3.

TEHNICI DE STERILIZARE A OBIECTELOR N LABORATORUL

DE MICROBIOLOGIE

Distrugerea microorganismelor sau sterilizarea este indispensabil pentru pregtirea materialuluidelucruiamediilordecultur. Sterilizareareprezintoperaiadedistrugeresaundeprtareatuturorformelorvegetativeide rezistenamicroorganismelorpatogeneiapatogene. Un produs este considerat steril cnd nu mai conine forme de microorganisme ce pot fi revitalizate. Exist mai multe procedee de sterilizare care corespund diferitelor tipuri de materiale ce trebuietratate. Metodederealizareasterilizrii: cuaercald(140200oC); cuvaporisubpresiune(120140oC); prinnclzirirepetate(70100oC); filtrareprinmaterialeporoase; utilizarearadiaiilor(UV,IR,razeX,razegamma,etc.) utilizareaagenilorchimici(oxiddeetilen,formaldehid,etc.) prepararepecaleaseptic. Produsele sterilizate nu trebuie s conin microorganisme vii sub form vegetativ sau sporulent capabile s se dezvolte n condiii adecvate. Metoda de sterilizare se alege n funcie de proprietile fizicochimice ale produsului supus sterilizrii evitnduse eventualele modificri din punct devederealcalitiiacestuia. a) b) c) d) e) f) g) Metodele a)c) sunt metode termicei se pot realiza prin nclzire uscat (a)i nclzire umed (bc). Ultima variant este destul de eficient deoarece aburuli apa cald acioneaz prin hidratare cu coagulareaihidrolizaproteineibacteriene. Sterilizarea prin metoda d) se utilizeaz frecvent n cazul produselor termolabile i cnd cheltuielile prin (ac) sunt foarte mari; se utilizeaz filtre (plci) poroase, Jena G5, de azbestceluloz; cu membran. Sterilizarea prin e) dei prezint unele dezavantaje este aplicat tot mai mult n special pentru aeruldinboxesterile.

Sterilizarea prin f) se aplic produselor termolabile la rece cu etilenoxid, formaldehid, fenol, etc. Se poate utiliza combinaia a)c) i adugare de substane chimice ca: aldehid formic, ap oxigenat,acid5nitrofenilacrilic. Prepararea pe cale aseptic se folosete atunci cnd nu este posibila sterilizarea prin a)e), realizndusenboxesterilencareaeruldinacesteasesterilizeazprind)f). n laboratorul de microbiologie de analize de rutin, cldura reprezint modalitatea de sterilizareceamaintrebuinat. STERILIZAREAPRINCLDUR Cldura umed. Sterilizarea prin cldur umed se efectueaz n autoclavul cu aburi prin procedeuldeautoclavare. Principiu: n atmosfera de vapori de ap sub presiune, toate bacteriile (inclusiv formele sporulate) sunt omortedup20minutela1210C.Aceastaestemetodaceamaieficientdesterilizare. Autoclavulpermite:

pregtireamaterialului(mediidecultur,diferiteobiecte)nvedereautilizriinlaborator,prin distrugereamicroorganismelor; decontaminarea materialelor dup folosirea n laborator (cel puin 30 minute la 1210C). Microorganismele din produsele patologice, eantioanele de ap i produse alimentare analizate, din culturilemicrobienedelaboratoretc.,trebuieneapratdistruse. Aceste dou operaii ar trebui efectuate de preferin n dou autoclave diferite sau, cel puin, nmodseparat. Duratele de sterilizare sunt date doar pentru obiecte, medii de cultur sau alte substane ce trebuiesterilizatenautoclavpentruanalizelederutin. Controlul eficienei sterilizrii prin autoclavare este realizat adesea cu ajutorul unor indicatori desterilizarecumsunthrtiileindicatoare:suntcomercializatebenzidehrtiespecialimprimatepentru aviraculoareadacaufostndeplinitecondiiiledesterilizare. Pasteurizarea

 Sterilizarea trebuie s fie deosebit de pasteurizare, care reprezint doar un procedeu de conservare utilizat n industria alimentar. Pasteurizarea const n tratarea produsului la o temperatur ndomeniul560C850C,oduratvariabildelactevaminutepnlaoor,nmediuumed,nfuncie deprodus. n aceste condiii, majoritatea celulelor vegetative bacteriene sunt distruse, dar nu i formele sporulate. Tyndalizarea

