6.

FOSFATAZA ACID

Ca i fosfataza alcalin, fosfataza acid catalizeaz acelai tip de reacie (hidroliza esterilor acizilor fosforici), deosebirea const n valoarea pH-ului, care pentru fosfataza acid se situeaz n domeniul acid. O O ACP ROH + HO P OH R O P OH + HOH OH OH Fosfatazele acide se gsesc n numeroase esuturi ale organismului uman: oase, ficat, prostat, splin, rinichi, plachete, eritrocite. Cele mai mari cantiti de fosfataz acid (ACP) se gsesc n prostat. Cea mai important utilitate a fosfatazei acide este detecia carcinomului de prostat i al carcinomului metastatic al prostatei, a cror inciden maxim este peste vrsta de 50 de ani la brbai. Carcinomul de prostat are patru etape (stagii): primele dou etape localizeaz tumora malign pe prostat, iar n ultima etap tumora este metastazat la nivelul mai multor esuturi din organism. Creteri ale activitii ACP n snge sunt evideniate din pcate n cele mai multe cazuri n carcinomul de prostat aflat n faza a patra (tumor metastazat). Se constat creteri ale activitii fosfatazei acide prostatice n hiperplazia prostatei i n interveniile chirurgicale prostatice. n bolile sistemului osos de asemenea se nregistreaz creteri ale activitii fosfatazei acide prostatice serice (metastaze osoase, boala Paget). Distrucia excesiv plachetar din trombocitopenie este acompaniat de creteri ale activitii ACP sanguine. Pstrarea serului (obinut imediat dup recoltarea sngelui) la temperatura camerei timp de cteva ore conduce la eliminarea CO 2 din ser, creterea alcalinitii acestuia i scderea activitii ACP. Dac serul nu se lucreaz imediat acesta trebuie s fie rcit sau acidifiat pn la pH 6,5. Prin acidifiere, activitatea enzimatic a ACP se menine dou zile la temperatura camerei. Prezena hemolizei aduce cu sine o surs de erori prin creterea activitii ACP datorit ACP eritrocitar. Intervalele de normalitate pentru fosfataza acid total i pentru cea prostatic sunt: - pentru brbai: ACP total: 2,5 11,7 nkat/L ACP prostatic: 0,2 5 nkat/L - pentru femei: ACP total: 0,3 9,2 nkat/L ACP prostatic: 0 0,8 nkat/L Pentru determinarea activitii enzimatice ACP se utilizeaz aceeai tehnic prezentat pentru ALP, cu deosebirea c reacia se desfoar la pH slab acid ( n jurul valorii 5) i reacia este stopat prin alcalinizare, cnd p-nitrofenolul rezultat devine colorat n galben i absoarbe la 405 nm.

NO2 + HOH OPO3H2 ACP pH 5

NO2 + H3PO4 OH

Pentru creterea sensibilitii determinrii ACP prostatic, serul de analizat este incubat n prezena unor inhibitori ai enzimei (L-tartrat, timol-ftaleinmonofosfat) i prin diferena dintre activitatea ACP nainte de inhibare i dup inhibare se obine activitatea ACP prostatic. O alt metod de dozare a activitii fosfatazei acide utilizeaz ca substrat naftilfosfatul, care la pH 5.5 este transformat n -naftol, care n prezena unei sri de diazoniu se transform ntr un complex azo colorat ACP -naftil fosfat -naftol -naftol + 4-clor-2-metilbenzendiazoniu complex azo colorat Sistemul se utilizeaz n specil la dozrile cu reactivi uscai unde slide+urile includ reactivii, tamponul, agenii tensioactivi i agenii de reticulare. Citirea se realizeaz la 600 nm Pentru creterea sensibilitii determinrii ACP prostatic se utilizeaz i tehnicile imunochimice n care enzima este inhibat de anticorpi specifici (RIA, EIA, contraimunelectroforeza, imunofluorescena). Izoenzimele derivate de la ACP se caracterizeaz pe baza msurtorilor electroforetice, n gel de agar sau poliacrilamid, dup vizualizare cu Fast blue B 8. Izoenzimele se pot caracteriza i prin inhibiie chimic difereniat deoarece Ltartratul inhib activitatea izoenzimei prostatice i leucocitare, iar formaldehida inhib izoenzimele eritrocitare i trombocitare. 6. FOSFATAZA ACID

