MODELAREA ENZIMELOR

CARBAPENEMAZELOR
PRIN DOCARE MOLECULAR I
QM/MM
PROIECT DE CERCETARE
C O O R D O N ATO R : P RO F. DR. DAN FLORIN

M IH ILESCU

N D R U M T O R : A S I S . D R . C A L B O R E A N O C TAVI A N
D R G H I C E A N U AN D R E I

I. SCOPUL STUDIULUI
Patogenii care produc carbapenemaze sunt cauza unor infecii foarte dificil de
tratat, cu rate de mortalitate foarte ridicate, din cauza structurii lor multi-medicament
rezistente (MDR). Fcnd studii cu -lactamaze i carbapenemaze vom optimiza n
mod direct maniera de tratarea al acestor infecii. Modelarea molecular poate fi un aliat
puternic, care ne poate ajuta s gsim noi metode de a lupta mpotriva acestor patogeni.

II. CARBAPENEMAZELE
carbapenemazele sunt enzime carbapenem-inactivante care se
clasific n clasele A, B, C i D (Palzkill T. 2013).
clasa B (metalo--lactamazelor, MBL) include enzimele
plasmidiale SPM, GIM, AIM, IMP i NDM-1 (metalo-lactamaza New Delhi). NDM-1 este probabil cel mai periculos
factor de rezistena la carbapeneme, putnd inactiva prin
hidroliz practic toate carbapenemele, precum i alte antibiotice
-lactamice (Palzkill T. 2013).

III. ANTIBIOTICELE LACTAMICE

exist sute de compui -lactamici distinci i acetia sunt bazai pe clasificri n

funcie de structur. Medicamentele -lactamice clinic importante includ
penicilinele, cefalosporinele, carbapenemele i monobactamicele (Palzkill T. 2013).
penicilinele i cefalosporinele conin un inel -lactamic legat de inele cu cinci i
ase membri, respectiv, care conin un grup carboxil la pozi iile C3 i C4. Ca i
grup, aceste antibiotice arat o gam larg de activitate asupra bacteriilor Grampostive i Gram-negative (Palzkill T. 2013).
monobactamii, nu conin un sistem legat de inele i constau ntr-un grup de
medicamente -lactamice cu o legatur de acid sulfonic ntr-o pozi ie analog
grupului gsit la peniciline i cefalosporine. Medicamentele monobactamice sunt
active mpotriva patogenilor Gram-negativ aerobi (Palzkill T. 2013).

IV. REZISTENA LA ANTIBIOTICE

bacteriile Gram-negative (GNB) sunt patogeni periculoi recunoscui pentru
rezistena lor la toate clasele de antibiotice. GNB pot determina mai muli factori de
rezistena, genernd fenotipuri complexe de rezisten a de tipul multidrog rezistent
(MDR) sau pandrog rezistent (PDR). Mai multe bacterii Gram-negative
nonfermentative (ex. Acinetobacter) la fel ca i Enterobacteriaceele (ex. Klebsiella) i
bacteriile Gram-pozitive (ex. Staphylococcus, Streptococcus) sunt sau devin din ce n ce
mai rezistente la majoritatea tratamentelor bazate pe carbapeneme. Acest lucru este o
ameninare ctre sntatea public i devine o problem extraordinar de grav (PappWallace, i alii 2011). n consecina devine o mare provocare i pentru antibioterapie i
pentru ntoarcerea la perioada pre-antibiotic.

mecanismele de rezisten ale carbapenemazelor includ producerea de -lactamaze,

pompe de eflux i mutaii care altereaz expresia i/sau func ia porinelor i a PBP
(Mena 2006).

V. METALLO-BETA-LACTAMAZE
metallo-beta-lactamazele (MBL) sunt caracterizate de abilitatea lor
de a hidroliza carbapeneme, cefalosporine i peniciline (dar nu
aztreonam) i prin rezistena lor la inhibitori de -lactamaze de pe pia
dei susceptibili inhibrii de ctre chelatorii de ioni metalici.
exist trei subclase de MBL:

B1, cu doi ioni de zinc n situsul catalitic (NDM-1, VIM-1-13, CcrA, etc.).
B2, doar cu un singur ion de zinc n situsul catalitic.
B3, cu doi ioni de zinc n situsul catalitic.
genele MBL sunt localizate n cromozomi, plasmide i integroni .

VI. MECANISMUL CATALITIC AL

NDM-1
NDM-1 este o MBL plasimidial
care poate hidroliza eficient aproape
toate antibioticele beta-lactamice. Este
considerate cel mai periculos factor de
rezistena n faa carbapenemelor.
Aceast enzima este un monomer cu
270 de amino-acizi cu doi ioni de zinc
n situsurile din despicatura catalitic.

