UNIVERSITATEA DE TIINE AGRICOLE I MEDICIN VETERINAR CLUJ NAPOCA COALA DOCTORAL FACULTATEA DE MEDICIN VETERINAR

OVAT IONEL MARIUS

REZUMAT AL TEZEI DE DOCTORAT

CERCETRI PRIVIND INCIDENA I SEMNIFICAIA IGIENIC A AZOTAILOR, AZOTIILOR I NITROZAMINELOR N PRODUSELE ALIMENTARE, VEGETALE I ANIMALE N JUDEUL BIHOR

CONDUCTOR TIINIFIC:

PROF. UNIV. Dr. Bara Vasile

CLUJ NAPOCA 2011 0

INTRODUCERE
Azotaii, forma cea mai oxidat a azotului, au fost cunoscui cu mai bine de un mileniu i jumtate .e.n., nainte de izolarea acestora din aerul atmosferic. Au fost folosii la prepararea pulberilor cu fum, la aruncarea proiectilelor din piatr sau metal, la confecionarea artificiilor, pentru conservarea unor alimente de natur animal i ca fumigene. Chinezii au fost primii care au folosit azotaii pentru prepararea prafului de puc, prezena tunurilor fiind consemnat nc n timpul luptelor de la Tai-Gokt din anul 618 .e.n. Dup mai bine de un mileniu, n anul 630 e.n., arabii folosesc tunurile la asediul cetii Mecca, apoi n luptele pentru ocuparea cetii din Spania. Principiile utilizrii fertilizanilor au fost puin cunoscute pn n anul 1804, cnd elveianul T. de Saussure afirm n cartea sa Recherches chimiques sur la vgtation c plantele iau azotul din sol sub forma unor combinaii diferite. Este stabilit rolul esenial al substanelor cu azot din sol pentru creterea i dezvoltarea plantelor. J.B. Bousingault, 1834 este primul autor care a determinat bilanul elementelor nutritive din sol. Analiznd coninutul n elemente nutritive al recoltelor i al solului i lund n considerare i substanele nutritive aplicate n sol, autorul constat c plantele folosesc carbonul i azotul n cantitate mult mai mare dect cantitatea introdus n sol sub form de gunoi de grajd, iar solul pe care cresc plantele i din care extrag cantiti mai mari de azot este rapid epuizat. Bousingault demonstreaz astfel necesitatea asigurrii plantelor cu azot i a restituirii lui n sol prin fertilizare. Astfel, experimentele lui Saussure sunt confirmate. Dup o perioad de 20-30 de ani de folosire a fertilizanilor cu azot, n unele cazuri n exces, au aprut o serie de fenomene negative privind fertilizarea solului, un coninut de azotai ridicat fa de nivelul normal n plante, cazuri de mbolnviri la animale i oameni, cauzate de consumul crescut de azotai, fenomene de poluare a mediului ambiant. De aceea suntem obligai s abordm i prin prisma msurilor necesare de protecie a mediului ambiant i a sntii omului. Pentru nlturarea efectelor negative ale utilizrii excesive a fertilizanilor cu azot de provenien industrial, o preocupare tot mai consistent n ultimul timp este orientat spre

promovarea principiilor aa numitei agriculturi biologice, n care folosirea acestor fertilizani este privit cu suspiciune, mergndu-se pn la preconizarea excluderii utilizrii lor din tehnologia agricol. Anual, suprafee ntinse sunt scoase din circuitul agricol i se reduc suprafeele cultivate cu plante leguminoase, care fixeaz azotul atmosferic cu ajutorul bacteriilor cu ajutorul bacteriilor fixatoare de azot simbiotice, fiindc cerinele populaiei omeneti pentru hran n care cerealele ocup un loc primordial, au crescut foarte mult. n prezent, sunt acumulate numeroase date despre azot, fertilizani cu azot i despre azotai. Se apreciaz c numrul lor depete cifra de 3000 iar aciunea lor toxic este cunoscut de mult timp. Problema a devenit deosebit de actual de cnd s-au semnalat frecvente intoxicaii acute i cronice la copiii mici care au consumat substane chimice au devenit i mai complexe n urma evidenierii efectului cumulativ al azotailor i al posibilitii formrii nitrozaminelor cancerigene. (DOROFTEI SORINA, DUGACIU N 1998,)

CAPITOLUL I ASPECTE GENERALE PRIVIND PREZENA XENOBIOTICELOR N UNELE PRODUSE ALIMENTARE DE ORIGINE ANIMAL I VEGETAL

Produsele alimentare, componente ale mediului, reflect ntreaga complexitate a polurii, prezena substanelor toxice crescnd cantitativ i calitativ. Pentru a contura dimensiunile acestei probleme voi rezuma aspectele polurii produselor alimentare dezbtute n mai multe monografii.
1.1. POLUAREA CU AZOTAI I AZOTII REZIDUALI N LANUL ALIMENTAR

Prezena azotailor n produsele de origine vegetal este n general, consecina suprafertilizrii solului cu ngrminte azotate. De asemenea, unele pesticide utilizate n agricultur pot contribui la creterea coninutului de azotai n plante.( AHMAD IMTIAZ, 1994 Azotiii n prezena oxigenului sunt transformai la rndul lor de alte bacterii (nitrobacter) n azotai. Azotaii sunt mai puin toxici pentru vieuitoarele din mediul acvatic iar pentru plante constituie chiar un nutrient strict necesar. Azotiii sunt veriga final a acestor transformri ale azotului, ei acumulndu-se n timp. Concentraia maxim de azotai este de 100 mg/l recomandabil s nu se depeasc valoarea de 50 mg/l.( GARNER G.B. I COLAB., 1993) Azotiii inhib respiraia mitocondrial i fosforilarea oxidativ, reduc semnificativ absorbia proteinelor i lipidelor, diminueaz rezervele hepatice de vitamin A i scad nivelul tisular de acid folic, tiamin i piridoxin. Nitrozaminele sunt substane puternic cancerigene, nitrozodietilamina induce cancerul la toate cele 18 specii de animale la care s-a experimentat, de la pete la macac, iar dimetilnitrozamina la 12 specii. Doze foarte mici (1 mg/kg aliment) pot produce cancerul la aproape toate organele n funcie de animal i de calea de administrare. Alte nitrozamine cancerigene: 4-nitrodifenil, nitropirolidina, piperazine, piperidine. Un mare numr de observaii experimentale dovedesc c ADN este inta

