CURS 8

BIOCHIMIE

EXAMENE MICROBIOLOGICE

HEMOCULTURA

Descriere

Sangele, fiind in mod normal steril, izolarea si identificarea unei bacterii sau a unui fung
in hemocultura are o semnificatie diagnostica considerabila.
Bacteriemia este prezenta in sange a bacteriilor provenite dintr-un focar septic sau de pe
o mucoasa lezata. Frecvent starea bacteriemica este lipsita de expresie clinica sau se insoteste
numai de frison si febra la care se pot adauga simptome si semne proprii conditiei care a
determinat descarcarea bacteriemica.
Septicemia este termenul clinic prin care se defineste o bacteriemie importanta cu
evolutie clinica neregulata, imprevizibila si grava, acompaniata de frisoane, febra neregulata,
toxemie, hipotensiune, prostratie, eruptii cutanate polimorfe si variate, metastaze septice tisulare
sau viscerale. Gravitatea sindromului septicemic lasa pe al doilea plan simptomatologia focarului
infectios primar, care trebuie insa intotdeauna cautat.

Germeni implicati in:

1. Septicemie - Staphylococcus aureus, Escherichia coli si alte enterobacterii, stafilococ
coagulazo-negativ (SCN) , Pseudomonas, Streptococcus, bacterii anaerobe, levuri.
2. Endocardita - Streptococcus spp., Enterococcus spp., Staphylococcus spp.
3. Pneumopatii - Streptococcus pneumoniae, Klebsiella pneumoniae, Haemophilus influenzae.
4. Meningite - Neisseria meningitidis.

In functie de poarta de intrare:

1. Pulmonara - Streptococcus pneumoniae, Klebsiella pneumoniae, Haemophilus influenzae.
2. Cutaneo-mucoasa (cateter, dren) - Staphylococcus spp.
3. Extractii dentare - Streptococcus spp.
4. Digestiva - Enterobacterii, bacterii strict anaerobe, Enterococcus spp.
5. Ginecologica - Bacterii strict anaerobe, E.coli, Enterococcus spp.
6. Infectii si obstructii urinare - Enterobacterii, Enterococcus spp. 

Principiul hemoculturii
Hemocultura este un test calitativ pentru detectarea microorganismelor prezente in sange.
Sangele, prelevat in conditii de stricta asepsie, este insamantat in flaconul de hemocultura a carui
compozitie favorizeaza dezvoltarea germenilor aerobi, anaerobi si microaerofili.
Multiplicarea bacteriilor depinde insa si de o serie de factori independenti de conditiile de
cultivare: densitatea germenilor in sange, stadiul lor de multiplicare,  prezenta in sange a unor
substante inhibitorii.
Bacteriemiile si fungemiile adultilor evolueaza in general cu un numar redus de
microorganisme circulante (intre 1-30 UFC/ml sange). La nou-nascuti, sugar si copilul mic
concentratia depaseste 100 UFC/ml. In general, intre gravitatea infectiei, prognostic si
concentratia bacteriilor din sange exista o relatie direct proportionala.

Pentru urmarirea probelor se  foloseste  metoda clasica:

Examenul macroscopic al flaconului: - se examineaza macroscopic - vizual de doua ori pe zi
flacoanele pentru a cauta semnele cresterii bacteriene. Este posibil ca aspectul flaconului sa
orienteze asupra bacteriei in cauza, de ex:
a) turbiditate - bacili Gram negativi aerobi, Staphylococcus, Bacteroides;
b)  hemoliza - Streptococcus, Staphylococcus, Lysteria, Clostridium, Bacillus;
c)  producere de gaz - bacili Gram negativi aerobi si anaerobi;
d) coaguli - Staphylococcus aureus.

Examinare microscopica: preparat proaspat, frotiu colorat Gram

- ameliorarea cresterii bacteriene. Constanta agitare a recipientelor in primele 24h de incubare
imbunatateste cresterea marii majoritati a bacteriilor aerobe.
Interpretarea  rezultatelor
Absenta cresterii 
Hemocultura pozitiva - daca in sangele de cercetat au existat germeni care s-au
multiplicat in mediul de cultura (hemocultura pozitiva), mediul va trece in camera de expansiune
si se va ridica deasupra mansonului verde al acesteia.

