Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
Material Imunologia Transplantului PT Studenti
Material Imunologia Transplantului PT Studenti
ILEANA CONSTANTINESCU
1
2
PREFAȚĂ
Imunologia transplantului este o specialitate nouă care își croiește drumul între specialități prin
frumusețea abordării noilor tehnologii de biologie moleculară, prin semnificația rezultatelor și impactul acestora
asupra deznodământului transplantului.
Atât genotiparea alelelor HLA cât și detecția și identificarea anticorpilor citotoxici sunt investigații
imunologice de transplant care au nevoie de o interpretare extrem de laborioasă, iar expertiza imunologului este
extrem de importantă în transplantul renal, medular, cardiac, hepatic, pulmonar, pancreatic, etc.
Alături de investigațiile imunologice pretransplant sunt foarte importante și evaluările posttransplant care
urmăresc posibila apariție a rejetului subclinic, apariția neoplaziilor sau a altor complicații imunologice legate de
regimurile imunosupresoare practicate, care sunt decisive în ceea ce privește evoluția pacienților transplantați.
Centrul de Imunogenetică și Virusologie, Fundeni, a fost înfințat în anul 2000 și are ca domeniu de
activitate imunologia transplantului, imunologia tumorală, diagnosticul virusologic. Acest centru, este centru de
referință metodologic în imunologia transplantului pentru România din anul 2006, în același an obținând și
acreditarea cu Federația Europeană de Imunogenetică (EFI). Seria acreditărilor a fost completată de acreditarea
ISO realizată în anul 2009. Prin intermediul acestui centru, s-au organizat numeroase workshop-uri interne și
internaționale, simpozioane, cursuri pentru toate centrele de imunogenetică din țară și pentru comunitatea de
transplant din Europa.
Prin realizările profesionale, centrul nostru, care este și primul centru de biologie moleculară în
diagnosticul imunologiei de transplant din România, are o activitate deosebit de susținută pe toate tipurile de
transplant care se efectuează la noi în țară, monitorizând anual peste 1000 de pacienți care au efectuat un
transplant.
Avem speranța că această monografie va fi utilă tuturor rezidenților care doresc să aprofundeze aspectele
imunologiei de transplant, de cercetare sau de practică clinică în domeniul transplantologiei și să reprezinte o
lucrare de referință pentru colegii noștrii imunologi din întreaga țară.
Octombrie, 2009
Conf. Dr. Ileana Constantinescu
Șeful Centrului de Imunogenetică și Virusologie, Institutul Clinic Fundeni
3
4
CUPRINS
GENETICA HLA……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..17
SEMNIFICAŢIE CLINICĂ………………………………………………………………………………………………………………………………………………...17
IZOLAREA CELULELOR………………………………………………………………………………………………………………………………….20
INTRODUCERE……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….23
AMPLIFICAREA GENELOR……………………………………………………………………………………………………………………………..26
TEHNOLOGIA MICROARRAY…………………………………………………………………………………………………………………………………………………32
5
EVALUAREA ANTICORPILOR CITOTOXICI………………………………………………………………………………………………………………………………………39
TESTUL CROSSMATCH…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..44
EVALUARE IMUNOLOGICĂ……………………………………………………………………………………………………………………………………………67
EVALUAREA VIRUSOLOGICĂ…………………………………………………………………………………………………………………………………………67
6
IMUNOGENETICA NON-HLA ȘI TRANSPLANTUL DE CELULE STEM HEMATOPOETICE…………………………………………………………………………79
INTRODUCERE………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….92
ONCOGENE ŞI CANCER....................................................................................................................................................................96
IMUNOSUPRAVEGHEREA…………………………………………………………………………………………………………………………………….103
ANTIGENE DE DIFERENŢIERE..........................................................................................................................................108
PROTEINE MUTANTE...................................................................................................................................................109
PROTEINE SUPRAEXPRIMATE........................................................................................................................................110
ANTIGENE VIRALE........................................................................................................................................................113
CONCEPTE EMERGENTE...............................................................................................................................................................,.113
TESTE IMUNOENZIMATICE............................................................................................................................................................129
7
VACCINURI ÎN CANCER……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….140
IMUNIZAREA GENETICĂ................................................................................................................................................................144
8
COMPLEXUL MAJOR DE HISTOCOMPATIBILITATE
Ileana Constantinescu
9
Astfel, prezentarea peptidelor virale şi bacteriene de către moleculele de clasa
I şi clasa a II-a antigenelor receptorilor pentru antigen ai celulelor T, conduce la un
răspuns imun.
Moleculele HLA de clasa I leagă peptide formate din 8 - 10 aminoacizi,
peptide ce rezultă din degradarea proteosomică a proteinelor citoplasmatice şi
prezintă aceste peptide limfocitelor T citotoxice, CD8+. Astfel, moleculele de clasa I
sunt primele care alertează celulele T faţă de celulele infectate viral.
Moleculele HLA de clasa a II-a leagă peptide formate din 13-25 de
aminoacizi, care rezultă din degradarea endosomală a proteinelor exogene şi
endogene şi prezintă aceste peptide limfocitelor T helper, CD4+. Moleculele de clasa
a II-a joacă un rol important în stimularea răspunsului imun faţă de organisme cum
sunt bacteriile piogene. Activarea celulelor T CD8+ şi CD4+ prin aceste două căi
duce la diviziune celulară şi diferenţiere, rezultând un răspuns imun celular şi
respectiv umoral [15].
Complexul HLA conţine aproximativ 4.000.000 de perechi de baze de ADN
şi este de dimensiune comparabilă cu genomul bacteriei Escherichia coli. În interiorul
complexului HLA se disting trei regiuni (Fig.1).
10
Între regiunile clasei I şi a II-a este situată regiunea clasei a III-a. Această
regiune conţine o varietate de proteine diferite care codifică componentele
complementului C4, C2 şi FACTORUL B. Atât regiunea clasei I cât şi regiunea
clasei a II-a conţin şi alte gene decât cele ale clasei I sau clasei a II-a care sunt
neînrudite structural cu acestea.
Genele care dau denumirea oficială a HLA sunt cele din interiorul
complexului HLA care codifică aloantigenele de clasa I şi clasa a II-a, gene şi
pseudogene.
11
Gena care codifică β2 microglobulina, lanţul uşor al moleculelor HLA de
clasa I, nu este situat în complexul HLA ci pe cromozomul uman 15. Din cauza
acestei localizări cromozomiale gena β2 microglobulinei nu are o denumire în
nomenclatura HLA.
12
Structura moleculelor HLA
Structura moleculelor HLA de clasa I
13
Polimorfismul antigenic al moleculelor HLA-A, B şi C este datorat
diferenţelor în secvenţele de aminoacizi ale lanţulului greu al HLA de clasa I. Cele
mai multe dintre aceste diferenţe apar prin substituţii nucleotidice la nivelul
exonilor 2 şi 3. Genele lanţului greu al HLA- A, B şi C sunt foarte polimorfe în
contrast cu genele lanţului greu al HLA-E şi G, ce dezvoltă un polimorfism limitat
denumit oligomorfism. Pentru HLA-F, o singură alelă este recunoscută în prezent
şi de aceea gena este considerată a fi monomorfă.
14
Genele lanţurilor şi au structură similară în care exonul 1 codifică
peptidul conducător şi exonii 2 şi 3 codifică cele două domenii extracelulare.
Alelele noi emerg cu o rată înaltă şi devin fixate în populaţie, în teorie, dacă au un
avantaj selectiv în prezentarea peptidelor provenite de la organisme infecţioase.
15
Fig.9. Nomenclatura specificităţilor HLA.
Prefixul HLA precede antigenele sau alelele pentru a defini MHC-ul
speciei. Denumirile A, B, C, DR etc, definesc locusul. Acesta este urmat
de un număr care denotă antigenul definit serologic sau un număr cu un
asterix care denotă alela definită molecular. În anumite cazuri, litera w
este plasată înaintea antigenului serologic indicând că este o denumire de
lucru, provizorie.