critic n declanarea cancerigenitii.( BRUNING, FANN C.S., 1993, CALANCEA LEONIDA, 2002 Nitrozaminele pot fi ingerate odat cu alimentele, n produsele de origine animal fiind puse n eviden cantiti mari de compui nitrozo, ele rezult i endogen, n tubul digestiv i n stomac, prin dou mecanisme principale: a. printr-o reacie chimic ntre nitrii i amine n mediul acid al stomacului; b. prin activarea metabolic a unor microorganisme din intestin i cile urinare. Gravitatea efectelor negative ale nitrozaminelor impune ca element de baz n profilaxie, controlul de laborator periodic al apei, solului, furajelor i alimentelor privind coninutul n azotii, azotai, amine secundare i nitrozamine. ( SANDER J., 1974, CUCUIANU M., RUS H.G., NICULESCU D., VONICA A., 1995) 1.2. POLUAREA CU AZOTAI I AZOTII I IMPACTUL LOR N LANUL ALIMENTAR Plantele folosesc azotul sub forma ionilor de azotat (NO3-) i de amoniu ( NH4-), ns principala form ionic ntlnit de plante n sol este de azotat (NO3-). O parte din azotai este absorbit de ctre rdcinile plantelor i servete ca materie prim pentru sinteza proteinelor i a altor compui cu azot, iar alt parte este antrenat de apele de suprafa sau de cele care traverseaz solul, regsindu-se n apele curgtoare subterane i de suprafa. ( BERCA M., 2002) Cantitatea de azotai existent la un moment dat n plant este rezultatul bilanului dintre cantitatea absorbit i cea utilizat n proteinogenez. ( CUMPT SIMONA DIANA, BECEANU D., 2005) Cu mari efecte poluante n soluri este nu numai folosirea ngrmintelor minerale cu azot n supradoze, ci i utilizarea unilateral a aceluiai sortiment de ngrmnt mineral cu azot de sintez mai muli ani pe fondul celor organice bogate n azot care determin n timp acumulri n sol, adesea excesive de azot mineral, mai ales (N - NO3-). ( NIELSEN T., JORGENSEN H.E., LARSEN J.C., POULSEN M., 1996)

CAPITOLUL II. PREZENA AZOTAILOR I AZOTIILOR N UNELE PRODUSE ALIMENTARE DE ORIGINE ANIMAL I VEGETAL
2.1. AZOTAII I AZOTIII Azotaii i azotiii sunt componeni naturali ai solului provenind din mineralizarea substanelor organice azotoase de origine vegetal i animal. Mineralizarea azotului se datoreaz n primul rnd microorganismelor existente n sol n rile cu climat temperat, acest proces se desfoar cu maximum de intensitate n sezonul cald. Prin intermediul furajelor i al apei, azotaii i azotiii ajung i n organismul animalelor ale cror produse intr n alimentaia omului. Ambele categorii de substane mai sunt utilizate ca aditivi alimentari n preparate din carne i uneori n laptele destinat produciei de brnzeturi, pentru ameliorarea nsuirilor senzoriale i prelungirea duratei de pstrare. (BANCIU D., OARD M., 1964)) 2.2 CONINUTUL PRODUSELOR ALIMENTARE DE ORIGINE

ANIMAL N AZOTAI I AZOTII n preparatele din carne - unc, salamuri, crnai .a. azotaii i azotiii se utilizeaz n mod curent pentru meninerea culorii roz roie i pentru efectele lor bacteriostatice, antioxidante i de dezvoltare a aromei produselor. Pentru a difuza uniform n masa de carne, azotaii i azotiii se adaug de obicei n sarea uscat sau n saramur, de exemplu, 1 kg nitrat sau 0.5 kg nitrit la 100 kg sare. Sub influena florei reductoare din saramur i din carne, azotaii trec n azotii. Acetia oxideaz mioglobina i hemoglobina din resturile de snge n nitrozomioglobin i respectiv, nitrozohemoglobin, care i pstreaz culoare roie dup tratamentul termic. n lipsa lor, mezelurile fierte sau oprite ar avea culoare gri cenuie. Azotaii au i o evident aciune bacteriostatic- bactericid n special fa de bacteriile anaerobe n grupa crora intr i clostridiile. Prin acest efect se prelungete

durata de pstrare a preparatelor din carne i se face profilaxia botulismului. Sarea i ph-ul acid poteneaz efectul bacteriostatic. n ara noastr, concentraia azotiilor n produse finite este limitat la maximum 50 mg/kg, conform Ordinului nr.438 din 18 iunie 2002 emis de Ministerul Sntii i familiei. n multe alte ri se accept cantiti mai mari, care ajung pn la 200 mg/kg i chiar mai mult. Riscul formrii de nitrozamine a adus ns n actualitate problema revizuirii acestor norme, n sensul reducerii lor.