Figura 3. K. Zhu et. al. "A quantum mechanics/molecular mechanics study

on the hydrolysis mechanism of New Delhi metallo-b-lactamase-1" J Comput Aided Mol
Des (2013) 27:247256; DOI 10.1007/s10822-012-9630-6

VII. COMPARAREA STRUCTURILOR

structurile NDM-1: 3SPU albastru; 3SFP rou;
4HL2 portocaliu.
tripleta de histidine leag Zn1 (sferele din stnga).
tripleta format din D124, C208, H250 se leag la
Zn2 (sferele din dreapta).
ionii de HO- i moleculele de ap legate de Zn2 n
3SPU (CPK).
distana dintre Zn1-Zn2 este mai mare n 4HL2 dect
n 3SPU.

VIII. CARBAPENEMELE
carbapenemele posed un spectru larg foarte puternic de activitate mpotriva
patogenilor Gram-pozitivi i Gram-negativi i sunt un grup esenial de antibiotice
pentru tratarea infeciilor cauzate de bacterii multi-medicament rezistente
(Palzkill T. 2013).
carbapenemele sunt formate dintr-un inel -lactamic legat de un inel cu cinci
membri din clasa penicilinei care are nlocuit atomul de sulf din poziia 1 cu un
carbon i de asemenea conine legtur dubla ntre C-2 i C-3 (Palzkill T. 2013).
o caracteristic important a carbapenemelor este rezistena la inactivare de
ctre -lactamaze (Palzkill T. 2013).

VIII. CARBAPENEMELE
carbapenemele au artat c au un spectru mai larg antimicrobial in vitro dect
toate celelalte antibiotice atestate, cum ar fi: penicilinele, cefalosporinele i lactamicele i alte combinaii de inhibitori de -lactamaze (Bassetti 2009).
n general imipenem, panipenem, i doripenem sunt antibiotice puternice n faa
bacteriilor Gram-pozitive (Bassetti 2009).
meropenem, biapenem, ertapenem i doripenem sunt mult mai eficiente
mportiva organismelor Gram-negative (Bassetti 2009).

IX. MODELAREA STRUCTURII NDM1 PRIN DOCARE MOLECULAR I

QM/MM
Pentru acest studiu am utilizat metode de mecanic molecular i mecanic cuantic
(QM/MM) pentru a realiza simulri asupra carbapenemazelor (NDM-1). Am folosit
programul de modelare molecular Discovery Studio pentru a doca moleculele a cinci
antibiotice la structurile NDM-1 n cele patru conformaii construite.
Structurile au fost minimizate nainte de simulrile QM/MM pentru lan urile urmtoarelor
enzime 3SFP, 3SPU, 3SRX i 4HL2. Am ales zona de calcul cuantic selectnd centrul
catalitic al enzimei constituit din ionii Zn2+ sau Cd2+ i din dou situsuri de legare a ionilor
de Zn2+, cu forma unei caviti, primul compus dintr-o triplet de histidine His120, His122,
His189, iar al doilea situs activ din amino-acizii Asp124, Cys208 i His250 i moleculele de
HOH sau ionii de Cl.

IX. MODELAREA STRUCTURII NDM1 PRIN DOCARE MOLECULAR I

QM/MM
Rezultatele pe care le-am obinut n urma simulrilor QM/MM le-am
centraliazat n urmtorul tabel:
NAME

Energia QM/MM
(kcal/mol)

Energia cuantic

Energia molecular

Energia QM/MM de

Energia

interaciune

QM/MM

electrostatic

de interaciune van

(kcal/mol)

der Walls (kcal/mol)

Energia de
interaciuneQM/M
M (kcal/mol)

3SFP_A

-21862.988

-6617.414

-15245.574

-182.335

-37.498

-219.83

3SFP_B

-23285.267

-7348.403

-15936.863

-241.407

-46.357

-287.76

3SFP_C

-21454.728

-6581.249

-14873.480

-196.823

-37.002

-233.83

3SFP_D

-23249.209

-7289.255

-15959.954

-196.464

-51.423

-247.89

3SPU_A

-6577.155

-7228.474

651.319

-460.027

-1.484

-461.51

3SPU_B

-4058.706

-7205.045

3146.339

-540.751

35.159

-505.59

3SPU_C

-7117.546

-7168.040

50.493

-416.565

-7.725

-424.29

3SPU_D

-7308.462

-7140.991

-167.472

-382.257

-13.536

-395.79

3SRX_A

-8167.378

-5660.588

-2506.790

25.273

-2.982

22.291

3SRX_B

-8795.016

-5470.544

-3324.473

17.357

-42.905

-25.548

4HL2_A

-31293.180

-6966.913

-24326.267

-704.891

-19.558

-724.45

TABEL 2. Energiile rezultate n urma simulrilor QM/MM

IX. MODELAREA STRUCTURII NDM1 PRIN DOCARE MOLECULAR I

QM/MM
Concluziile Modelarii Moleculare prin QM/MM sunt urmatoarele:
structurile

cu 2 ioni de Zn2+ sunt mai stabile decat cele cu un singur Zn2+.

lanul A al 4HL2 (structura este legat de ampicilin hidrolizat) este cea
mai stabil structur, n mare parte datorit componentei energiei MM.
lanul A al 4HL2 prezint cele mai puternice interacii QM/MM.

