Ministerul Educației, Culturii și Cercetării al Republicii Moldova

Universitatea Tehnică a Moldovei

Facultatea Calculatoare, Informatică și Microelectronică

Departamentul Microelectronică și Inginerie Biomedicală

Proiect de cercetare
disciplina – IT

TEMA: Citometria de flux,echipamente , tipuri, principii de

funcționare

A efectuat: Rotari Nicu

gr. IBM-211M

A verificat: Nacu Viorel,

prov.univ.dr.hab

CHIŞINĂU - 2022

1
 Citometria fluxului (HR) este o tehnică utilizată pentru a detecta și măsura caracteristicile fizice
și chimice ale unei populații de celule sau particule. 
În acest proces, o probă care conține celule sau particule este suspendată într-un fluid și injectată
în instrumentul citometrului de debit. Eșantionul este concentrat să curgă în mod ideal o celulă la
un moment dat printr-un fascicul laser, unde lumina împrăștiată este caracteristică celulelor și
componentelor lor. Celulele sunt adesea marcate cu markeri fluorescenti, astfel încât lumina să
fie absorbită și apoi emisă într-o gamă de lungimi de undă. Zeci de mii de celule pot fi examinate
rapid, iar datele colectate sunt prelucrate de un computer.

Citometria fluxului este utilizată în mod obișnuit în cercetarea de bază, practica clinică și studiile
clinice. Utilizările pentru citometria fluxului includ:

 Celule
 Clasificarea celulelor
 Determinarea caracteristicilor și funcțiilor celulei
 Detectarea microorganismelor
 Detectarea biomarkerului
 Detectarea ingineriei proteinelor
 Diagnosticul tulburărilor de sănătate, cum ar fi cancerul de sânge

Un analizor de citometrie de flux este un instrument care furnizează date cuantificabile dintr-o
probă. Alte instrumente care utilizează citometrie de flux includ clasificatoare de celule care s-au
separat fizic și, astfel, purifică celulele de
interes pe baza proprietăților lor optice.

Istorie

Primul dispozitiv de citometrie a fluxului bazat pe impedanță, folosind principiul Coulter, a fost

dezvăluit în Us Patent 2,656,508, emis în 1953 către Wallace H. Coulter. Mack Fulwyler a fost
inventatorul precursorului citometrelor de flux de astăzi - în special clasificatorul de celule.
Fulwyler a dezvoltat acest lucru în 1965, odată cu publicarea sa în Science. Primul dispozitiv de
citometrie a fluxului pe bază de fluorescență (ICP 11) a fost dezvoltat în 1968 de Wolfgang
Göhde de la Universitatea din Münster, cu cerere de brevet la 18 decembrie 1968 și
comercializate pentru prima dată în 1968/69 de către dezvoltatorul și producătorul german Partec
prin intermediul Phywe AG din Göttingen. La acea vreme, metodele de absorbție erau încă
2
preferate pe scară largă de alți oameni de știință în ceea ce privește metodele de
fluorescență. [8] Curând după aceea, au fost dezvoltate instrumente de citometrie a fluxului,
inclusiv Cytofluorograph (1971) de la Bio / Physics Systems Inc. (mai târziu: Ortho
Diagnostics), PAS 8000 (1973) al partecului, primul instrument FACS (clasificarea celulelor
activate cu fluorescență) de Becton Dickinson (1974), ICP 22 (1975) al partecului / Phywe și
epopeilor din Coulter (1977/78). Primul citometru neetichetat de debit de impedanță de înaltă
frecvență bazat pe un laborator microfluidic patentat pe cip, Ampha Z30, a fost introdus de
Amphasys (2012).

Denumirea tehnologiei

Numele original al tehnologiei citometriei fluxului pe bază de fluorescență a fost "citofotometria

pulsului" (germană: Impulszytophotometrie), bazată pe prima cerere de brevet în citometria
fluxului pe bază de fluorescență. La cea de-a 5-a Conferință a Fundației Americane pentru
Inginerie privind Citologia Automatizată din Pensacola (Florida) din 1976 - la opt ani de la
introducerea primului citometru de flux pe bază de fluorescență (1968) - s-a convenit utilizarea
tradițională a numelui de "citometrie de flux", un termen care a devenit rapid popular.