Eliberarea  rezultatelor
a) rezultat partial prin frotiu colorat Gram;
b)  rezultat definitiv dupa izolarea, identificarea bacteriei si efectuarea antibiogramei sau
antifungigramei.

Interpretarea rezultatului final se face in functie de contextul clinic si de numarul flacoanelor

pozitive in raport cu cele recoltate.

Hemoculturi pozitive
Se iau in considerare:
- mai multe hemoculturi pozitive cu un germen patogen;
- mai multe hemoculturi pozitive cu un germen obisnuit comensal intr-un anumit context clinic;
- 1 hemocultura pozitiva cu germeni patogeni cunoscuti (Salmonella);
- 1 hemocultura pozitiva cu germeni potential patogeni in context clinic evocator cum ar fi:
Streptococcus pneumoniae in pneumopatii, enterobacterii in infectii urinare, Stafilococ
coagulazo-negativ in infectii de cateter.
Se exclud:
- 1 hemocultura pozitiva cu un germen comensal fara context clinic: suprainfectie cu Stafilococ
coagulazo-negativ, Corynebacterii, Streptococ non-grupabil;
- pe un teren imunologic deprimat se iau in considerare si aceste bacterii;
- pe un teren imunologic normal se repeta hemocultura.

Hemoculturi negative
- recoltarea probei s-a realizat dupa antibioticoterapie;
- recoltarea s-a realizat tardiv in cursul bolii (apar anticorpii);
- cantitate insuficienta de sange recoltat;
- timp de observatie prea scurt;
- mediu de cultura gresit ales.

Hemoculturi pozitive pentru mai multe specii bacteriene

In cazul in care s-au izolat mai multe specii bacteriene intr-un singur flacon sau din flacoane
diferite ale aceluiasi pacient, acestea se tin in observatie in urmatoarele situatii :
- bolnav imuno-deprimat;
- bolnav comatos;
- cateter mentinut timp indelungat.

Specii bacteriene izolate in functie de perioada de crestere

- in primele 1-2 zile cresc: Streptococcus pneumoniae, Streptococcus spp, enterobacterii;
- dupa 3 zile cresc: bacilii Gram negativi non-fermentativi, bacteriile anaerobe;
- la 4-5 zile: Haemophilus si Stafilococul coagulazo-negativ;
- la 6-7 zile: speciile de Candida;
- la 9 zile: corynebacteriile.

Recomandari

Recomandari pentru efectuarea hemoculturii:

Se face la  indicatia  medicului in anumite situatii clinice cum sunt:
- toate cazurile cu febra de origine neprecizata, mai ales daca se acompaniaza de semne clinice
evocatoare de infectie;
- sepsis, soc septic;
- pacienti cu endocardita acuta;
- sindrom sugestiv pentru infectie sistemica cu germeni specifici (febra enterica, bruceloza,
leptospiroza);
- infectii localizate severe (meningite, pneumonii, supuratii intraabdominale).

Hemocultura este in plus motivata la:

- bolnavii imunodeprimati (cancer, toxicomani);
- pacientul care este supus unei agresiuni medicale (cateter, dializa sau interventii chirurgicale) si
prezinta o stare febrila;
- in anumite situatii particulare (femeie insarcinata, pacient cardiac, diabetic, cu insuficienta
renala, insuficienta hepatica) cand pacientul prezinta febra de origine neprecizata.

Pregatire pacient

Prelevarea se efectueaza inainte de tratament antimicrobian, conform evolutiei predictive a

curbei febrile sau in momentul in care bolnavul semnaleaza aparitia frisonului. In cazul in care
acest lucru nu este posibil, sangele va fi prelevat imediat inaintea administrarii unei noi doze de
antibiotic. Se indica prelevarea a trei probe intermitente in decurs de 24 de ore; in urgente ritmul
este la un interval de 30-60 de minute.

Metoda

Pentru hemocultura se utilizeaza kit-ul, compus din: a) recipient cu mediu de cultura;

compozitia acestui mediu permite cresterea germenilor aerobi, anaerobi si microaerofili, ceea ce
provoaca o crestere a presiunii detectata prin indicatorul de crestere adaptat flaconului (camera
de expansiune); b) camera de expansiune pentru mediu, in care in cazul multiplicarii bacteriene
si cresterii presiunii, o parte din amestecul sange/bulion trece in ea si indica activitate bacteriana
(hemocultura pozitiva).

