CATEDRA: Anatomie Topografică și Chirurgie Operatorie

Laboratorul Inginerie Tisulară și Culturi Celulare

TEZA DE DIPLOMĂ:

Autor: Tatiana Malcova, studentă anul VI, gr. M1013, facultatea MEDICINĂ nr. 1

Conducător științific: Viorel Nacu, prof. univ., dr. hab. în șt. med.

Chișinău, 2016
 Morbiditatea și mortalitatea din cauza leziunilor
Termice rămîn și astăzi o problemă medicală importantă
și o provocare majoră pentru medicina contemporană.

Arsura nu este doar o leziune localizată, limitată la

nivelul tegumentului afectat, ci o leziune gravă, ce duce
la declanșarea răspunsului general sistemic, manifestat prin stres metabolic și un
proces inflamator sever.

După datele statisticii mondiale frecvența traumatismului termic în populația

de copii este de 3,4-36 % și la maturi – 5,6-10,0 %, evoluții letale se înregistrează
în 4,9-14,5 %.

În Republica Moldova frecvența traumatismului termic în perioada 2006 -

2013 varia între 178 - 82 cazuri la 100.000 locuitori, cu o micșorare în ultimii ani.
61,2 % - 72,6 % din cazurile de accidente termice survenite la persoanele mature și
50,4 % - 56,1 % la copii au beneficiat de tratament în centre specializate de leziuni
termice.
 STANDARTUL DE AUR în
îngrijire și tratament al arsurilor
extinse la ora actuală rămâne
transplantul de GP. Cînd suprafața
arsurii este mai mare de 40% STC,
acoperirea defectului cu grefa autologă
deja nu este posibilă; apare necesitate
de a căuta o variantă de tratament
alternativă, mai eficientă. Fig. 1: “Clasificarea GP după grosime”
Sursa: 1

În aceste condiții aplicarea cheratinocitelor și fibroblastelor

autologice sau alogene cultivate in vitro favorizează închiderea
plăgilor în timp mai scurt și îmbunătățește semnificativ rezultatele
vindecării.
 Scopul și obiectivele studiului:
Studierea și stabilirea metodelor optime de
cultivare in vitro a fibroblastelor și
cheratinocitelor pentru pacienții arși.

Importanța teoretică și științifică

a rezultatelor obținute:
1. Evaluarea metodelor contemporane
descrise de cultivare in vitro a
fibroblastelor și cheratinocitelor
autologice;
2. Cultivarea practică a fibrobastelor
autologice;
3. Elaborarea POS (Procedurilor
operaționale standarde) pentru cultivarea
fibroblastelor.
 1. Funcția de protecție:
termică, mecanică,
chimică, biologică,
antiactinică, dielectrică;
2. Rol senzorial;
3. Termoreglarea;
4. Rolul de excreție;
5. Respirația cutanată;
6. Funcția endocrină;
7. Funcția imună;
8. Funcția de rezervor de
celule embrionare;
9. Funcția de comunicare.

Fig. 2: “Structura histologică a pielii, colarație hematoxilin-eozină”,

Sursa: 2
 Clasificarea arsurilor.

Fig. 3: “Clasificarea arsurilor după profunzimea alterării țesuturilor”

Sursa: 3, 4, 5
Structura plăgii combustionale:
1. Zona centrală sau de coagulare
2. Zona de stază sau de ischemie
3. Zona periferică sau de hiperemie
 Etapă Caracteristica etapei Celulele responsabile Durata

I. Faza de o Vasodilatație • Neutrofile Primele patru

hemostază și o Extravazare de • Monocite zile după
inflamație lichide • Macrofage trauma
o Edem

II. Faza o Închiderea plăgii • Keratinocite Ziua a 3-a –

proliferativă o Revascularizare • Fibroblaste săpt. a 3-a

III. Faza de o Maturizarea plăgii • Colagen

remodelare și o Formarea cicatricei • Elastina Săpt. a
maturizare • Fibroblaste/ 3-a – 2 ani
miofibroblaste

după Schilling JA și Matei P. Rowan1 et al.