16
Genetica HLA
Una din consecinţele conglomeratului de gene HLA de la nivelul
cromozomului 6 este că cei mai mulţi indivizi moştenesc un set de alele HLA
nerecombinat de la fiecare părinte. Aceste gene sunt exprimate codominant. Astfel,
dacă tipurile HLA ale membrilor familiei sunt determinate, segregarea tipurilor
HLA în interiorul familiei poate fi utilizată pentru construirea tipurilor HLA din
fiecare cromozom. Setul alelelor HLA găsit pe un cromozom este denumit
haplotip. Determinarea haplotipurilor este importantă pentru identificarea
persoanelor înrudite identice, deoarece purtarea de antigene din haplotipuri diferite
este frecventă.
Semnificaţie clinică
17
Tipizarea antigenelor leucocitare umane (HLA) joacă un rol important
deoarece moleculele HLA sunt ţintele primare ale răspunsurilor imune în
transplanturile alogenetice, sunt critice pentru răspunsurile la stimuli antigenici şi
sunt implicate în susceptibilitatea genetică faţă de anumite boli imune şi autoimune.
1. Care sunt antigenele HLA ale unei celule particulare? Când este cunoscută specificitatea
anticorpului (aşa cum se întâmplă la reactivii de tipizare HLA) şi celula este de fenotip
necunoscut, rezultatul testului pozitiv cu anticorpi specifici identifică antigenele celulei.
18
Când un ser este testat pentru prezenţa anticorpilor anti-HLA, un test
pozitiv indică activitate anti limfocitară în ser. Din modelul de reacţii pozitive şi
negative, cu un panel de celule tipizate HLA, poate fi găsită specificitatea
anticorpilor. Dacă serul pacientului reacţionează cu celulele donatorului, cei doi
indivizi sunt incompatibili. Astfel, printr-un proces iterativ, de testare a serului şi
tipizare a celulelor, antigenele HLA sunt definite, panelul de limfocite tipizate este
generat şi sunt create colecţiile de seruri tipizate anti-HLA de specificitate
cunoscută.
Un ser ideal pentru tipizare HLA ar trebui să fie monospecific, adică să aibă
specificitate pentru un singur antigen HLA.
19
Mulţi anticorpi multiclonali reacţionează cu mai mult de o specificitate HLA
ceea ce arată existenţa de determinanţi antigenici comuni la nivelul moleculelor
HLA.
Izolarea celulelor
Limfocitele sunt tipul celular preferat pentru tipizarea HLA serologică,
screening-ul anticorpilor şi crossmatching. În mod tradiţional, limfocitele sunt
izolate din sânge total periferic prin separare în gradient de densitate – când
donatorul este viu. În cazul donatorului cadavru, limfocitele sunt separate din splină
sau ganglioni limfatici. Lucrând această metodă, trebuie o grijă deosebită pentru a
prepara o suspensie celulară de viabilitate foarte bună şi care să nu conţină eritrocite
şi trombocite. Tipizarea HLA pentru clasa II de antigene HLA, HLA –DR şi DQ
este performată pe preparate limfocitare îmbogăţite cu limfocite B. Procedurile de
izolare speciale, performate, sunt necesare, deoarece aproximativ 80% din
limfocitele din sângele periferic sunt celule T inactive care nu conţin antigene HLA
de clasa a II-a pe suprafaţa lor.
Celulele legate de aceste bile devin mai sensibile ca ţinte posibil datorită
modificării membranelor celulare şi astfel testele necesită o perioadă de incubare
mai redusă ca timp, faţă de metodele standard de citotoxicitate.
20
Protocol de lucru pentru testul limfocitotoxicităţii dependente de complement
Antiseruri HLA individuale sunt dispensate câte 1 µL în godeuri microtest,
de specificitate desemnată, în plăcuţe de plastic compuse din 60 sau 72 de godeuri
având capacitatea de 15µL. Un model de seruri anti HLA este ales cu specificităţi
care acoperă toate posibilităţile variantelor de tipuri HLA. În general, fiecare tip
este reprezentat de cel putin doua antiseruri. Astăzi, laboratoarele obţin plăcuţe de
tipizare congelate, comerciale, gata de folosit.
21
HLA clasa a I-a se aşteaptă să se găsească modele de rezultate cu două antigene
pentru, fiecare din locusurile A, B şi C. Când numai un singur antigen este
identificat într-un locus, individul poate fi homozigot pentru acel tip de antigen sau,
laboratorul a eşuat în a identifica cel de-al doilea antigen deoarece serurile pot să nu
conţină anticorpi pentru epitopii prezenţi pe celulele ţintă sau există o exprimare
redusă a moleculelor HLA pe limfocitele testate.
Alte variabile sunt metodele folosite pentru a vizualiza celulele vii şi moarte,
timpii de incubare şi definirea terminării perioadei de lucru a testului, precum şi
interpretarea rezultatelor.
22
Tipizarea HLA prin metode de biologie moleculară
Introducere
23
O consecinţă importantă a acestor motive secvenţiale purtate în comun este
că anumite combinaţii heterozigote ale alelelor nu pot fi întodeauna distinse de o a
doua combinaţie diferită.
Toate metodele de tipizare ADN trebuie să ia în considerare aceste aspecte
când propun schemele pentru identificarea alelelor.
În mod evident, cea mai performantă metodă de tipizare HLA ar fi aceea
care ar putea performa o analiză completă secvenţială a ADN-ului de la nivelul
genelor HLA pentru fiecare individ.
Secvenţierea nucleotidică automată este folosită în mod curent ca şi
„standardul de aur” pentru tipizarea HLA, dar această tehnologie este în general
mai restrânsă pentru Centrele de Imunogenetică care sunt implicate în programele
de transplant de celule stem hematopoetice care folosesc frecvent donatori
neînrudiţi.
În tabelul următor sunt redate comparativ caracteristicile metodelor de
tipizare HLA serologice şi moleculare.
Metode
SEROLOGICE ADN: SSP/SSOP ADN: SBT
Numărul de tipuri identificabile
HLA-C 10 10-83 83
HLA-DQ 9 9-43 43
HLA-DP - 6-87 87
Materialul probei 2-3 milioane de limfocite Cantităţi infime de ADN Cantităţi infime de
vii ADN
Puterea de a identifica Foarte limitată: depinde de Limitată: bazată pe Nelimitată: noi alele
noi alele disponibilitatea şi cunoştinţa secvenţelor şi pe identificate prin
24
specificitatea serurilor noi modele de reacţie secvenţiere
Factori importanţi Expresia HLA pe suprafaţa Calitatea şi cantitatea ADN- Calitatea şi cantitatea
celulară. ului genomic şi factorii de ADN-ului genomic şi
amplificare. factorii de amplificare.
Viabilitatea celulelor
Obligativitatea respectării cu
stricteţe a protocolului
25
Cea mai recentă dezvoltare în domeniul metodelor de biologie moleculară
pentru tipizarea HLA este tipizarea bazată pe descifrarea secvenţelor – secvenţiere
(SBT) care are avantajul automatizării şi a unei acurateţi perfecte. Secvenţierea este
urmată de dezvoltarea tehnologiei microarray pentru genotiparea HLA.
*În prezent este în curs de investigare clinică şi tehnologia microarray pentru genotiparea HLA.
Amplificarea genelor
Majoritatea metodelor moleculare de genotipare HLA folosesc reacţia PCR
pentru a amplifica selectiv segmentele genelor HLA care sunt necesare tipizării.
Cele mai multe scheme de tipizare necesită condiţii care evită co-amplificarea
pseudogenelor.
26
Genotiparea HLA SSOP
Dot sau slot blot cu ADN-ul amplificat legat de un suport solid (cum este
membrana) şi hibridizat cu substanţe de marcat în soluţie
Revers dot sau slot blot cu substanţe de marcat legate de un suport solid,
hibridizat cu ADN-ul amplificat în soluţie.
Formatul dot blot este favorabil pentru tipizarea unui număr mare de probe.
Unele laboratoare cu volum mare de lucru, folosesc această metodă pentru tipizarea
unor loturi de 96 sau 384 de probe. Metoda revers dot blot este favorabilă pentru
testarea unui număr mic de probe. Reactivii pentru dot/slot-blot sunt disponibili
comercial, existând kituri standardizate având toate componentele necesare lucrului
incluse.
27
Reacţia este oprită printr-o etapă de spălare şi modelul reactivităţilor
sondelor este înregistrat.
Amplificarea este efectuată prin PCR (Fig.10). Datele obţinute sunt introduse
în calculator, iar programul interpretează şi redă tipul alelic HLA.