2.2.2 Coninutul laptelui i al produselor lactate n azotai i azotii

Coninutul laptelui n azotai este foarte redus. Azotiii de obicei lipsesc. Dup datele lui Walker, coninutul laptelui n azotai este cuprins ntre valorile de 20 i 40 mg azotat/l. Aceast variaie a datelor analitice att de pronunate, este determinat de natura furajelor consumate. (WALKER R., 1990) Brnzeturile au un coninut de azotai mult mai ridicat dect laptele. Nivelul azotiilor n brnzeturi dei nu pare a avea o semnificaie deosebit n unele brnzeturi maturate nitriii duc la formarea nitrozaminelor. Valoarea medie stabilit a fost de 2,4 ori mai mic ca a laptelui de la brnza proaspt de vaci, de circa 6,5 ori mai mic la caul din lapte de vac, de circa 10 ori mai mic la caul din lapte de oaie, de 1,4 ori mai mic n brnza telemea i de circa 2 ori mai mic la cacaval; (GU CAMELIA, SEMENIUC C., 2005) 2.2.3. Aciunea azotailor i azotiilor Din analiza acestor reacii rezulta urmtoarele: transformarea NaNO3 n NaNO2 are loc sub aciunea nitratreductazelor. Reducerea NaNO3 la NaNO2 este favorizat de temperaturi mai ridicate (10C), durata de srare mai mare (72 ore), ph mai mare de 5,8, nitritul este instabil n condiiile de mediu create de maturarea crnii, evoluia ionului NO2-, n funcie de ph-ul mediului fiind fundamental pentru formarea culorii, dac pH-ul este mai mare de 6,2 carne DFD azotitul este instabil i provoac oxidarea pigmenilor crnii la metmioglobin, dac pH = 5,6...6 nitritul este n echilibru cu NO i are loc formarea culorii rou aprins, specific crnii srate n prezena de azotai/azotii, dac pH mai mic de 5,6 carne PSE, azotitul dispare rapid din mediu formndu-se rapid NO volatil, culoarea crnii devenind rou pal; dac pH-ul este mai

mic dect 5,2 formarea de NO este inhibat. Cu ct cantitatea de substane reductoare este mai mare, cu att transformarea azotitului n NO este mai eficient. Creterea cantitii de substane reductoare din carne se face prin adaosul de acid ascorbic i al srurilor sale, de zaharuri reductoare. n cursul tratamentului termic, nitrozomioglobina este transformat n nitrozomiocromogen iar nitrozohemoglobina n nitrozohemocromogeni, compui mai stabili. Se consider ca 5-15% din azotitul adugat poate fi fixat de pigmenii crnii restul pierzndu-se n reacii secundare HNO2 se combin cu proteinele, cu aminoacizii, cu aminele, cu lipidele , etc. ( MUCETE D., 2005) Chiar dac se folosesc aceti aditivi n preparatele din carne este de dorit s se respecte valorile maxime admise, cauzele depirilor fiind multiple. Verificarea calitii produselor reprezint un imperativ al progresului, al satisfacerii nevoilor i cerinelor consumatorilor de pe piaa romneasc, innd cont totodat i de meninerea strii de sntate a consumatorilor prin lansarea pe pia a unor preparate i produse care s acopere valoarea nutritiv i asigurarea energiei indispensabile proceselor vitale, nu s se transforme n ageni nocivi care submineaz starea de sntate sau chiar ne mbolnvesc organismul. 2.3 AZOTAII I AZOTIII N UNELE PRODUSE VEGETAL Transformarea azotailor n azotii se face preponderent n rdcini i frunze. Cantitatea de azotai existent n plant la un moment dat este rezultatul bilanului dintre cantitatea absorbit i cea utilizat n proteinogenez. Orice factor susceptibil de a interveni n absorbie sau ntr-un punct oarecare al lanului metabolic, ce asigur transformarea azotului nitric n azot aminat i azot proteic, poate influena cantitatea de nitrai liberi din plant. Acumularea de azotai poate fi favorizat i de ali factori cum sunt: existena n plant a unor cantiti mici de nitratreductaz, aa cum se ntmpl la legumele din familiile Chenopodiaceae (spanac, sfecl, ridichi, .a.). i la Umbelliferae (morcov, mrar, ptrunjel, .a.), nsorirea slab, de exemplu plantele de ser, deoarece nu se asigur energia necesar reaciilor, carena n oligoelementele ce particip la DE ORIGINE

activitatea enzimelor reductoare de exemplu, insuficiena molibdenului i a altor elemente minerale care stimuleaz creterea plantelor.

CAPITOLUL III. NITROZAMINELE N UNELE PRODUSE DE ORIGINE VEGETAL I ANIMAL. EFECTELE NOCIVE ALE NITROZAMINELOR
n condiiile actuale de dotare cu o aparatur scump i performant a laboratoarelor medico-sanitare, cu gaz- cromatografe, de mare finee, a substanelor uor volatile cum sunt majoritatea nitrozaminelor, este greu de efectuat mereu n organismele vegetale, animale, n sol, atmosfer i n diferite produse alimentare. Pn n prezent, analizele efectuate, au fost axate n principal pe determinarea nitroso dimetil aminei NDMA, o nitrozoamin frecvent i puternic cancerigen. ntre coninutul de azotai i azotii n mediul de nutriie i coninutul produselor vegetale i animale n NDMA exist o strns corelaie. Pe baza acestor date i prin interpolare, sa apreciat coninutul la unele produse vegetale i animaliere, n funcie de coninutul lor n azotai. S-a semnalat adeseori c pe solurile foarte bogate n azotai i azotii unele plante pot s conin cantiti relativ reduse de NDMA. 3.1 DEFINIRE I CLASIFICARE Nitrozaminele se formeaz n organism la nivelul tubului digestiv din azotiii ingerai ori din azotaii ingerai i descompui n azotii i aminele secundare prezente n diverse alimente. n stomac nitrozaminele se formeaz n mediul acid i n prezena grupelor amidice, fenolice i a celor sulfhidrice. 3.2 SINTEZA NITROZAMINELOR Nitrozaminele se formeaz din amine secundare, teriare i cuaternare, dup reacia general menionat de Langes. Un efect important de inhibare a aciunii compuilor NA l prezint i antioxidanii butilhidroxianisolul BHA, butilhidroxitoluolul BHT i alii, folosii n industria alimentar. Mecanismul de aciune a acestora este necunoscut. Se pare c ei acioneaz asupra activitii unor enzime care metabolizeaz substanele cancerigene. Substanele de inhibare a dezvoltrii microorganismelor conservanii, antibioticele reduc indirect coninutul de NA prin prevenirea acumulrii de amine. 3.3 FORMAREA ENDOGEN A NITROZAMINELOR

