Cultivarea microorganismelor

Medii de cultură
Cultivare
Etapă specifică a diagnosticului de laborator bacteriologic

Permite „înmulțirea” microorganismelor

Oferă un mod în care putem „interacționa” cu microorganismele

Dependentă de timp

Singura care ne oferă materialul biologic necesar analizei aprofundate

 Medii de cultură
După conţinutul în celule vii :
1. Medii necelulare
(artificiale, medii de cultură)
Ce variante avem pentru microorganismele care nu cresc pe
medii artificiale?
 Medii de cultură
2. Medii celulare (care includ celule vii):
● animale de laborator
● ouă de găină embrionate
● culturi de celule
Există anumite microorganisme (ex. virusuri, Rickettsia, Chlamydia)
care nu pot fi cultivate decât pe substraturi care includ celule vii.

Majoritatea bacteriilor, fungii şi unele protozoare se pot cultiva şi pe

medii de cultură (necelulare, artificiale).
Animale de laborator (de experienţă)
Indicații:
● Microorganisme care nu se dezvoltă pe medii artificiale
● Studierea caracterelor de patogenitate

Se pot utiliza în funcţie de specia microbiană şi scopul urmărit:

- şoarecele alb
- cobaiul
- şobolanul
- hamsterul
- iepurele

Pentru producerea de seruri imune sunt folosiţi cai.

 Animale de laborator (de experienţă)
Animalele de laborator necesită condiţii speciale de întreţinere iar biobaza trebuie să respecte o serie de norme care
să garanteze calitatea acestor gazde vii. Astfel se explică costurile ridicate în ceea ce priveşte acest tip de „medii”.

Având în vedere microorganismul inoculat, susceptibilitatea gazdei şi scopul urmărit se pot inocula
- animale cu vârste diferite (embrioni, nou-născuţi, animale tinere, adulţi)
- pe căi diferite de inoculare (per cutanat, prin scarificare, subcutanat, instilare la nivelul anumitor mucoase, per
os, intramuscular, intravenos, intratesticular etc).

Spre exemplu, virulenţa Mycobacterium tuberculosis scade pe măsură de microorganismul este cultivat pe anumite
medii de cultură (aspect dovedit şi prin obţinerea tulpinii vaccinale BCG de M. tuberculosis varianta bovis).

În sens invers, este necesară uneori exacerbarea virulenţei, prin pasaje repetate realizate pe gazde susceptibile.
Oul de găină embrionat
Avantaje:
● preţ mai scăzut
● în mod normal steril (în condiţiile producerii acestor „gazde vii” în unităţi specializate)
● nu prezintă factori antimicrobieni în perioada în care se realizează în mod obişnuit
inocularea (la 6-14 zile de incubaţie)
 Oul de găină embrionat
- Oul de găină este întâi examinat la ovoscop pentru evaluarea embrionului şi
prezenţei unor eventuale modificări nedorite.
- În condiţii de strictă asepsie oul de găină embrionat se poate inocula
- intraembrionar (intramuscular, intracerebral etc.),
- la nivelul membranei chorioalantoidiană,
- în sacul alantoidian sau
- în sacul amniotic.

Oul inoculat se introduce în incubator, la 37ºC, în condiţii de bună ventilaţie a aerului şi

umiditate corespunzătoare, pentru 1 sau mai multe zile. Se poate utiliza această metodă
pentru izolarea şi identificarea tulpinilor rickettsiene (utilizând metode imunologice, ex.
reacţia de microaglutinare).
Culturile de celule (1)
Există posibilitatea utilizării unor culturi de organ sau a culturilor de celule dispersate.
Acestea din urmă se pot clasifica drept:
- Culturi primare - derivă din dispersia enzimatică (de ex. cu tripsină-EDTA) a celulelor unui
organ proaspăt recoltat şi pot fi menţinute in vitro pentru 3-5 pasaje.
- Tulpini celulare - reprezintă culturi cu un singur tip de celule (culturi omogene) şi pot fi
menţinute in vitro pentru 50-60 pasaje.
- Linii celulare continue (stabile) sunt populaţii celulare care derivă din ţesut normal sau malign
şi pot fi subcultivate (respectând indicaţiile din protocol) în mod nelimitat.
 Culturi de celule (2)
Au fost puse la punct foarte multe linii celulare, spre exemplu:
· linii celulare derivate din rinichi de maimuţă (Vero, BSC-1, BGMK etc), şoarece (McCoy); ovar de hamster (CHO)
· linii celulare derivate din carcinom de col uterin (HeLa), laringe (HEp-2)
· linii celulare limfoblastoide (MT-4, H9 etc) etc.
Culturi de celule (3)
Pentru Chlamydia trachomatis se pot utiliza liniile celulare BGMK, HeLa, McCoy,
Pentru Chlamydia pneumoniae se pot utilizat liniile celulare HeLa, HEp-2
Pentru Chlamydia psittaci se poate utiliza linia celulară McCoy etc.
 Culturi de celule (4)
Liniile celulare pot fi utile şi în vederea studierii efectului unor exotoxine, spre exemplu:
● în cazul toxinelor produse de E. coli
O157:H7 și de Shigella shiga se poate
utiliza linia celulară Vero (verotoxină)
● pentru toxinele produse de Vibrio cholerae
şi E. coli entero-toxigen se poate utiliza
linia celulară CHO.