Tipizarea PCR-SSOP reprezintă o metodă cu un înalt nivel de rezoluţie şi
acurateţe.
Această metodă este foarte adecvată pentru analiza unui număr mare de
probe pe o perioadă lungă de timp, fiind foarte eficientă pentru lucrul pacienţilor
aflaţi pe listele de aşteptare. Dezavantajele acestei metode sunt durata mare a
timpului de lucru (9,50 ore) şi costul ridicat în cazul în care se utilizează pentru un
număr redus de probe.
Una din cele mai frecvente metode de biologie moleculară utilizată pentru
genotiparea HLA este metoda de amplificare genică cu primeri cu secvenţa
specifică (SSP). Perechile de primeri sunt elaborate pentru a amplifica specific
fiecare secvenţă polimorfă HLA care trebuie să fie detectată, pentru a furniza
nivelul dorit de rezoluţie al tipizării. Trebuie menţionat că există o pereche de
primeri care amplifică un segment diferit al ADN-ului şi care în mod curent este
inclusă în acelaşi tub ca şi control intern pozitiv al amplificării. ADN-ul ţintă este
adăugat în reacţie alături de primeri şi celelalte componente de reacţie (ADN
polimeraza, tamponul, Mg2+)apoi este performată ciclizarea termică.
28
Produsele de amplificare PCR sunt uzual detectate prin separare pe un gel de
agaroză. După electroforeză, ADN-ul este marcat cu ethidium bromide şi reacţia este
scorificată pentru prezenţa produşilor de amplificare ai primerilor controlul intern
şi prezenţa sau absenţa produsului de amplificare specific HLA. Combinarea
reacţiilor HLA pozitive şi negative este folosită pentru a desemna tipul HLA. Dacă
nu sunt prezente produse de amplificare specifice HLA şi nu se identifică nici
produsul controlului intern, reacţia este cotată ca eşec şi trebuie repetată.
29
Absenţa amplificării implică absenţa acelei secvenţe alelice particulare în
proba ADN.
30
moleculă ADN polimerizarea este terminată. Astfel, extensia primerilor este
generată astfel încât se termină la fiecare poziţie a moleculei ADN.
Un avantaj al acestei metode este că fiecare secvenţă, din fiecare spiră ADN
poate fi determinată pentru a confirma tipul. Acest lucru este recomandat deoarece
artefactele tehnice pot determina câteodată pierderea unui nucleotid particular care
poate conduce la o interpretare incorectă a datelor de la heterozigoţi.
31
Tehnologia Microarray
Acelaşi principiu se poate aplica şi altor ţinte şi sonde ca: proteine, glicani, etc.
32
Limitele metodelor de biologie moleculară
Mai mult, probleme pot apărea cu diferite interpretări ale datelor depinzând
de lista secvenţelor HLA folosite pentru asamblarea tipului HLA. Aceste
circumstanţe fac să fie dificilă compararea tipizărilor performate la date diferite.
33
Evaluarea acurateţei metodelor de tipizare HLA
Complexitatea identificării alelelor HLA necesită asigurarea unor rezultate de
înaltă calitate.
34
EVALUAREA IMUNOLOGICĂ ÎN
TRANSPLANTUL RENAL
__________ ___________
Transplantul renal este tratamentul cel mai eficient pentru marea majoritate a
pacienţilor cu insuficienţă renală cronică, îmbunătăţind semnificativ calitatea vieţii,
în anumite cazuri crescând speranţa de viaţă.
35
În România, programul de transplant renal se bazează aproape exclusiv pe
donatori vii, donatorii cadavru fiind în medie de 20 pe an.
*****
În prezent se cunosc mai mult de 1300 alele în populaţia din întreaga lume, la
nivelul celor 12 locusuri exprimate ale clasei I şi clasei a II-a [10].
Polipeptidele codificate de către aceste alele diferă una de alta prin una sau
mai multe substituţii aminoacidice care sunt de fapt mutaţii cu sens greşit (missens)
[30].
Nu există alte locusuri genetice umane mai polimorfe decât locusurile HLA.
De exemplu, locusul HLA-B are mai mult de 400 de alele cunoscute [30]. În
prezent este cunoscută secvenţa genomică completă a MHC [26].
MHC conţine mai mult de 200 de gene, iar dintre acestea mai mult de 20 de
locusuri codifică proteine implicate în legarea şi prezentarea produselor de
degradare peptidice ale proteinelor la receptorul antigenic al celulei T.
37
sau puţin exprimate. Relaţia între specificităţile serologice şi tipurile moleculare nu
este întodeauna directă (Fig.9). De exemplu, multe alele recent descoperite nu au
fost tipizate prin metode serologice şi de aceea nu au specificitatea serologică
definită.
38
Evaluarea anticorpilor citotoxici
Screening-ul anticorpilor citotoxici prin metoda limfocitotoxicitătii
dependente de complement
Cele mai multe laboratoare evaluează lunar, din punct de vedere al screening-
ului anticorpilor citotoxici, pacienţii aflaţi pe listele de aşteptare. Serurile fiecărui
pacient sunt testate pentru prezenţa anticorpilor împotriva unui panel de celule care
conţin cele mai frecvente tipuri HLA în populaţia donatoare, prezentă la nivelul
unor diferite combinaţii de HLA-A şi B (sau DR şi DQ pentru clasa II), pentru a
permite determinarea specificităţilor aloanticorpilor [13]. Formatul poate fi astfel
gândit ca un test în masă pentru toţi pacienţii sau un test pentru un singur pacient.
Procentul de anticorpi ,ca panel (PRA), este calculat ca procent al numărului de
celule pozitive faţă de numărul total de celule din panel, multiplicat cu 100.
39
Avantajele testului ELISA, faţă de testul convenţional de limfotoxicitate
dependentă de complement, includ procesarea rapidă şi uşoară a mai multor probe,
prin cititoare automate de plăcuţe, şi eliminarea dependenţei testului de viabilitatea
limfocitelor şi a complementului [22].
În acest caz, testul crossmatch va fi clar pozitiv iar pericolul unui rejet acut,
imediat în perioada post-transplant, este iminent.
Testul ELISA este formulat numai pentru detecţia anticorpilor HLA de tip
IgG. În consecintă, testul ELISA standard nu poate detecta anticorpii citotoxici de
tip IgM şi anticorpii non-HLA dar detectează anticorpii IgG nefixatori de
complement pe care testele de citotoxicitate îi omit.
40
reacţia este oprită adăugând soluţie de hidroxid de sodiu. Densitatea optică a
probelor este măsurată cu un spectrofotometru.
Metoda de identificare a anticorpilor anti HLA clasa I şi aII-a prin tehnica ELISA
are, ca principiu de lucru următoarele etape:
41
Pentru identificarea de anti-HLA clasa a II-a, validarea rezultatelor
este efectuată dacă:
42
Screening-ul anticorpilor citotoxici prin metoda Luminex
Sistemul multiplex Luminex poate fi folosit atât pentru screening-ul cât şi pentru
identificarea anticorpilor citotoxici având o sensibilitate şi o specificitate
performantă.
43
Comparând Luminex-ul cu alte metodologii folosite pentru screening-ul
anticorpilor (cum sunt CDC-AHG, ELISA şi flowcitometrie), a fost relevat faptul
că sensibilitatea acestei metode este comparabilă cu cea a flowcitometriei [14]
(tabelul 3).
Tabelul nr. 3. Comparaţie între metodele actuale folosite pentru detecţia
anticorpilor citotoxici
CDC-AHG 12 / 66 18
ELISA 32 / 66 48
Luminex 44 / 66 67
Flowcitometrie 48 / 66 73
Prin tehnica Luminex se pot lucra deodată 96 de probe, astfel încât, se poate
face screening-ul şi identificarea anticorpilor pe o singură placă, ceea ce înseamnă
eficienţă maximă în testarea pacienţilor [14].
Testul crossmatch
Scopul testului crossmatch este de a detecta prezenţa, în serul pacienţilor, a
anticorpilor direcţionaţi împotriva antigenelor HLA ale potenţialului donator de
rinichi. Dacă sunt prezenţi, anticorpii semnalizează că sistemul imun al primitorului
a fost sensibilizat faţă de alelele donatorului şi este susceptibil a rejeta puternic
orice alogrefă ce poartă respectivele antigene.
