Metode

imunoenzimatice
Serologia
 Ştiinţa care încearcă să detecteze semnele unei infecţii în serul
unui pacient, iniţial aplicabilă pentru detecţia Ac, curent şi
pentru Ag microbieni, virali specifici.
 Aplicabilă pentru detecţia titrului de anticorpi între perioada acută şi
convalescentă sau detecţia IgM în infecţia primară.

 Testele serologice bazate pe interacţiunea specifică între Ac şi

Ag, efectuate in vitro
 Ag cunoscut interacţionează cu Ac necunoscut din serul pacientului
testat
 Ac cunoscut poate fi utilizat pentru detecţia Ag necunoscut din serul
pacientului testat

 Interacţiunea Ag-Ac poate fi evidenţiată prin

fenomenele de aglutinare, precipitare, floculare sau
sisteme marcate
Interacţiunea Anticorp-Antigen
 Antigen – orice agent străin capabil să inducă un răspuns
imun
 Molecule isolate
 Molecule de pe suprafaţa celulelor sau virusurilor
 Anticorpi = proteine sintetizate în urma stimulului prin
antigen. Ei sunt capabili să recunoască epitopul specific al
antigenului şi să se unească de el inactivănd ul.

Situs-ul de Epitopii
unire cu Ag (determinantele antigenice)
Anticorpul A
Anticorpul A Epitopii
(determinanta antigenică)

Anticorpul B
Anticorpul B Anticorpul C
Anticorpul C
Enzyme-Linked
Immunosorbent Assays
(ELISA)
Metode serologice

Metodele clasice Metode noi

RFC- metoda de fixare a ELISA – reacţia imunoenzimatică

complementului
RIHA – reacţia de inhibare a RIA – reacţia imunoenzimatică
hemaglutinării
IFA – reacţia de
Aglutinarea latex
imunofliorescenţă
Teste de neutralizare
Western Blot (WB)
Contraimunoelectroforeza.
RIBA test
TESTE IMUNOLOGICE NOI
 BAZATE PE aplicarea SUBSTANŢELOR MARCATE

 Unii antigeni/anticorpi reacţionează între ei fără a produce

efect de precipitare sau aglutinare vizibilă cu ochiul liber.

 Ei se pot măsură indirect prin utilizarea reagenţilor

marcaţi:

 Radioactiv
 Fluorescent
 Chemiluminescent
 Cu fermenţi
Metoda ELISA - metodă
imunoenzimatică în fază solidă
 A evoluat din metoda RIA (analiza radioimună)
 prin care s-a observat că antigenul sau anticorpul poate fi
absorbit pe un substrat solid şi în paralel poate participa în
uniri/legături specifice de înaltă afinitate.

 Introdusă în practică în 1971, de către Engvall E.

şi Perlman P.

 Aplicată iniţial pentru determinarea IgE, apoi a

fost extinsă şi pentru identificarea anti HBs.
CE ESTE ELISA?
 Denumirea sugerează prezenţa a 3 componente

 Anticorpi
 Permite detecţia specifică a substanţei studiate

 Faza solidă / solid phase (sorbent)

 Permite spălarea materialului care nu este captat de pe
suprafaţa solidă

 Enzime (peroxidaza, fosfataza alcalina),

 Permite transformarea unei mici cantităţi de enzime din soluţie din
formă incoloră (la adăugarea unui substrat specific) în coloră
 Schimbarea culorii soluţiei poate fi quantificată prin aparat special
(spectrofotometru) şi prezentată sub formă de rezultate
Metoda ELISA

 Permite identificarea substanţei necunoscute, atât

calitativ, cât şi cantitativ

 în ambele cazuri se necesită ANTICORPI

monoclonali înalt specifici şi înalt sensibili pentru
antigenii particulari
Pentru ce se utilizează metoda
ELISA?
 Măsurarea nivelului de anticorpi (postinfecţie, alergie,
vaccin)