Piérard D, De Greve H, Haesebrouck F, Mainil J. O157:H7 and O104:H4 Vero/Shiga toxin-producing Escherichia coli outbreaks: respective role of cattle
and humans. Vet Res. 2012;43(1):13.
Clasificarea mediilor de cultură artificiale (1)
Mediile de cultură artificiale se pot clasifica după o serie de criterii:

După starea de agregare, mediile de cultură artificiale pot fi:

- solide (agar / geloză, agar-sânge, AABTL, ADCL, CLED, Bordet-Gengou, Chapman, Löffler,
Löwenstein, agar Mueller-Hinton, Sabouraud, TCBS, TSI etc.)
- lichide (apă peptonată alcalină, bulion Mueller-Hinton, bulion nutritiv, bulion-sânge, bulion selenit,
bulion tioglicolat, Middlebrook 7H9, O.C.S.T. etc.)
- semisolide (Cary-Blair, MIU, Stuart etc.)

Medii solide Medii lichide Medii semisolide

Clasificarea mediilor de cultură artificiale (2)
După complexitatea ingredientelor, mediile pot fi:
- simple (agar, bulion simplu etc.)
- complexe (agar-sânge, geloză-chocolat, agar cu factori X şi V, Bordet-Gengou,
Mueller-Hinton etc.)

După conţinutul în apă, mediile pot fi:

- cu umiditate obişnuită
- medii uscate (deshidratate) – în scopul conservării
Clasificarea mediilor de cultură artificiale (3)
Medii speciale:
● Mediul electiv conţine ingredientele care convin cel mai bine dezvoltării unei anumite
bacterii (de exemplu mediul Lőffler, cu ser coagulat de bou, pentru bacilul difteric).
Clasificarea mediilor de cultură artificiale (4)
● Prin conţinutul său în substanţe antimicrobiene, mediul selectiv inhibă dezvoltarea altor bacterii
decât cea a cărei izolare se urmăreşte.
○ De exemplu: mediul Chapman (MSA, manitol-sare-agar), mediul MacConkey, sau medii în
care includem antibiotice (faţă de care bacteria care se doreşte a fi izolată este rezistentă).
Clasificarea mediilor de cultură artificiale (5)
● Mediul de îmbogăţire favorizează înmulţirea anumitor bacterii patogene, inhibând dezvoltarea
florei de asociaţie dintr-un produs patologic.
○ Funcţionează concomitent ca mediu selectiv şi ca mediu electiv: apă peptonată alcalină,
bulion selenit, O.C.S.T. etc.
 Clasificarea mediilor de cultură artificiale (6)
● Mediul diferenţial conţine un indicator de pH şi un anumit substrat (de exemplu un zahar) care poate fi sau nu
metabolizat, determinând modificarea pH-ului şi a culorii indicatorului sau modificarea aspectului culturii.
● De exemplu, agarul cu albastru de brom-timol lactozat (AABTL) permite diferenţierea bacteriilor lactozo-
pozitive (cum este E. coli) de bacteriile lactozo-negative (Shigella, Salmonella etc).
● Alte exemple: ADCL (agar dezoxicolat citrat lactoză), TSI (3 zaharuri şi fier), MIU (mobilitate indol uree),
CLED (cystine–lactose–electrolyte-deficient agar)
Clasificarea mediilor de cultură artificiale (7)
După scopul urmărit mediile de cultură artificiale pot fi și:
- de transport (apă peptonată alcalină, Cary-Blair, Stuart etc.)
Clasificarea mediilor de cultură artificiale (8)
- de izolare (agar-sânge, Bordet-Gengou, Löffler, Löwenstein, Sabouraud etc.)
Clasificarea mediilor de cultură artificiale (9)
- de identificare (TSI, MIU, truse API etc.)
Clasificarea mediilor de cultură artificiale (10)
- de conservare (agar nutritiv în coloană etc.)
Medii utilizate de rutină în microbiologie
1. Agar sânge
2. Agar chocolat
3. Mueller Hinton
4. MacConkey
5. CLED
6. ADCL/XLD
7. Löwenstein-Jensen
8. Löffler
9. Sabouraud (+/- cloramfenicol)
10. Medii cromogene
11. Medii selective diverse
etc.
Mueller-Hinton Agar Trypticase Soy Agar Cystine-Lactose-Electrolyte-Deficient Columbia Blood Agar Sabouraud agar
(MHA) (TSA) (CLED) Agar Agar Chocolat

Chromogenic media

Löwenstein-Jensen