44
Testul crossmatch prin metoda limfocitotoxicităţii
Astfel, 10-20% din moartea celulară poate rezulta dintr-un anticorp specific
pentru clasa aII-a sau se poat datora unui anticorp slab anti clasa I. Pentru a rezolva
specificitatea anticorpilor, crossmatch-ul este performat apoi pe preparate celulare
îmbogăţite atât cu limfocite T cât şi B.
45
1 µL din serul primitorului este dispensat în multiple godeuri ale
plăcuţei microtest; pentru pacienţii imunizaţi sunt puse în reacţie
seruri multiple cu PRA cunoscut.
Sunt adăugate celulele T ale donatorului (2-3 x 106) şi testul este
incubat pentru 30-60 de minute.
Pentru a creşte sensibilitatea testului, serurile sunt spălate din godeuri
înainte de adăugarea complementului.
Adăugarea unui al doilea anticorp, cum este IgG-ul de capră anti-
uman creşte şi mai mult sensibilitatea.
După câteva minute de incubare cu AHG, este adăugat complementul
şi testul este incubat pentru încă 60 de minute.
Incubarea de lungă durată a complementului până la 3 ore, este uneori
performată în loc de adaugarea AHG.
Dacă serul primitorului conţine anticorpi care reacţionează cu celulele
donatorului, celulele sunt omorâte şi colorantul (eozina sau ethidium
bromide) pătrunde în interiorul celulelor indicând un test crossmatch
pozitiv.
Un test crossmatch pozitiv pentru celula T este o contraindicaţie
pentru transplantul renal.
Mai mult, celulele B sunt un indicator mai sensibil pentru anticorpii slabi de
clasa I deoarece ei poartă molecule de clasa I într-o mai mare densitate decât
celulele T. Crossmatch-ul prin flowcitometrie poate distinge între anticorpii B
adevăraţi şi anticorpii slabi de clasa I ai unui crossmatch citotoxic pozitiv pe celulă B.
46
Este posibil ca pierderea grefelor transplantate în cazul crossmatch-ului negativ
pe celula T şi pozitiv pe celula B să fie datorată componentelor anti-HLA clasa I ale
acestor seruri aloreactive.
Fig.15
47
În Centrul de Imunogenetică şi Virusologie din Institutul Clinic „Fundeni”
crossmatch-ul este performat printr-un test calitativ ELISA în fază solidă pentru
detecţia anticorpilor IgG direcţionaţi către antigenele HLA din clasa I şi aII-a
specifice donatorului.
48
Interpretarea rezultatelor – Criteriul de pozitivitate
Această tehnică de lucru este între 30 - 250 de ori mai sensibilă decât
metodele serologice vizuale pentru detecţia anticorpilor anti-HLA de tip IgG.
Celulele T sunt separate electronic de celulele B, prin folosirea unui anticorp faţă de
antigene de suprafaţă ale celulelor T,(cum ar fi complexul CD3-PCR, marcat cu
fluoresceină)
49
Flowcitometria este în general performată pe serul cel mai recent şi pe o
selecţie de seruri istorice, reactive, pentru toţi pacienţii aflaţi pe lista de aşteptare
pentru donatori cadavru şi care au un risc crescut de rejet (cum ar fi alogrefa
rejetată anterior, PRA înalt, donator viu înrudit cu crossmatch serologic pe celula T
negativ şi pe celula B pozitiv).
50
Crossmatch-ul pentru autoanticorpi
51
Fig.18. Evaluarea imunologică în vederea transplantului renal de la donator viu.
52
Când PRA este > 10% este prudent să efectuăm teste pentru a determina
dacă unii dintre anticorpi sunt mai mult autoreactivi decât aloreactivi. Anticorpii
autoreactivi nu cresc riscul de rejet dar cei aloreactivi cresc riscul de pierdere a
alogrefei renale. Titrul mare de anticorpi aloreactivi se datorează, de obicei,
sarcinilor anterioare, transplanturilor sau transfuziilor de sânge.
Determinarea anticorpilor citotoxici poate fi utilă în evitarea anumitor
antigene HLA. La pacienţii foarte sensibilizaţi (PRA > 50%) poate fi foarte dificil
de găsit un donator crossmatch negativ. Evitarea transfuziilor poate ajuta ca titrul
anticorpilor citotoxici să scadă în timp.
53
Alegerea unui donator viu versus donator cadavru pentru transplantul renal
Donatorul marginal
Deşi nu este acceptată încă o definiţie unanimă, aceşti donatori includ
persoane la vârste extreme, cu hipertensiune sau diabet sau indivizi cu un risc
crescut de transmitere a diferitelor boli. În mod surprinzător, transplantul de
rinichi de la un astfel de donator marginal duce în multe cazuri la o funcţie renală
bună la nivelul receptorului.
54
Donatori non-heart-beating
Principala problemă legată de transplanturile renale de la acest tip de
donatori este rata crescută de funcţie renală întârziată şi de nefuncţionare primară
comparativ cu rinichii provenind de la donatori cadavru heart-beating [8].
Aceste date au încurajat centrele de transplant renal pentru a face cât mai
multe transplanturi de la donatori vii, în acest fel evitând şi lunga aşteptare pentru
un donator de rinichi cadavru.
55
Efectele potrivirii HLA asupra
(după L.K. Lebeck şi M.R. Garovoy – Histocompatibility testing and organ sharing, chapter 8).
Supravieţuirea alogrefei este cea mai bună pentru alogrefe HLA identice de la
fraţi şi este urmată apoi de alogrefe cu un singur haplotip nepotrivit. Important este
că timpul de înjumătăţire (T½) al grefelor care supravieţuiesc la cel puţin un an este
proporţional cu gradul de matching. Această informaţie poate fi folosită împreună cu
alţi factori pentru a selecta cel mai adecvat potenţial donator de rinichi [27].
56
Matching-ul imunologic: conceptul de matching în transplantul renal
Influenţa pozitivă a potrivirii HLA asupra supravieţuirii grefei renale a fost
demonstrată timp de mai bine de 25 de ani [11, 31, 6]. În practică, gasirea unui
donator de rinichi cu zero missmatch HLA este extrem de rară. De aceea, eforturile
se concentrează pentru găsirea unui donator cu minimum de nepotriviri HLA sau,
se merge mai departe, până spre limita maximă de nepotriviri, astfel încât să putem
avea, totuşi, un matching HLA optim.
2) antigenele HLA de clasa I care au fost identificate numai în serurile istorice ale
pacientului;
3) antigenele HLA ale donatorului care au fost nepotrivite în cazul unui transplant
anterior, dacă acest lucru este aplicabil.
În anii recenţi, progrese mari s-au efectuat prin potrivirea HLA la nivel de
alelă [7]. De asemenea, trebuie menţionat că mulţi primitori de alogrefă renală cu
nepotriviri HLA continuă să aibă o funcţie bună mulţi ani după transplant,
sugerând că anumite nepotriviri HLA sunt totuşi acceptate [8].
58
Transplanturile renale ABO incompatibile
59
BIBLIOGRAFIE
60
19. Lucas, D.P., Paparounis, M.L., Meyers, L., Mart, J.M., Zachary, A.A.,: Detection of HLA
class I specific antibodies by the QuikScreen Enzyme-Linked Immunosorbent Assay. Clin
Lab Diagn Lab Immunol, 1997;4:252
20. Luminex Corporation, 1998-2000. Luminex 100 User Manual Version 1.7 Rev B.
21. Marsh, S.G.E., Parham, P. Barber., Barber L.D., The HLA FactsBook, Academic Press,
2000.
22. Moore, S.B., Ploeger, N.A., DeGoey, S.R.,: HLA antibody screening: Comparison of a solid
phase enzyme-linked immunoassay with antiglobulin augmented lymphocytotoxicity.
Transplantation 1997; 64:1617.
23. Nyberg, S. L., Matas, A. J., Kremers, W. K., et. al. Improved scoring system to assess adult
donors for cadaver renal transplantation. American Journal of Transplantation. 3, 715-721,
2003.
24. Rhodes, D.A., Trowsdale, J.: Genetics and molecular genetics of the MHC. Reviews in
Immunogenetics, 1:21-31, 1999.