 Detecţia virusurile, Ag virale, bacteriene (hepatita,

HIV, IST)

 Detecţia modificărilor hormonale (sarcina, hormoni

tiroidieni)

 Detectă markerii circulatori inflamatori (citokinele: IL,

IFN, TNF)
Capturarea şi Detecţia Anticorpilor

Anticorpul secundar

Antigenul

Anticorpul primar
 PRINCIPIUL METODEI ELISA

• Imobilizearea Ag în godeu
Ac-
• Incubare cu proba pacientului conjugaţi cu
enzime
Ac din X
• Se adaugă anticorpi serul pacientului
conjugaţi cu enzime. Y
Imobilizarea Ag
• Se adaugă substratul pentru
enzima
• Intensitatea culorii este
proportională cu cantitatea Ac
din proba pacientului
Avantajele
 Sensibilitate Sensibilitatea
Relative relativă a of
sensitivities testelor
testsde diagnostic
(approx)

Usual operating range

Limitele de detecţie
[Ab] or [Ag]
 Quantificare a Ac sau Ag
Precipitarea
precipitation
immunoelectrophoresis
Imunoelectroforeza 10 g/ml - 1 mg/ml
 Reproductibilitate double/radial
Difuzia diffusion
radială

immunofluorescence
Imunofluorescenţa 0.1 - 10 g/ml
 Format de Kit ELISA (colour) 0.1 - 10 ng/ml
ELISA (chemiluminescence) 0.01 - 10 ng/ml

Metoda radioimună
radioimmunoassay 0.01 - 10 ng/ml
Avantajele ELISA

 sensibilitate înaltă, posibilitate de detecţie a concentraţiei de

până la 1,0- 0,05 ng/ml

 utilizarea cantităţi minime de material studiat (ser, plasmă)

 stabilitate la păstrarea tuturor ingredientelor până la un an şi

mai mult

 uşurinţa executării reacţiei; posibilitatea automatizării tuturor

etapelor reacţiei

 posibilitatea vizualizării rezultatului reacţiei, atât instrumental

(varianta cantitativă şi calitativă), cât şi vizual

 un preţ destul de redus al reagenţilor de diagnostic.

Dezavantajele
 Tehnica ELISA furnizează informaţii doar despre
prezenţa sau absenţa substanţei cercetate

 Nu oferă informaţie privind proprietăţile biomedicale,

precum greutatea moleculară sau distribuţia spaţială
a substanţei cercetate în ţesuturi;

 Pentru a afla aceste lucruri este nevoie de efectuat

şi alte metode de laborator.
 Ex. imunoblottul este o metodă combinată de detecţie a prezenţei sau
absenţei markerului studiat, cât şi de studiere/analiză a proprietăţilor
fizice a substanţei (greutatea moleculară, etc), însă este mai costisitoare
ca ELISA.
Componentele

 1. Antigen/anticorp uman = albumină

 2. Anticorp anti specie = Ac de iepure sau şoarece
anti-uman
 3. Enzimă = peroxidasa de hrean, fosfataza alcalină
 4. Substrat

Reacţia enzimatică se va dezvolta odată cu adăugarea

substratului (ex. o-phenylene diamine (OPD) sau– substrate 4-
nitrophenyl phosphate).
Tehnica ELISA
Echipamentul necesar
 Cititor ELISA – cititor automat de plăci ELISA
Spectrofotmetric multicanal cu filtru de 492 nm.
 Spălător - Spălător automat de plăci ELISA cu
rezervor pentru soluţia de spălare şi rezervor pentru
deşeuri.
 Incubator sau termostat – orice tip de incubator
care poate menţine temperatura în limitele 37°C -
39°C.
 Agitator
 Pipete multicanal – ajustabile pentru volume mai
mici de 50 µl şi volume reglabile între 50 şi 200 µl.
 Pipete monocanal – ajustabile pentru volume mai
mici de 50 µl şi volume reglabile între 50 şi 200 µl.
 Placi ELISA de microtitru cu suprafaţa plata
Variaţii a metodei ELISA
ELISA indirectă ELISA directă Tehnica sandwich,
Detecţia anticorpilor Detecţia antigenelor var. a tehnicii directe
Metoda ELISA directă
 Utilizează Ac monoclonali pentru detecţia prezenţei antigenelor particulare în
probele de testare.

