin E2 by an

increase in cyclooxygenase-2 expression in osteoblasts. Acta Biochim Biophys Sin
(Shanghai). 2007 Mar;39(3):163-72.
6 Nagarajan R, Miller CS, Dawson D 3rd, Al-Sabbagh M, Ebersole JL. Cross-talk between clinical
and host-response parameters of periodontitis in smokers. J Periodontal Res.

2017;52(3):342–352. doi:10.1111/jre.12397
7 Deo V, Bhongade ML. Pathogenesis of periodontitis: role of cytokines in host response. Dent
Today. 2010; 29(9):60-2, 64-66; quiz 68-69.

8 Willcox JK, Ash SL CG. Antioxidants and prevention of chronic disease. Crit Rev Food Sci Nutr.
2004;44(4):275-295.
9 D'Aiuto F, Nibali L, Parkar M, Patel K, Suvan J, Donos N. Oxidative stress, systemic inflammation,
and severe periodontitis. J Dent Res. 2010; 89(11):1241-1246.

10 Valko M, Leibfrit D, Moncol J, Cronin Mt, Mazur M, Telser J. Free radicals and antioxidants in
normal physiological functions and human disease. Int J Biochem Cell Biol. 2007; 39(1):44-
84.
11 Gulati M, Anand V, Govila V, Jain N. Host modulation therapy: An indispensable part of
perioceutics. J Indian Soc Periodontol. 2014;18(3):282-288.

12 Bengmark S. Integrative medicine and human health - the role of pre-, pro- and synbiotics. Clin
Transl Med. 2012;1(1):6.

13 Irimie AI, Braicu C, Zanoaga O, Pileczki V, Gherman C, Berindan-Neagoe I, Campian RS.
Epigallocatechin-3-gallate suppresses cell proliferation and promotes apoptosis and

autophagy in oral cancer SSC-4 cells. Onco Targets Ther. ;8:461-70. 2015.
14 Tao L, Park JY, Lambert JD. Differential prooxidative effects of the green tea polyphenol, (-)-
epigallocatechin-3-gallate, in normal and oral cancer cells are related to differences in sirtuin
3 signaling. Mol Nutr Food Res.;59(2):203-11. 2015.
15 Asahi Y, Noiri Y, Miura J, Maezono H, Yamaguchi M, Yamamoto R, Azakami H, Hayashi M, Ebisu
S. Effects of the tea catechin epigallocatechin gallate on Porphyromonas gingivalis biofilms. J

Appl Microbiol.;116(5):1164-71. 2014.
16 Zhou H, Beevers CS, Huang S. The targets of curcumin. Curr Drug Targets. 2011;12(3):332-47.
17 Shehzad A, Rehman G, Lee YS. Curcumin in inflammatory diseases. Biofactors. 2013;39(1):69-
77.
18 Borra SK, Mahendra J, Gurumurthy P, Jayamathi, Iqbal SS, Mahendra L. Effect of curcumin
against oxidation of biomolecules by hydroxyl radicals. J Clin Diagn Res. 2014;8(10):CC01–

CC5. 7 Li JP, Habibovica P, van del Doel M, Wilson CE, de Wijn JR, van Blitterswijk CA et al.
Bone ingrowth in porous titanium implants produced by 3D fiber deposition. Biomaterials.
2007;28:2810– 2820
19 Li JP, Habibovica P, van del Doel M, Wilson CE, de Wijn JR, van Blitterswijk CA et al. Bone
ingrowth in porous titanium implants produced by 3D fiber deposition. Biomaterials.
2007;28:2810– 2820.
20 Ilea A, Vrabie OA, Bă bțan AM, Miclaus V, Ruxanda F, Sarkozi M, Barbu-Tudoran L, Berce C,
Boș ca BA, Petrescu NB, Cadar O, Câ mpian RS, Barabá s R. Osseointegration of titanium
scaffolds manufactured by selective laser melting in rabbit femur defect model. Journal of
Materials Science: Materials in Medicine (2019)30(2):26
21 Ilea A, Timuș D, Petrescu NB, Sorițău O, Boș ca BA, Mager V, Barbu-Tudoran L, Bă bțan AM,
Câ mpian RS, Barabá s R. An in vitro Study on the Biocompatibility of Titanium Implants Made
by Selective Laser Melting. Biotechnol Bioproc E. 2019;24: 782-792.
22 Sharma P. Inflammation and the metabolic syndrome. Indian J Clin Biochem. 2011
Oct;26(4):317-8.
23 Xu H, Li X, Adams H, Kubena K, Guo S. Etiology of Metabolic Syndrome and Dietary
Intervention. Int J Mol Sci. 2018;20(1):128. Published 2018 Dec 31.

doi:10.3390/ijms20010128
24 Băbțan AM, Ilea A, Boșca BA, Crișan M, Petrescu NB, Collino M, Sainz RM, Gerlach J, Câmpian
RS. Advanced Glycation End Products (AGEs) as biomarkers in systemic diseases. Premises
and perspectives of salivary AGEs 2019;13(6):479–495.
25 Ilea A, Băbţan AM, Boşca BA, Crişan M, Petrescu NB, Collino M, Sainz RM, Gerlach JQ, Câmpian
RS. Advanced glycation end products (AGEs) in oral pathology. Arch Oral Biol. 2018 May
18;93:22-30.
26 Anida-Maria Babtan, Aranka Ilea, Nausica Petrescu, Bianca Bosca, Maria Crișan, Manuela
Lenghel, Anca Ionel, Andreea Pop, Willi Uriciuc, Codruta Mirica, Claudia Feurdean, Radu
Septimiu Campian. Advanced glycation end products (AGEs) ultrasound evaluation in facial
skin and mucosa. Palestrica of the third millennium - Civilization and sport, Romanian
Journal of Applied Medicine for Sport, Health, Exercise and Medical Rehabilitation.
Supplement No. 4, Vol. 19/2018, pp 58
27 Băbțan AM, Boșca AB, Crișan M, Lenghel M, Câmpian RS, Ilea A. Ultrasound Investigation in
Congenital Masseter Hypertrophy. Biomed J Sci&Tech Res 6(3)- 2018. BJSTR. MS.ID.001350.
DOI: 10.26717/ BJSTR.2018.06.001349.
28 Băbțan AM, Boșca AB, Petrescu BN, Mirică CI, Crișan M, Câmpian RS,Ilea A. Use of Ultrasound
Investigation in the Treatment Plan of Apical Surgery Relapse. Biomed J Sci & Tech Res.
2019;19(1):13983-87. BJSTR. MS.ID.003230, DOI: 10.26717/BJSTR.2019.19.003230, ISSN:
2574-1241
29 Tiwari, M. Science behind human saliva. J. Nat. Sci. Biol. Med. 2011, 2, 53–58.
30 Iorgulescu, G. Saliva between normal and pathological. Important factors in determining
systemic and oral health. J. Med. Life 2009, 2, 303–307.

31 Faragó P, Gălătuș R, Hintea S, Boșca AB, Feurdean CN, Ilea A. An Intra-Oral Optical Sensor for
the Real-Time Identification and Assessment of Wine Intake. Sensors, 2019, 19, 4719;
doi:10.3390/s19214719
32 Chilukuri H, Kulkarni MJ, Fernandes M. Revisiting amino acids and peptides as anti-glycation
agents. Medchemcomm. 2018; 9(4): 614–624.

33 Luevano-Contreras C, Chapman-Novakofski K. Dietary advanced glycation end products and
aging. Nutrients. 2010;2:1247-1265.

34 Delgado-Andrade C, Morales FJ, Seiquer I, Navarro MP. Maillard reaction products profile and
intake from Spanish typical dishes, Food Res Int. 2010;43:1304-1311.