Tyndalizarea const n 2 3 pasteurizri repetate, alternate cu perioade n care proba este meninut n condiii favorabile pentru germinarea endosporilor bacterieni, care devin vulnerabili trecnd n stare vegetativ i sunt distrui prin pasteurizare. Tyndalizearea se poate realiza n baie de ap, de exemplu, n urmtoarele condiii: nclzire la 56 0C (pn la 80 0C) timp de 1 or, 3 7 zile consecutiv,cuunintervalde24deore. Tyndalizarea se poate folosi pentru distrugerea microorganismelor n mediile ce conin substanetermolabile. Cldurauscat Sterilizareaprinclduruscatseefectueaznsterilizatoarelecuaercald(etuv). Cldura uscat nu poate distruge bacteriilei n special sporii bacterieni, dect la o temperatur mai ridicat ca n cazul cldurii umede. Tratamentul pentru sterilizare cu cldur uscat este de 4 ore la 1400Csau1orla1800C. Un alt procedeu de sterilizare prin cldur uscat este flambarea, care se efectueaz n flacra beculuidegazpentru:extremitateafiruluiansei,exteriorulpipetelor,gtuleprubetelorialflacoanelor. ALTEPROCEDEEDESTERILIZARE Sterilizareaprinfiltrare Filtrarea const n trecerea unui produs lichid printrun perete poros sau o membran care reine bacteriile. Se pot utiliza filtre de porelan (Chamberland), de sticl poroas sau membrane tip Millipore,cuporidediferitedimensiuni. Sterilizareapringazetoxice

Oxidul de etilen, de exemplu, este foarte utilizat pentru sterilizarea materialului medico chirurgical,amaterialelordinplasticnumitesterile,deunicfolosindinindustrie. Sterilizareacuajutorulradiaiilor Radiaiile ultraviolete sunt radiaii cu utilizare curent n laboratorul de microbiologie; ele sunt bactericide,darnudistrugsporiibacterieni.Acesttipderadiaiiacioneaznmoddirectiauputerede penetraie sczut (civa milimetri). Lmpile germicide al cror efect se bazeaz pe aciunea radiaiilorUVculungimeadeundde254nmsuntutilizate: pentrusterilizareaapei pentrusterilizareaincinteloriaaeruluiambiant Radiaiilegamma Radiaiile gamma fac parte din categoria radiaiilor ionizantei au un efect puternic microbicid. Sunt dificil de produsi de utilizati foarte periculoase datorit efectelor pe care le au asupra materiei vii. Acest tip de radiaii poate fi utilizat n sterilizarea materialului medical i microbiologic de folosinunicsaupentrusterilizareaunordeeuri.

3.1. PREGTIREA I STERILIZAREA STICLRIEI N LABORATORUL DE MICROBIOLOGIE

Pregtireai sterilizarea materialului n vederea utilizrii n laboratorul de microbiologie este o operaie deosebit de important deoarece exactitatea rezultatelor precum i reuita desfurrii proceselormicrobiologicedepindnmaremsurderigurozitateacucareseefectueaz. Principaleleoperaiidepregtireasticlrieidelaboratorsunt: splarea uscarea executareadopuriloriambalarea

Recipientele pot fi pregtite cu dop din vat hidrofob pentru a nu pstra umezeala dup autoclavare. Din ce n ce mai folosite sunt dopurile din celuloz comprimat (comercializate), sterilizabile pan la 200 0C. Pentru nlocuirea eprubetelor cu dop de vat, n scopul pstrrii optime a culturilor,sepotutilizatuburiprevzutecucapsulecaresemonteazprinnurubare. Pentru evitarea contaminrii mediilor de cultur utilizate n analiza microbiologic sau n obinerea culturilor microbiologice, sticlria de laborator trebuie ambalati sterilizat corespunztor.

Sterilizarea se efectueaz la etuv (sau pupinel), iar materialele supuse acestei operaii trebuie s fie curatei mpachetate n hrtie sau aezate n conteinere metalice nchise. Sterilizarea uscat se poate aplica pentru articole din sticl (plci Petri, baloane, pipete, eprubete), obiecte din porelan, instrumentar metalic fr suduri n cositor, pulberi uscate etc. Aerul fiind slab conductor de cldur, sterilizatorultrebuiesuniformizezetemperaturaisasigureptrundereaaeruluifierbintenobiectele desterilizat.ncalculareatimpuluidesterilizareuscattrebuieavutenvedereurmtoareleetape:

perioada de nclzire la temperatura de sterilizare, socotit n general o or; perioada de meninere a temperaturii de sterilizare; perioada de rcire n care scderea temperaturii trebuie realizat treptat pentru evitarea spargerii obiectelor de sticl prin oc termic, aproximativ 2 ore.

n practic se procedeaz la alegerea unei temperaturi de sterilizare de 180 oCi a unei durate deoor.Dinexcesdeprudensepracticsterilizrilatemperaturimairidicatesaudeduratemaimari. n unele cazuri aceast practic este duntoare deoarece, de exemplu, vata ordinar la durate i temperaturimaridesterilizareuscatelibereazgudroanecepotinhibacretereamicrobian. Materialeutilizate:

- pipete; - plci Petri; - eprubete; - flacoane Erlenmayer; - vat hidrofob; - tifon; - hrtie ambalaj i etuv. Mod de lucru:
Se execut dopuri de vat hidrofob pentru eprubete, astfel nct s poat fi extrase uor n timpul inoculrii, iar densitatea materialului s asigure sterilitatea. Eprubetele se introduc n coul de srmi seacopercuhrtie.Pipeteleseastuplaparteaopusvrfului,cuundopsubiredevatcaresrein microorganismele ce ar putea ptrunde n pipet pe la partea superioar. Pipetele se ambaleaz ntro fie de hrtie care se rsucete n jurul tubului de sticl, ncepnd de la vrf. Plcile Petri se ambaleaz n hrtie de ambalaj, n funcie de numrul necesar. Flacoanele Erlenmayer pentru medii de cultur se astup cu dop de vat nfurat n tifon. Toat sticlria se sterilizeaz 1 or la 180 oC la etuv, timp socotit din momentul atingerii temperaturii. Dup aceast perioad etuva se oprete i se ateapt rcireamaterialului.

4.EXAMENULMICROSCOPICALMICROORGANISMELOR

 Studiul morfologiei microbiene nu poate fi conceput fr utilizarea microscopului; examenul microscopic joac un rol important n studiul i identificarea germenilor, precum i n determinarea numruluiacestora. Microscopul (grec. mikrs: mic; skopein: a observa) este un instrument optic care mrete imaginea unuiobiectobservatprintrunsistemdelentile. MICROSCOPULOPTIC Microscopul optic se compune dintrun stativ pe care sunt montate un sistem de transmisie optic,oplatinportobiectiunsistemdeiluminare. Sistemuldetransmisieoptic Oculareleauputereademrirede5x,7x,10x,15x,20xichiar30x.nlucrrilecurentecele mai des folosite sunt cele 7x i 10x. Ocularele au rolul de a mri imaginea preparatului, dar i de a aplatizailuminacmpuloptic. Obiectivele reprezint un sistem optic bine centrat, constituit din una sau mai multe lentile destinate a forma o imagine real a obiectului. Puterea lor de mrire este invers proporional cu distana focal, adic cu distana dintre obiect i lentila pe care se formeaz imaginea. Calitatea esenial a obiectivelor este puterea lor de rezoluie. Aceasta la rndul ei depinde de mrimea deschideriiunghiuluipecarelfaceconulderazecareintrnlentilprecumideindicelederefracieal mediuluidintreobiectilentil.Obiectivelesuntfixateprinnurubarepeunrevolverportobiectivcare permite selecionarea rapid a unuia din ele, prin simpla rotire. Gama de obiective necesare n microbiologie se compune din trei obiective cu puterea de mrire de 10x, 20x, 40x i un obiectiv cu imersiecugrosismentul90x.Acestobiectivsefolosetencazulncareobiectulcetrebuieexaminateste maimicsaudacestenecesaraseobservaamnuntefoartefine.Laobiectivulcuimersieestenecesara se interpune ntre obiect i lentila frontal a obiectivului un lichid transparent (ulei de cedru, ulei de parafin,balsamdeCanadaetc.). 100m domeniulmicroscopiei opticeceluleepiteliale

10mglobuleroiidinsnge bacteriitipice 1mdomeniul microscopiei micoplasmeelectronice 100nm virusuri 10nm(100) proteine 1nm(10)aminoacizi atomi 0,1nm(1) Figura1.Domeniilemicroscopieiopticeielectronice Sistemuldeiluminaresecompunedinsursluminoasidintruncondensator. Condensatorulesteopiescaresegseteimediatsubplatinamicroscopuluiicarearerolulnu att de a strnge (condensa) razele luminoase venite de la sursa de lumin, ct de a mri seciunea conuluideluminpentruomaibunclaritateaimaginii. Sistemul de reglare Deplasarea platinei portobiect sau a sistemului optic se efectueaz cu ajutorul unei cremaliere, prin intermediul a dou butoane: unul mare care d o micare ampli rapid (vizamacrometric)ialtulmic,pentrureglajulfin(vizamicrometric).