Citometre de debit

Diagrama schematică a unui citometru de flux, de la focalizarea în teacă la achiziționarea de

date.
Citometrele moderne de flux sunt capabile să analizeze multe mii de particule pe secundă în
"timp real" și, dacă sunt configurate ca clasificatoare de celule, pot separa și izola în mod activ
particulele cu proprietăți optice specificate la rate similare.

Un citometru de flux este similar cu un microscop, cu excepția faptului că, în loc să producă o
imagine celulară, citometria fluxului oferă cuantificarea automată cu randament ridicat a

3
parametrilor optici specificați pe bază celulară. Pentru a analiza țesuturile solide, trebuie mai
întâi pregătită o suspensie cu o singură celulă.
Un citometru de debit are cinci componente principale: o celulă de flux, un sistem de măsurare,
un detector, un sistem de amplificare și un computer pentru analiza semnalului. Celula de
curgere are un flux lichid (fluid de carcasă), care încarcă și aliniază celulele astfel încât acestea
să treacă printr-un singur fișier prin fasciculul de lumină pentru detectare. Sistemul de măsurare
utilizează de obicei măsurarea impedanței (sau conductivitatea) și sisteme optice - lămpi
(mercur, xenon); Lasere răcite cu apă de mare putere (argon, krypton, laser colorant); lasere
răcite cu aer de mică putere (argon (488 nm), Red-HeNe (633 nm), HeNe-verde, HeCd (UV));
lasere cu diodă (albastru, verde, roșu, violet) care rezultă în semnale luminoase. Detectorul și
sistemul de conversie analogic-digital (ADC) convertește măsurătorile analogice ale luminii
împrăștiate înainte (FSC) și ale luminii împrăștiate laterale (SSC), precum și semnalele de
fluorescență specifice colorantului în semnale digitale care pot fi procesate de un computer.
Sistemul de amplificare poate fi liniar sau logaritmic.
Procesul de colectare a datelor de la eșantioane utilizând citometrul de flux se numește
"achiziție". Achiziția este mediată de un computer conectat fizic la citometrul fluxului și
software-ul care face interfața digitală cu citometrul. Software-ul este capabil să ajusteze
parametrii (de exemplu, tensiunea, compensarea) pentru eșantionul testat și, de asemenea, ajută
la afișarea informațiilor din eșantionul inițial atunci când achiziționează date eșantion pentru a se
asigura că parametrii sunt setați corect. Primele citometre de flux au fost, în general, dispozitive
experimentale, dar progresele tehnologice au permis aplicații generalizate pentru a fi utilizate
într-o varietate de scopuri clinice și de cercetare. Datorită acestor evoluții, a fost dezvoltată o
piață considerabilă pentru instrumente, software de analiză, precum și reactivii utilizați în
achiziție, cum ar fi anticorpii etichetați cu fluorescență.

Instrumentele moderne au adesea mai multe lasere și detectoare de fluorescență. Recordul actual
pentru un instrument comercial este de zece lasere și 30 detectoare de fluorescență. Creșterea
numărului de lasere și detectoare permite marcarea anticorpilor multipli și poate identifica mai
precis o populație țintă prin markerii fenotipici. Anumite instrumente pot obține chiar și imagini
digitale ale celulelor individuale, permițând analiza locației semnalului fluorescent în interiorul
sau pe suprafața celulelor.