35 Poulsen MW, Hedegaard RV, Andersen JM, de Courten B, Bugel S, Nielsen J, Skibsted LH,
Dragsted LO. Advanced glycation endproducts in food and their effects on health, Food Chem
Toxicol. 2013; 60:10-37.
36 Delgado-Andrade C. Carboxymethyl-lysine: thirty years of investigation in the field of AGE
formation. Food Funct. 2016 Jan;7(1):46-57

tisulară
37 Ahmed MU, Thorpe SR, Baynes JW. Identification of Nε-(carboxymethyl)lysine as a

degradation product of fructoselysine in glycated protein. J Biol Chem. 1986;261:4889–
4894.
38 Assar SH, Moloney C, Lima M, Magee R, Ames JM. Determination of Nε– (carboxymethyl)lysine
in food systems by ultra performance liquid chromatography- mass spectrometry, Amino

Acids, 2009, 36, 317-326.
39 Niquet-Leridon C, Tessier FJ. Quantification of Nε-carboxymethyl-lysine in selected chocolate-
flavoured drink mixes using high-performance liquid chromatography-linear ion trap

tandem mass spectrometry, Food Chem., 2011, 126, 655-663.
40 Hull GLJ, Woodside JV, Ames JM, Cuskelly GJ. Nε-(carboxymethyl)lysine content of foods
commonly consumed in a western style diet, Food Chem., 2012, 131, 170-174.
41 Delgado-Andrade C. Maillard reaction products: some considerations on their health effects,
Clin. Chem. Lab. Med., 2014, 52, 53-60.

42 Cai W, He JC, Zhu L, Peppa M, Lu C, Uribarri J, Vlassara H. High levels of dietary advanced
glycation end products transform low-dersity lipoprotein into a potent redox-sensitive

mitogen-activated protein kinase stimulant in diabetic patients, Circulation, 2004, 110,285-
91.
43 Ames JM. Evidence against dietary advanced glycation endproducts being a risk to human
health, Mol. Nutr. Food Res., 2007, 54, 1085-1090.

44 Ramasamy R, Yan SF, Schmidt AM. Receptor for AGE (RAGE): signaling mechanisms in the
pathogenesis of diabetes and its complications, Ann. N.Y. Acad. Sci., 2011, 1243, 88-102.
45 Zizzi A, Tirabassi G, Aspriello SD, Piemontese M, Rubini C, Lucarini G. Gingival advanced
glycation end-products in diabetes mellitus-associated chronic periodontitis: An

immunohistochemical study. Journal of Periodontal Research, 2013 : 48(3), 293–301.
46 Gurav A. Advanced glycation end products: A link between periodontitis and diabetes
mellitus? Current Diabetes Reviews. 2013, 9, 355–361.

47 Lalla, E., Lamster, I., Stern, D., & Schmidt, A. M. (2001). Receptor for advanced glycation end
products, inflammation, and accelerated periodontal disease in diabetes: Mechanisms and

insights into therapeutic modalities. Annals of Periodontology, 6, 113–118.
48 Băbțan AM, Boșca BA, Petrescu NB, Pârvu AE, Uifălean A, Taulescu M, Negru M, Crișan M,
Câmpian RS, Ilea A. Accumulation of N-epsilon carboxymethyl lysine in various tissues and
organs related to diet-induced aging process. State of the art and experimental animal study.
HVM Bioflux 2019;11(3):106-115.
49 Thomas CJ, Cleland TP, Sroga GE, Vashishth D. Accumulation of carboxymethyl-lysine (CML) in
human cortical bone. Bone. 2018;110:128-133. doi:10.1016/j.bone.2018.01.028

50 Schmidt, A. M., Weidman, E., Lalla, E., Yan, S. D., Hori, O., Cao, R., Brett, J. G. & Lamster, I. B.
(1996) Advanced glycation endproducts (AGEs) induce oxidant stress in the gingiva: a
potential mechanism underlying accelerated periodontal disease associated with diabetes.
Journal of Periodontal Research 31, 508–515.
51 Segal AW. How neutrophils kill microbes. Annu Rev Immunol. 2005;23:197-223.
52 Scott DA, Krauss J. Neutrophils in periodontal inflammation. Front Oral Biol. 2012;15:56-83.
53 Çanakçi CF, Çiçek Y, Çanakçi V. Reactive oxygen species and human inflammatory periodontal
diseases. Biochemistry. (Mosc). 2005;70(6):619–628.

54 Chapple IL, Matthews JB. The role of reactive oxygen and antioxidant species in periodontal
tissue destruction. Periodontol 2000. 2007;43(1):160–232.

55Ying Ouyang X, Mei Xiao W, Chu Y, Ying Zhou S. Influence of periodontal intervention therapy
on risk of cardiovascular disease. Periodontol 2000. 2011;56(1):227–257.

56Loukides S, Bakakos P, Kostikas K. Oxidative stress in patients with COPD. Curr Drug Targets.
2011;12(4):469–477.
57 Stadler K. Oxidative stress in diabetes. Adv Exp Med Biol. 2012;771:272–287.
58 Lee R, Margaritis M, Channon KM, Antoniades C. Evaluating oxidative stress in human

cardiovascular disease: methodological aspects and considerations. Curr Med Chem.
2012;19(16):2504– 2520.
59 Tuder RM, Petrache I. Pathogenesis of chronic obstructive pulmonary disease. J Clin Invest.
2012;122(8):2749–2755.
60 Wei D, Zhang XL, Wang YZ, Yang CX, Chen G. Lipid peroxidation levels, total oxidant status and
superoxide dismutase in serum, saliva and gingival crevicular fluid in chronic periodontitis
patients before and after periodontal therapy. Aust Dent J. 2010;55(1):70–78.
61 Trivedi S, Lal N, Mahdi AA, Mittal M, Singh B, Pandey S. Evaluation of antioxidant enzymes
activity and malondialdehyde levels in patients with chronic periodontitis and diabetes
mellitus. J Periodontol. 2014;85(5):713–720.
62 Graves DT, Kang J, Andriankaja O, Wada K, Rossa C Jr. (2012). Animal models to study host-
bacteria interactions involved in periodontitis. Front Oral Biol. 15:117-32.

63 Oz HS, Puleo DA. (2011). Animal models for periodontal disease. J Biomed Biotechnol. 754857.
64 Boșca AB, Miclaus V, Ilea A, Câmpian RS, Rus V, Ruxanda F, Ratiu C, Uifălean A, Pârvu AE. Role
of nitro-oxidative stress in pathogenesis of experimental rat periodontitis Clujul Medical;

2016: 89 (1) 150-159.
65 Boşca AB, Ilea A, Șovrea AS, Constantin AM, Ruxanda F, Rus V, Rațiu C, Miclăuş V. An
Experimental Model for Inducing Periodontal Pathology in Rat: Histopathological and

Enzymatic Aspects Bulletin UASVM Veterinary Medicine 2014 71(2) 507-508
66 Miranda KM, Espey MG, Wink DA. A rapid, simple spectrophotometric method for
simultaneous detection of nitrate and nitrite. Nitric Oxide. 2001;5:62-71.

67 Erel O. A new automated colorimetric method for measuring total oxidant status. Clin
Biochem. 2005;38:1103-1111.
68 Erel O. A novel automated method to measure total antioxidant response against potent free
radical reactions. Clin Biochem. 2004;37:112-119.

69 Harma M, Harma M, Erel O. Increased oxidative stress in patients with hydatidiform mole.
Swiss Med Wkly. 2003;133:563- 566.

70 Oyinloye BE, Adenowo AF, Kappo AP. Reactive oxygen species, apoptosis, antimicrobial
peptides and human inflammatory diseases. Pharmaceuticals (Basel). 2015;8(2):151-175.

71 Harasym J, Oledzki R. Effect of fruit and vegetable antioxidants on total antioxidant capacity of
blood plasma. Nutrition. 2014;30(5):511-517.

72 Dahiya P, Kamal R, Gupta R, Bhardwaj R, Chaudhary K, Kaur S. Reactive oxygen species in
periodontitis. J Indian Soc Periodontol. 2013;17(4):411-416.