Ca i fosfataza alcalin, fosfataza acid catalizeaz acelai tip de reacie (hidroliza esterilor acizilor fosforici), deosebirea const n valoarea pH-ului, care pentru fosfataza acid se situeaz n domeniul acid. O O ACP ROH + HO P OH R O P OH + HOH OH OH Fosfatazele acide se gsesc n numeroase esuturi ale organismului uman: oase, ficat, prostat, splin, rinichi, plachete, eritrocite. Cele mai mari cantiti de fosfataz acid (ACP) se gsesc n prostat. Cea mai important utilitate a fosfatazei acide este detecia carcinomului de prostat i al carcinomului metastatic al prostatei, a cror inciden maxim este peste vrsta de 50 de ani la brbai. Carcinomul de prostat are patru etape (stagii): primele dou etape localizeaz tumora malign pe prostat, iar n ultima etap tumora este metastazat la nivelul mai multor esuturi din organism. Creteri ale activitii ACP n snge sunt evideniate din pcate n cele mai multe cazuri n carcinomul de prostat aflat n faza a patra (tumor metastazat).

Se constat creteri ale activitii fosfatazei acide prostatice n hiperplazia prostatei i n interveniile chirurgicale prostatice. n bolile sistemului osos de asemenea se nregistreaz creteri ale activitii fosfatazei acide prostatice serice (metastaze osoase, boala Paget). Distrucia excesiv plachetar din trombocitopenie este acompaniat de creteri ale activitii ACP sanguine. Pstrarea serului (obinut imediat dup recoltarea sngelui) la temperatura camerei timp de cteva ore conduce la eliminarea CO 2 din ser, creterea alcalinitii acestuia i scderea activitii ACP. Dac serul nu se lucreaz imediat acesta trebuie s fie rcit sau acidifiat pn la pH 6,5. Prin acidifiere, activitatea enzimatic a ACP se menine dou zile la temperatura camerei. Prezena hemolizei aduce cu sine o surs de erori prin creterea activitii ACP datorit ACP eritrocitar. Intervalele de normalitate pentru fosfataza acid total i pentru cea prostatic sunt: - pentru brbai: ACP total: 2,5 11,7 nkat/L ACP prostatic: 0,2 5 nkat/L - pentru femei: ACP total: 0,3 9,2 nkat/L ACP prostatic: 0 0,8 nkat/L Pentru determinarea activitii enzimatice ACP se utilizeaz aceeai tehnic prezentat pentru ALP, cu deosebirea c reacia se desfoar la pH slab acid ( n jurul valorii 5) i reacia este stopat prin alcalinizare, cnd p-nitrofenolul rezultat devine colorat n galben i absoarbe la 405 nm. NO2 + HOH OPO3H2 ACP pH 5 OH Pentru creterea sensibilitii determinrii ACP prostatic, serul de analizat este incubat n prezena unor inhibitori ai enzimei (L-tartrat, timol-ftaleinmonofosfat) i prin diferena dintre activitatea ACP nainte de inhibare i dup inhibare se obine activitatea ACP prostatic. O alt metod de dozare a activitii fosfatazei acide utilizeaz ca substrat naftilfosfatul, care la pH 5.5 este transformat n -naftol, care n prezena unei sri de diazoniu se transform ntr un complex azo colorat ACP -naftil fosfat -naftol -naftol + 4-clor-2-metilbenzendiazoniu complex azo colorat Sistemul se utilizeaz n specil la dozrile cu reactivi uscai unde slide+urile includ reactivii, tamponul, agenii tensioactivi i agenii de reticulare. Citirea se realizeaz la 600 nm Pentru creterea sensibilitii determinrii ACP prostatic se utilizeaz i tehnicile imunochimice n care enzima este inhibat de anticorpi specifici (RIA, EIA, contraimunelectroforeza, imunofluorescena). Izoenzimele derivate de la ACP se caracterizeaz pe baza msurtorilor electroforetice, n gel de agar sau poliacrilamid, dup vizualizare cu Fast blue B 8. Izoenzimele se pot caracteriza i prin inhibiie chimic difereniat deoarece LNO2 + H3PO4

tartratul inhib activitatea izoenzimei prostatice i leucocitare, iar formaldehida inhib izoenzimele eritrocitare i trombocitare.