IX. MODELAREA STRUCTURII NDM1 PRIN DOCARE MOLECULAR I

QM/MM
Am simulat docri la lanurile A i B ale urmtoarelor structuri: 3SFP, 3SPU
i 4HL2. Tipurile de antibiotice folosite pentru docri au fost: Imipenem,
Faropenem, Doripenem, Meropenem i Panipenem, acestea fiind unele dintre
cele mai cunoscute i eficiente antibiotice existente pn astazi. Rezultatele
pe care le-am obinut n urma docrilor cu medicamente, n poziiile cele mai
favorabile, pentru ca energiile s fie ct mai mari sunt urmtoarele:

IX. MODELAREA STRUCTURII NDM1 PRIN DOCARE MOLECULAR I

QM/MM
Structur

Antibiotic

Energie

CDOCKER

Energie de

Interaciune
CDOCKER

3SFP_A

Imipenem

-289.468

-93.4388

3SFP_A

Faropenem

-739.78

-148.813

3SPU_A

Imipenem

-16.6579

34.1214

3SPU_A

Faropenem

-14.5941

42.7545

3SPU_A

Doripenem

-8.96238

47.3594

3SPU_A

Meropenem

-19.3041

45.6926

3SPU_A

Panipenem

-31.2673

43.0983

3SPU_B

Imipenem

2.00396

60.1761

3SPU_B

Faropenem

-9.15013

48.9978

3SPU_B

Doripenem

4.18665

57.0698

3SPU_B

Meropenem

-13.8044

50.2169

3SPU_B

Panipenem

-27.2435

41.4705

4HL2_A

Imipenem

-5.08656

51.7316

4HL2_A

Faropenem

-4.24129

52.4466

4HL2_A

Doripenem

-10.5061

62.2222

4HL2_A

Meropenem

-29.3554

45.9602

4HL2_A

Panipenem

-21.81

53.2521

4HL2_B

Imipenem

25.3572

87.4897

4HL2_B

Faropenem

31.0795

88.5789

4HL2_B

Doripenem

-2.53242

42.8404

4HL2_B

Meropenem

-21.4579

45.2967

4HL2_B

Panipenem

13.0512

89.9294

TABEL 3. Energiile rezultate n urma docrilor dintre diferite structuri la antibiotice

IX. MODELAREA STRUCTURII NDM1 PRIN DOCARE MOLECULAR I

QM/MM
Nume

Sarcin la
pH = 7.4

Observaii

Nume

Doripenem

0 (COO-)
(NR2H2+)

PubChem CID: 73303

hidrolizat nPDB:
PAE, 3PAG, 3IQA,
3ISG

Ertapenem

-1 (COO-)
(COO-)
(NR2H2+)

PubChem CID:
150610
hidrolizat n PDB:
3M6B, 3ZGP, 4GCS

Faropenem

-1 (COO-)

PubChem CID: 65894

hidrolizat CID:
23627205
Structuri PDB: 2EXA,
3BFF, 4HKY
hidrolizat in PDB:
3BFF, 4EBL, 4HKY

Structur

Sarcin la pH
= 7.4

Observaii

Meropenem

0 (COO-)
(NR2H2+)

PubChem CID: 441130

Hidrolizat n PDB:
4EYL
(incomplet) hidrolizat n
PDB: 4JF4, 4EV4, 3Q82,
3PBR, 2ZD8, 3BFG,
1H8Y

Imipenem

0 (COO-)
(R=NH2+)

PubChem CID: 104838

hidrolizat n PDB:
4JMX, 4GOG, 4H8R,
4BEN, 3UPN, 4A52,
3UDX, 3Q81, 3MZF,
3PBQ, 3BFC, 1LL5,
1H5X, 1JVJ, 1BT5