73 de Sa Siqueira MA, Fischer RG, da Silva Figueredo CM, Brunini TM, Mendes-Ribeiro AC. Nitric
oxide and oral diseases: can we talk about it?. Cardiovasc Hematol Agents Med Chem.
2010;8(2):104-112.
74 Akpinar A, Toker H, Ozdemir H, Bostanci V, Aydin H. The effects of non-surgical periodontal
therapy on oxidant and antioxidant status in smokers with chronic periodontitis. Arch Oral
Biol. 2013;58(6):717-723.
75 Borges I Jr, Moreira EA, Filho DW, De Oliveira TB, da Silva MB, Frö de TS. Proinflammatory and
oxidative stress markers in patients with periodontal disease. Mediators Inflamm.

2007;2007:45794.
76 Ghiselli A, Serafini M, Natella F, Scaccini C. Total antioxidant capacity as a tool to assess redox
status: critical view and experimental data. Free Radic Biol Med. 2000;29(11):1106-1114.
77 Kirkwood KL, Cirelli JA, Rogers JE, Giannobile WV. Novel host response therapeutic
approaches to treat periodontal diseases. Periodontol 2000. 2007;43:294-315.

78 San Miguel SM, Opperman LA, Allen EP, Svoboda KK. Reactive oxygen species and antioxidant
defense mechanisms in the oral cavity: a literature review. Compend Contin Educ Dent.
2011;32(1):E10-15.
79 Ammon HP, Wahl MA. Pharmacology of Curcuma longa. Planta Med.1991;57:1-7.
tisulară
80 Nagpal M, Sood S. Role of curcumin in systemic and oral health: An overview. J Nat Sc Biol Med.
2013;4:3-7.
81 Quitschke WW. Differential solubility of curcuminoids in serum and albumin solutions:
implications for analytical and therapeutic applications. BMC Biotechnol. 2008;8:84.

82 Shehzad A, Rehman G, Lee YS. Curcumin in inflammatory diseases. Biofactors. 2013;39(1):69-
77.
83 Borra SK, Mahendra J, Gurumurthy P, Jayamathi, Iqbal SS, Mahendra L. Effect of curcumin
against oxidation of biomolecules by hydroxyl radicals. J Clin Diagn Res. 2014;8(10):CC01–

CC5. 7
84 Zhou T, Chen D, Li Q, Sun X, Song Y, Wang C. Curcumin inhibits inflammatory response and
bone loss during experimental periodontitis in rats. Acta Odontol Scand. 2013;71(2):349-
356.
85 Guimarã es MR, Coimbra LS, De Aquino SG, Spolidorio LC, Kirkwood KL, ROSSA C Jr. Potent
anti-inflammatory effects of systemically administered curcumin modulate periodontal

disease in vivo. J Periodontal Res. 2011;46(2):269-279.
86 Fujisawa S, Atsumi T, Ishihara M, Kadoma Y. Cytotoxicity, ROS-generation activity and radical-
scavenging activity of curcumin and related compounds. Anticancer Res. 2004;24(2B):563–

569.
87 Boșca AB, Dinte E, Colosi H, Ilea A, Câmpian RS, Uifălean A, Pârvu AE Curcumin effect on nitro-
oxidative stress in ligature-induced rat periodontitis, Rom Biotechnol Lett. 2015;

21(4):10709 – 10717.
88 Dinte E, Todica M, Pop CV, Leucuta SE. Physical Characterization of Some Mucoadhesive Gels
for Oral Cavity Applications, Studia Universitatis Babes-Bolyai, Physica. 2008; LIII, 1, 55-64.
89 Sharma RA, Euden SA, Platton SL, Cooke DN, Shafayat A, Hewitt HR. Marczylo TH, Morgan B,
Hemingway D, Plummer SM, Pirmohamed M, Gescher AJ, Steward WP. Phase I clinical trial of
oral curcumin: biomarkers of systemic activity and compliance. Clin Cancer Res. 2004;10:
6847–6854.
90 Aggarwal BB, Sundaram C, Malani N, Ichikawa H. Curcumin: the Indian solid gold. Adv Exp
Med Biol. 2007;595:1-75.

91 Wahlströ m B, Blennow G. A study on the fate of curcumin in the rat. Acta Pharmacol Toxicol
(Copenh). 1978;43(2):86-92.
92 Holder GM, Plummer JL, Ryan AJ. The metabolism and excretion of curcumin (1,7-bis-(4-
hydroxy-3-methoxyphenyl)-1,6-heptadiene-3,5-dione) in the rat. Xenobiotica1978;8:761–

768.
93 Elburki MS, Rossa C, Guimarã es MR, Goodenough M, Lee HM, Curylofo FA, Zhang Y, Johnson F,
Golub LM. A novel chemically modified curcumin reduces severity of experimental

periodontal disease in rats: initial observations. Mediators Inflamm. 2014; 2014:959471.
94 Sharma RA, Ireson CR, Verschoyle RD, Hill KA, Williams ML, Leuratti C, Manson MM, Marnett
LJ, Steward WP, Gescher A. Effects of dietary curcumin on glutathione S transferase and
malondialdehyde-DNA adducts in rat liver and colon mucosa: relationship with drug levels.
Clin Cancer Res. 2001;7:1452–1458.
95 Huang S, Beevers C. Parmacological and clinical properties of curcumin. Botanics: Targets and
Therapy. 2011; 1:5-18.

96 Ireson CR, Jones DJ, Orr S, Coughtrie MW, . Boocock DJ, Williams ML, Farmer PB, Steward WP,
Gescher AJ. Metabolism of the cancer chemopreventive agent curcumin in human and rat
intestine. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2002; 11:105–111.
97 Shoba G, Joy D, Joseph T, Majeed M, Rajendran R, Sirinivas PS. Influence of piperine on the
pharmacokinetics of curcumin in animals and human volunteers. Planta Med. 1998; 64:353–
356.
98 Egusa H, Sonoyama W, Nishimura M, et al. Stem cells in dentistry--part I: stem cell sources. J
Prosthodont Res. 2012;56(3):151-65.

99 Giordano G, La Monaca G, Annibali S, et al. Stem cells from oral niches: a review. Annali di
Stomatologia. 2011;2(1-2):3-8.
100 Boşca AB, Soriţău O, Ilea A, et al. Effect of curcumin and epigallocatechin-3- gallate on stem
cells derived from human periodontium. Ann Rom Soc Cell Biol. 2015;19(3):83-94.
doi:10.ANN/RSCB-2015-0030:RSCB.
101 Moga M, Boşca AB, Soriţău O, et al. Nicotine cytotoxicity on the mesenchymal stem cells
derived from human periodontium. Rom Biotechnol Lett. 2016;21(4):11632-11641.

102 Bozkurt SB, Hakki SS, Hakki EE, Durak Y, Kantarci A. Porphyromonas gingivalis
Lipopolysaccharide Induces a Pro-inflammatory Human Gingival Fibroblast Phenotype.

Inflammation. 2017;40(1):144-153. doi: 10.1007/s10753-016-0463-7.
103 Kut-Lasserre C, Miller CC, Ejeil AL, Gogly B, Dridi M, Piccardi N, Guillou B, Pellat B, Godeau G.
Effect of avocado and soybean unsaponifiables on gelatinase A (MMP-2), stromelysin 1

(MMP-3), and tissue inhibitors of matrix metalloproteinase (TIMP- 1 and TIMP-2) secretion
by human fibroblasts in culture. J Periodontol. 2001;72(12):1685-1694.
104 Fang Y, Svoboda KH. Nicotine inhibits myofibroblast differentiation in human gingival
fibroblasts. Journal of Cellular Biochemistry. 2005;95:1108–1119.