n organismul omului i al animalelor, formarea nitrozaminelor poate avea loc n tubul digestiv i n cile urinare, prin dou mecanisme principale: printr-o reacie chimic ntre azotii i amine n mediul acid al stomacului, sau prin activitatea metabolic a unor microorganisme din intestin i din cile urinare. 3.4 FACTORII CARE INFLUENEAZ FORMAREA NITROZAMINELOR Viteza de nitrozare depinde de aciditatea mediului, bazicitatea aminelor, concentraia participanilor i temperatur. La formarea nitrozaminelor pot participa amine secundare, teriare i cuaternare. Reacia de nitrozare in vitro i in vivo decurge cel mai intens n mediul acid, dar n anumite condiii se formeaz nitrozamine i la un pH apropiat de 7. Pentru aminele secundare, pH-ul optim de nitrozare este situat ntre 2,5 i 3,5 i n majoritatea cazurilor, viteza reaciei este proporional cu ptratul concentraiei de azotit. Aminele teriare, la pH de 3-6 i la 37C, interacioneaz, de asemenea, cu azotiii formnd nitrozamine. 3.8 CONINUTUL PRODUSELOR ANIMALIERE N NITROZAMINE Coninutul unor produse animaliere n NDMA ,NPYR de pe pieele i magazinele din Romnia a fost obiectul unor vaste cercetri efectuate de ctre Popa[12]. Astfel au fost detectate n crnai, unc i n alte produse asemntoare, n cantiti extrem de reduse sau chiar nedetectabile. n crnatul polonez i n unca de Praga de asemenea nu au fost detectate nitrozamine. Cea mai mare cantitate de NDMA i Npirolidin, de 3-5 g NDMA i Npirolidin s-a gsit n muchi file. n salamul afumat au fost gsite cantiti maxime cuprinse ntre 3 i 5 g NDMA i NPYR/kg. La majoritatea produselor din aceast categorie, nitrozaminele nu au fost detectate. n salamul de Sibiu, nitrozaminele nu au fost detectate. La bacon, nitrozaminele n majoritatea probelor analizate nu au fost detectate. Dar n puine probe ele au prezentat doar urme. Chiar dac studiile de laborator au artat c exist posibilitatea formrii nitrozaminelor, nu exist nici un studiu epidemiologie care s precizeze cu siguran legtura dintre cancer i consumul de spanac, cu sau fr pete. Probabil una din cauza neexistenei nici unui astfel de studiu este coninutul ridicat a vitaminei C din spanac,

care joac rol anticancerigen. De asemenea, vitamina C mpiedic formarea azotiilor i deci a nitrozaminelor. 3.9 ACIUNEA TOXIC A NITROZAMINELOR Aciunea cancerigen este explicat prin mai multe mecanisme, cea mai plauzibil fiind ipoteza alchilrii. Nitrozaminele sunt supuse unui proces de activare metabolic printr-o ARN. reacie de alchilare cu formare de alfa-hidroxinitrozamin. Agentul alchilant final este diazoalcanul, care alchileaz sediile nucleofile ale ADN i

CAPITOLUL IV. ORGANIZAREA CERCETRILOR

Scopul propus n cercetarea noastr este lrgirea sferei cunoaterii pentru o perioad determinat cu date referitoare la nivelul azotiilor i azotailor n unele produse de origine animal i vegetal din zona Bihor avnd n vedere faptul c acetia intr n lanul trofic alimentar; evaluarea acestor compui privind limita maxim admis (LMA) pentru protecia consumatorilor i indicarea depirii limitelor tolerabile din unele produse; iniierea evalurii nivelului de nitrozamine volatile din unele produse care se comercializeaz n zona studiat; monitorizarea nivelului de contaminani i relaionarea lor cu aspectele legate de protecia i sigurana consumatorilor. Conform reglementrilor prevzute de Comisia European, legislaia actual vizeaz reducerea nivelurilor autorizate de azotai i azotii din produsele din came i se impune monitorizarea riscului de poluare chimic a alimentului i aprecierea ingestei acestui contaminant prin alimentele consumate. n baza datelor obinute din efectuarea analizelor chimice, este evaluat aportul alimentar de substane chimice ingerate prin alimente. Obiectivele cercetrii noastre n privina incidenei azotailor, azotiilor i nitrozaminelor n unele produse alimentare de origine animal i vegetal sunt urmtoarele: 4.1.1. Incidena azotailor i nitriilor n unele produse alimentare de origine animal.

10

4.1.1.1.Incidena azotailor i azotiilor n carne, preparate din carne, usturoi i condimente. 4.1.1.2. Incidena azotailor i nitriilor n apa folosit la obinerea bradtului. 4.1.1.3. Incidena azotailor i nitriilor n lapte i produse lactate. 4.1.2. Incidena azotailor i azotiilor n unele produse alimentare de origine vegetal. 4.1.3. Incidena nitrozaminelor n unele produse alimentare de origine animal.

4.3 MATERIALE I METODE

4.3.1. MATERIALE Pentru a aprecia incidena azotailor, azotiilor i nitrozaminelor n produsele alimentare de origine animal i vegetal n perioada anilor 2007 2011 obinute i procesate n judeul Bihor, s-au efectuat analize fizico chimice, conform metodologiei standardizate, pe 1785 probe carne (vit, porc, oaie, pasre); 4360 probe preparate din carne (salamuri, tobe, specialiti, conserve din carne de pete, pateuri, crnai, pastram); condimente 50 de probe; ap folosit la prepararea bradtului; lapte i produse lactate 883 probe; produse de origine vegetal 4284 probe. Determinrile de calitate au fost efectuate n laboratoarele Facultii de Protecia Mediului din Oradea Laboratorul de Control Alimente, Laboratorul de Control pe Flux Tehnologic i Analiza Riscurilor n Industria Alimentar, ncepnd cu anul 2007. Prelevarea probelor fiind efectuat cu ajutorul logistic al Direciei Sanitar Veterinare Bihor i Direcia de Sntate Public Bihor n baza conveniilor de colaborare existente cu Facultatea de Protecia Mediului din Oradea. Prelevarea, transportul i conservarea probelor au fost asigurate de ctre Direciei Sanitar Veterinare Bihor. Analiza probelor au fost efectuate de ctre doctorand conform metodologiei de cerecetare instituite i a metodelor de determinare prezentate n extenso n lucrare.