8. AMILAZA

Amilaza (AMS) face parte din clasa hidrolazelor, este o glicoprotein constituit dintr-un singur lan polipeptidic de-a lungul cruia sunt dou legturi tiolice (-SH) i patru legturi disulfur. Amilaza necesit pentru activare ioni de clorur i calciu i are masa molecular 50.000 60.000 D. -Amilaza (-AMS) catalizeaz hidroliza legturilor -glicozidice din amiloz, amilopectin i glicogen, n urma creia se obin glucoza, maltoza i dextrine (oligopeptide care conin legturi -(1-6). Sursele cele mai importante de amilaz sunt pancreasul i glandele salivare, cantiti reduse gsindu-se i n muchii scheletici i intestinul subire. Datorit masei moleculare mici amilaza poate fi filtrat prin glomeruli i este prezent i n urin. Datorit acestui fapt amilaza se ndeprteaz din ser prin filtrare glomerular i apoi catabolizare tubular renal sau excreie n urin. Amilaza salivar are proprietatea de a cataliza hidroliza polizaharidelor n cavitatea bucal i este rapid inactivat de aciditatea sucului gastric atunci cnd nainteaz n tractul digestiv. Activitatea amilazei salivare este mare la nou nscui, la care secreia amilazei pancreatice este redus Cea mai important aciune catalitic este efectuat de amilaza pancreatic deoarece acioneaz asupra -polizaharidelor la nivelul intestinului subire (fig.7). Cea mai important afeciune diagnosticat prin msurtorile de activitate enzimatic ale amilazei serice i urinare este pancreatita acut, deoarece afeciunile altor esuturi dect pancresul nu conduc la creterea concentraiei acestei enzime. n pancreatita acut se nregistreaz un maxim al nivelului seric al amilazei la 24 de ore de la declanarea bolii, nivelul revenind la normal dup 3 5 zile. Valorile maxime ale amilazemiei n pancreatita acut sunt de 2,5 5 ori mai mari dect valorile normale ale acestui parametru. In genere, amilazemia nu se coreleaz cu severitatea pancreatitei, creteri ale activitii plasmatice ale amilazei nregistrndu-se i n leziunile glandei salivare (parotiditele), n bolile intraabdominale (ulcerul perforat, obstrucia intestinal, colecistitele, infarctul mezenteric, apendicita acut), n insufuciena renal i cetoacidoza diabetic, n pneumonie i tuberculoz, n arsuri, sarcin i traumatism cerebral, n peritonit i metastaze, n obstrucia ductului biliar, n interveniile chirurgicale toracice, n insuficien renal, cnd se nregistreaz hiperamilazemia. In pancreatita cronic, amilazemia nu este ridicat, n schimb n pancreatita acut crete activitatea amilazei i n lichidul peritoneal i pleural, iar activitatea seric a lipazei crete n paralel cu amilazemia. Creterea activitii amilazei n lichidul pleural i peritoneal, peste valorile din snge prezint valoare diagnostic pentru pancreatita acut. n ultima perioad s-au evideniat complexe constituite din amilaz i imunoglobuline care sunt mari pentru a fi filtrate prin glomerul i n aceste condiii se instaleaz macroamilazemia datorit scderii eliminrilor renale ale enzimei.