Moduldeutilizareamicroscopului Preparatul este plasat pe platina microscopului, avnd grij s fie bine fixat n dispozitivul de prindere.Esteselectatobiectivul;ngeneral,unexamendebuteazcuutilizareaobiectivuluicelmaimic. n practic, se utilizeaz obiectivul 10x, apoi 20x pentru un preparat necunoscut sau pentru drojdii i mucegaiuri i obiectivul 40x pentru bacterii. Se regleaz distana lentilei obiectivului fa de preparat prin micarea vizei macrometrice i a celei micrometrice. (Obiectivele au o distan de reglare care descrete cu puterea lor). Cutarea imaginii este apoi efectuat prin manevrarea butonului care acioneaz cremaliera, iar dup fixarea imaginii se face o nou reglare a acesteia. Curarea sistemului opticseefectueazregulatcuxylolinucualcooletilic. Reglarea intensitii luminii condensatorului se face innd seama de puterea de mrire a obiectivelor;cuctaceastaestemaimare,cuattpoziiacondensatoruluiestemairidicat.

5.PREPARAREAISTERILIZAREAMEDIILORDECULTUR

Un mediu de cultur reprezint un substrat nutritiv complex, steril, care trebuie s asigure microorganismelor cantitatea necesar de ap, sursa de carbon, de azot, sruri minerale, factori de cretere, deci care s le furnizeze substanelei energia necesare n procesele de cretere, reproducere intreinereafunciilorvitale. Mediuldeculturtrebuiesndeplineascurmtoarelecondiii:

s corespund din punct de vedere nutritiv, s aib o concentraie a substanelor dizolvate care s nu influeneze negativ schimburile osmotice ale celulei s nu conin substane toxice s aib un anumit pH s fie steril (lipsit de microorganisme vii), astfel nct s se dezvolte numai celulele introduse prin inocul.
Sterilizarea mediilor de cultur se poate realiza prin metode fluidodinamice (filtrare, flotaie, centrifugare,termice,chimiceifizice(undeelectroamgnetice)). Cea mai utilizat metod de sterilizare este sterilizarea cu abur pentru c este uor de realizat i permite obinerea unui nalt grad de sterilitate. Inconvenientele procedeului sunt generate de reaciile secundare pe care le sufer componentele mediului de cultur (hidrai de carbon, aminoacizi, proteine) ntimpulsterilizriiianume: a) denaturareaproteineloriinactivareaenzimatic

b) degradareaparialavitamineloriaanumiifactoridecretere c) supranclzirile pot iniia reacii de oxidare a fenolilor i a acidului ascorbic, de polimerizare a aldehidelor nesaturate, de caramelizare a hidrailor de carbon, brumificarea mediului sau de condensare a gruprilor aldehidice din zaharuri reductoare cu grupele aminice libere din aminoacizisauproteine. Produii rezultai n urma reaciilor secundare sunt toxici pentru majoritatea microorganismelor i trebuie ca formarea lor s fie evitat n timpul sterilizrii. Din acest motiv se recomand sterilizarea separatahidrailordecarboniacompuilorcuazotiamestecareaulterioaralor. Mediile de cultur se folosesc n practica de laborator sau n practica industrial i sunt foarte difereniate n funcie de scopul urmrit. n tehnica de laborator mediile se folosesc pentru izolarea din mediul natural a diferitelor microorganisme, pentru obinerea de culturi pure, pentru ntreinerea culturilor selecionate. n scopuri industriale, mediile de cultur sunt utilizate pentru obinere de biomassauaunorcompuidenaturmicrobian. Cerinele nutriionale ale celulelor de cultur depind de metabolismul lor. Una din ideile de baz ale logicii viului general valabil pe Pmnt este c biochimia tuturor entitilor vii are la baz chimia carbonului. Nutrienii ce constituie mediul de cultur sunt cunoscui sub denumirea consacrat de substrate. Dup aportul n constituieni celulari se numesc i surse de: C, H, N, O, P, microelemente i altele. EvidentcunsubstratpoateficoncomitentsursadeCiNisimilar. n ceea ce privete microorganismele, majoritatea celor cu aplicaii industriale obin carbonul celular din compui organici (de unde denumirea de heterotrofe). Pe lng rolul lui esenial de constituent majoralmaterialuluicelular,carbonuldincompuiiorganiciestefolositicasursdeenergie. Ca surs de material celular, carbonul formeaz cca 50% din masa celular uscat a bacteriilor i fungilor. Domeniul compuilor organici cu carbon care pot fi utilizai este vast, iar versatilitatea lumii microbilor se manifest prin faptul c toi compuii cu carbon sintetizai sunt la rndul lor biodegradabili. Zaharurilei n mod special glucoza sunt sursele de carboni energie cele mai folosite n mediile de cultur ale microorganismelor, dar n funcie de necesitile nutriionale speciale ale altor celule se mai folosesc derivai de zaharuri, alcooli, acizi grai, acizi organici, hidrocarburi i compui organicicuazot. La rndul su azotul reprezint 814% din masa molecular uscat a bacteriilor i fungilor. Majoritateamicroorganismelorpotutilizanprimulrndionuldeamoniu(NH4+)casursdeN.Deaceea n majoritatea mediilor de cultur de laborator sau industriale se folosesc sruri de amoniu ca surs de N.nfunciedenevoilemetaboliceexistentemaipotfifolositecasursedeNnitraii(deiseacumuleaz adesea nitrai toxici) uneori chiar N gazos sau produi organici cu azot (proteine sau peptide). De obicei mediile de cultur conin o sare de amoniu ca surs de N anorganici un derivat industrial cu coninut de N organic. Sursele de N organic (derivat de soia, extract de drojdie, extract de porumb, snge uscat, extract de semine de bumbac, fracii solubile de la distilarea alcoolului i altele) aduc i un aport suplimentarnmediuldeculturdefactoridecretere,cevorfiprezentaiulterior.