4
Hardware
Sistemul fluidic al unui citometru de debit
Celulele trebuie să treacă uniform prin centrul fasciculelor laser focalizate pentru a măsura cu
precizie proprietățile optice ale celulelor din orice citometru de flux. [12] [13] [14] Scopul sistemului
fluidic este de a muta celulele unul câte unul prin fasciculul laser și prin instrument. Fluidica
într-un citometru de flux cu capacități de clasificare celulară utilizează, de asemenea, fluxul
pentru a transporta celulele clasificate la tuburile de colectare sau puțuri. [12]

Focalizare hidrodinamică
Pentru poziționarea precisă a celulelor într-un jet lichid, focalizarea hidrodinamică este utilizată
în majoritatea citometrelor. [12] [13] [14] Celulele suspendate intră în instrument ensperabil de un
lichid de acoperire extern. Miezul probei este păstrat în centrul fluidului de teatrală. Rata de
intrare a eșantionului sau cât de repede fluxul celulelor prin interogarea cu laser poate fi
controlată de presiunea fluidului carcasei din miezul probei. În condiții ideale, curentul lichidului
central și lichidul carcasei nu se amestecă.

Focalizare hidrodinamică acustică asistată

Tehnologia de focalizare acustică este utilizată în unele citometre de debit pentru a sprijini
focalizarea hidrodinamică. Undele acustice (> 2 MHz) se concentrează anterior pe probă înainte
de a fi introduse în lichidul de teacă. Proba pre-focalizată este apoi injectată în nucleul
hidrodinamic și curge prin instrument. Acest lucru poate contribui la creșterea preciziei datelor
în cazul ratelor ridicate de introducere a eșantioanelor.
Optică și electronică

Filtre optice
Lumina emisă de fluorofori se află într-un spectru de lungimi de undă, astfel încât combinația de
fluorofori multipli poate provoca suprapunerea. Pentru a adăuga specificitate, filtrele optice și
oglinzile dihotice sunt utilizate pentru a filtra și muta lumina la detectoare, cum ar fi tuburi
fotomultipliere (PMT) sau fotodiode de avalanșă (APD). [12] Filtrele optice sunt proiectate ca
filtre de bandă de trecere (BP), longpass (LP) sau shortpass (SP). Majoritatea citometrelor de
debit utilizează oglinzi dichoice și filtre de trecere a benzilor pentru a selecta benzi specifice din
spectrul optic

5
Prisme spectrale de curgere, grile și citometrie
Citometria fluxului spectral utilizează prisme sau grile de difracție pentru a dispersa lumina
emisă de un marker într-o matrice de detector. [12] [15] Acest lucru permite măsurarea spectrului
total al fiecărei particule. Spectrele măsurate ale celulelor individuale sunt ulterior neamestecat
folosind spectrele de referință ale tuturor coloranților utilizați și spectrul de autofluorescență.
Acest lucru poate permite un design mai larg al panoului și aplicarea de noi markeri biologici.

Citometrie flux imagine

Citometria fluxului de imagini (IFC) captează imaginile celulelor în mai multe
canale. [12] [16] Detectoarele utilizate în platformele de imagistică pot fi echipate cu dispozitiv de
încărcare cuplat (CCD) sau semiconductor complementar de oxid metalic (CMOS) pentru a
capta imagini ale celulelor individuale.
Analiza datelor
Compensație
Fiecare fluorocrom are un spectru larg de fluorescență. Atunci când se utilizează mai mult de un
fluorocrom, poate apărea suprapunerea între fluorocromi. Această situație se numește
suprapunere de spectru. Această situație trebuie depășită. De exemplu, spectrul de emisii pentru
FITC și PE este că lumina emisă de fluoresceină se suprapune cu aceeași lungime de undă care
trece prin filtrul utilizat pentru PE. Această suprapunere spectrală este corectată prin eliminarea
unei părți a semnalului FITC din semnalele PE sau invers. Acest proces se numește compensarea
culorilor, care calculează un fluorocrom ca procent pentru a se măsura.
Compensarea este procesul matematic prin care se corectează suprapunerea spectrală a datelor
citometrice cu flux multiparametru. Deoarece fluorocromele pot avea spectru larg, ele se pot
suprapune, provocând rezultatul nedorit al confuziei în timpul analizei datelor. Această
suprapunere, cunoscută sub numele de propagare și cuantificată în coeficientul de propagare, este
de obicei cauzată de detectoare ale unui fluorocrom dat care măsoară un vârf semnificativ în
lungimea de undă a unui fluorocrom diferit. Algebra liniară este cel mai adesea folosită pentru a
face această corecție.
În general, atunci când se afișează diagrame ale unuia sau mai multor parametri, trebuie să se
arate că ceilalți parametri nu contribuie la distribuția afișată. Mai ales atunci când se utilizează
parametri care sunt mai mult decât dublu, această problemă este mai gravă. În prezent, nu au fost
descoperite instrumente pentru a afișa eficient parametrii multidimensionali. Compensarea este
foarte importantă pentru a vedea distincția dintre celule.