25. Rodey Glenn E. HLA Beyond Tears. De Novo, Inc. 2000;213.
26. Sanger Centre, http://www.sanger.ac.uk./HGP/Chr6/MHC/shtml
27. Thelan, D., Rodey, G., American Society of Histocompatibility and Immunogenetics
Laboratory Manual, edn. Lenxa, K.S: ASHY.
28. Trowsdale, J. Immunogenetics 41,1-17,1995.
29. Trowsdale, J. In HLA and MHC: Genes, Molecules and Function (Browning, M. And
McMichael, A. Eds), 1996, Bios Scientific Publishers, Oxford.
30. Williams, T.M., Human Leucocyte Antigen Gene Polymorphism and the Histocompatibility
Laboratory, The Journal of Molecular Diagnostics, 3, 3, 2001.
31. Wujciak, T., Opelz, G., Matchabililty as an important factor for kidney allocation according
to the HLA Match. Transplantation Proceedings; 27: 1403-1405, 1997.
32. Zachary, A.A., Delaney, N.C., Lucas, D.P., Laffell, M.S., Characterization of HLA Class I
Specific Antibodies by ELISA Using Solubilized Antigen Targets: I. Evaluation of the GTI
Quik-ID Assay and Analysis of Antibody Patterns. Human Immunology 2001; 62:3, 228-
235
61
EVALUAREA IMUNOLOGICĂ ÎN
TRANSPLANTUL HEPATIC
_______________ _______________
62
Donatori marginali:
1. vârstă > 50 ani: deşi vârsta înaintată a donatorului se poate asocia cu funcţia
deficitară a grefei, lipsa de organe şi evoluţia favorabilă post-transplant par să
justifice numărul în creştere al donatorilor > 50 ani.[5]
2. steatoza hepatică: ficatul cu infiltrare grasă uşoară sau moderată poate fi
utilizat cu rezultate bune dacă timpul de ischemie rece este redus.[6]
3. markeri pozitivi pentru virusul hepatitic B sau C: grefele provenind de la
donatori cu markeri de infecţie VHB sau VHC pot fi utilizate la receptori cu
ciroză secundară infecţiei VHB, respectiv VHC, dacă se administrează
tratament profilactic specific.[7,8]
Transplantul cu ficat împărţit (split liver transplantation ): un ficat de la
cadavru este împărţit în două grefe funcţionale, lobul drept fiind folosit pentru un
receptor adult, iar lobul stâng (segmentele 2, 3 şi 4) sau segmentul lateral stâng
(segmentele 2 şi 3) pentru un adult scund sau un copil. Majoritatea centrelor
consideră că împărţirea in vivo este superioară celei ex vivo dacă sunt luate în
considerare rezultatele imediate şi pe termen lung. Principalul dezavantaj al tehnicii
cu ficat împărţit constă în supravieţuirea mai mică a grefei şi numărul crescut de
complicaţii biliare comparative cu transplantul hepatic integral.
63
Compatibilitatea donator – primitor în transplantul hepatic
64
Boala acută de grefă contra gazdă (GVHD) în transplantul hepatic
65
Este o complicație raportată mai frecvent în cazul transplantelor cu
mismatch minor ABO si poate fi cauza unor hemolize "neexplicate" apărute în
perioada postoperatorie. Incidența SLP biochimic (haptoglobină scăzută,
transaminaze și bilirubină indirectă crescute) în transplantul hepatic este de circa 30
– 40% .
Fenomene de rejet post transplant hepatic pot fi întâlnite la peste 50% din
pacienti și sunt tratate relativ ușor și cu succes dacă sunt diagnosticate precoce. Din
păcate, semnele și simptomele clinice (febră, dureri abdominale, ascită,
hepatomegalie, inapetență ) și testele paraclinice (creșterea nivelelor serice ale
bilirubinei, transaminazelor, fosfatazei alcaline) sunt nespecifice.
66
TH2, cum ar fi IL-4 sau IL-10, inhibă răspunsul TH1 şi compromite imunitatea
gazdei, dar promovează tolerenţa transplantului (27).
Evaluarea virusologică
Afecţiunea care ridică cele mai importante probleme legate de recidiva post-
transplant este infecţia cu VHC. Reinfecţia grefei cu VHC este universală, recurenţa
histologică fiind notată la 50-80% din pacienţi la 1 an post-transplant. O
proporţie de 15-30% dintre pacienţii cu hepatită cronică C recurentă dezvoltă
ciroză hepatică la 5 ani post-transplant.
67
episoadelor de rejet acut tratate cu bolusuri de metilprednisolon, tratamentul
rejetului cu anticorpi anti-limfocitari, infecţia cu virusul citomegalic, absenţa
coinfecţiei VHB pretransplant [6,9,28,29].
68
conferă rezistenţă la tratament (mutaţii în gena S pentru HBIG sau mutaţii în gena
P a polimerazei virale – mutaţii YMDD pentru lamivudină).
Este deja bine cunoscut rolul pe care îl joacă imunitatea celulară în controlul
infecției. Concentrațiile crescute de neopterină reflectă răspunsul imun mediat
celular și în infecțiile produse de CMV sau EBV, fiind un marker imunologic foarte
util în diagnosticul acestor infecții la pacienții cu transplant hepatic, deoarece
nivelele serice de neopterină cresc în stadiile timpurii ale acestor infecți, de obicei
chiar înainte de seroconversie.
69
BIBLIOGRAFIE
1. Forman LM, Lucey MR. Predicting the Prognosis of Chronic Liver Disease: An
Evolution From Child to MELD. Hepatology 2001; 33: 473-5
3. Kamath PS, Wiesner RH, Malinchoc M et al. A model to predict survival in patients
with endstage liver disease. Hepatology 2001; 33: 464-70
4. Wiesner R, Edwards E, Freeman R et al. The model for end-stage liver disease
(MELD) and allocation of donor livers. Gastroenterology 2003; 124: 91-6
5. Hoofnagle JH, Lonbardero M, Zetterman RK et al. Donor age and outcome of liver
transplantation.Hepatology 1996; 24: 89-96
6. Keeffee EB. Selection of patients for liver transplantation. In Transplantation of the Liver,
edited by Maddrey WC, Schiff ER, Sorrell MF. Lippincott Williams & Wilkins 2001; 5-34
8. Dodson SF, Bonham CA, Geller DA et al. Prevention of de novo hepatitis B infection
in recipients of hepatic allografts from anti-HBc positive donors. Transplantation 1999; 68:
1058-61
11. Broering DC, Sterneck M, Rogiers X. Living donor liver transplantation. J Hepatol
2003; 38: S119-S135
12. Renz JF, Roberts JP. Long-term complications of living donor liver transplan-tation.
Liver Transpl 2000; 6(6 suppl 2): S73-S76
13. Ghobrial RM, Saab S, Lassman C et al. Donor and recipient outcomes in right lobe
adult living donor liver transplantation. Liver Transpl 2002; 8: 901-909
14. Manikkam S, Stock P, et al. Clinical transplantation, in Medical Immunology, tenth edition
edited by Parslow TG, Stites DP, Terr AI, Imboden JB. McGraw-Hill 2001; 719-742
15. Edinger M, Hoffman P, Ermann J, et al. CD4 + CD25+ regulatory T cells preserve
graft–versus-tumor activity while inhibiting graft vs. host disease after bone marrow
transplantation. Nat Med 2003; 9:1144 -50
70
16. Perri R, Assi M, Talwalkar J, et al. Graft vs. host disease after liver transplantation : a
new approach is needed. Liver Transpl 2007; 13: 1092-9
17. Smith DM, Agura E, Netto G, et al. Liver transplant- associated graft vs. host
disease. Transplantation 2003; 75:118-26
18. Chan EY, Larson AM, Gernsheimer TB, et al. Liver Transpl 2007; 13: 516-22
19. Audet M, Panaro F, Piardi T, et al. Passenger Lymphocyte Syndrome and Liver
Transplantation.Clinical and Developmental Immunology 2008;
20. Yazer MH and Triulzi DJ Immune hemolysis following ABO-mismatched stem cell
or solid organ transplantation Current Opinion in Hematology 2007;14, 6,664– 670.