11

Tabelul/Table 4.1. Metodele STAS pentru deteminrile de azotii i azotai din alimente STAS determinations methods for nitrite and nitrate in foodstuffs Azotit, azotat Nitrite, nitrate Mezeluri Sausages Conserve, legume, fructe, meniuri Preserves, vegetables, fruits, menus Lactate Dairy Preparate din carne Meat products Ap Water 4.3.2. METODE DE DETERMINARE 4.3.2.1.Determinarea azotailor i azotiilor din carne, preparate din carne, condimente i usturoi 4.3.2.1.1. Determinarea azotailor din carne, preparate din carne, condimente i usturoi 4.3.2.1.2. Determinarea azotiilor din carne, preparate din carne, condimente i usturoi Pentru aceste produse s-a folosit metoda colorimetric cu M-xilenol n care azotaii i azotiii sunt determinai ca azotat total, iar azotiii se determin separat prin metoda Griess. Coninutul de azotai din produs se calculeaz prin diferena ntre azotaii totali determinai i azotii gsii i experimentai n echivalent de azotai SRISO - 26777/2002 SREN 1214 3/2005 STAS 10314 84 STAS 11581 83 STAS 9065/9-74 Metoda

12

Cea mai folosit metod de determinare a azotiilor este metoda Greiss, care este recunoscut ca metod de referin. Principiul metodei se bazeaz pe faptul c n mediu acid, azotiii se combin cu o amin aromatic primar, cu care formeaz o sare de diazoniu. Condensarea acestei sri de diazoniu sau cuplarea ei cu o alt amin aromatic primar duce la formarea unui complex colorat supus legii Lambert-Beer. Deci azotiii se vor putea determina colorimetric la fotocolorimetru sau spectrocolorimetru. 4.2.2 Determinarea azotailor i nitriilor n apa folosit la obinerea bradtului n acest context, pentru determinrile azotailor din apa rcit folosit la formarea bradtului s-a folosit metoda spectrocolorimetric, descris de Bianu i Nica(1998), ca metod omologat i acceptat n practica determinrilor de laborator din ar. 4.2.3 Determinarea azotailor i azotiilor din lapte i produse lactate Pentru lapte i produsele lactate s-a folosit metoda cu reducere pe coloan de cadmiu, iar exprimarea s-a fcut n ioni de NO-3 i NO-2. 4.2.4. Determinarea azotailor i azotiilor din unele produse alimentare de origine vegetal Pentru aceste produse s-a folosit metoda colorimetric cu M-xilenol n care azotaii i azotiii sunt determinai ca azotat total, iar azotiii se determin separat prin metoda Griess. Coninutul de azotai din produs se calculeaz prin diferena ntre azotaii totali determinai i azotii gsii i experimentai n echivalent de azotai. 4.2.5. Determinarea nitrozamine din unele produse de origine animal Nitrozaminele volatile ( NDMA, NDEA, NPYR) s-au determinat din 6 probe din preparate carne (salam de Sibiu, salam Bnean) i 6 probe de brnzeturi (brnz telemea i cacaval afumat) prin metoda cromatografic confirmat prin spectrofotometrie de mas. 4.4 PRELUCRAREA STATISTIC A DATELOR n procesul de prelucrare statistic a datelor s-au folosit un numr de trei teste: Testul statistic t; Testul de normalitate Anderson-Darling;

13

 Testul de permutri randomizate Monte-Carlo; Testul statistic t aplicat n aceast lucrare este cel pentru un eantion mic. Valoarea medie a eantionului este testat fa de valoare a LMA (limita medie admis). Acest tip de test se numete testul t pentru un singur eantion. Tabelul 4.2 Exemplificarea cazului de statistic t n care concluzia arat c valorile medii anuale de azotii sunt nesemnificativ egale fa de LMA.
TestultpentruvaloareaLMA
Datedeintrare An C LMA Statisticadescriptiva 2007 4.63 5.000 2008 5.35 2009 5.4 2010 5.5 2011 4.7

Limitasuperioara Limitainferioara ICpt95% ICpt.95% Media SD SEM N 5.116 0.416 0.186 4.600 5.632 5 Rezultateletestuluistatistic H0:Media=LMA Ha:MD<>LMA Ha:MD<LMA Ha:MD>LMA DF T T<> T< T> P<> P< P> 4 0.624 2.776 2.132 2.132 0.567 0.717 0.283 Decizie: SeACCEPTAipotezaH0,laniveluldesemnificatiestatisticade0,05. Concluzie: MddeiavalorilortestateesteNESEMNIFICATIVdiferitadevaloareaLMA.

alfa 0.050

Statistica testului de normalitate Anderson-Darling Datele analizate statistic n acesat lucrare reprezint valorile medii anuale pentru nitrai i nitrii determinate din diferite produse alimentare. Procesele biochimice ce nsoesc producerea acestora genereaz o distribuie normal sau nu n decursul timpului. Cu alte cuvinte unele serii de timp ale valorilor medii anuale de nitrai i nitrii survin din procese aleatoare, stochastice sau deterministe (n acest caz au caracter cumulativ n timp).

14

Tabelul 4.3 Exemplu de rezultate ale testului de normalitate Anderson-Darling.

TestulAndersonDarlingpentrudistributienormalaadatelordeintrare
Rezultateteststatistic 5 1 2 3 4 C 2.12 2.8 3.8 3.5 4.4 Csortat 2.12 2.8 3.5 3.8 4.4 Pnorm 0.0871 0.2771 0.5787 0.7045 0.8877 Probabilitateacumulatadistribuitanormal,inversa 1.2816 0.5244 0.0000 0.5244 1.2816 S AD AD* P ADcritic alfa 5.161 0.1614 0.2002 0.8838 0.787 0.050 Rezultateregresieliniaradingraficuldeprobabilitatenormala panta 0.8987 termenulliber 3.3240 R2 0.9865 Decizie: SeACCEPTAipotezaH0,laniveluldesemnificatiestatisticade0,05. Concluzie: DistributiadateloresteNORMALA.