Macroamilazemia este caracteristic bolilor autoimune i nu se gsete n relaie cu pancreatita. Pentru specia om s-au evideniat dou tipuri de amilaze serice (izoamilaze) P i S, provenite din pancreas i respectiv glandele salivare. Migrarea electroforetic a fraciilor S este mai mare dect a fraciilor P i acestea corespund regiunii i globulinelor. n pancreatita acut se nregistreaz creterea activitii izoenzimei P, n care P3 este predominant. Izoamilaza S reprezint aproximativ 2/3 din activitatea amilazei din serul normal, iar izoamilaza P este preponderent n urin. Amilaza este stabil n ser i urin o sptmn la temperatura camerei i dou luni la refrigerare n serurile hiperlipemice triacilglicerolii inhib activitatea amilazei serice i din aceast cauz amilazemia pacienilor cu pancreatit acut poate fi normal.

Cavitate bucal Glande salivare

Amilaza salivar

Amidon

Diet

Digestie partial

Intestin subtire

Fragmente oligozaharidice

Amilaza pancreatic

Sange portal

Digestie intestinal

Pancreas

Maltaz

Ficat

Fig. 7 Digestia i absorbia amidonului n prezena amilazei Administrarea corticosterolilor morfinei i altor substane din aceast clas, pacienilor nainte de recoltarea sngelui, conduce la creterea nivelului seric al amilazei. -Amilaza este prezent n mal i are proprietatea de a cataliza hidroliza macro moleculelor din amidon, nspre capetele nereductoare, cu eliberarea maltozei (uniti dizaharidice) Intervalele de normalitate pentru activitatea amilazei sunt: 95 290 U/L n ser i 35 400 U/L n urin. n genere activitatea plasmatic este cu 20 U/L mai mare dect cea seric. Determinarea activitii AMS se poate realiza prin mai multe metode: a) n prezena iodului, amidonul d o coloraie albastr a crei intensitate este proporional cu amidonul rmas dup incubarea cu -amilaza din prob; b) Cuplarea reaciei catalizat de AMS cu -glucozidaza, hexokinaza i glucozo-6fosfatdehidrogenaza (NAD) dependent, a crei absorban se modific dependent de raportul strilor oxidate i reduse. Evidenierea izoenzimelor salivare i pancreatice se relizeaz prin electroforez n gel sau amidon. Fraciile proteice etalate de-a lungul cmpului electric sunt colorate fie prin procedeul (a) fie prin cuplare cu glucozoxidaz, maltoz, peroxidaz, n prezena o-toluidinei.

CH2OH O OH OH OH CH2OH O O

CH2OH O OH O OH CH2OH O OH O OH OH OH n-2

CH2OH O OH OH OH CH2OH O

AMS

n/2
OH

OH

glucozidaza

n
OH

OH OH OH

HK

Maltoza
CH2OPO3H2 O

Glucoza

HK n ATP

n
OH

OH OH OH

+ n ADP O C H C OH

CH O H C OH n HO C H H C OH H C OH CH2 OPO3H2 + n NAD+

G-6-PD

HO C H H C OH H C CH2

O + n NADH + n H+

OPO3H2

6-Fosfogluconolactona

Bibliografie Greiling, H., 1995, Lehrbuch der Klinischen Chemie und Pathobiochemie, Schattauer Verlag, Stuttgart Junge, W., Troge, B., 1989, Evaluation of New Assay for Pancreatic Amylase, Clin.Biochem., 22, 109-114 Kruse-Jarres, JD., 1989, Evaluation of a New -Amylase Assay, J.Clin.Chem.Clin.Biochem., 27, 103-113. Tietz, NV., 1995, Clinical Guide to Laboratory Tests, WB Saunders Company, 4651, Philadelphia Young DS., 1997, Effects of Preclinical Variables on Clinical Laboratory, AACC Press

10. COLINESTERAZELE

Colinesterazele sunt hidrolaze capabile s catalizeze hidroliza esterilor colinei. n esuturile indivizilor umani se ntlnesc dou tipuri distincte de colinesteraze: acetilcolinesteraza (AChE) i pseudocolinesteraza (PChE). Dac acetilcolinesteraza catalizeaz strict specific acetilcolina, pseudocolinesteraza catalizeaz preferenial butirilcolina i semnificativ i alte substraturi (esteri ai
O + CH3 + CH3 AChE CH3 COOH + HO H2C CH2 N CH3 H3C C O CH2 CH2 N CH3 + HOH CH3 CH3 Colina Acetilcolina O PChE + CH3 H3C CH2 CH2 COOH H3C CH2 CH2 C O CH2 CH2 N CH3 + HOH CH3 + + CH3 HO H2C CH2 N CH3 CH3