 În metoda ELISA directă Ac monoclonali sunt absorbiţi din start pe suprafaţa

internă a godeurilor microplanşetelor.

 În godeuri se adaugă serul testat cu presupusul Ag necunoscut.

 Dacă Ag specific este prezent în serul testat el se va uni complementar cu Ac

monoclonali imobilizaţi pe peretele intern al godeului.

 Se adaugă o soluţie cu alţi anticorpi monoclonali marcaţi cu o enzimă.

Această enzimă produce o colorare a soluţiei când reacţionează cu substratul
său specific.

 rezultat pozitiv formarea complexului cu Ac imobilizaţi de godeu – Ag – Ac

conjugat cu enzima cu schimbarea culorii

 rezultat negativ lipsa culorii indică lipsa Antigenului în proba testată.

Metoda ELISA indirectă
 Uilizată pentru detecţia anticorpilor necunoscuţi din proba de testare.

 În acest caz, Ag specific este absorbit pe suprafaţa internă a godeurilor

microplanşetelor ELISA.În godeuri se adaugă serul testat.

 Dacă Ac specific este prezent în serul testat el se va uni complementar cu Ag

imobilizat pe peretele intern al godeului.

 Dacă Ac s-a unit cu Ag specific, ei pot fi detectaţi cu ajutorul altor anticorpi (Ac
secundari) conjugaţi cu o enzimă. Aceşti Ac se vor uni cu imunoglobulinele
(de obicei, clasa IgG) din serul testat.

 Ca Ac secundari se utilizează IgG anti-specie (anti-uman) conjugaţi cu o

enzimă. Această enzimă produce o colorare a soluţiei când reacţionează cu
substratul său specific.

 rezultat pozitiv (prezenţa Ac din serul testat)- pe suprafaţa godeului se

formează un complex din Ag imobilizaţi de godeu – Ac din serul probă – Ac
anti-specie conjugaţi cu o enzimă cu schimbarea culorii

 rezultat negativ (lipsa Ac din serul testat) - lipsa modificării culorii

INTERPRETAREA
REZULTATELOR
Positiv ELISA                            Negative ELISA          

Control Control Controlul

Pacientul A Pacientul B Pacientul C
Positiv Negative metodei

1.689 0.153 0.055 0.412 1.999 0.123

NEG POZ
CONTROLUL

CALITĂŢII
Test sisteme

 teste sreening (mai pot fi denumite şi teste iniţiale/primare -

ELISA) Testele iniţiale ne dau informaţii
prezumtive/preventive privind prezenţa/ identificarea
Ac/Ag din produsele biologice

 teste confirmatorii (mai denumite teste

suplimentare (PCR, RIBA, ImmunoBlott). Testele de
confirmare/suplimentare sunt utilizate pentru
retestarea şi confirmarea rezultatelor pozitive a
testelor de screening.
Evaluarea test sistemelor
 multiple variante şi denumiri de test sisteme
în multe cazuri de o calitate ambiguă;
 alegerea test sistemei va corespunde
 recomandărilor OMS, naţionale,
 necesităţilor, posibilităţilor laboratorului unde se procesează,
 a prevalenţei virusului în populaţia testată

 rol important în acest lucru îi revine OMS, Centrelor

ştiinţifice internaţionale, Laboratoarele Naţionale de
Referinţă.
Sensibilitatea şi specificitatea test-
sistemelor
 Sensibilitatea = procentajul de cazuri reale de hepatită (in raport
cu testul standard) detectate ca pozitive printr-un test = a/(a+c)
(exprimat %)
Specificitate = procentajul de cazuri de hepatită negative detectat
prin test, care sunt negative si in raport cu testul standard = d/(b+d)
(exprimat %)