21. Sternberg A J, Lee G, Croxton T, et al. Severe hemolysis after minor ABO
unmatched kidney transplant—a non-secrector transplanted from a donor with high anti-
A titre. Transfusion Medicine2000;10;1, 87–89
22. Sokol RJ, Stamps R, Booker DJ, et al.. Posttransplant immune-mediated hemolysis
Transfusion 2002 , vol. 42, no. 2, pp. 198–204
23. Shortt J, Westall GP, Roxby D, et al. A ‘dangerous’ group O donor: severe hemolysis
in all recipients of organs from a donor with multiple red cell alloantibodies. American
Journal of Transplantation, vol. 8, no. 3, pp. 711–714, 2008.
24. Panaro F, DeChristopher PJ, Rondelli D, et al. Severe hemolytic anemia due to
passenger lymphocytes after living-related bowel transplant Clinical Transplantation 2004;
18, 3, 332–335
27. Moore KW, de Waal Malefyt R, Coffman RL, et al. Interleukin-10 and the interleukin-
10 receptor. Annu Rev Immunol 2001; 19:683-765
29. Ponce M, Berenguer M, Prieto M et al. Should we discard old donors for hepatitis C
candidates? The importance of donor steatosis. Hepatology 2003: 38: 226A.
30. Han SH, Ofman J, Holt C et al. An efficacy and cost-effectiveness analysis of
combination hepatitis B immune globulin and lamivudine to prevent recurrent hepatitis B
after orthotopic liver transplantation compared with hepatitis B immune globulin
monotherapy. Liver Transpl 2000; 6: 741-748.
71
31. Imperial JC, Keeffe EB. Liver transplantation in Handbook of liver disease, second
edition, edited by Lawrence S. Friedman, Emmet B. Keeffe, Churchill-Livingstone, 2004;
401-415
33. Razonable RR. Cytomegalovirus infection after liver transplantation: current concepts
and challenges. World Gastroenterology 2008; 14(31):4849-60
35. Adams AB, Williams MA, et al. Heterologous immunity provides a potent barrier to
transplantation tolerance. J Clin Invest 2003; 111(12): 1887-95
72
EVALUAREA IMUNOLOGICĂ ÎN TRANSPLANTUL
MEDULAR
____________ ____________
73
imun şi orice nepotrivire între donator şi receptor, chiar și modificarea unui singur
aminoacid în situsul de recunoaștere a antigenului, poate determina fenomene grave
de rejet, fie în sensul unei boli gazdă contra grefă fie în sens invers ca boală de grefă
contra gazdă.
Cel mai adecvat donator este un frate potrivit din punct de vedere al
genotipului HLA.
74
”Standardul de aur” este reprezentat de tipizarea cu rezoluție înaltă a
locusurilor HLA – A, B, DRB1, DQB1, DPB1. Dacă transplantul se face pentru o
afecțiune nemalignă, nu este necesar efectul de grefă contra leucemie, mediat prin
incompatibilitatea DP, și potrivirea DPB1 poate fi luată în considerare când sunt
disponibili mai mulți donatori compatibili HLA – A/B/C/DR/DQ (5).
75
Selectia donatorului din banca de sânge din cordonul ombilical
77
Aceste mismatch-uri KIR - ligand apar deseori in transplantul cu donator
haploidentic. Când alloreactivitatea NK se exercită în direcția donor – versus-
primitor pare să aibe un rol crucial în îmbunătățirea rezultatelor posttransplant
haploidentic și se asociază cu [16]:
Circa 25% din caucazieni, care sunt homozigoți pentru așa-numitul haplotip
A, nu posedă receptori KIR activatori, restul, homo- sau heterozigoți pentru
haplotipul B, prezintă gene inhibitorii și variate combinații de gene activatoare.
78
Imunogenetica non-HLA și transplantul de celule stem hematopoetice
79
Polimorfismul IL-6 -174G/G la primitor se asociază cu GVHD acut și
cronic.
GVHD care apare după un transplant de la frate HLA identic este inițiat de
limfocitele T care recunosc antigene minore de histocompatibilitate ( peptide
derivate din proteinele intracelulare, codate de gene de pe cromozomi autozomali
sau de pe cromozomul Y ). Unele antigene (ex: HA-1, HA-2) se găsesc numai pe
celulele sistemului hematopoietic, iar altele (ex: H-Y, HA-3) sunt exprimate
ubicuitar pe țesuturile normale. Cele codate de gene de pe cromozomul Y sunt
implicate în transplantul cu mismatch de sex. Nepotrivirile între donator și primitor
pentru HA-1, HA-2, HA-4, HA-5 se asociază cu creșterea incidenței GVHD [23].
80
Posttransplant se adoptă următoarea politică transfuzională:
81
BIBLIOGRAFIE
3. Petersdorf EW. Risk assessment in hematopoietic stem cell transplantation. Best Pract
Res Clin Haematol 2007; 20: 155-170
4. Hurley CK, Wagner JE, Setterholm MI, Confer DL. Advances in HLA: Practical
implications for selecting adult donors and cord blood units. Biol Blood Marrow
Transplant 2006; 12: (1 Suppl 1): 28-33
5. Tiercy JM. The rol of HLA in HSCT. The EBMT Handbook, 5th edition 2008; 46-92
6. Shaw BE, Marsh SG, Mayor NP, et al. HLA- DPB1 matching status has significant
implications for recipients of unrelated donor stem cell transplants. Blood 2006; 107:
1220-1226
8. Flomenberg N, Baxter-Lowe LA, Confer D, et al. Impact of HLA class I and class II
high resolution matching on outcomes of unrelated donor bone marrow
transplantation. Blood 2004; 104: 1923-1930
9. Gluckman E, Rocha V. Donor selection for unrelated cord blood transplants. Curr Op
Immunol 2006; 18: 565-570
10. Tiercy JM, Bujan-Lose M, Chapuis B, et al. Bone marrow transplantation with
unrelated donors: What is the probability of identifying an HLA-
A/B/C/w/DRB1/B3/B5/DQB1- matched donor? Bone Marrow Transpl 200; 26: 437-
441
11. Warrington KJ, Takemura S, Goronzy JJ, Weyand CM. CD4+,CD28- T cells in
rheumatoid arthritis patients combine features of the innate and adaptive immune
systems. Arthritis Rheum 44:13; 2001.
12. Martin MP, Nelson G, Lee JH, Pellett F, et al. Susceptibility to Psoriatic Arthritis:
Influence of Activating Killer Ig-Like Receptor Genes in the Absence of Specific HLA- C
Alleles. J Immunol 169:2818; 2002.
82
13. Martin MP, Gao X, Lee JH, Nelson GW, Detels R, Goedert JJ, Buchbinder S, Hoots
K, Vlahov D, Trowsdale J, et al. Epistatic interaction between KIR3DS1 and HLA-B
delays the progression to AIDS, Nat Genet 31:429; 2002.
14. Yawata M, Yawata N, Draghi M, et al. Roles for HLA and KIR polymorphisms in
natural killer repertoire selection and modulation of effector function. J Exp Med 2006; 203:
633-645
16. Ruggeri L, Mancusi A, Capanni M, et al. Donor NK cell allorecognition of missing self
in haploidenrical haematopoietic transplantation for acute myeloid leukemia. Challenging
its predictive value. Blood 2007; 110: 433-440
17. Smith HRC, Heusel JW, Mehta IK, et al. Recognition of a virus-encoded ligand by a
natural killer cell activation receptor. Proc Natl Acad Sci USA 2002; 99: 8826-8831
18. Degli Esposti MA, Smyth MJ. Close encounters of different kinds: Dendritic cells and
NK cells take centre stage. Nature Reviews Immunology 2005; 5: 112-124
19. Ishikawa Y, Kashiwase K, Akaza T, et al. polymorphisms in TNFA and TNFR2 affect
outcomes of unrelated bone marrow transplantation. Bone Marrow Transplant 2002; 29: 569-
575
20. Mullighan CG, Bardy PG. Advance in the genomics of allogeneic haematopoietic stem
cell transplantation. Drug Development Research 2004; 62: 273-292
21. Lin MT, Storer B, Martin PJ, et al. Relation of an IL-10 promoter polymorphism to
GVHD and survival after haematopoietic -cell transplantation. N Engl J Med 2003; 349:
2201-2210
22. Cullup H, Stark G. IL-1 polymorphism and GVHD. Leuk Lymphoma 2005; 46: 517-523
23. Goulmy E. Human minor histocompatibility antigens. Curr Opin Immunol 1996; 8:75-81
24. Middleton PG, Cullup H, Dickinson AM, et al. Vitamin D receptor gene
polymorphism associates with GVHD and survival in HLA-matched sibling allogeneic
bone marrow transplantation. Bone Marrow Transplant 2002; 30:223-228
83
27. Helbig G, Stella-Holowiecka B, Woinar J, et al. Pure red cell apasia following major and
bidirectional ABO-incompatible allogeneic stem cell transplantation: Recovery donor-
derived erythropoiesis after long-term treatment using different therapeutic strategies. Ann
Hematol 2007
28. Toubert A. Immune reconstitution after allogeneic HSCT. The EBMT Handbook, 5th
edition 2008; 297-316
84
Glosar de termeni - Imunologia transplantului
Alelă: variantă a unei gene într-un locus genetic particular. Cele două alele, de pe
cei doi cromozomi omologi, pot fi identice, şi individul este homozigot sau diferite
şi el este heterozigot.