Fibroblastele dermale și keratinocitele epidermale joacă un rol esențial în
vindecarea plăgilor cutanate. Pe parcursul fazelor a doua și a treia pe prim plan iese
interacțiunea specifică a acestora - keratinocitele stimulează fibroblastele să
sintetizeze factori de creștere, și fibroblastele, la rîndul său, stimulează atașarea și
proliferarea keratinocitelor.
Funcțiile de bază a fibroblastelor:
Sinteza PMEC;
Închiderea (contractarea) defectului (prin diferențierea fibroblastelor în
miofibroblaste);
Sinteza colagenului de tip I (în faza de remodelare);
Neovascularizare și limfangiogeneza.

Funcțiile de bază a keratinocitelor:

Acoperire mecanică simplă a defectului tegumentar;
Participarea activă la controlul procesului inflamator asociat leziunii;
Contribuie la formarea țesutului de granulație pe parcursul fazei de remodelare.
Obiectivele de bază în tratamentul arsurilor:
 restabilirea funcției de barieră mecanică;
 prevenirea infecției;
 minimalizarea dimensiunilor cicatricilor;
prevenirea desfigurărilor regiunii anatomice afectate

După fixare keratinocitele încep să

secrete citokine și componente ale
matricei extracelulare (fibronectină și
laminină), eliberează factorul de
creștere a fibroblastelor, factorul de
creștere a endoteliului vascular,
tromboplastină și alte substanțe, care,
la rîndul său, accelerează adeziunea și
migrarea keratinocitelor noi.
Fibroblastele, în special cele pe
suport dermic, contribuie la
vindecare mai rapidă a arsurilor,
reduc gradul de contracție a plăgii,
stimulează sinteza colagenului și
procesul de neovascularizare.
 Celule autologice
 Avantaje:
1. Nu poartă nici un risc de dezvoltare a
reacțiilor de rejet sau de contaminare
încrucișată;
2. Au efecte benefice asupra procesului de
reepitelizare, cresc densitatea celulară și
accelerează rata vindecării arsurilor;
3. Asigură acoperire permanentă
satisfăcătoare a defectului tegumentar
cu rezultate funcționale și estetice mai
bune;
4. Permit micșorarea volumului cicatricii;
 Dezavantaje:
1. Necesită timp pentru obținerea
numărului suficient de celule. Ca
rezultat etapele tratamentului întărzie;
Celule alogene
 Avantaje:
1. Sunt crioconservate și, prin urmare,
sunt permanent accesibile în cantități
suficiente;
2. Nu poartă risc de dezvoltare a reacțiilor
de respingere clinică sau imunologică;
3. Sunt recomandate pentru acoperire
temporară a defectului tegumentar ca
pansament biologic înainte de aplicare a
grefei permanente; permit crearea
mediului adecvat pentru supraviețuirea
celulelor autologice;
 Dezavantaje:
1. Prezintă risc de contaminare
încrucișată;
2. Cicatricea finală grosolană,
voluminoasă, cu grad de contracție
mare;
 Prelevarea eșantionului de piele

Controlul serologic al donatorului

(HIV, HVB, HVC, Sifilis)

Pregătirea mediilor nutritive și vaselor pentru

cultivarea celulelor

Separarea dermului și epidermului

a. Cultivarea fibroblastelor
b. Cultivarea keratinocitelor
a. Aplicare la pacient
b. Crioconservarea celulelor
 După obținerea acordului informat al pacientului a fost prelevat
în Sala de Operație cu respectarea regulile de asepsie și antisepsie un
fragment de piele cu S = 1,0 cm2.
 Pentru efectuarea testelor serologice în aceeașă zi s - au prelevate
20,0 ml de sânge. Probele au fost îndreptate în laborator pentru
investigație. Rezultatele obținute sunt prezentate mai jos.