SursadeH,estedeobiceiconcomitentcusursadeCnproduseleorganice.Suntfoarterarecazurile defolosireaHgazos. Oxigenul este prezent i el n toi compuii organici celulari i apa celular. El este obinut din majoritatea compuilor organici ai mediului de cultur, dar n cazul metabolismului aerob este absolut necesaroxigenuldinaer. PrezenaP esteesenialpentru cretereaculturiiipentruoseriedealteprocesemetabolice,sursa consacratfiindconstituitdefosfaiiuneorideuniiderivaiorganici. S se obine de obicei din sulfai, iar K (principalul cation al celulei) este introdus de asemenea sub formadesulfaisaudefosfai.SursaimportantdeMgestesulfatulrespectiv. n mediul de cultur se introduc adesea microelemente, soluii de sruri minerale care conin ionii metalici de care au nevoie metaloenzimele din celul. Concentraiile acestor sruri sunt extrem de reduse n mediu. n funcie de cerinele unor microorganisme se mai introduc vitamine i uneori aminoacizi. Odat stabilit formula mediului de cultur n funcie de cerinele nutriionale ale celulelor, urmtoarea etap este prepararea acestuia. Este numai aparent o operaie simpl, pentru c cere totui elaborarea unei proceduri dedicate, astfel ca fiecare cantitate de mediu preparat s fie identic cu celelalte, deci asigurarea unui nalt grad de reproductibilitate a compoziiei. Aceasta nseamn c trebuie urmrite cu atenie condiiile de conservarei manipulare a componentelor la temperaturii umiditate controlate. n special n cazul mediilor pentru instalaia industrial, protocoalele de lucru trebuie s conin instruciuni ct mai clare, astfel nct s se evite producerea unor reacii nedorite ntre componentele mediului, cnd ingredientele sunt introduse ntro ordine greit (se poate ajunge la precipitarea unor componente, care odat scoase din soluie nu mai sunt accesibile celulelor de cultur, sau la eliminarea unor componente volatile, de exemplu amoniacul; se poate realiza complexarea unor sruri sau reacii decondensarentrecomponenteleorganice,maialesntimpulsterilizriimediului). Este important ca mediul s fie suficient agitat n timpul preparrii, astfel nct s se solubilizeze toate componenteleiarlimiteledesolubilitatealesubstanelorsfieavutenvederecugrij. Dupscopulutilizriilor,mediiledecultursempartn:

medii de cultur generale care asigur dezvoltarea unui mare numr de specii medii de cultur selective care permit dezvoltarea unui numr restrns de microorganisme medii de cultur de difereniere care permit separarea speciilor n funcie de anumite caractere biochimice medii de mbogire destinate separrii i cultivrii unor microorganisme pretenioase din punct de vedere nutritiv sau care se afl n numr redus medii de conservare

medii de cultur industriale Din punct de vedere al compoziiei chimice, mediile de cultur se mpart n 3 categorii: medii naturale (empirice) de origine animal sau vegetal, cu o compoziie chimic nedefinit n mod exact; medii sintetice: acestea sunt soluii de substane chimice pure n ap distilat, cu o compoziie perfect determinat; medii semi-sintetice: sunt constituite din produse chimice bine definite, dar i din produse de origine natural (cu compoziie cunoscut).
Constitueniiprincipaliaimediilordecultursunt: 1.Extractedecarneimacerate

Aceste produse, comercializate n form concentrat sub denumirea de extracte de carne, coninnprincipalproteinepuinhidrolizate,glucide,sruriminerale,vitaminehidrosolubile.Compoziia lorvariaznfunciedecarneautilizatpentrupreparare. 2.Extractededrojdie

Acesteextracte,comercializatesubformdeshidratat,suntpreparatedindrojdiadebere,fiind utilizatecasursdeaminoaciziidevitaminehidrosolubile(vitaminedincomplexulB). 3.Peptoneihidrolizate