Pentru cadre medicale

Specimen recoltat - sange venos, de preferinta à jeun (pe nemancate), hiperlipemia putand

impiedica evidentierea unei cresteri bacteriene in mediul lichid.
Zona de electie pentru punctie este reprezentata de venele plicii cotului.

Procedura de prelevare respecta normele de asepsie si antisepsie necesare pentru a evita

contaminarea probei cu bacterii rezidente in flora tegumentara. Dupa recoltarea sangelui, proba
de 10 mL sange, recoltata in seringa se introduce in recipientul cu mediul de cultura prin
inteparea capacului de cauciuc al acestuia in conditii de stricta asepsie. Flaconul se agita bland
pentru omogenizarea acestuia in masa mediului. Proba se eticheteaza si se transporta in cel mai
scurt timp de la recoltare la laborator, la temperaturi cat mai apropiate de 37ºC (cutie izoterma).
Materiale necesare - seringa sterila de 10  mL; recipient cu mediu de cultura Signal.
Cantitate recoltata - adult:10 mL;  copil:3-5 mL.
Cauze de respingere a probei -probe neetichetate; probe incorect recoltate (nu s-au respectat
regulile de antisepsie); transport necorespunzator.
Prelucrare necesara dupa recoltare - se ataseaza camera de expansiune livrata in acelasi kit.
Se incubeaza la 37ºC. Durata incubarii la termostat si urmarirea probei este in medie de 7 zile. Se
impune incubare mai prelungita la pacientii cu endocardita subacuta, la probele prelevate sub
antibioticoterapie (pana la 14 zile) sau cand urmarim microorganisme exigente.

Limite si interferente

- tratament antimicrobian aplicat inaintea prelevarii;

- contaminarea sangelui cu flora exogena;
- cantitate insuficienta de sange prelevat;
- frecventa si momentul recoltarilor gresit stabilite;
- mediu de incubare si repicare gresit alese;
- timp de incubare necorespunzator.

UROCULTURA

În mod normal urina conţinută în căile urinare este sterilă, exceptând segmentul inferior al
uretrei, învecinat meatului urinar, prezentând o abundentă floră microbiană saprofită. Această
floră saprofită contaminează în momentul micţiunii porţiunea iniţială a jetului urinar.
Examenul bacteriologic al urinii presupune:
 recoltarea adecvată a mostrelor de urină pentru urocultură,
 transportul corect al probei la laborator,
 estimarea cantitativă a conţinutului bacterian al uroculturii şi determinarea
antibiogramei în cazul uroculturilor pozitive.
 Recoltarea urinii pentru urocultură se efectuează în eprubetă sterilă, din porţiunea
mijlocie a urinii matinale emise spontan, după toaleta riguroasă a regiunii perineale. Acest tip de
recoltarea se mai numeşte şi urocultură “din zbor”.
 Toaleta perineului se va efectua cu apă şi săpun, urmată de clătire abundentă cu apă
sterilă a regiunii periuretrale.
 Nu se vor utiliza soluţii antiseptice pentru toaletarea organelor genitale externe.
 Recoltarea urinii pentru urocultură prin sondaj vezical este utilizată numai la
pacienţii comatoşi sau necooperanţi, deoarece riscul infectării vezicale, chiar în
condiţii riguroase de asepsie, este crescut.
 Recoltarea uroculturii prin puncţie suprapubiană este şi ea rezervată unui număr
restrâns de indicaţii (pacienţi necooperanţi, cu septicemii sau stare generală foarte
gravă, de vârste extreme).
 După recoltare, urocultura trebuie transportată la laborator pentru a fi însămânţată
pe mediile de cultură în maxim 60 min (la temperatura camerei, numărul
germenilor conţinuţi în urină se dublează în 30 minute). În cazul în care acest
deziderat nu poate fi îndeplinit, urocultura va fi conservată la frigider maxim 24
ore.
Urocultura cantitativă se realizează în laboratorul de bacteriologie, prin metoda diluţiilor
zecimale succesive. Pentru evidenţierea baciclului Koch se utilizează medii speciale de cultură
(Löwestein-Jensen) sau inocularea intraperitoneală a animalelor de laborator (cobai).
După incubarea mediilor de cultură însămânţate la 37 °C timp de 24 ore se numără
coloniile dezvoltate, exprimarea rezultatelor făcându-se în germeni (UFC)/ml.