105 Malhotra R, Kapoor A, Grover V, Kaushal S. Nicotine and periodontal tissues. Journal of Indian
Society of Periodontology. 2010;14:72-9.

106 Broulik PD, Rosenkrancova J, Ruzicka P, Sedlacek R, Kurcova I. The effect of chronic nicotine
administration on bone mineral content and bone strength in normal and castrated male
rats. Hormone and Metabolic Research. 2007;39:20–4.
107 Ilea A, Petrescu N, Boșca AB, Sorițău O, Câmpian RS. Metode de izolare a celulelor stem
mezenchimale de la nivelul cavității orale, utile în testele de citotoxicitate a materialelor

dentare. In: Cercetare în Medicina Dentară – proprietăți optice ale dinților și materialelor
dentare, Ed. Colorama, Cluj-Napoca, 2016, pp. 151-161.
108 Ilea A, Timuș D, Sorițău O, Vulpoi A, Boșca BA, Pall E, Petrescu BN, Băbțan AM, Câmpian RS,
Șovrea AS. Interaction of stem cells derived from maxillary and mandibular bone with salts
from culture medium. Front Nanosci Nanotech. 2019;5:1-7. doi: 10.15761/FNN.1000180
109 Dominici M, Le Blanc K, Mueller I, Slaper-Cortenbach I, Marini Fc, Krause Ds, Deans Rj,
Keating A, Prockop Dj, Horwitz Em. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal
stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy.
2006; 8.4: 315-317.
110 Bainbridge BW, Darveau RP. Porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide: an unusual
pattern recognition receptor ligand for the innate host defense system. Acta Odontol Scand.
2001;59(3):131-138.
111 Wang PL, Ohura K. Porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide signaling in gingival
fibroblasts-CD14 and Toll-like receptors. Crit Rev Oral Biol Med. 2002;13(2):132-142.
112 Li Q, Valerio MS, Kirkwood KL. MAPK Usage in Periodontal Disease Progression. J Signal
Transduct. 2012;2012:1-17. doi:10.1155/2012/308943.

113 Oeckinghaus A, Hayden MS, Ghosh S. Crosstalk in NF-κB signaling pathways. Nat Immunol.
2011;12(8):695-708. doi:10.1038/ni.2065.
114 Liu C, Mo L, Niu Y, Li X, Zhou X, Xu X. The role of reactive oxygen species and autophagy in
periodontitis and their potential linkage. Front Physiol. 2017;8(JUN):1-13.

doi:10.3389/fphys.2017.00439.
115 Ha H, Bok Kwak H, Woong Lee S, et al. Reactive oxygen species mediate RANK signaling in
osteoclasts. Exp Cell Res. 2004;301(2):119-127. doi:10.1016/j.yexcr.2004.07.035.

116 Ejeil AL, Igondjo-Tchen S, Ghomrasseni S, Pellat B, Godeau G, Gogly B. Expression of matrix
metalloproteinases (MMPs) and tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMPs) in healthy

and diseased human gingiva. J Periodontol. 2003;74(2):188-195.
117 Wu Y, Zhu L, Wei H, Peng B. Regulation of matrix metalloproteinases, tissue inhibitor of
matrix metalloproteinase-1, and extracellular metalloproteinase inducer by interleukin-17 in

tisulară
human periodontal ligament fibroblasts. J Endod. 2013;39(1):62-67. doi:

10.1016/j.joen.2012.09.025.
118 Zhou J, Windsor LJ. Porphyromonas gingivalis affects host collagen degradation by affecting
expression, activation, and inhibition of matrix metalloproteinases. J Periodont Res 2006;

41(1):47-54.
119 Séguier S, Gogly B, Bodineau A, Godeau G, Brousse N. Is collagen breakdown during
periodontitis linked to inflammatory cells and expression of matrix metalloproteinases and

tissue inhibitors of metalloproteinases in human gingival tissue? J Periodontol.
2001;72(10):1398-1406.
120 Hadziabdic N, Kurtovic-Kozaric A, Pojskic N, Sulejmanagic N, Todorovic L. Gene-expression
analysis of matrix metalloproteinases 1 and 2 and their tissue inhibitors in chronic periapical
inflammatory lesions. J Oral Pathol Med. 2016;45(3):224-30. doi: 10.1111/jop.12347.
121 Miao L, Zhan S, Liu J. Interleukin-12-mediated expression of matrix metalloproteinases in
human periodontal ligament fibroblasts involves in NF-κB activation. Biosci Rep. 2017;37(6).
pii: BSR20170973. doi: 10.1042/BSR20170973.
122 Sato Y, Kishi J, Suzuki K, Nakamura H, Hayakawa T. Sonic extracts from a bacterium related to
periapical disease activate gelatinase A and inactivate tissue inhibitor of metalloproteinases

TIMP-1 and TIMP-2. Int Endod J. 2009;42(12):1104-1111. doi: 10.1111/j.1365-
2591.2009.01640.x.
123 Xiang J, Li C, Dong W, Cao Z, Liu L. Expression of matrix metalloproteinase-1, matrix
metalloproteinase-2 and extracellular metalloproteinase inducer in human periodontal

ligament cells stimulated with interleukin-1 beta. J Periodont Res 2009; 44:784–793.
124 Hakki SS, Hakki EE, Nohutcu RM. Regulation of matrix metalloproteinases and tissue
inhibitors of matrix metalloproteinases by basic fibroblast growth factor and dexamethasone

in periodontal ligament cells. J Periodont Res. 2009;44(6):794-802. doi: 10.1111/j.1600-
0765.2008.01192.x.
125 Bodet C, Andrian E, Tanabe S, Grenier D. Actinobacillus actinomycetemcomitans
lipopolysaccharide regulates matrix metalloproteinase, tissue inhibitors of matrix

metalloproteinase, and plasminogen activator production by human gingival fibroblasts: a
potential role in connective tissue destruction. J Cell Physiol. 2007;212(1):189-194.
126 Li G, Liu D, Zhang Y, Qian Y, Zhang H, Guo S, Sunagawa M, Hisamitsu T, Liu Y. Celastrol Inhibits
Lipopolysaccharide-Stimulated Rheumatoid Fibroblast-Like Synoviocyte Invasion through

Suppression of TLR4/NF-κB-Mediated Matrix Metalloproteinase-9 Expression. Gay N, ed.
PLoS ONE. 2013;8(7):e68905. doi:10.1371/journal.pone.0068905.
127 Zhou J, Windsor LJ. Heterogeneity in the collagen-degrading ability of Porphyromonas
gingivalis-stimulated human gingival fibroblasts. J Periodont Res 2007;42: 77–84.

128 Pattamapun K, Tiranathanagul S, Yongchaitrakul T, Kuwatanasuchat J, Pavasant P. Activation
of MMP-2 by Porphyromonas gingivalis in human periodontal ligament cells. J Periodontal

Res. 2003;38(2):115-121.
129 Tiranathanagul S, Yongchaitrakul T, Pattamapun K, Pavasant P. Actinobacillus
actinomycetemcomitans lipopolysaccharide activates matrix metalloproteinase-2 and

increases receptor activator of nuclear factor-kappaB ligand expression in human
periodontal ligament cells. J Periodontol. 2004;75(12):1647-54.
130 Sorsa T, Tjaderhane L, Salo T. Matrix metalloproteinases (MMPs) in oral diseases. Oral Dis
2004;10(6):311–318.
131 Hassan ZK, Daghestani MH. Curcumin effect on MMPs and TIMPs genes in a breast cancer cell
line. Asian Pac J Cancer Prev. 2012;13(7):3259-64.

132 Scalera F, Borlak J, Beckmann B, et al. Endogenous nitric oxide synthesis inhibitor asymmetric
dimethyl L-arginine accelerates endothelial cell senescence. Arterioscler Thromb Vasc Biol.
2004;24(10):1816-1822. doi:10.1161/01.ATV.0000141843.77133.fc.
133 Baehrecke EH. Autophagy: dual roles in life and death?. Nature Reviews Molecular Cell
Biology. 2005;6(6):505-510.
134 Dahiya P., Kamal R., Gupta R., Bhardwaj R., Chaudhary K., Kaur S. Reactive oxygen species in
periodontitis J Indian Soc Periodontol.; 17(4): 411– 416. 2013.