Peptonele reprezint un amestec de compui solubili n ap care provin n urma aciunii enzimelorasupramaterialuluiproteic.Potfi:peptonpepsicdincarne,peptontripsicdincazein(cu coninut crescut n triptofan), pepton pancreatic de cazein, pepton tripsic de carne, pepton papainicdesoia,peptonecompuse. Hidrolizatele sunt peptone obinute n urma aciunii compuilor anorganici asupra proteinelor (acid clorhidric de ex.). Cel mai des ntrebuinat este hidrolizatul acid de cazein, coninnd aminoacizii constitutiviaicazeineidinlapte. 4.Agaragarulsaugeloza

Agaragaruldenumitigelozesteunextractdealgeroii(Rhodophyceae)dingenulGelidiumi Gracilaria,recoltatenmrileJaponieisaualeNoiiZeelande. Sedizolvnaplaotemperaturnjur de 900Ci se solidific sub 450C, fiind utilizat pentru solidificarea mediilor de cultur. Nu este degradat de microorganismele obinuite. Este comercializat n forma sa iniial deshidratat, numit agar fibre (foarteimpur),subformdepaiete(maipuinimpur),sausubformdepulbere. Numeroase firme sunt specializate n producerea i comercializarea mediilor de cultur de laborator(firmaDifco,Merck,Biokar,Oxoid). Mediile fermentative sunt medii de cultur industriale destinate producerii unor cantiti mari de celule sau produi de metabolism. n compoziia acestor medii intr ca surse de carbon: melasa, produs secundar rezultat la fabricarea zahrului i care conine 45 55% zaharoz, diferite tipuri de

finuri, cereale boabe, zer bogat n lactoz, tre etc. Dintre sursele de azot cel mai des folosite sunt: finurile proteice de soia, sulfatul de amoniu, ureea, ngrmntul complex. Ca sruri minerale se adaug fosfai, sulfai, cloruri etc. Pentru cultivarea microorganismelor care necesit factori de cretere, se adaug extract de porumb (obinut prin concentrarea apelor rezultate la nmuierea porumbului, bogat in aminoacizi, vitamine, acid lactic, microelemente), extract de drojdie, extract din radicele de maligermenidegruiporumb.

5.1. PREPARAREA MEDIILOR DE CULTUR PENTRU NTREINEREA BACTERIILOR, DROJDIILOR I MUCEGAIURILOR

Materiale utilizate: - balan cu precizie de 0,1 g; - pahare Berzelius; - sit azbest; - agar nutritiv pulbere; - mediu de cultur extract de mal - agar pulbere; - mediu extract de cartof-dextroz-agar pulbere; - eprubete cu dop, sterile; - pipete de 10 mL; - flacoane Erlenmayer; - bec de gaz; - autoclav cu gaze.
Moddelucru: Conform indicaiilor de pe flacoanele coninnd mediile de cultur pulverulente, se vor cntri cantitile necesare pentru a obine cte 1 litru din fiecare tip de mediu de cultur pentru eprubetei cte 300 mL mediu pentru baloanele Erlenmayer. n cazul n care nu exist medii deshidratate, procuratedelafirmespecializate,mediilesevorpreparaprincntrireacomponentelorpentruvolumul finaldorit. Mediul de cultur se aduce la fierbere n paharele Berzelius de 1 L, pn la completa dizolvare a agarului,apoiserepartizeazcte10mLneprubetesterile,prevzutecudopdevat,careseaeazn couri de srmi se acoper cu hrtie. n mediu se determin pHuli, dac este necesar, se ajusteaz la valoarea dorit. Mediile cu agar nu trebuie s fie aduse la un pH mai mic de 6, deoarece agarul este parial hidrolizat n timpul sterilizrii la pH acidi nu se mai solidific la rcire. Cnd sunt necesare astfel demedii,pHultrebuieajustatdupsterilizare. Baloanele Erlenmayer se astup cu dop de vat nvelit n tifon, se leag la gur cu hrtie i sfoar. Courile i baloanele Erlenmayer se introduc n autoclavul cu gaze, iar sterilizarea se face conforminstruciunilorafiatelngaparat. Se nchide capacul autoclavului, se verific nivelul apei n vasul de nivel, se aprinde gazuli se ateaptapariiajetuluideaburviucareesteeliminatprinpurj.