6
Clasificarea celulară după citometrie de flux
Clasificarea celulară este o metodă de purificare a populațiilor celulare pe baza prezenței sau
absenței caracteristicilor fizice specifice. [12] [14] [30] În citometrele de flux cu capacități de
clasificare, instrumentul detectează celulele folosind parametri, inclusiv dimensiunea celulei,
morfologia și expresia proteinelor, apoi renunță la tehnologie pentru a clasifica celulele și a
prelua subseturi pentru utilizare post-experimentală.
Primul prototip clasificator a fost construit la Laboratorul Național Los Alamos (LANL) în 1965
de fizicianul Mack J. Fulwyler prin aderarea la un senzor de volum Coulter cu noua imprimantă
cu jet de cerneală inventată.Clasificatorul de celule vii sau clasificatorul de celule activate cu
fluorescență (FACS) a fost generat de Len Herzenberg, care a câștigat ulterior Premiul Kyoto în
2006 pentru munca sa seminală.

Clasificarea celulelor folosind tehnologia citometriei fluxului și a picăturilor

Electronică
Funcția sistemului electronic al citometrului de debit este dublă; converti semnalele luminoase în
semnale electronice (tensiuni) și de a efectua analiza datelor. Primul este realizat de unul dintre
cele două tipuri de fotodetectori menționați mai sus (fotodiode și tuburi fotomultipliere).
Fotodioda este mai puțin sensibilă la lumină și este utilizată în principal pentru a detecta
semnalul de împrăștiere înainte mai puternic. PMT-urile sunt capabile să identifice semnale mult
mai slabe și, prin urmare, sunt utilizate pentru a detecta lumina de împrăștiere și fluorescență
emisă.
Un semnal electronic, sau puls de tensiune, este creat atunci când o particulă / celulă intră în
calea fasciculului laser și începe să împrăștie lumina sau fluoresce. Această lumină intră apoi în
fotodetectoare (PMT sau fotodiodă) și este transformată în electroni. Electronii sunt multiplicați

7
creând un curent electric mai mare. Apoi, curentul este amplificat și transformat într-un puls de
tensiune. Pulsul de tensiune începe să crească pe măsură ce celula intră în calea laserului, atinge
vârfuri atunci când se află în centrul fasciculului și revine la linia de bază după ce a trecut
complet .

Crearea de impulsuri de tensiune. Retipăriți cu

permisiunea bectonului, Dickinson și a companiei.

În cele din urmă, impulsurile de tensiune sunt cuantificate

de procesoarele de semnal în valori numerice pentru
înălțimea pulsului, lățime și zonă. Aceste date sunt apoi
transferate către stația de lucru a citometrului pentru stocare
și analiză ulterioară.

Analiză
Unul dintre beneficiile majore ale citometriei de flux este că permite unui cercetător să măsoare
mai multe caracteristici fizice ale fiecărei celule dintr-o populație eșantion. După ce datele sunt
colectate și transferate într-un format digital, acestea sunt gata să fie analizate folosind software-
ul de calculator citometre. Profunzimea analizei efectuate pe baza datelor este determinată în
mare măsură de obiectivele cercetătorului și poate varia de la clasificarea morfologică simplă a
unui eșantion prin trasarea FSC și SSC până la identificarea mai multor subpopulații (prin
gating) într-o probă folosind diferiți markeri de suprafață celulară (fluorocromi). Cele mai
frecvente metode de vizualizare a datelor de citometrie a fluxului sunt discutate mai jos.
Histograme și parcele scatter

8
O histogramă jurnal parametru
O parcelă punct este o reprezentare grafică cu doi parametri a proprietăților unui eșantion, unde
fiecare punct parcelat corespunde unei celule individuale. Figura 10 prezintă o parcelă de
împrăștiere tipică (FSC vs. SSC) care ar fi utilizată pentru a defini dimensiunea și complexitatea
celulelor din eșantionul de interes.