135 Mathur A, Mathur L, Manohar B, Mathur H, Shankarapillai R, Shetty N, Bhatia A. Antioxidant
therapy as monotherapy or as an adjunct to treatment of periodontal diseases. J Indian Soc

Periodontol.;17(1):21-4. 2013.
136 Chapple IL. Role of free radicals and antioxidants in the pathogenesis of the inflammatory
periodontal diseases. Clin Mol Pathol.;49:M247–55. 1996.

137 Nagle DG, Ferreira D, Zhou YD. Epigallocatechin-3- gallate (EGCG): chemical and biomedical
perspectives. Phytochemistry.;67(17):1849-55. 2006.

138 Singh BN, Shankar S, Srivastava RK. Green tea catechin, epigallocatechin-3-gallate (EGCG):
mechanisms, perspectives and clinical applications. Biochem Pharmacol.;82(12):1807-21.

2011.
139 Cabrera C, Artacho R, Gimenez R. Beneficial effects of green tea: a review. J Am Coll
Nutr.;25:79–99. 2006.
140 Jung IH, Lee DE, Yun JH, Cho AR, Kim CS, You YJ, Kim SJ, Choi SH. Anti-inflammatory effect of (-
)- epigallocatechin-3-gallate on Porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide-stimulated

fibroblasts and stem cells derived from human periodontal ligament. J Periodontal Implant
Sci.;42(6):185-95. 2012.
141 Hirasawa M, Takada K, Makimura M, Otake S. Improvement of periodontal status by green tea
catechin using a local delivery system: a clinical pilot study. J Periodontal Res.;37(6):433-8.
2002.
142 Hattarki S. A., Pushpa S. P., Bhat K. Evaluation of the efficacy of green tea catechins as an
adjunct to scaling and root planing in the management of chronic periodontitis using PCR
analysis: A clinical and microbiological study. J Indian Soc Periodontol.; 17(2): 204–209.
2013.
143 Navabazam AR, Sadeghian Nodoshan F, Sheikhha MH, Miresmaeili SM, Soleimani M, Fesahat
F. Characterization of mesenchymal stem cells from human dental pulp, preapical follicle and
periodontal ligament. Iran J Reprod Med.;11(3):235-42. 2013.
144 Seo BM, Miura M, Gronthos S, Bartold PM, Batouli S, Brahim J, Young M, Robey PG, Wang CY,
Shi S. Investigation of multipotent postnatal stem cells from human periodontal ligament.
Lancet.;364(9429):149-55. 2004.
145 Sahingur SE, Yeudall WA. Chemokine function in periodontal disease and oral cavity cancer.
Front Immunol.;6:214. 2015.

146 Kumar D, Kumar M, Saravanan C, Singh SK. Curcumin: a potential candidate for matrix
metalloproteinase inhibitors. Expert Opin Ther Targets 2012; 16: 959–972.

147 Singh N, Ranjan V, Zaidi D, Shyam H, Singh A, Lodha D, Sharma R, Verma U, Dixit J, Balapure
AK. Insulin catalyzes the curcumin-induced wound healing: an in vitro model for gingival
repair. Indian J Pharmacol.;44(4):458-62. 2012.
148 Hosadurga RR, Rao SN, Jose J, Rompicharla NC, Shakil M, Shashidhara R. Evaluation of the
efficacy of 2% curcumin gel in the treatment of experimental periodontitis. Pharmacognosy

Res. Oct;6(4):326-33. 2014.
149 Bisht, S., Maitra, A. Systemic delivery of curcumin: 21st century solutions for an ancient
conundrum.Curr. Drug Discov. Technol.; 6:192– 199, 2009.

150 Sharma RA, Steward WP, Gescher AJ. Pharmacokinetics and pharmacodynamics of curcumin.
Adv Exp Med Biol. ;595:453-70. 2007.

151 Pandey KB, Rizvi SI. Plant Polyphenols as Dietary Antioxidants in Human Health and Disease.
Oxid Med Cell Longev. 2009;2(5):270-278. doi:10.4161/oxim.2.5.9498.

tisulară
152 Pröhl M, Schubert US, Weigand W, Gottschaldt M. Metal complexes of curcumin and curcumin
derivatives for molecular imaging and anticancer therapy. Coord Chem Rev. 2016;307:32-41.
doi:10.1016/j.ccr.2015.09.001.
153 Kanzaki H, Wada S, Narimiya T, et al. Pathways that regulate ROS scavenging enzymes, and
their role in defense against tissue destruction in periodontitis. Front Physiol.

2017;8(MAY):1-8. doi:10.3389/fphys.2017.00351.
154 Yallapu MM, Nagesh PKB, Jaggi M, Chauhan SC. Therapeutic Applications of Curcumin
Nanoformulations. AAPS J. 2015;17(6):1341-1356. doi:10.1208/s12248-015-9811-z.

155 Zeng L, Yan J, Luo L, Ma M, Zhu H. Preparation and characterization of (−)-Epigallocatechin-3-
gallate (EGCG)-loaded nanoparticles and their inhibitory effects on Human breast cancer
MCF-7 cells. Sci Rep. 2017;7(November 2016):45521. doi:10.1038/srep45521.
156 Laudadio E, Mobbili G, Minnelli C, Massaccesi L, Galeazzi R. Salts Influence Cathechins and
Flavonoids Encapsulation in Liposomes: A Molecular Dynamics Investigation. Mol Inform.

2017 Nov;36(11). doi: 10.1002/minf.201700059.
157 LIU W, ZHAI Y, HENG X, CHE FY, CHEN W, SUN D, ZHAI G. Oral bioavailability of curcumin:
problems and advancements. J Drug Target 2016; 24: 694–702.

158 Pignanelli C, Ma D, Noel M, Ropat J, Mansour F, Cur- Ran C, Pupulin S, Larocque K, Wu J, Liang
G, Wang Y, Pandey S. Selective targeting of cancer cells by oxidative vul- nerabilities with
novel curcumin analogs. Sci Rep 2017; 7: 1105.
159 Feng T, Wei Y, Lee RJ, Zhao L. Liposomal curcumin and its application in cancer. Int J
Nanomedicine. 2017 Aug 21;12:6027-6044. doi: 10.2147/IJN.S132434. PMID: 28860764;

PMCID: PMC5573051.
160 Kloesch B, Gober L, Loebsch S, Vcelar B, Helson L, Steiner G. In Vitro Study of a Liposomal
Curcumin Formulation (Lipocurc™): Toxicity and Biological Activity in Synovial Fibroblasts

and Macrophages. In Vivo. 2016 Jul-Aug;30(4):413-9. PMID: 27381602.
161 Bc J, Kumar B, Thilagavathi R, Yadhav A, Kumar P, Sel- Vam C. Synthesis, evaluation of
cytotoxic properties of promising curcumin analogues and investigation of possible

molecular mechanisms. Chem Biol Drug Des 2018; 91: 332– 337.
162 Achim M, Tomuță I, Muntean D, Porfire A, Tefas LR, Patras L, et al. Optimization and in vitro
evaluation of 5-fluorouracil – loaded long – circulating liposomes. Farmacia 2017;65(1):82–