Statistica testului de permutri randomizate Monte-Carlo

6 5

y=0.8987x +3.3240 R=0.9865

Valoriledeintrare

4 3 2 1 0 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 Probabilitatilenormale

Figura 4.1 Graficul probabilitilor normale pentru exemplul din tabelul 4.3.

15

Statistica testului Wilcoxon Testul Wilcoxon utilizat n aceast lucrarare este varianta non-parametric a testului t prezentat anterior. Condiiile de aplicare sunt: distribuia valorilor testate nu este normal, dar diferenele dintre aceste valori i valoarea LMA sunt distribuite normal. n esen, acest test se bazeaz pe faptul c rancurile cu semn ale diferenelor dintre valorile mediilor anuale i valoarea LMA sunt testate statictic cu testul z, pe baza valorilor statisticii W calculate i cele prescrise ale mediei i varianei acesteia (tabelul 4.5). Tabelul 4.5 Exemplu de rezultate ale testului Wilcoxon.
Testul Wilcoxon pentru valoarea LMA Statistica descriptiva
Diferentele in valoare absoluta Rancurile diferentelor Rancurile cu semn ale diferentelor Rancurile cu semn pozitiv Rancurile cu semn negativ

LMA

Diferentele

16.080 14.900 25.050 15.500 13.050 Mediana 15.500 Sum 84.580 Media 16.916 SD 4.687 SEM 2.096 Rezultatele testului statistic N Statistica W

5.000

5.000 5.000

11.080 9.900 20.050 10.500 8.050 11.916 59.580 11.916 4.687 2.096

11.080 9.900 20.050 10.500 8.050

4.0 2.0 5.0 3.0 1.0 Statistica rancurilor Rancuri "+" Rancuri "-" Rancuri 0 Ha:MD<>LMA P<> 0.0431

4.0 2.0 5.0 3.0 1.0

4.0 2.0 5.0 3.0 1.0

0.0 0.0 0.0 0.0 0.0

Media W prescrisa

SD_W

H0:Media=LMA Statistica z pentru W

Suma Nr 15.0 5 0.0 0 0.0 0 Ha:MD<LMA Ha:MD>LMA P< 0.9784 P> 0.0216 P critic 0.05

5 15.000 7.500 3.7081 2.0226 Decizie NUseACCEPTAipotezaH0,laniveluldesemnificatiestatisticade0,05. Concluzie MediavalorilortestateesteSEMNIFICATIVMAIMAREdecatLMA.

CAPITOLUL VI.CONCLUZII GENERALE I RECOMANDRI

6.1. CONCLUZII GENERALE n urma studiului ntreprins cu privire la nivelul rezidual de azotai, azotii i nitrozamine n unele produse alimentare de origine animal i vegetale la nivelul unei structuri regionale ne-a permis evidenierea de concluzii care reflect nivelul i dinamica contaminanilor precum i msuri corective i preventive de aplicat n perioada 2007-2011:

16

1.

n probele de carne luate n studiu nivelul coninutului de azotaii prezint

valori medii de 9,0 mg % la carnea de vac, de 9,3 mg % la carnea de oaie; de 13,3 mg % la carnea de porc i 12,9 mg % la carnea de pasre. Coninutul mediu de azotii reziduali este de 0,42 mg % la carnea de vac; 0,57 mg % la carnea de porc ; 0,36 mg % la carnea de oaie i de 0,45 mg % la carnea de pasre. 2. La preparatele din carne, coninutul mediu de azotai pe ntreaga perioad (2007 - 2011) variaz ntre 10,1 - 14,1 mg % la prospturi; 12,5 - 19,9 mg % la preparate din carne semiafumate; 10,6 - 16,0 mg % la salamurile de durat; 12,1 - 18,2 mg % la pastram; 15,5 - 20, 7mg % la afumturi; 14,2 - 19,40 mg % la specialiti din carne srat i afumat, 15,2 - 18,6 mg % la conserve din carne de vit i porc n suc propriu; 11,0 - 20,7 mg % la crnai; 12,4 - 32,4 mg % la pete srat i afumat; 13,616,9 mg % la conservele de pete. 3. Coninutul de azotii variaz ntre 4,63 - 6,63 mg % la prospturi; 4,5 7,0 mg % la produsele semiafumate; 5,55 - 8,4 mg % la salamurile de durat; 5,0 15,0 mg % la pastram; 5,1-5,8 mg % la afumturi, 3,8-6,21 mg % la specialiti din carne srat i afumat; 4,2 - 7,3 mg % la conserve n suc propriu din carne de vit i porc; 3,12 - 6,6 mg % la crnai; 3,8 - 5,9 mg % la petele srat i afumat; 4,9 5,35 mg % la conservele de pete n ulei. Depiri ale limitei maxime admise se gsesc la salamurile de durat, la salamurile semiafumate, la pastram, la specialiti. Aceste depiri sunt sub 10 mg % n toate cazurile. 4. Analiza coninutului de azotai n apa folosit la obinerea bradtului evideniaz valori de 2,3 - 24,5 mg %. Media concentraiei de nitrii pe an variaz ntre 7,70-14,10 mg%, iar valoarea medie pe ntrega perioad este de 9,76 mg %. Analiza datelor primare a scos n eviden faptul c 90% din probe a avut un coninut sub 10 mg % azotai. Limita maxim admis la ap este de 50 mg azotai/l de ap. 5. Coninutul de azotai n amestecul de condimente i usturoi are valori medii de 67,35 mg % n usturoi i 3,7 mg % n condimente, iar coninutul de nitrii este de 2,5 mg % la usturoi i 0,2 mg % la condimente. 6. n produsele de origine animal, dei prin standardele de ramur, ncepnd cu anul 1994, s-a recomandat limitarea utilizrii azotatului doar la salamuri crude, uscate acesta s-a folosit n continuare n toate tipurile de mezeluri, productorii