morfinei, atropinei i cocainei) Acetilcolina are rol de neurotransmitor i dac nu este hidrolizat corespunztor, cantitile excesive rezultate blocheaz activitatea neuromuscular. Acetilcolinesteraza se gsete n creier, celulele nervoase, eritrocite, iar pseudocolinesteraza este prezent n ser, pancreas, inim, ficat i n sistemul nervos central. Pseudocolinesteraza seric acioneaz de patru ori mai rapid asupra butirilcolinei dect acetilcolinesteraza asupra acetilcolinei. Activatorul colinesterazelor sunt ionii de magneziu, iar inhibitorii acestora sunt organofosfaii i carbamaii. Acetilcolinesteraza este o glicoprotein cu masa molecular 70.000 75.000 D i n soluii aceasta este prezent sub forma unor agregate care au mase moleculare de aproximativ 260.000 D. Valoarea optim de aciune a acestei enzime este pH 7. Butirilcolinesteraza prezint o structur tetramer, a crei mas molecular medie este 440.000 D i prezint un interval optim de pH 6 8. Comparativ cu acetilcolinesteraza, la nivelul moleculei de pseudocolinesteraz acioneaz ca inhibitori i srurile cuaternare de amoniu. Valoare diagnostic mai important pentru organismul uman prezint pseudocolinesteraza deoarece aceasta se gsete preponderent n snge i n sistemul nervos central. Activitatea seric a pseudocolinesterazei este sensibil la variaiile vitezelor de biosintez proteic i din aceast cauz este utilizat n aprecierea dezvoltrii unor afeciuni hepatocelulare i a unor procese maligne. Scderi ale activitii plasmatice a pseudocolinesterazei se nregistreaz n post (nfometare), n organismele arilor, hepatita cronic evolutiv, staza hepatic, cancer hepatic, mielom multiplu, boala Hodgkin, anemii feriprive, nefropatii. Diagnosticul n intoxicaiile cu organofosfai i carbamai se poate elibera pe baza diminurii activitii enzimatice PChE tiut fiind faptul c acetia sunt inhibitori. De regul inhibiia este nsoit de tremur i paralizii. n organismul unor indivizi se biosintetizeaz o pseudocolinesteraz atipic ce este implicat n declanarea fenomenelor de paralizie n urma expunerii indivizilor la unele anestezice

(succinilcolina). Paralizia complet se instaleaz rapid dup administrarea anestezicelor (cteva ore) i de aceea este strict necesar ca pacienii s fie testai din acest punct de vedere naintea intervenilor chirurgicale i a administrrii anestezicelor. Valori crescute ale activitii pseudocolinesterazei sunt nregistrate n alcoolismul cronic, diabetul zaharat cu obezitate, tireotoxicoz. Prezena acetilcolinesterazei n eritrocite nu permite ca serul utilizat n determinarea activitii colinesterazelor s fie hemolizat, n schimb enzimele din aceat subclas sunt stabile la refrigerare timp de cteva zile. n otrvirea cu organofosfai i carbamai sunt inhibate ambele enyime, efectul toxic datorndu-se otrvirii acetilcolinesterazelor terminaiilor nervoase. n bolile ficatului: ciroze, hepatite, carcinoame cu metastaze pe ficat, scderea activitii colinesterazice se datoreaz scderii capacitii biosintetice a ficatului. Intervalul de normalitate al colinesterazelor este 4.700 11.800 U/L. Determinarea activitii colinesterazei prin metoda colorimetric se bazeaz pe msurarea scderii pH-ului sistemului n urma eliberrii acidului acetic din reacia catalizat. Cea mai utilizat metod de determinare a activitii colinesterazei se bazeaz pe utilizarea substraturilor: butirilcolin i 5,5-ditiobis-(2-nitrobenzoic acid) care n final se transform n 5-tio-nitrobenzoic acid, care este un produs colorat n galben, fotocolorimetrabil.
O (+) N CH3 CH3 CH3 (+) N CH3 CH3 CH3 PChE