Estimarea rezultatelor uroculturii cantitative:

Urocultură pozitivă > 105 UFC/ml;

Bacteriurie nesemnificativă: 103 – 105 UFC/ml.

În cazul uroculturilor pozitive (bacteriurii semnificative) este importantă identificarea

agentului etiologic implicat şi a sensibilităţii acestuia la antibiotice (antibiograma).
 Germenii frecvent implicaţi în determinismul infecţiilor urinare sunt: Escherichia
coli, Proteus, Pseudomonas, Klebsiella, Enterobacter. Mai rar sunt izolaţi stafilococul auriu,
anaerobi sau mycoplasme.
Antibiograma este obligatorie în orice bacteriurie semnificativă. Testarea sensibilităţii
germenilor bacterieni in vitro se efectuează prin două metode: metoda diluţiilor şi metoda
difuzimetrică.
Exprimarea rezultatelor în buletinul de analiză se poate face fie direct, cantitativ (diametrul
zonei de inhibiţie şi limitele valorilor de sensibilitate şi rezistenţă la diversele antibiotice testate),
fie calitativ (aprecierea tulpinilor bacteriene izolate ca rezistente R, intermediar sensibile I sau
sensibile S).
Discrepanţele întâlnite în practică între sensibilitatea bacteriilor faţă de antibiotice in vitro
şi in vivo sunt explicate de o serie de factori ca:
 difuzibilitatea scăzută a antibioticului în focarul de infecţie,
 existenţa unor tulpini bacteriene mutante, rezistente,
 prezenţa unor asociaţii de germeni,
 suprainfecţii microbiene în cazul tratamentului prelungit sau prezenţa unei colecţii
purulente, nedrenate.
Persistenţa simptomatologiei clinice în condiţiile unui tratament adecvat, conform
antibiogramei, impune repetarea uroculturii.

EXAMEN BACTERIOLOGIC SECRETII, PLAGI, FISTULE, ABCESE

DESCRIERE:
Secretia purulenta poate apărea în tesuturi și organe (cutanate, țesut musculo-scheletal,
ganglioni, viscere, cavitati, pe suprafetele tisulare denudate prin arsuri, plagi); colectiile se pot
deschide spontan prin fistule.
Puroiul este un exsudat continand fibrina, leucocite, resturi celulare și microorganisme. În
funcție de localizare,etiologia poate varia.
 Supuratiile tegumentului implica cel mai frecvent Staphylococcus aureus și/sau
Streptococcus pyogenes ; pot fi cauzate și de fungi.
  Plagile muscate Pasteurella multocida, Streptococcus spp, anaerobi.
 Arsurile frecvent sunt infectate cu Staphylococcus aureus, Pseudomonas
aeruginosa, Klebsiella, Enterobacter, Enterococi, mai rar alte ennterobacteriacee.
Pot fi implicate și specii de fungi.
RECOMANDARI:
Prelevarea probelor uneori este unica și nu se poate repeta. Se prefera, atunci când este
posibil, punctionarea și aspirarea cu seringa.
Recoltarea cu tamponul trebuie făcută din profunzimea plagii, sau atunci când este vorba
de colectii foarte mici.
Se poate face și recoltare chirurgicala prin biopsie sau chiuretaj.
INTERVAL DE REFERINTA / UM
Absenta bacteriilor patogene în cazul prelevarii cu tamponul absenta bacteriilor în cazul
prelevarii prin punctie.
INTERPRETARE VALORI MICI:
Un rezultat negativ poate aparea ca o consecinta a prelevarii incorecte sau după tratament
cu antibiotice, de regula absenta creșterii bacteriene semnifica absenta bacteriilor cultivabile în
prelevatul respectiv.
INTERPRETARE VALORI MARI:
Rezultatul pozitiv este util în cazul izolarii speciilor semnificative clinic; dacă au fost
izolati germeni patogeni, dacă au fost izolati germeni în situri normal sterile sau după catetere,
materiale protetice, sau germeni izolati în cultura purasi asociat cu examenul microscopic al
produsului patologic (inflamatie).
INTERFERENTE ANALITICE:
Recoltarea de la suprafața plagii poate evidentia germeni de contaminare care nu reflecta
etiologia infectiei. Pentru izolarea anaerobilor sunt necesare condiții speciale de recoltare și
transport.
Nu se recomanda transport >2 ore de la recoltare.