Dup 1015 minute de purjare se nchide robinetul purjei, iar presiunea indicat de manometru vaurcapnlavaloarea1,undevafimeninuttimpde20min.prinmicorareaflcrii. ntre presiune i temperatura din autoclav exist o corelaie, aa cum se prezint n tabelul urmtor: Tabel3.Corelaientrepresiuneaitemperaturadinautoclav

Temperatura, o C 100 105 110 112 115 120 121 122 128 130 135 140

Presiunea, kg/m3 0,00 0,20 0,43 0,55 0,69 0,99 1,00 1,33 1,55 1,72 2,16 2,65

Presiunea, atm 0,00 0,20 0,42 0,50 0,67 0,96 1,00 1,29 1,50 1,65 2,09 2,56

Dup acest interval se oprete gazul, se ateapt scderea presiunii pe manometru, se deschide purjaidup5minutesepoatedeschidecapaculautoclavei. n general, mediile de cultur trebuie s ofere o suprafa de dezvoltare suficient pentru microorganisme. De aceea , dup sterilizare tuburile cu mediu se nclin pentru ca s rmn cu o suprafa mare de cretere. nclinarea se face prin sprijinirea eprubetelor pe o baghet suficient de groas, innd seama ca mediul negelificat s nu ude dopul de vat, ci s se opreasc la 2 3 cm de acesta.Prinrcire,vaporiiceiesdinmediulcald,secondenseazpepereiimaireciaieprubeteloricad sub form de picturi pe mediu, adunnduse pe fundul eprubetei. Din aceast cauz, eprubetele cu mediul rcit nu se aeaz n poziie orizontal, ci vertical, in couri de srm. Acestea se acoper apoi cuohrtieiseleagcusfoar. Pentru a nu prepara n fiecare zi medii, sau, dac este nevoie de mai multe feluri de medii n acelai timp, acestea se pregtesc o dat i apoi se depoziteaz pentru pstrare. Sticlele cu medii se eticheteaz,notndusetipulmediuluiidatapreparrii.Pentruevitareauscriiserecomandpstrarea mediilornutritivenfrigider. Sterilizarea mediului de cultur are ca scop ndeprtarea organismelor nedorite care pot avea un efect duntor asupra productivitii. Creterea rapid a contaminanilor poate reduce substanial concentraia nutrienilor disponibili pentru celulele de cultur. Dezvoltarea unor organisme strine

poate conduce la consumul masiv al sursei de C i de N, al unor precursori eseniali, poate limita cantitatea de oxigen solubil n mediu disponibil n cazul bioproceselor aerobe, poate induce i alte modificri duntoare modificarea pHului, excreia de substane toxice. n aceste condiii se poate ajunge fie la inhibiia creterii celulelor de cultur fie la contaminarea i chiar descompunerea metabolitului de interes. Anumite mucegaiuri contaminante pot produce chiar importante creteri ale vscozitiimediuluindetrimentuleficieneiamestecrii. Sterilizarea mediilor se realizeaz n mod uzual prin tratament termic, filtrare, folosirea unor radiaii, tratament chimic sau diverse combinaii ale acestora. Utilizarea radiaiilor i tratamentelor chimice este rar n cazul mediilor industriale. Pentru unele componente ale mediilor labile la temperatur,filtrareasterilizantprinmembraneesteceamairecomandabil. Metoda cea mai folosit pentru sterilizarea mediilor industriale complexe este sterilizarea cu abur sub presiune. Durata acestei sterilizri, ceea ce implic perioada de nclzire treptati de meninere a temperaturii de sterilizare sunt de asemenea probleme care trebuie studiate cu grij naintea procedeului industrial, astfel nct s se asigure att gradul avansat de sterilizare,cticonservareacalitiimediuluidecultur. nclzirea unor amestecuri complexe de substane chimice, anorganice sau organice la temperaturi mai mari de 120 0C i pentru perioade mai lungi de 20 de minute poate cauza distrugerea unor componente de mediu fie prin degradare termic direct, fie prin producerea unor reacii nedorite ntre componente, disprnd cel puinparialunelesubstraturiiaprndnschimbprodusetoxicepentrucultur. Condiiile n care are loc sterilizarea pot afecta nu numai stabilitatea componentelor dar de asemenea disponibilitatea lor pentru organismul de cultur. Microelementele de exemplu pot exercita o influen asupra solubilitii nutrienilor majori. De asemenea temperatura i durata sterilizrii pot afecta solubilitateaunorcomponentealemediului.

6.NSMNAREACULTURILORDEBACTERII,DROJDIII
MUCEGAIURI

Principiul metodei: Microorganismele pot fi cultivate pe medii de cultur n plci Petri sau n tuburi, att pentru studiul lor, pentru conservarea lor prin refrigerare, ct i pentru obinerea culturilor stoc i de lucru, n diversele procese biotehnologice. Operaia de trecere a unei culturi dintr-un vas de cultur n altul se numete repicare sau trecere, iar fragmentul de cultur ce se trece pe alt mediu se numete inoculum. n jurul flcrii becului de gaz exist o zon steril cu diametrul de aproximativ 20 cm, n lipsa curenilor de aer. Toate manipulrile care necesit deschiderea recipientelor sterile sau coninnd culturi trebuie efectuate n aceast zon de protecie.