91.
163 Vilela PD, DE Oliveira JR, D Barros PP, Leao MV, De Oliveira LD, Jorge AO. In vitro effect of
caffeic acid phenethyl ester on matrix metalloproteinases (MMP-1 and MMP-9) and their
inhibitor (TIMP-1) in lipopolysaccharide- activated human monocytes. Arch Oral Biol 2015;
60: 1196– 1202.
164 Hu J, Shen T, Xie J, Wang S, He Y, Zhu F. Curcumin mod- ulates covalent histone modification
and TIMP1 gene activation to protect against vascular injury in a hypertension rat model.
Exp Ther Med 2017; 14: 5896–5902
165 Hugar SS, Patil S, Metgud R, Nanjwade B, Hugar SM. Influence of application of chlorhexidine
gel and curcumin gel as an adjunct to scaling and root planing: a interventional study. J Nat
Sci Biol Med 2016; 7: 149–154.
166 Nagasri M, Madhulatha M, Musalaiah SVVS, Kumar PA, Krishna CMH, Kumar PM. Efficacy of
curcumin as an adjunct to scaling and root planning in chronic periodontitis patients: a

clinical and microbiological study. J Pharm Bioal- lied Sci 2015; 7: S554–S558.
167 Rakmanee T, Calciolari E, Olsen I, Darbar U, Griffiths GS, Petrie A, Donos N. Expression of
growth mediators in the gingival crevicular fluid of patients with aggressive periodontitis
undergoing periodontal surgery. Clin Oral Investig 2018. [Epub ahead of print].
https://doi.org/10.1007/s00784- 018-2752-z.
168 Elburki MS, Moore DD, Terezakis NG, Zhang Y, Lee HM, Johnson F, Golub LM. A novel
chemically modified curcumin reduces inflammation-mediated connective tissue breakdown

in a rat model of diabetes: periodontal and systemic effects. J Periodont Res 2017; 52: 186–
200.
169 National Center for Biotechnology Information. Pub- chem Compound Database;
CID=969516. https://pubchem. ncbi.nlm.nih.gov/compound/969516.

170 Fischer-Fodor E, Mikla S R, Risianova L, Cenariu M, Grosu IG, Virag P, Perde-Schrepler M,
Tomuleasa C, Berindan-Neagoe I, Devinsky F, Miklasova N. Novel Palla- dium(II) complexes

that influence prominin-1/CD133 expression and stem cell factor release in tumor cells.
Molecules 2017; 22: E561.
171 Fischer-Fodor E, Miklas R, Krausz LT, Virag P, Moldovan DC, Perde Schrepler M, Berindan
Neagoe I, Devinsky F, Miklasova N. Immunomodulatory potential of Palladium (II) complexes

with (1e,6e)-1,7-bis (3,4-dimethoxyphenyl) hepta-1,6-diene-3,5-dione. Stud U Babes Bol Che
2015; 60: 93–100.
172 Risianova L, Fischer-Fodor E, Valentova J, Tatomir C, Decean C, Virag P, Pechova I, Devinsky F,
Miklasova N. Synthesis, structural characterization and biological activity of novel

Knoevenagel condensates on DLD-1 human colon carcinoma. Bioorg Med Chem Lett 2017;
27: 2345–2349.
173 Boșca AB, Ilea A, Sorițău O, Tatomir C, Miklášová N, Pârvu AE, Mihu CM, Melincovici CS,
Fischer-Fodor E. Modulatory effect of curcumin analogs on the activation of

metalloproteinases in human periodontal stem cells. Eur J Oral Sci 2019; 000: 1–9.
DOI:10.1111/eos.12625.
174 Prohl M, Schubert US, Weigand W, Gottschaldt M. Metal complexes of curcumin and curcumin
derivatives for molecular imaging and anticancer therapy. Coord Chem Rev 2016; 307: 32–
41.
175 Granelli-Piperno A, Reich E. A study of proteases and pro- tease-inhibitor complexes in
biological fluids. J Exp Med 1978; 148: 223–234.

176 Bradford MM. A rapid and sensitive method for quantification of microgram quantities of
protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem 1976; 72: 248–254.
177 Kowalczyk,P.(2001)Designoptimizationofcementlessfemoral hip prostheses using finite
element analysis. J. Biomech. Eng. 123: 396-402.

178 Gorguluarslan, R. M., S. K. Choi, and C. J. Saldana (2017) Uncertainty quantification and
validation of 3D lattice scaffolds for computer-aided biomedical applications. J. Mech. Behav.

Biomed. Mater. 71: 428-440.
179 Băbțan A-M, Timuș D, Sorițău O, Boșca BA, Barabas R, Ionel A, Petrescu NB, Feurdean CN,
Bordea IR, Saraci G, Vesa ŞC, Ilea A. Tissue Integration and Biological Cellular Response of
SLM-Manufactured Titanium Scaffolds. Metals. 2020; 10(9):1192.
180 Pattanayak, D. K., A. Fukuda, T. Matsushita, M. Takemoto, S. Fujibayashi, K. Sasaki, N. Nishida,
T. Nakamura, and T. Kokubo (2011) Bioactive Ti metal analogous to human cancellous bone:
Fabrication by selective laser melting and chemical treatments. Acta Biomater. 7: 1398-1406.
181 Tsukanaka, M., S. Fujibayashi, M. Takemoto, T. Matsushita, T. Kokubo, T. Nakamura, K. Sasaki,
and S. Matsuda (2016) Bioactive treatment promotes osteoblast differentiation on titanium

materials fabricated by selective laser melting technology. Dent. Mater. J. 35: 118-125.
182 Vasconcellos LM, Leite DO, Oliveira FN, Carvalho YR, Cairo CA. Evaluation of bone ingrowth
into porous titanium implant: histomorphometric analysis in rabbits. Braz Oral Res.
2010;24:399–405.
183 Livada, R., Shiloah, J. Calcium channel blocker-induced gingival enlargement. J Hum
Hypertens. 2014;28:10–14 https://doi.org/10.1038/jhh.2013.47

184 Walsh P, Häkkinen L, Pernu H, Knuuttila M, Larjava H. Expression of fibronectin-binding
integrins in gingival epithelium in drug-induced gingival overgrowth. J Periodontal Res.

2007;42(2):144-51. doi: 10.1111/j.1600-0765.2006.00927.x. PMID: 17305873.
185 Bă bțan Anida-Maria, Boș ca Adina Bianca, Miclă uș Viorel, Ruxanda Flavia, Rațiu Cristian
Adrian, Ionel Anca, Ilea Aranka. Hiperplazia gingivală indusă medicamentos. În cartea Cazuri
tisulară
clinice. Prezentă ri de medicală ș i chirurgie. Volumul XII. Editura Bioflux, Cluj-Napoca, 2020.
31-48.
186 Chang CC, Lin TM, Chan CP, Pan WL. Nonsurgical periodontal treatment and prosthetic
rehabilitation of a renal transplant patient with gingival enlargement: A case report with 2-
year follow-up. BMC Oral Health 2018;18:1–9
187 Mavrogiannis M, Ellis JS, Thomason JM, Seymour RA. The management of drug-induced
gingival overgrowth. J Clin Periodontol. 2006 Jun;33(6):434-9. doi: 10.1111/j.1600-

051X.2006.00930.x. PMID: 16677333.
188 Prabhu SR, Wilson DF. Human papillomavirus and oral disease—emerging evidence: a
review. Aust Dent J. 2013;58:2–10; quiz 125.

189 Ilea A, Boșca B, Miclăuș V, Rus V, Băbțan AM, Câmpian RS Human papillomavirus infection in
the oromaxillofacial area. Clinical anatomy and histological considerations. Clin Anat. 2015
Nov;28(8):1002-7. doi: 10.1002/ca.22620.
190 Ilea A, Boşca B, Miclăuş V, Rus V, Băbţan AM, Mesaros A, Crişan B, Câmpian RS. Oral Human
Papillomavirus Infection in Children. Pediatr Infect Dis J. 2016 Feb;35(2):e65-8.