Alogrefă: este tipul cel mai răspandit de grefă şi se referă la situaţia în care un organ
se transplantează unui individ aparţinând aceleiaşi specii, dar diferit genetic.
Aloreactivitate: descrie stimularea celulelor T de către moleculele MHC, altele
decât cele proprii; marchează recunoaşterea moleculelor MHC alogenice. Astfel de
răspunsuri sunt numite aloreacţii.
Anticorp: este o proteină care se leagă specific la o substanţă particulară, antigenul
corespunzător. Fiecare moleculă de anticorp are o structură unică care îi permite să
se lege specific la antigenul său corespunzător, dar toţi anticorpii au aceeşi structură
şi sunt cunoscuţi ca imunoglobuline sau Ig-uri. Anticorpii sunt produşi de celulele
plasmatice ca răspuns faţă de infecţie sau imunizare, legându-se la patogeni,
neutralizându-i şi îi pregăteşte pentru distrugere de către fagocite.
Anticorpi citotoxici: anticorpi anti-HLA
Antigen: orice moleculă care se leagă specific de un anticorp. Numele lor provine
de la abilitatea acestora de a genera anticorpi. Nu toate antigenele sunt capabile să
stimuleze producţia de anticorpi; antigenele care induc producţia de anticorpi sunt
denumite imunogene.
ASHI: Societatea Americană de Histocompatibilitate şi Imunogenetică.
Autogrefă: când un organ se transplantează aceluiaşi individ, dar în altă parte a
organismului.
CD: Clusters of differentiation, sunt grupuri de anticorpi monoclonali care identifică
aceeaşi moleculă de la suprafaţa celulară. Molecula de la suprafaţa celulei este
desemnată CD urmat de un numar (de exemplu: CD1, CD2 etc).
Celulele prezentatoare de antigen: sunt celule înalt specializate care pot procesa
antigene ale căror fragmente peptidice le proiectează pe suprafaţa celulară împreună
cu moleculele necesare activării celulelor T. Principalele celule prezentatoare de
antigen pentru celulele T sunt celulele dendritice, macrofagele şi celulele B.
Celulele T CD4 (helper): aceste celule ajută celulele B pentru a produce anticorpi
ca răspuns la stimularea antigenică. Cele mai eficiente celule T helper sunt cunoscute
ca celule TH2, care produc citokinele IL4 şi IL5. Celulele CD4 sunt importante
85
pentru recunoaşterea peptidelor antigenice legate la moleculele MHC de clasa aII-a.
Acţionează ca şi co-receptori prin legarea la partea laterală a moleculelor MHC de
clasa aII-a.
Celulele T CD8: sunt celule T care poartă co-receptorul CD8. Aceste celule
recunosc antigenele, de exemplu antigenele virale, care sunt sintetizate în citoplasma
celulei. Peptidele derivate din aceste antigene sunt transportate de către TAP,
asamblate cu molecule MHC de clasa I în reticulul endoplasmatic şi expuse ca
complexe peptide MHC de clasa I pe suprafaţa celulară. Celulele T CD8 se
diferenţiază în celule T CD8 citotoxice.
Centimorgan: unitate de măsură a distanţei dintre două locusuri în linkage, stabilită
prin frecvenţa recombinărilor între locusuri. Este egal cu o frecvenţă de
recombinare de 1% între locusuri. Are simbolul cM. Unitate de recombinare.
Centromer: punct de unire a cromatidelor. La om secvenţele centromerice sunt
diferite.
Chimera: coexistenţa la nivelul unui singur individ sau la nivelul ţesuturilor sau
celulelor a două genotipuri diferite. De exemplu, primitorul unui transplant de
maduvă de la un individ genetic diferit are celulele sanguine de origine ale
donatorului ca şi celulele autologe. Termenul provine din mitologia greacă,
reflectând un monstru cu un cap de leu, un corp de capră şi coada unui dragon.
Citokine: polipetide secretate care afectează funcţia altor celule. Citokinele sunt
importante pentru interacţiunile celulare din cadrul răspunsului imun. Citokinele
produse de fagocitele mononucleare se numesc monokine; cele produse de
limfocite se numesc limfokine.
Cod genetic: triplete de baze din ADN şi ARN care poartă informaţia genetică,
necesară sintezei proteinelor. Este un veritabil dicţionar care permite trecerea de la
un grup de 3 nucleotide (triplet sau codon) la un aminoacid specific.
Codon: secvenţe a trei nucleotide mARN, care codifică un aminoacid specific.
Codon ambiguu: care codifică mai mulţi aminoacizi cu sens greşit (missens)şi care
în urma unei mutaţii devine un codon terminator al sintezei lanţului polipeptidic.
Codon iniţiator: unul dintre cei 2 codoni AUG sau GUG care marchează
începutul sintezei proteice.
Codoni sinonimi: care codifică acelaşi aminoacid.
Codoni terminatori: care anunţă terminarea sintezei proteinelor. Când ribozomii
ajung în dreptul lor, sinteza se opreşte şi lanţul polipeptidic este eliminat.
86
Conversie genică: înlocuire a materialului genetic de pe un sit particular al unei
cromatide, de către materialul genetic situat pe un punct exact corespunzător, de pe
o cromatidă ne-soră; este o formă particulară de recombinare, care explică apariţia
unor anomalii de segregări.
CREGs: Cross reactive groups (grupuri care reacţionează încrucişat) epitopi publici
care sunt responsabili pentru crossreactivitatea serologică bine cunoscută care este
observată între aloantiserurile HLA. Modelul crossreactivităţii serologice a
antiserurilor HLA au fost utilizate pentru a categorisi genele HLA de clasa I în
grupuri majore crossreactive sau CREGs. Baza moleculară a crossreactivităţii
serologice este existenţa concomitentă, diferenţiată a epitopilor publici la nivelul
mai multor gene HLA.
Cromatină: complexul de ADN, histone, proteine nehistonice şi puţin ARN care
compune cromozomul.
Cromozom: purtătorul informaţiei genetice.
Crossing-over: încrucişare, schimb de material genetic între cromatidele
cromozomilor omologi.
Crossmatch: test care evidenţiază anticorpi direcţionaţi faţă de antigenele HLA
prezente la nivelul limfocitelor T ale donatorului (clasa I) sau la nivelul limfocitelor
B ale donatorului (clasa a II-a) implicate în răspunsul imun; prin acest test se
previne fenomenul de rejet în transplantul renal.
EFI: Federaţia Europeană de Imunogenetică
ELISA: Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, este un test serologic în care un antigen
sau un anticorp legat este detectat utilizând anticorpi cuplaţi cu o enzimă care
converteşte un substrat incolor într-un produs colorat. Testul ELISA este larg
folosit în biologie şi medicina ca şi în imunologie.
Epitop: determinant antigenic definit
Epitop privat: iniţial, un epitop privat a fost considerat a fi unic la nivelul unui
singur produs genetic alelic. Astăzi prin epitop privat înţelegem epitopii care se află
la nivelul unui grup limitat sau familii de alele strâns înrudite, cum sunt alelele A2
(A*0201-0229), sau alelele B39 (B*39 01011-*3915). Epitop de grup este un termen
şi mai adecvat pentru a descrie acest tip de epitop şi poate fi interschimbat cu
termenul de “privat”.
.