Două parametru liniar punct grafic

Utilizarea unei scări liniare sau logaritmice pe o axă depinde în principal de intervalul de
intensitate al semnalului de fluorescență. În cazul în care intervalul este îngust folosind o scară
liniară ar fi cel mai bine ca diferenta subtila important ar putea deveni obscure în cazul în care o

9
scară jurnal este utilizat. În schimb, în cazurile în care intensitățile fluorescenței pot varia de 100
de ori, utilizarea scalării liniare ar putea face ca două populații distincte să fie greu de vizualizat,
deoarece parcela ar arăta prea comprimată pe axă.

Controlul calității
Calibrare
Un instrument este standardizat, calibrat și monitorizat în mod regulat pentru controlul calității
folosind particule (sintetice sau biologice disponibile în comerț). Particulele de referință sintetice
disponibile în comerț (cunoscute în mod obișnuit sub numele de margele de referință) sunt
adesea potrivite cu spectrele fluorochromilor angajați în experiment. Cu toate acestea, uneori,
sunt folosite margele curcubeu care sunt capabile să fluoresce în spectrul complet dorit. În plus,
o verificare de rutină a liniarității PMT folosind margele de calibrare ajută la detectarea
funcționării necorespunzătoare a mașinii . Toate aceste măsuri asigură că semnalele sunt
detectate într-un interval dorit, cu doar o abatere minimă.

10
Cu toate acestea, margelele de referință au două limitări: în primul rând, ele pot avea proprietăți
diferite de împrăștiere a luminii în comparație cu celulele. În al doilea rând, fluorescența dintr-o
mărgea și cea dintr-o celulă pentru un fluorocrom dat, deși poate fi similară, nu se poate potrivi
niciodată exact .
Molecule de fluorocrom solubil echivalent (MESF) este o unitate standard pentru măsurarea
fluorescenței. Din punct de vedere comercial, sunt disponibile bile de calibrare care sunt
conjugate cu un număr cunoscut de molecule de fluorocrom. Această cantitate este raportată în
termeni de unități MESF. În astfel de cazuri, cantitățile absolute de semnale de fluorescență
pentru probe pot fi calculate în unități MESF prin analizarea granulelor și a probelor la aceeași
tensiune PMT la momentul analizei. Folosind o astfel de calibrare, rezultatele pot fi, de
asemenea, comparate între diferite instrumente și/sau între experimentele efectuate în zile
diferite.
EXEMPLU DE CONTROL : lvl Normal

11
Câștig de tensiune
Electronica este utilizată pentru controlul tensiunii PMT care determină sensibilitatea la
semnalele luminoase. O gamă optimă de tensiuni (câștig) poate fi determinată pentru
experimente zilnic folosind margele de referință. Câștigul este aplicat astfel încât fiecare
fluorocrom utilizat să afișeze un semnal maxim în PMT atribuit canalului specific
fluorocromului respectiv și un semnal mai mic în toate celelalte canale. Mai mult, pentru fiecare
experiment particular, câștigul este setat folosind celule nepătate, astfel încât aceste celule să
apară în intervalul inferior al scării logaritmice a canalului specific de fluorescență. Cu toate
acestea, aceste câștiguri aplicate sunt doar pentru referință. Ajustările de tensiune sunt necesare
zilnic pentru diferite experimente bazate pe diferiți parametri și/sau tipuri de eșantioane studiate.