191 Pringle GA. 2014. The role of human papillomavirus in oral disease. Dent Clin North Am
58:385–399.
192 Jelihovschi I, Bidescu AC, Tucaliuc SE, Iancu LS. 2015. Detection of human papilloma virus in
head and neck squamous cell carcino- mas: A literature review. Rev Med Chir Soc Med Nat
Iasi 119: 502–509.
193 VK V, Hallikeri K, Girish HC, Murgod S. Expression of CD34 and CD68 in peripheral giant cell
granuloma and central giant cell granuloma: an immunohistochemical analysis. J Oral

Maxillofac Pathol, 2014, 18(3):341–348.
194 Torabinia N, Razavi SM, Shokrolahi Z. A comparative immunohistochemical evaluation of
CD68 and TRAP protein expression in central and peripheral giant cell granulomas of the
jaws. J Oral Pathol Med, 2011, 40(4):334–337.
195 Cotran RS, Kumar V, Robbins SL (1989). Inflammation and Repair. In : Robbins’ Pathologic
Basis of Disease. 4th Edition, W.B. Saunders International Edition, 66-68, 821.
196 Papanicolaou P, Chrysomali E, Stylogianni E, Donta C, Vlachodimitropoulos D. Increased TNF-
α, IL-6 and decreased IL-1β immunohistochemical expression by the stromal spindle- shaped
cells in the central giant cell granuloma of the jaws. Med Oral Patol Oral Cir Bucal, 2012,
17(1):e56–e62.
197 Brodbeck WG, Anderson JM (2009). Giant cell formation and function. Curr Opin Hematol. Jan
16(1):53-7.
198 Boşca AB, Ilea A, Șovrea AS, Constantin AM, Ruxanda F, Rus V, Raţiu C, Miclăuş V.
Multinucleated Giant Cells Polymorphism in Epulis. Bulletin UASVM Veterinary Medicine

72(1) / 2015, 47-52.
199 Boşca AB, Şovrea AS, Miclăuş V, Ruxanda F, Mihu CM, Melincovici CS, Constantin AM, Petrescu
BN, Câmpian RS, Pârvu AE, Ilea A. Diagnostic and therapeutic approaches in oral cavity
granulomas based on new data concerning their origin and pathogenesis Rom J Morphol
Embryol. 2018;59(3):679-690.
200 Itonaga I, Hussein I, Kudo O, Sabokbar A, Watt-Smith S, Ferguson D, Athanasou NA. Cellular
mechanisms of osteoclast formation and lacunar resorption in giant cell granuloma of the
jaw. J Oral Pathol Med, 2003, 32(4):224–231.
201 Kruse-Lö sler B, Diallo R, Gaertner C, Mischke KL, Joos U, Kleinheinz J. Central giant cell
granuloma of the jaws: a clinical, radiologic, and histopathologic study of 26 cases. Oral Surg
Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod, 2006, 101(3):346–354.
202 Kim CS, Park S, Kim J. The role of glycation in the pathogenesis of aging and its prevention
through herbal products and physical exercise. J Exerc Nutrition Biochem. 2017;21(3):55-61.
doi:10.20463/jenb.2017.0027
203 Porter SR, Mercadente V, Fedele S. Oral manifestations of systemic disease. BDJ. 2018;5:
18012
204 Kumar P, Mastan K, Chowdhary R, Shanmugam K. Oral manifestations in hypertensive
patients: A clinical study. J Oral Maxillofac Pathol. 2012;16(2):215–221. doi:10.4103/0973-

029X.99069
205 Malon, R.S.P.; Sadir, S.; Balakrishnan, M.; Có rcoles, E.P. Saliva-Based Biosensors: Noninvasive
Monitoring Tool for Clinical Diagnostics. BioMed Res. Int. 2014, 2014, 962903
206 Lee, Y.H.; Wong, D.T. Saliva: An emerging biofluid for early detection of diseases. Am. J.
Dentistry. 2009, 22, 241–248.

207 Tricoli, A., Nasiri, N., De, S. Wearable and Miniaturized Sensor Technologies for Personalized
and Preventive Medicine. Adv. Fun. Mater. 2017, 27, 1605271.

208 Ilea A, Timuș D, Höpken J, Andrei V, Băbțan AM, Petrescu NB, Câmpian RS, Boșca BA, Șovrea
AS, Negucioiu M, Mesaros AS. Oral appliance therapy in obstructive sleep apnea and snoring -
systematic review and new directions of development. CRANIO: The Journal of
Craniomandibular & Sleep Practice. 2019 Oct 5;1-12. doi: 10.1080/08869634.2019.1673285.
209 Boșca AB, Ilea A, Tăulescu M, Negru M, Băbțan AM, Petrescu N, Feurdean CN, Mirică IC, Pârvu
AE, Dinte E, Mihu CM, Melincovici C, Șovrea AS, Constantin AM, Buhățel D, Ionel, A Sava A,
Uriciuc WA, Lazăr AC, Bordea IR, Pop AS, Crișan M, Câmpian RS. Valoarea diagnostică a
citoblocurilor preparate din mucoasa orală, în cartea ”Antropologia Mileniului III" - Andrei
Kozma, Octavian Buda, Constantin Bălăceanu-Stolnici, Colecția Zilele Rainer, Editura
Academiei Române, București 2020, pg. 272- 279, ISBN 978-973-27-3200-7
210 Maier H, Weidauer H, Zoller HK et al. Effect of chronic alcohol consumption on the
morphology of the oral mucosa. Alcohol Clin Exp Res 1994;18:387–91.

211 Hegde V. Cytomorphometric analysis of squames from oral premalignant and malignant
lesions. J Clin Exp Dent 2011;3:441‐4.

212 Ogden GR, Cowpe JG, Wight AJ. Oral exfoliative cytology: review of methods of assessment. J
Oral Pathol Med 1997;26:201- 5.

213 Ott C, Jacobs K, Haucke E, Navarrete Santos A, Grune T, Simm A. Role of advanced glycation
end products in cellular signaling. Redox Biol. 2014;2:411–29.

214 Schalkwijk CG, Miyata T. Early- and advanced non-enzymatic glycation in diabetic vascular
complications: the search for therapeutics. Amino Acids. 2012;42:1193–204.

215 Dalal M, Sun K, Cappola AR, Ferrucci L, Crasto C, Fried LP, et al. Relationship of serum
fibroblast growth factor 23 with cardiovascular disease in older community-dwelling

women. Eur J Endocrinol. 2011;165:797–803.
216 Pageon H, Zucchi H, Rousset F, Monnier VM, Asselineau D. Skin aging by glycation: lessons
from the reconstructed skin model. Clin Chem Lab Med. 2014;52:169–74.
217 Băbțan AM, Ilea A, Petrescu BN, Ionel A, Feurdean CN, Uriciuc WA, Boșca AB, Crișan M, Mirică
CI, Bordea RI, Câmpian RS. Aplicații ale ultrasonografiei în diagnosticul patologiei regiunii
cervico-faciale, în cartea ”Antropologia Mileniului III" - Andrei Kozma, Octavian Buda,
Constantin Bălăceanu-Stolnici, Colecția Zilele Rainer, Editura Academiei Române, București
2020, pg. 266- 271, ISBN 978-973-27-3200-7
218 Gill V, Kumar V, Singh K, et al. Advanced glycation end products (AGEs) may be a striking link
between modern diet and health. Biomolecules. 2019;9:1–21.

https://doi.org/10.3390/biom9120888
219 Akase T, Nagase T, Huang L, et al (2012) Aging-like skin changes induced by ultraviolet
irradiation in an animal model of metabolic syndrome. Biol Res Nurs 14:180–187.

https://doi.org/10.1177/1099800411401013
220 Rinnerthaler M, Bischof J, Streubel MK, et al (2015) Oxidative stress in aging human skin.
Biomolecules 5:545–589. https://doi.org/10.3390/biom5020545

tisulară
221 Del Bino S, Duval C, Bernerd F (2018) Clinical and biological characterization of skin
pigmentation diversity and its consequences on UV impact. Int J Mol Sci 19:.
https://doi.org/10.3390/ijms19092668
222 Barsh GS (2003) What controls variation in human skin color? PLoS Biol 1:19–22.
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.0000027
223 Vashi N, de Castro Maymone M, Kundu R (2016) Aging Differences in Ethnic Skin. Aesthet
Dermatol 9:31–38
224 Ilea A, Andrei V, Feurdean CN, Băbțan AM, Petrescu NB, Câmpian RS, Boșca AB, Ciui B, Tertiș
M, Săndulescu R, Cristea C. Saliva, a Magic Biofluid Available for Multilevel Assessment and a
Mirror of General Health-A Systematic Review. Biosensors (Basel). 2019 Feb 14;9(1). pii: E27
225 Bhalla, N.; Jolly, P.; Formisano, N.; Estrela, P. Introduction to biosensors. Essays Biochem.
2016, 60, 1–8.