Testul evaluat Rezultat test de referinta Total

Pozitiv Negativ
Pozitiv Real pozitive Fals pozitive = (b) Total pozitive la testul
identificate evaluat = (a+b)
corect = (a)
Negativ Fals negative = (c) Real negative, Total negative la
identificate testul evaluat =
corect = (d) (c+d)
Total Total real pozitive = Total real negative = Total general probe
(a+c) (b+d) testate =
(a+b+c+d)
În Republica Moldova

 orice test sistema pentru diagnosticarea

Hepatitelor virale este supusa testării în
Instituţiile abilitate (Departamentul
Virusologie, CNŞPMP – pentru hepatite şi
Centrul SIDA, CNŞPMP – pentru HIV/SIDA)
şi doar după o certificare, aprobare pozitivă
ele pot fi comercializate, utilizate în ţară.
control al calităţii test sistemelor
imunoenzimatice (ELISA)

 Respectarea instrucţiunilor din test sistem

 Practici bune de lucru al personalului
 Echipamentul, utilajul bun funcţional
 Principalul instrument de performanţă = panouri de
referinţă, probe de referinţă/standarde pentru
controlul intern
Panou de referinţă
 un set de probe care real conţin sau nu marcherul care ne interesează.

 Panou de seroconverise, ex. Boston Biomedica Inc, mai denumite panouri BBI.
 Avantaje permit de a cunoaşte ziua de depistare a markerului serologic în sângele
bolnavului.
 Dezavantaje – sunt costisitoare, foarte greu de găsit astfel de persoane.

 Panou de performanţă probe serologice naturale integre standardizate cu

diferit titru al markerilor studiaţi, caracterizate după prezenţa sau lipsa
marcherului şi după concentraţia markerului studiat
 Dezavantaje - foarte greu de depistat un număr adecvat de peroane cu diverse titre a
markerului studiat, iar pentru zone cu endemicitate mare a AgHBs, precum RM este
dificil de găsit seruri cu titre joase.

 Panou de performanţă artificial prin diluarea probelor pozitive la markerul

studiat cu titru mare în probe negative
HEPATITA VIRALĂ C
Testul ELISA – detecţia anti-
VHC
 TEST INITIAL, ESTE MAI PUTIN COSTISITOR

 INDICĂ EXPUNEREA LA VHC

 TESTE PENTRU Ac VHC. Mai nou sunt teste pt anti-VHC

IgM

 POSITIVE după 4-8 săptămâni de la infectare

 sensiIbilitate înaltă (99% teste generaţia 3), cele fals

pozitive se pot retesta

33
Când se va face testarea VHC?
În următoarele cazuri 
 Daca s-au utilizat DIV

 Daca au fost efectuate transfuzii de sânge/produse din ele (în SUA - July după 1992; în
Moldova – după 2004) 

 Daca s-au efectuat hemodialize 

 Pentru copii născuţi de la mame HCV-positive

 Pentru personalul de laborator, medical după ce a avut accident de serviciu cu materiale

înţepătoare

 Pentru persoane care prezintă semne de hepatită cronică

 Membrii familiei in care există o persoană VHC pozitivă


Diagnosticul VHC

 Testele ELISA Anti-HCV detectă prezenţa anticorpilor faţă de virus şi

indică doar la expunerea în trecut faţă de VHC. Acest test nu ne poate
spune dacă persoana suportă o infecţie virală acută.

 De obicei se primesc rezultate raportate ca “positive” sau “negative.”

 Actualmente sunt revizuite indicaţiile, precum ca testul pozitiv anti-VHC

(ELISA) cu titru mare confirmă automat ca persoană infectată.