17

nerenunnd din obinuin la utilizarea lui pn la sfritul anilor 1990. Pe pia a aprut amestecurile condimentare n industria crnii, care cuprind i azotii n compoziie. Datorit acestui fapt a fost posibil limitarea folosirii azotatului n industria crnii. 7. Cercetarea noastr arat c valorile medii de azotii n arealul de studiu se ncadreaz n general n valorile admise de norme. Doar n proporie de 2% din probe s-au constat valori maxime de 1,3 - 1,7 ori mai mari dect cele admise de norme la sortimentele de salam, parizer, cremvurti, pastram, ceea ce indic faptul c productorii nu lucreaz totdeauna n baza unor proceduri care s elimine acest risc. Sau evideniat azotii i n produsele de carne timp prospturi (tob), n care este interzis utilizarea azotiilor. 8. Coninutul de azotai n laptele proaspt este de 2,42 mg/l, iar cel de azotii de 0,06 mg/l; n laptele pasteurizat coninutul de azotai are valoarea medie de 2,42 mg/l, iar coninutul de azotii are valoarea medie de 0,08 mg/l. Coninutul mediu de azotii pe an variaz ntre 0,075 - 0,090 mg/l; n laptele reconstituit coninutul de azotai are valoarea medie de 2,04 mg/l; iar coninutul mediu de azotai pe an variaz ntre 1,90 - 2,20 mg/l. Coninutul mediu de azotii pe an variaz ntre 0,096 - 0,125 mg/l. 10. n laptele de oaie coninutul de azotai are valoarea medie de 12,12mg/l, iar coninutul de azotii are o valoare medie 0,65 mg/l. Valorile obinute sunt mult sub limita maxim admis. 11. n iaurt coninutul de azotii are valoarea medie de 0,057 mg/l, n smntn, coninutul mediu de azotii variaz ntre 0,054 - 0,064 mg/l, cu o valoare medie de 0,050 mg/l. 12. n brnza proaspt de vac coninutul de azotii are valoarea medie de 0,026mg/ %. Valorile obinute sunt mult sub limita maxim admis. Brnza telemea de vac are coninutul de azotai la o valoare medie de 3,06 mg/ %, iar coninutul de azotii are o valoare medie de 0,044 mg/ %. n probele de cacaval coninutul mediu de azotii este de 0,0326 mg/ %; n brnza Moeciu coninutul mediu de azotai este de 3,81 mg/ %, iar cel de azotii de 0,032 mg/ %; n brnza Olanda coninutul mediu de azotii este de 0,032 mg/ %. Scderea coninutului de azotai n brnzeturi fa de cel

18

din lapte se poate datora trecerii unei prii de azotai n zer i metabolizrii altei pri de ctre microorganisme n timpul maturrii brnzeturilor. 13. n produsele vegetale coninutul de azotai are o valoare medie pe perioada analizat de 37,0 mg %, la conopid; 87,2 mg % la castravei, 27,8 mg % la roii, 26,12mg % la spanac; 65,88 mg % la salata verde, 15,77 mg % la tarhon, 11,60 mg % la coriandru, 10,20 mg % la cimbru; 34,06 mg % la morcov; 39, 65mg % la varz alb; 28,7 mg % la varza roie; 40,07 mg % la ardei; 69,4 mg % la cartofi, 55,9 mg % la ceap; 78,80 mg % la ridichi. Valorile obinute sunt sub limita maxim admis. La restul produselor vegetale luate n studiu, coninutul de azotai este la valori asemntoare cu cele menionate mai sus 14. Coninutul de azotii este de 4,7 mg % la conopid, 2,67 mg % la castravei, 3,59mg % la roii; 4,69 mg % la spanac; 6,19 mg % la salata verde; 7,14 mg% la tarhon; 10,6 mg % la coriandru; 6,7 mg % la cimbru; 6,08 mg % la morcov; 4,65 mg % la varza alb, 4,72 mg % la varza roie; 5,30 mg % la elin; 10,5 mg % la ardei; 12,9 mg % la cartofi; 5,97 mg % la ceap i 4,32 mg % la ridichi. Valorile obinute sunt sub 7 mg % cu excepia probelor de ardei i cartofi la care aceste valori depesc 7mg % ajungnd la 10,5 - 12,9 mg %. 15. Examenul pentru determinarea nitrozaminelor evideniaz n produsele de carne studitae (salam Bnean i salam de Sibiu) prezena nitrozodimetilaminei (NDMA) i a nitrozodietilaminei (NDEA), la valori medii 0,100-0,113 m/kg (NDMA) i 0,04 - 0,085 m/kg pentru NDEA. NPYR nu s-a decelat n probele de salam. 16. La brnzeturi coninutul din aceste nitrozamine au avut valori sub limita maxim admis (LMA). n probele de brnz telemea i cacaval afumat s-au evideniat toate cele 3 tipuri de nitrozamine: NDMA, NDEA, NPYR, la valori de 0,03 - 0,085 m/kg n cazul NDMA; 0,01 - 0,034 m/kg pentru NDEA i ),015 - 0,04 m/kg pentru NPYR. 17. Azotiii, azotaii i nitrozaminele reziduale n produsele analizate nu s-au dovedit a fi n cantiti care ar putea induce stri morbide la consumatori.

19

6.2 RECOMANDRI Investigaiile ntreprinse de noi pe parcursul celor cinci ani experimentali (2007 - 2011) ne ndreptesc s facem cteva recomandri pentru fiecare contaminant n parte: 1. Pentru azotai se recomand: - limitarea strict a folosirii lor numai la produse din carne afumate; pentru lapte se propune ca LMA s fie de 10 ppm NO3-; 2. Pentru azotiii din produsele la care relativ s-au ntlnit depiri ale LMA propunem : - meninerea monitorizrii n continuare n produsele din carne; - nsprirea msurilor de control, corective i preventive n unitile de procesare n vederea ncadrrii n cerinele referenialului; 3. Pentru nitrozamine, ca substane cancerigene recomandm: - utilizarea de laboratoare capabile s determine nitrozaminele la limitele reale de contaminare; - realizarea de studii mai aprofundate asupra nivelelor de nitrozamine din produse alimentare supuse unor maturri mai ndelungate.