12
Gating
Cel mai important și laborios pas în analiza manuală a datelor FCM este identificarea
populațiilor de celule omogene într-un eșantion dat și o comparație a acestor subpopulații între
probe. Acest lucru se realizează printr-un proces numit gating. Aceasta implică compararea
vizuală a parcelelor bidimensionale sau tridimensionale, urmată de selectarea regiunilor dorite
pentru analiza ulterioară.
Gating secvențială este utilizată pentru analiza seturilor de date multidimensionale. Această
metodă utilizează software pentru aplicarea porților manuale secvențiale, astfel încât să selecteze
regiuni în două parcele dimensionale . În timpul etapei de închidere, limitele sunt determinate de
operator și nu sunt întotdeauna ghidate de reguli. Cu toate acestea, analiza manuală a seturilor de
date de înaltă dimensiune este obositoare. Pentru a depăși această constrângere, s-au depus multe
eforturi în dezvoltarea strategiilor de închidere automată care utilizează atât metode statistice
supravegheate, cât și nesupravegheate. Aceste metode identifică direct subpopulațiile celulare
din datele FCM cu dimensiuni ridicate, depășind astfel limitările de închidere manuală.
În acest moment, controalele de închidere pot fi utilizate pentru a configura limitele porții pentru
clasificarea celulelor pe parcelele dot. Aceste controale ajută la distingerea semnalelor specifice
de cele nespecifice. Controalele de închidere sunt critice atunci când nu există o separare clară
între celulele fluorocrom pozitive și cele negative. Acest lucru este frecvent observat în cazul
unor markeri de suprafață, cum ar fi CD25. Un control negativ (de exemplu, celule nestimulate)
sau un control de fluorescență-minus unu (FMO) poate fi utilizat ca controale de închidere .

Vizualizarea datelor pe scări liniare, logaritmice și bi-exponențiale

13
 Datele obținute de FCM pot fi exprimate pe o scară liniară, logaritmică sau bi-exponențială care
este selectată pe baza tipului de experiment. De exemplu, amplificarea liniară este utilizată în
timpul analizei ADN care implică doar o diferență limitată (de două ori) în conținutul de ADN.
Cu toate acestea, atunci când imunofluorescența este efectuată pentru proteine

Avantajele citometriei fluxului

Cele mai mari două avantaje ale citometriei de flux sunt capacitatea sa de a măsura un număr
mare de parametri (2 până la 30 sau mai mult) într-o probă și capacitatea sa de a colecta
informații de la milioane de celule în câteva secunde.
Această tehnică analitică este un instrument puternic pentru aplicații care includ un număr
semnificativ de analize celulare, de la fenotipare la sănătatea și viabilitatea celulelor.

Aplicații ale tehnicii

 Imunofenotiparea
Folosind anticorpi conjugați cu fluorescență direcționați către o proteină de interes, celulele care
exprimă această proteină (proteine) la suprafață sau intracelular pot fi detectate prin citometrie de

14
 flux. Tipurile specifice de celule pot fi distinse în cadrul unei populații mixte folosind anticorpi
multipli conjugați cu fluorescență.
 Starea de sănătate celulară
De la viabilitate la apoptoza în stadiu avansat sau moartea celulară programată
 Starea ciclului celular
Furnizarea unui instrument puternic pentru evaluarea celulelor din faza G0 / G1 față de faza S,
G2 sau poliploidia, inclusiv analiza proliferării și activarea celulelor. Intensitatea fluorescentă
este utilizată pentru a determina cantitatea de ADN celular prezentă în fiecare celulă.
 Când se utilizează citometria fluxului?
Citometria fluxului este adesea folosită în:
• Onco-hematologie: număr absolut de celule, diagnostic / prognostic și urmărirea tratamentului
bolilor hematologice (leucemie și limfom), analiza măduvei osoase, numărul de reticulocite.
• Imunologie: Identificarea și numărul
absolut de populații de celule imune, analiza citokinelor, tipizarea țesuturilor, stimularea
limfocitelor.
• Microbiologie: diagnostic bacterian și viral, sensibilitate la antibiotice.
• Genetică: cariotip, diagnostic purtător, diagnostic prenatal.
• Farmacologie: studii de cinetică celulară.

Concluzie: Unele instrumente pot separa celulele care îndeplinesc anumite criterii preselectate.
Prin urmare, citometrul de flux este utilizat pe scară largă în cercetare, precum și în imunologia
clinică și hematologia pentru a efectua imunofenotiparea rapidă, sortarea celulelor și analiza
ADN-ului.

15