 Testele pozitive anti-VHC sunt necesar de confirmat prin alte

metode/teste adiţionale pentru a determina dacă virusul este/sau nu
activ.

 
Testele VHC confirmatorii
1. HCV RIBA test este un test aditional pentru confirmarea prezenţei anticorpilor în
sânge. Rezultatele pot fi raportate ca: RIBA positive; RIBA negative sau RIBA
indeterminante.
 Ca şi anti-VHC (ELISA) nu ne poate spune dacă persoana este curent infectată sau a
fost expusă cândva la acest virus.

2. VHC-RNA test identifică prezenţa virusului în sângele bolnavului. În cazul pozitiv

indică despre infecţia activă cu VHC.

 Teste calitative VHC - RNA sunt raportate ca “positive” /“detectabile” - la prezenţa ARN
VHC sau “negative”/ “nedetectabile” – în lipsa ARN-VHC în sânge.
Utilizat pentru confirmarea diagnozei şi înainte de tratament antiviral

 Teste Quantitative VHC – RNA măsoară numărul copiilor particulelor ARN din sânge
 Utilizat înainte şi după tratament (în special după 3 luni); Tratamentul cu succes
indică descreşterea nr de particule virale de 99% sau mai mult (2 logs) sau soldat
prin nedetecţia particulelor virale
3. Genotiparea Virală determina varianta sau genotipul virusului VHC.
HCV CORE ANTIGEN (Ag)
UN NOU MARKER AL VIREMIEI VHC
 ELISA QUANTITATIVĂ

 DETECTEAZĂ PROTEINA CORE VIRALĂ

 UŞOR DE EFECTUAT
 RESULTATE RAPIDE (3 ORE)
 CORELATĂ CU ARN-VHC
 DEZAVANTAJ - COSTISITOR

NYS OASAS 37
SUMAR
DIAGNOSTICUL VHC

 HCV anticorpi: expunere în trecut, posibil infecţie

cronică – necesită confirmare

 HCV PCR: positiv indică infecţie, negative –

necesar de rpetat

 Testele funcţiei ficatului: sugerează despre

progresia maladiei (dacă persitent normale –
supravegherea pacientului)
 Biopsia : defineşte progresia maladiei.

NYS OASAS 38
 Compararea metodelor de diagnostic:

Avantaje: Dezavantaje:
Experimental Poate fi utilizat pentru studierea Scump; lent – rezultate în săptămâni/ luni/ani
Animale: patogenezei (virus-gazdă interacţiune). sistem complex, rezultate complexe.

Metodă lentă – resultat în 5-7 zile/săptămâni;

Utilizat pentru studiere şi cuantificare a
Cultura celulară virusurilor, nu pentru toate
tehnic laborioasă, condiţii speciale; pentru
virusurile hepatice nevalabil.

Testare rapidă – rezultat până la 1 oră;

Detecţia valabil pentru virusurile hepatice şi alte
Sensibilitate şi specificitate necunoscută; tehnic
Directă: laborioasă; echipament costisitor.
virusuri care nu pot fi testate

Rapid – rezultate în 1 oră/zi; Anticorpii în organismul pacientului nu necesar

sensibilitate relativă; poate fi indică infecţia virală acută; nu este atât de
Serologice: cuantificată; pot fi procesate un număr sensitivă ca şi cultivarea virusurilor, sau metode
mare de probe concomitent, procesare bazate pe detecţia acizilor nucleici.
automată.

Foarte costisitoare! tehnic laborioasă, cu condiţii

Acizii Nucleici Rapid – rezultate în ore/zile;
speciale, echipament şi reagenţi costisitori.
 ALEGEREA
METODEI \ VARIANTEI \ TEHNICII
OPTIME DE DIAGNOSTIC DE
LABORATOR APARŢINE

MEDICULUI CURANT
împreună cu
MEDICUL DE LABORATOR
MULTUMESC PENTRU
ATENŢIE