Structur

TABEL 4. Tipuri de antibiotice cu care am facut docri la NDM-1

IX. MODELAREA STRUCTURII NDM1 PRIN DOCARE MOLECULAR I

QM/MM
n urm docrilor acestor structuri la medicamente am reu it s centralizm urmtoarele date:
Imipenemul i Faropenemul au reuit s acioneze la toate dintre cele 5 structuri (3SFP lanul A,
3SPU pe lanurile A i B, i 4HL2 pe lanurile A i B). Doripenemul, Meropenemul i
Panipenemul au reuit s acioneze doar la patru dintre structuri. Energia cea mai mare la
docare am obinut-o la structura 4HL2 pe lanul B cu antibioticul Faropenem (31.0795
kcal/mol), ns i antibioticul Imipenem a avut o energie de docare mare (25.3572 kcal/mol) fa
de restul antibioticelor la aceast structur.
Energia cea mai mare am gsit-o pe lanul B al structurii 3SPU (-4058.706 kcal/mol) iar cea mai
mic pe lanul A al structurii 4HL2 (-31293.180 kcal/mol). Comparnd energiile QM/MM i
lund n calcul i docrile pe care le-am realizat ulterior am putut observa c pe lan ul B al
structurii 3SPU am constatat ca antibioticele Doripenem i Meropenem au cea mai mare energie
de docare fa de restul structurilor. n plus, pe lan ul A al structurii 4HL2, unde energia
QM/MM este cea mai mic, am descoperit c antibioticele Doripenem i Meropenem au cea mai
mic energie de docare fa de restul structurilor. Acest fapt poate releva c docarea
antibioticelor Doripenem i Meropenem se poate corela cu energia QM/MM rezultat.

X. CONCLUZII I PERSPECTIVE
Pentru a putea nvinge aceti patogeni trebuie s nelegem care sunt factorii
determinani ai rezistenei lor. Un alt scop foarte important este modificarea
carbapenemelor n aa fel nct ele s nu fie inactivate de -lactamaze. n aceast studiu
am observat c este posibil ca energia din situsul activ s fie corelat cu eficien a unora
dintre antibiotice, mai precis corelnduse cu energia de docare.

X. CONCLUZII I PERSPECTIVE
Perspectivele continurii acestui studiu sunt numeroase. Dorim s cercetm mai multe
structuri NDM-1 prin calcularea energiilor QM/MM i docarea acestora la antibiotice
noi. Putem calcula energii QM/MM pentru noi configuraii (HO- n loc de legtura de
ap la ionii de Zn2+, etc.), corespunztoare altor stadii ale reaciei catalitice. Dorim s
calculm n detaliu energii QM/MM ale diferitelor structuri NDM-1 cu antibiotice sau
antibiotice hidrolizate n situsul catalitic. Mecanica cuantic i cea molecular pot fi
cheia n identificarea unui model de inhibitori eficieni mpotriva carbapenemazelor.

XI. BIBLIOGRAFIE
1.Palzkill, Timothy. 2013. Metallo--lactamase structure and function. ANNALS OF THE NEW YORK ACADEMY OF SCIENCES 91-104.
2.Berrazeg M, Diene SM, Medjahed L, Parola P, Drissi M, Raoult D, Rolain JM. New Delhi Metallo-beta-lactamase around the world: An eReview
using Google Maps. Euro Surveill. 2014;19(20):pii=20809.
3.Bassetti, M., S. Esposito, L. Nicolini, E. Righi, and C. Viscoli. 2009. Current status of newer carbapenems. Curr. Med. Chem.
4.Oliver, A., B. R. Levin, C. Juan, F. Baquero, and J. Blazquez. 2004. Hypermutation and the preexistence of antibiotic-resistant Pseudomonas
aeruginosa mutants: implications for susceptibility testing and treatment of chronic infections. Antimicrob. Agents Chemother.
5.Hugonnet, J. E., L. W. Tremblay, H. I. Boshoff, C. E. Barry, III, and J. S. 2009. Meropenem-clavulanate is effective against extensively drugresistant Mycobacterium tuberculosis. Science.
6.Mandell, L. 2009. Doripenem: a new carbapenem in the treatment of nosocomial infection. Clin. Infect. Dis. , S1.
7.Papp-Wallace, Krisztina M., Andrea Endimiani, Magdalena A. Taracila, i Robert A. Bonomo. 2011. Carbapenems: Past, Present and Future.
Antimicrobial Agents and Chemotherapy.
8.Cha, R. 2008. In vitro activity of cefepime, imipenem, tigecycline, and gentamicin, alone and in combination, against extended-spectrum lactalactamase-producing Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli. Pharmacotherapy.
9.Mena, A., et al. 2006. Characterization of a large outbreak by CTX-M-1-producing Klebsiella pneumoniae and mechanisms leading to in vivo
carbapenem resistance development. J. Clin. Microbiol.
10.Koga, T., et al. "Affinity of tomopenem (CS-023) for penicillin-binding proteins in Staphylococcus aureus, Escherichia coli, and Pseudomonas
aeruginosa." Antimicrob. Agents Chemother. 53, 2009.