6.1. NSMNAREA N TUBURI

Materiale utilizate: - culturi de Bacillus subtilis pe agar nutritiv; - culturi de Saccahromyces cerevisiae pe mediul extract de mal - agar; - culturi de Monascus purpureus, Aspergillus niger i Penicillium pe mediul extract de cartof dextroz - agar; - fir de inoculare; - bec de gaz; - eprubete cu mediu sterilizat i nclinat (nutrient-agar, extract de mal-agar, extract de cartofdextroz-agar); - termostat la 30 oC; - lamp bactericid. Mod de lucru:
nsmnareacuansa

Setergesuprafaadininteriorulnieidelucrucuuntamponmbibatcualcool95%.Seaprinde lampa bactericid i se las 15 minute pentru sterilizarea incintei de lucru. Se spal minile cu spun, apoi se cltesc cu alcool. Se aprinde becul de gaz i se regleaz flacra, care trebuie s aib conul de culoarealbastr. Seine eprubeta n care exist cultura ce trebuie repicat cu mna stng, n poziie oblic sau chiar orizontal. n mna dreapt se ine acul de repicat. Acesta se arde n flacra becului de gaz, inndul n poziie vertical pentru ca flacra s cuprind o poriune ct mai mare din el. Se ine n flacr pn ce mai mult de jumtate din ac se nroete, apoi se plimb de 23 orii restul acului pn lamner,nflacr.

Dupaceeaseapropieguraeprubeteideflacri,cudegetulmicdelamnadreaptndoit,se trage afar dopul de vat din gura eprubetei, apucndul de captul rmas afar. Nu i se d drumul dopului pe mas ci se ine tot timpul n mn. Se trece gura eprubetei de 2 3 ori prin flacr. Se introduce acul fierbinte n eprubet i se rcete, nu n cultur, ci alturi, pe o poriune de agar fr cultur. Se ia apoi o foarte mic poriune (de 1 2 mm) din cultur pe vrful acului (se alege poriunea ceamaitipicimaicurataculturiirespective). Se scoate acul din eprubet, se arde din nou gura eprubeteii se astup cu dopul de vat din mnadreapt.Selasjoseprubetaiseia,totcumnastng,oalteprubetcumediusteril. Acul de repicat cu fragmentul de cultur, seine mai departe n mna dreapt ferindul acum de flacr. Se procedeaz cu eprubeta a doua la fel cum sa procedat cu prima, adic:seinenpoziieorizontalsaupuinoblicnmnastng,sescoatedopulcudegetulcelmicde lamnadreaptndoit,inndusetottimpuloperaieiderepicarenmn.Setreceguraeprubeteiprin flacr, se introduce acul de repicare cu fragmentul de cultur, atingnd uor mediul (n centrul eprubetei), pn ce partea din cultur rmne pe mediu. Uneori este bine ca fragmentul de cultur s fiepuinafundatnmediu,pentruafaceuncontactmaistrnscuel. Se scoate acul de repicat din eprubet, se arde din nou gura eprubetei i se astup cu dopul din mna dreapt. Se treceicaptuldopuluicareafostinutcumnaprinflacr,darfoarterapid. Se arde din nou acul n flacr pan la rou. Aceast operaie este absolut necesari trebuie fcut cu rbdare,pentruaseevitainfectarea mediilorurmtoare.Dupardereaacului seiadinnoueprubetacu cultura ce trebuie repicati se repet operaia de repicare cu o alt eprubet steril. Toate micrile descrise mai sus, din care const operaia de repicare, trebuie executate destul de repede pentru a nu permite infectarea mediilor sterile din eprubete. Ele trebuie fcute cu o oarecare ritmicitate i nu prelungite prea mult. De asemenea trebuie respectate o serie de indicaii, care la prima vedere par minore,dardecaredepindefoartemultreuitauneirepicri. Astfel,trebuieavutenvedere: inerea eprubetei n poziie orizontal n timpul repicrii pentru a evita cderea sporilor de ciupercii bacteriidinatmosferpemediu; inerea acului de repicat n poziie vertical n flacri nu orizontal, pentru ca arderea s se fac pe o poriunectmaimare; scoaterea dopului de vat cu degetul mic al minii drepteiinerea lui tot timpul n mn, pentru al feridecontaminrisecundare; arderea gurii eprubetei la scoatereai introducerea dopului de vat, deoarece pe marginile exterioare aleeprubeteipotexistagermenideinfeciesecundar. Dup dezvoltarea culturii se observ aspectul, culoarea, tipul coloniilor, precum i eventuala prezenacontaminriicualtemicroorganisme.