20

BIBLIOGRAFIE SELECTIV 1. Ahmad Imtiaz, 1994, Accumulation of nitrate and nitrite in foods of plant origin, Instiute of Chemistry/University of the Punjab, Pakistan Research Repository, Tez de doctorat, avaible on-line at. http://eprints.hec.gov.pk/1612/1/1490.HTM.; 2. Allison C.D., 1998, Nitrate Poisoning of Livestock, New Mexico State University, Extension Publication B-807; 3. Andrae John, 2008 , Defining and Managing Nitrates in Forages, Forage Leaflet 13, The Clemson University Cooperative Extension Service; 4. Ardelean M., 2005, Metodologia elaborrii tezelor de doctorat, Editura Academic Pres, Cluj-Napoca; 5. Apostu S. , 2004 , Managementul calitii alimentelor, Editura Risoprint, Cluj Napoca; 6. Banu, C, .a., 1998 , Manualul inginerului de industrie alimentar, Ed. Tehnic, Bucureti; 7. Bosch M, Bosch N., Garcia Mata M. , 1990 , Nitrate and nitrite contents in reconstitued food stuffs. 8. Bosgiraud C. i colab, 1991 Etude epidemiologique de la distribution des especes deListeria et des serotypes de Listeria monocytogenes en pathologie humanine, animale et dans les aliments, Rev Med. Vet.142, 6, 463-468; 9. Brad, S., Rodica Segal , 1991, Tehnologia produselor alimentare de protecie, Ed. Ceres, Bucureti; 10. Castelani A.G., Niven C. Jr. , 1955, Factors affecting the bacteriostatic action of sodium nitric. Appl. Microbiology 11. Chi Adriana, Bara V., 2005, Metode de laborator pentru identificarea i dozarea rezidurilor de pesticide din ap i sol, Fascicula: Protecia Mediului, Vol X, Anul 10, Editura Universitii din Oradea;

21

12. Crowley JW, 1985, Effects of Nitrate on Livestock, American Society of Agricultural Engineers, Paper Number 80-20026; 13. Cucuianu M., Rus H.G., Niculescu D., Vonica A. , 1995, Biochimie. Aplicaii clinice, Editura Dacia, Cluj-Napoca; 14. Cumpt Simona Diana, Beceanu D., 2005, Nitraii i nitriii, surse de poluare a alimentelor de origine vegetal, Lucrri tiinifice USAMV Iai, Seria Horticultur,anul XLVIII(48), p.519-524, Editura Ion Ionescu de la Brad, Iai; 15. Fusari A., Ubaldi A., Zannetti G., Schianchi M. ,1995 , Intossicatione da nitrate e qualita del latte, Annali de la Facolta de Med. Veterinaria di Parma; 16. Garner G.B., Pfander W.H.,Smith G.E., Case A.A.., 1993, Nature and History of the Nitrate Problem, University of Missouri Extension; 17. Hura, Carmen , 2005, Contaminarea chimic a alimentelor n Romnia, 2004, Ed. Cernii, Iai; 18. Iacub, G.G., 1991, Intoxicarea animalelor cu plante furajere i otrvuri, Editura Cartea Moldoveneasc, Chiinu; 19. Minea S., ueanu E., Alifanti E., Botha V. , 2000, Aspecte privind poluarea chimic a unor crnuri materie prim, Revista Romn de Medicin Veterinar. 20. Mitrnescu Elena, Savu C., 1998, Din riscurile polurii mediului i alimentelor, Editura MAST, Bucureti; 21. Prvu G., Costea Mihaela, Prvu Marius, Nicolae B., 2003, Tratat de nutriia animalelor, Editura CORAL SANIVET, Bucureti; 22. Pinkerton B.W., Understander D.J., Wright R.E., 1998, Nitrate poisoning, Forage Leaflet 13, the Clemson University Cooperative Extension Service; 23. Popa, G., Dumitrache S., Apostol C, Brad S., Rodica Segal, Teodoru V., 1986, Toxicologia produselor alimentare, Ed. Academiei Romne, Bucureti; 24. Stnescu V., Apostu S. , 2010, Igiena, inspecia i sigurana alimentelor de origine animal, Editura Risoprint, Vol. I, Cluj- Napoca; 25. Trif Alexandrina, Gherdan A., Prvu D., Pdeanu I., Pcurar M. ,1986, Cercetri privind coninutul n azotai i azotiii din snge i lapte. Lucr. t. I.A., Timioara;

22

26. Trif A. Curtui V., Milovan Gh., Prvu D., Cpn C., Baicu D. , 1994, Rezidual nitrates and nitrites in pasteurized milk, yoghourt and green cheese preparted from milk with nitrat content over the tolerated limits, Lucrare t. USAB, Timioara; 27. Ovat M., Bara V. , 2010 , Research on the residual level of nitrates in some cheese products, Analele Universitii din Oradea, Fascicula Ecotoxicologie, Zootehnie i tehnologii de industrie alimentar, Vol. IX, Anul 9, Editura Universitii din Oradea; 28. Ovat M., Bara V. , 2010, Research on the residual level of nitrates of smoked products, lasting salami, bacon, Analele Universitii din Oradea, Fascicula Ecotoxicologie, Zootehnie i tehnologii de industrie alimentar, Vol. IX, Anul 9, Editura Universitii din Oradea; 29. Ovat M., Bara V. , 2010, Research on the residual level of nitrates of the meat of certain butcher animals, Analele Universitii din Oradea, Fascicula Ecotoxicologie, Zootehnie i tehnologii de industrie alimentar, Vol. IX, Anul 9, Editura Universitii din Oradea; 30. Ovat M., Bara V. , 2010, Research on the residual level of nitrates contents in milk and some diary products, Analele Universitii din Oradea, Fascicula Ecotoxicologie, Zootehnie i tehnologii de industrie alimentar, Vol. IX, Anul 9, Editura Universitii din Oradea.

23