1. Ac anti-HIV-1 şi 2 1. Grupa ABO

2. Ac anti-VHC 2. Grupa RhD
3. AgHBs 3. Ac anti-CMV
4. Ac anti-HBcor 4. Ac anti-EBV
5. Ac anti-Treponema pallidum 5. Ac anti-toxoplasma
6. Ac anti-HTLV-1* 6. West Nile NAT Virus
 Am adăugat în vasul sol. 0,1 % gelatina (câte 1,0 ml soluție per
10 cm2 suprafața). Am plăsat vasul în incubator pentru 30 minute la
37oC. Ulterior am aspirat excesul de soluție și am adăugat 5,0 ml MCF
(câte 5,0 ml mediu pentru 25 cm2). Am transferat vasele în incubator.
Pentru cultivarea fibroblastelor
noi am folosit HiFibroXLTM
Fibroblast Expansion Medium
(Codul Productului: AL525, by
HiMedia) suplimentat cu un
amestec de antibiotic și
antimicotice:
 Penicilina (100 U/ml),
 Streptomicina (0,01g/ml),
 Amfotericina B (0,25µg/ml).
 Pentru detașarea dermului de epiderm am folosit metoda mecanică, propusă de
Tabachnick.
Ulterior am tăiat dermul în fragmente mai mici (1,0-1,5 mm2) și le-am
transferat în vasele de cultură. Am adăugat suplimentar 1,0 ml mediu nutritiv
proaspăt. Am transferat vasele în incubator la 37,0 C și 5% CO2 pe 3 zile.
Celule – fibroblaste în cultura încă nu se depistează.
Fragmentele de țesut sunt atașate de suprafața vasului.
Am adăugat 0,5 ml de mediu nutritiv și am transferat vasele în incubator (37,0 C
și 5% CO2).
Ulterior, la fiecare două zele culturile au fost reexaminate, se adăuga câte 1,0 ml
mediu nutritiv în fiecare vas.
 a
a

a. Fibroblaste umane cu
morfologia fusiformă,
atașate de suprafața vasului
de cultură
(amplificare 100 μm)
Densitatea celulelor în cultură – 1,0*104 celulă/cm2
Densitatea celulelor în cultură – 2,5*104 celulă/cm2
Densitatea celulelor în cultură – 3,0*104 celulă/cm2
Densitatea celulelor în cultură – 4,5*104 celulă/cm2
 Acest studiu a demonstrat că terapia, bazată pe
utilizarea fibroblastelor autologice sau alogene, este eficientă
în tratamentul pacienților cu arsuri și alte defecte tegumentare
mari.
În timp ce terapia celulară cu fibroblastele
dermice are un potențial imens, mai multe părți ale lanțului de
aprovizionare cu celule necesită dezvoltare. Printre acestea se numără:
 Alegerea optimă a site-ul de recoltare în funcție de indicația terapeutică dorită;
 Descriere metodelor noi de izolare a celulelor din derm;
 Perfecționarea tehnologiilor de cultivare a fibroblastelor cu scop de obținere a
populației omogene de celule în număr optim , cu potența dorită și în timp mai
scurt
 Prevenirea contaminării a culturilor;
 Dezvoltarea metodelor de depozitare și transport al fibroblastelor la locul traumei.
Cu toate că substituenții dermali pot oferi o acoperire a defectului și de a
reduce durerea, ei încă mai au nevoie de o componentă epidermică. Culturile
epidermale autologice sau alogene sunt obiecte de valoare ca măsuri de sălvare a
vieții, dar nu sunt potrivite pentru o acoperire permanentă. În cadrul procedurilor
rezultate funcționale și estetice rămân inconsecvente și necesită o perfecționare în
viitor.
1. Gerard M. Doherty: CURRENT Diagnosis and Treatment: Surgery, 13th Edition
http://www.accessmedicine.com
2. http://dermatopathologymadesimple.blogspot.md/2011/08/introduction-to-skin-histopathology.html
3. http://www.eurolab.ua/skin-beauty/2458/3536/29024/
4. http://www.sfatulmedicului.ro/galerii-foto/arsurile-solare_509
5. http://mykozha.ru/ozhogi/chem-pomazat.html