87
Epitopi publici: există concomitent, diferenţiat între conglomeratele de gene HLA
care în mod normal aparţin la grupuri diferite de gene, strâns înrudite, de exemplu,
existenţa concomitentă a epitopului public între A2 şi moleculele B57 sau 58.
Exon: secvenţă de nucleotide care codifică o secvenţă de aminoacizi specifici. În
medie, ei sunt constituiţi din 100-300 de nucleotide. O genă este, astfel constituită
din mai mulţi exoni separaţi prin introni, iar fiecare exon poate fi considerat un
modul al unei proteine.
Expresie genică: manifestare fenotipică a unei gene specifice; este condiţionată de
natura genei, dominantă sau recesivă, de interacţiunea cu alte gene, condiţiile de
mediu, penetranţă şi expresivitate.
Fenotip: caracteristicile detectate ale unei celule sau organism; rezultă din
interacţiunile genotipului cu mediul.
Genă: informaţia nucleotidă care asigură sinteza unei secvenţe de aminoacizi şi care
ocupă un locus specific.
Genom: set haploid de cromozomi. Totalitate a variantelor genetice de pe un locus
dat. Dacă pe un locus se găsesc n alele, atunci pot exista n homozigoţi şi n(n-1)/2
heterozigoţi. Numărul total al genotipurilor de pe acelaşi locus este egal cu
n(n+1)/2. Genomul uman conţine 6,4 x 10-10 g ADN, echivalentul a 5800 de
milioane de baze, în timp ce al Escherichia Coli are numai 4 milioane. Nucleul diploid
uman include 6 milioane de gene.
Genotip: constituţia genetică a unui organism.
Haplotip: setul de alele HLA găsit pe un cromozom.
Histocompatibilitate: identitate la nivelul moleculelor de histocompatibilitate de
clasa I şi clasa a II-a. Termenul este folosit în sens operaţional însemnând
similaritate suficientă între moleculele HLA ale donatorului şi primitorului, în
transplantul de organe.
HLA: antigene leucocitare umane sau “leucocite de histocompatibilitate”.
Imunogenetică: ramura a geneticii care studiază complexitatea proceselor ce
asigură apărarea şi integritatea organismului, în ipoteza în care în organism pătrund
antigene străine; controlul genetic al imunoglobulinelor, deficienţele condiţionate
genetic, răspunsul imun, imunitatea celulară etc, variabilitatea genelor implicate în
acest proces (ABO, Rh, HLA) precum şi tulburările autoimune; imunogenetica a
descoperit complexul major de histocompatibilitate, a reuşit să cartografieze
regiunea cromozomială 6 pe care este situat acest sistem, a elucidat structura
anticorpilor (imunoglobulinelor), a explicat fenomenele de compatibilitate şi
88
incompatibilitate, a precizat existenţa asociaţiilor dintre genele sistemului HLA şi
diverse tulburări.
Interleukinele: sunt citokine secretate în principal de celulele mononucleare
(limfocitele şi fagocitele mononucleare) care induc creşterea şi diferenţierea
limfocitelor şi a celulelor stem hematopoietice pluripotente.
Intron: secvenţă de 100-1000 nucleotide situată în afara sau în interiorul genei care
separă exonii (secvenţele de nucleotide ADN care sunt transcrise) şi sunt prezente
în mARN. Toţi intronii studiaţi până acum încep cu secvenţe GT şi se termină cu
secvenţele AG. Uneori, secvenţele de început şi de sfârşit se repetă de numeroase
ori. Intronii coordonează sinteza proteinelor şi diminuează frecvenţa mutaţiilor
survenite în cursul recombinării.
Izogrefă: când un organ se transplantează între indivizi ai aceleiaşi specii, cu
configuraţie antigenică identică (gemeni monozigoţi).
Linkage: asociere a două sau mai multe gene nealele în aşa fel încât se transmit ca
o singură unitate dacă nu intervine fenomenul de crossing-over.
Linkage disequilibrium : legătură dezechilibrată – tendinţă a unor alele situate pe
locusuri diferite de a apărea împreună pe acelaşi cromozom sau haplotip, într-o
secvenţă mai mare decât cea aşteptată teoretic.
MHC: complexul major de histocompatibilitate: regiune cromozomială formată din
locusurile care au rol fundamental în procesele imune. La om MHC este sistemul
HLA, omolog cu complexul H2, la şoarece.
Microarray: tehnologie cu microcipuri, care are ca principiu de bază hibridizarea
complementară a secvenţelor simplu spiralate ale acizilor nucleici. În genetica
cancerului, ADN microarray este creată prin plasarea diferitelor ADN-uri pe un mic
fragment al unui microcip, folosindu-le apoi, pentru a evalua expresia ARN în
celulele normale sau maligne.
Mutaţie: modificare permanentă şi transmisibilă a structurii şi implicit a funcţiei
unei gene. De obicei, termenul de mutaţie se referă la o singură genă. Prin lărgirea
conceptului, în categoria mutaţiilor au fost incluse modificările numerice şi
structurale ale cromozomilor, precum şi modificările numerice ale genomului
(poliploidia).
Neopterina: pteridină serică secretată de macrofag; valorile serice crescute ale
neopterinei reprezintă expresia activării răspunsului imun celular.
Polimorfism: înseamnă existenţa într-o varietate de forme diferite. Polimorfismul
genetic este variabilitatea de la nivelul locusului genei în care se produc variante
89
genice la o frecvenţă mai mare de 1%. Complexul major de histocompatibilitate
(MHC) este cel mai polimorf conglomerat de gene cunoscut la om.
Prezentarea antigenică: descrie antigenul ca fragmente peptidice legate la
moleculele MHC pe suprafaţa unei celule. Celulele T recunosc antigenul când este
prezentat în acest fel.
Procesarea antigenică: este degradarea proteinelor în peptide care se pot lega la
moleculele MHC pentru prezentare la celulele T. Toate antigenele, cu excepţia
peptidelor, trebuie să fie procesate în peptide înainte de a putea fi prezentate de
către moleculele MHC.
Rejetul grefei: reacţie imunologică direcţionată faţă de moleculele de
histocompatibilitate din grefă care conduce la eliminarea sau rejetul grefei.
RT-PCR: reacţie de amplificare genică folosită pentru a amplifica secvenţele ARN.
Enzima revers-transcriptaza (RT) este folosită pentru a converti secvenţa ARN
într-o secvenţă de ADN complementar (cADN), care este apoi amplificată prin
PCR.
Segregare: separare a cromozomilor omologi în meioză, implicit, separarea şi
migrarea în gameţi diferiţi a celor 2 membri ai oricărei perechi de alele. În acest fel
se disociază şi caracterele materne şi paterne. Este prima lege a lui Mendel, legea
segregării genelor.
Sistemul complement: este un set de proteine plasmatice care reacţionează
împreună pentru a ataca formele extracelulare ale patogenilor.
Sistemul grupelor sanguine ABO: antigene care sunt exprimate pe eritocite. Ele
sunt folosite pentru tipizarea sângelui uman pentru transfuzii. Indivizii care nu
exprimă antigenele A sau B pe eritrocitele lor, în mod natural formează anticorpi
care interacţionează cu acestea.
Sit: “pozitie”, “localizare”; 1. Cea mai mică unitate a unei gene care poate suferi o
mutaţie. 2. Secvenţă de nucleotide recunoscută specific de anumite proteine.
Tapasin (TAP – associated protein): este o moleculă cheie în asamblarea
moleculelor MHC de clasa I; o celulă deficientă în această proteină are numai
molecule MHC de clasa I instabile pe suprafaţa celulară. TAP1 şi TAP2
(“transporters associated with antigen processing”) sunt proteine – casetă care leagă
ATP, implicate în transportul peptidelor scurte din citosol în lumenul reticulului
endoplasmatic, unde se asociează cu moleculele MHC de clasa I.
TCR (“T-cell receptor”): receptorul celulei T este al lanţurilor înalt variabile şi
heterodimer legate disulfidic, exprimate de membrana celulară ca un complex cu
90
lanţurile CD3 permanente. Celulele T care poartă acest tip de receptor frecvent
denumite celule T .
Telomer: cromomer terminal situat la extremităţile cromozomilor care au rolul de
a împiedica fuziunea cromozomilor intacţi.
Xenogrefa: este transplantul de organe între specii diferite (de exemplu: de la porc
sau de la babuin la om).
91