226 Minamitani, H.; Suzuki, Y.; Iijima, A.; Nagao, T. A Denture Base Type of Sensor System for
Simultaneous Monitoring of Hydrogen Ion Concentration pH and Tissue Temperature in the

Oral Cavity. Ieice Trans. Inf. Sys. 2002, 85, 22–29.
227 Kim, J.; Valdé s-Ramı́rez, G.; Bandodkar. A.J.; Jia, W.; Martinez, A.G.; Ramı́rez, J.; Mercier, P.;
Wang, J. Non-invasive mouthguard biosensor for continuous salivary monitoring of

metabolites. Analyst 2014, 139, 1632–1636.
228 Băbțan AM, Petrescu NB, Ionel A, Boșca BA, Uriciuc WA, Feurdean CN, Mirică CI, Bordea R,
Miclăuș V, Ruxanda F, Todea AD, Alexescu TG, Câmpian RS, Ilea A. Insights into the
pathogenesis of nicotine addiction. Could a salivary biosensor be useful in Nicotine
Replacement Therapy (NRT)? J Mind Med Sci. 2019; 6(2): 196-209.

24.06.2021 Teză de Abilitare

Încărcat de

Informații document

Titlu original

Drepturi de autor

Formate disponibile

Partajați acest document

Partajați sau inserați document

Opțiuni de partajare

Vi se pare util acest document?

Este necorespunzător acest conținut?

Drepturi de autor:

Formate disponibile

24.06.2021 Teză de Abilitare

Încărcat de

Drepturi de autor:

Formate disponibile

UNIV E RSI T AT EA DE MED I CINĂ ŞI FA RM ACIE “IU L IU HAŢI E GA NU” C LU J - NAPO CA

Abordări terapeutice inovative în boala

Conf. Dr. Adina Bianca Boșca

diseases. Premises and perspectives of salivary AGEs. Biomarkers in Medicine.

2.3.2. Eficiența curcuminei și epigallocatechin-gallate în modularea

CARIERA ACADEMICĂ ȘI PROFESIONALĂ

ABREVIERI UTILIZATE IN TEXT

MSCs Celule stem mezenchimale

Tendințele moderne în medicină se axează pe produsele vegetale, care

În cadrul proiectului SALIVAGES, a fost dezvoltat prototipul unui senzor optic

1. Mecanisme patogenetice în boala parodontală și

În prezent, se consideră că CML este un biomarker al îmbătrânirii, întrucât

În țesuturile dentare și parodontale, CML a fost exprimată în pulpă, dentină,

Fig. 2. Țesuturile dentare și parodontale: A – secțiune longitudinală prin dinte, ligamentele

În tegument, epidermul și foliculii piloși au prezentat o cantitate mai mare de

Având în vedere valoarea AGEs ca biomarkeri, studiile viitoare se vor concentra

1.2. Expresia imunohistochimică a carboximetil lizinei în

Scorurile acordate conform immunoreactivității pentru CML în celulele

Scorul IHC pentru expresia CML

1.3. Implicarea stresului oxidativ în patogeneza bolii

Recent, numeroase studii au demonstrat că inflamația parodontală este strâns

Figura 7. Evoluția parametrilor stresului nitro-oxidativ pe parcursul celor 16 zile de

1.4. Eficiența tratamentului antioxidant în parodontita

cronică 84, 85.

Tabelul III. Efectul tratamentului cu curcumină asupra markerilor stresului nitro-

Fig. 8. Comparație între valorile parametrilor stresului nitro-oxidativ în funcție de

Nivelurile serice ale TOS au fost semnificativ reduse la lotul OC tratat cu

2. Răspunsul celulelor stem parodontale umane la

La nivelul parodonțiului, celulele stem mezenchimale joacă roluri esențiale în

nu sunt pe deplin cunoscute.

2.1. Izolarea și caracterizarea celulelor stem mezenchimale de

fragmentele au fost introduse în tuburi Falcon de 15 ml, în mediu de cultură, și

Fig. 10. A și B – aspectul precipitatelor în cultura primară de celule stem mezenchimale

Celulele și-au menținut rata de proliferare crescută și la pasaje avansate. Pe

Tabelul IV. Expresia markerilor în celulele stem mezenchimale derivate din

2.1.3.2. Caracterizarea genetică

Tabelul V. Expresia genică a markerilor în celulele stem mezenchimale derivate

Fig. 12. Imagini de miscroscopie optică în fluorescență a celulelor stem mezenchimale

Diferențierea neurogenică a demonstrat o expresie variabilă a markerilor

Fig. 13. Imagini de miscroscopie optică în fluorescență a celulelor stem mezenchimale

La diferențierea condrogenică, GLSCs au prezentat cea mai intensă expresie a

Fig. 14. Imagini de miscroscopie optică în fluorescență a celulelor stem mezenchimale

Rezultatele obținute la colorația cu Alcian blue nu au relevat pozitivitate pentru

Porphyromonas gingivalis 118, 127.

Cele patru tipuri de celule au prezentat niveluri semnificativ diferite ale

15’ 5944±261.6 6155±185.4 6267±341.8 6343±361.1 6496±441.7 6612±191.0 6937±268.7

30’ 6194±110.0 6408±170.7 6579±116.0 7076±73.90 7213±253.5 7438±223.9 7777±377.3

15’ 5944±261.6 6155±185.4 6267±341.8 6343±361.1 6496±441.7 6612±191.0 6937±268.7

0’ 6004±120.5 6266±241.2 6263±182.5 6161±117.6 6289±215.8 6162±133.2 6193±100.2

15’ 6118±92.19 6536±123.7 6535±60.62 6779±291.5 6786±558.9 6982±358.4 7084±226.6

30’ 6314±238.2 7085±139.3 7044±91.82 7264±258.0 7309±573.7 7294±196.1 7352±445.5

0’ 10348±316.4 10375±553.2 10597±914.1 10788±865.2 10480±479.6 10396±450.7 10547±362.1

15’ 10511±436.8 11071±412.4 11135±665.4 11559±623.0 12018±490.0 12093±1439 12112±1265

30’ 10606±194.9 12254±449.4 12257±695.7 12347±301.2 12772±526.9 13054±348.0 13331±488.0

* - comparativ cu Ctrl. negativ; # - comparativ cu 0’ pentru LPS-Pg. *p<0.05; **p<0.01;

min creșterea a fost treptată, probabil datorită activării mecanismelor antioxidante

La examenul microscopic, cele patru tipuri celulare au prezentat aspecte

mezenchimale, timp de 24 h. Apoi, mediul de cultură a fost înlocuit cu mediul

La comparația între tipurile celulare, s-a observat că GLSCs au prezentat cea

Pentru imunocitochimia privind expresia proteinelor osoase au fost folosiți

Fig. 20. Expresia proteinelor osoase osteocalcină – OC - FITC și osteopontină – OP –

În GLSCs, dozele mici de LPS-Pg și nicotina au crescut expresia OC, iar

Fig. 21. Expresia proteinelor osoase osteocalcină – OC - FITC și osteopontină – OP –