2 H3C

CH2

CH2

CH2

CH2

2 H3C

CH2

CH2

COOH

+ 2 HS

CH2 Tiocolina

CH2

O2N

COOH S

COOH NO2 +
2 HS

(+)

CH3

CH2

CH2

N CH3 CH3

5,5'-ditiobis-(2-nitrobenzoic acid)

O2N
2

COOH SH +

S CH2

CH2

(+)

CH3

(+)

N CH3 CH3 CH3 N CH3 CH3

S CH2
5-tio(-2-nitrobenzoic acid)

CH2

O alt tehnic de determinare a activitii enzimatice a colinesterazelor utilizeaz fericianura de potasiu care oxideaz tiocolina, rezultat din reacia catalizat la pH

7.6, la ditiobiscolin. Virajul de culoare de la fericianur la ferocianur este nregistrat la 400nm. Bibliografie 1. Trundle, D., 1988, Detection of Cholinesterase Inhibition, Annals of Clinical and Laboratory Science, 5, 345-352 2. ***Method Recomanded by the Working Group on Enzymes for Clinical Chemistry, 1992, Eur.J.Clin.Chem., 30, 163-170. 12. GLUCOZO-6-FOSFAT DEHIDROGENAZA

Glucozo-6-fosfat dehidrogenaza (G-6-PD) este o oxidoreductaz care catalizeaz oxidarea glucozo-6-fosfatului la 6-fosfogluconat sau lactona corespunztoare n prezena NADP.
O CH H HO H H C C C C H OH OH OPO3H2 O OH + NADP+ G-6-PD H HO H H COOH C C C C OH H OH OH OPO3H2 H HO H H C C C C C CH2 OPO3H2 OH H OH O + NADPH + H+

CH2

CH2

Reacia aparine untului pentozofosfailor prin care glucoza este metabolizat i este important prin produsul secundar obinut, NADPH utilizat n procesele sintetice celulare. Enzima este constituit din dou subuniti i posed masa molecular medie 104.000 D. n structura catenelor polipeptidice enzimatice sunt absente resturile cistinice i cisteinice, iar n centrul activ enzimatic este prezent un rest lisinic. Activatorii enzimei sunt ionii Mg2+ strict necesari n procesele catalitice, iar inhibitorii sunt piridoxalfosfatul i fluordinitrobenzenul. esuturile n care se gsete glucozo-6-fosfat dehidrogenaza sunt: adrenal cortex, timus, nodulii limfatici, splin, glanda mamar n lactaie, eritrocitele. n condiii normale enzima se gsete n cantiti foarte mici i n serul uman. G-6-PD eritrocitar prezint importan remarcabil pentru c are rolul de a menine n form redus NADPH, care la rndul su regenereaz gruprile tiol (-SH) din peptide i polipeptide care au fost oxidate (glutation). Gruprile tiol libere n form redus (-SH) protejeaz hemoglobina de agenii oxidani prezeni n celule. Din aceste cauze, deficiena n G-6-PD expune eritrocitele agenilor oxidani, hemoglobina oxidat deterioreaz membrana eritrocitar i apare hemoliza. n aceast situaie se instaleaz anemia hemolitic. Creteri ale activitii enzimatice plasmatice a G-6-PD se nregistreaz n infarctul miocardic i n anemia megaloblastic, nenregistrndu-se creteri n bolile hepatice. Creteri moderate ale activitii G-6-PD se pot ntlni n cetoza diabetic, tromboza cerebral, mononucleoza infecioas, carcinomul metastatic.

Nu este indicat s fie utilizate serurile cu hemoliz n determinrile de activitate enzimatic ale G-6-PD. n condiii de normalitate intervalul de activitate enzimatic este 0 0,18 U/l. Determinarea activitii G-6-PD (NADP) dependent se bazeaz pe diferena de absorban a coenzimelor nicotinamidice aflate n stare oxidat sau redus, rezultate n procesul catalizat (Fig.2).