8 Biosinteza Proteinelor Procesul complex de biosinteza a proteinelor structurale ei functionale, implica paniciparea a numeroase enzime, dar rolul esential

in dirijarea acesteia il au acizii nucleici. Watson gi Crick (1953) au formulat dogma centrala a geneticii care exprima aceasta relatie prin urmtoarele: transcriere translagie (REPLICARE) ADN ~;> ARN > PROTEINE Sunt identiticate deci trei mecanisme esentiale care asigur sinteza acizilor nucleici, cuplata cu sinteza proteinelorz replicarea ADN-ului, care const in biosinteza moleculelor de ADN cu respectarea identittii structurale intre molecula primara gi moleculele nou formate (vezi 7.1.1.); transcrierea (copierea) mesajului genetic din ADN in ARN-ul care se sintetizeaza (vezi 7.2.); _ translatia (traducerea) mesajului genetic de la ARN Ia moleculele proteice care se formeaz. Unele date mai noi oblig la completarea celor aratate mai sus. Astfel, a fost descrisa replicarea retrovirusurilor sub actiunea reverstranscriptazei (0 ADNpolimeraza ARNdependenta), ceea ce implica transferul invers al informatiei genetice, de Ia ARN la ADN, fenomen in discordanta cu dogma centrala a biologiei moleculare. Apoi, relativ recent au fost puse in evidenta si ARN-polimeraze ARNdependente. Ca urmare, 0 schema mai completa este cea de mai jos:

Procesul schitat se realizeaza in dou etape: 0 etapa cu sediul in nucleul A celular si a doua in citoplasm. Nucleele celulelor contin ADN. Anumite fragmente ale dublei elice de ADN, numite gene, contin informatia care se transmite in citoplasma, prin intermediul ARNm; acesta dirijeaza, in ribozomi, sinteza unei

anumite proteine. L, 8.1 Mecanismul smtezei proteice. 8.1.1 Elementele functionale implicate in biosinteza proteinelor. Acidul dozoxiribonucleic (ADN) contine informatia genetica, sub forma codincata, privind proteinele care se sintetizeaz. ADN-ul nu participa in mod nemijlocit (direct) la biosinteza proteica in sensul oa nu serveste ca matrita directa in ordonarea aminoacizilor in proteina (acest proces se realizeaza prin intermediul ARNm). Reamintim ins ca ADN serveste ca matrit pentru propria replicare precum si sinteza de ARN-m in care este transcris mesajul genetic pentru sinteza proteinei. Participanti directi Ia procesul de biosintez proteica sunt acizii ribonucleici (vezi structura lor intrun volum anterior) si ribozomii. ( ARN-ul mesager este purtatorul informatiei genetice din nucleu la ribozomi (in citoplasma), care sunt sediul sintezei proteice. Biosinteza ARN-m precede sinteza unei proteine. Moleculele de ARN-m indeplinesc direct functia de matrita pentru sinteza proteic. ln structura lantului ARN-m succcesiunea de triplete nucleotidice (codonii),(vezi volum anterior) specitica anumiti aminoacizi ce urmeaz a ti inglobati in Iantul polipeptidic care se sintetizeaza si care va avea o structura conform mesajului genetic transmis de ADN. ARN de transport (10-15 % din ARN-ul celular) este sintetizat de asemenea pe matrita de ADN monocatenar, el oferind ribozomilor materialele necesare sintezei proteice. Tndeplineste rol decisiv in descifrarea (traducerea) mesajului genetic prin recunoasterea, Iegarea si tranportarea aminoacizilor din faza solubila a citoplasmei la ribozomi. Fiecare aminoacid are una sau mai multe molecule de ARNt. Specificitatea pentru un aminoacid este dictat de succesiunea bazelor azotate din molecula si este exprimata prin tripletul de nucleotide ce constituie

anticodonul, recunoscut (cu 0 eventuel imperfecgiune la baza a treia-fenomen wobble) de codonul din ARNm. Agadar, ARN-m detine la nivel citcplasmatic planul construirii Iantului pclipeptidic, iar ARNt leaga si transport la nivelul rib0z0mil0r elementele lui constitutive, adic aminoacizii.

ARN-ul ribozomal este sintetizat deasemenea pe matrit de ADN monocatenar, intri in structura rib0z0miI0r, reprezentnd pin la 50-60 % din masa acestor organite. Are rol in orientarea moleculelor de ARN-t si in plasarea pe ribozomi a aminoacizilor activati, facilitnd decoditicarea (traducerea mesajului genetic). Foarte probabil ca ARN-r s reprezinte scheletul structural al rlb0z0mil0r de care se ataseaz in lccuri specifice, proteinele ribozomale. Ribozomii reprezinta "santierul", fiind sediul gi suportul material al procesulul de asamblare a aminoacizilor in lanturi pclipeptidice specince. Ribozomii la procariote sunt formati din 0 subunitate mic, de 30S, lar la eucaricte 40S gi 0 subunitate mare, de 50S si respectiv 60S. Subunitatea mare 503 prezint 2 centrii

cataiitici: centrul A (aminoacidic) gi centrul P (peptidic), unda are loc Iegarea amin0acilARN-t $i, respectiv, peptidil-ARNt. De meniionat c subunitatea mare prezint gi 0 activitate peptidiltransferazic. Subunitatea 30S Hxeaz ARNm (purttor ai informaigiei genetice), care i$i axercit funciia de matrig pentru biosinteza Ianturilor polipeptidice. Legatura dintre Iangul ARNm si ribozomi este Iax, ceea ce permite derularea tripleteior nucieotidice (codoni) din ARN-m, derularea in dreptul situsurilor catalitice (A si P), indicnd natura aminoacil-ARNt care s tie inclus in Iarfqtul proteic. _ V Agregarea subunittiior care alctuiesc ribozomii este putemic dependent de concentratia icnilor de Mg: Ia concentratii mici disociaz, iar Ia concentratii mari se agreg. Fiecare ribozom poate asigura sinteza compiet a unei catene polipeptidice. Poliribozomii sau polizcmii sunt un ansamblu de mai multi ribozomi ascciati unui singut lant de ARN-m, asigurnd 0 rapiditate sporit in descifrarea Iantului ARN-m, cu mrirea eticientei unei singure macromolecule ARN-m, prin sinteza

simultan a mai multor Ianturi corespunztoare acelcrasi catene polipeptidice. La nivelul ribozomilor neatasati membranelor reticuiului endcpiasmatic se sintetizeaz proteineie de structur ('proteine ce se consum in special Tn diviziune si crestere sau proteine de inlocuire ale organitelor uzate din celula respectiv), iar Ia nivelul ribozomiicr atasati membranelor reticulului endopiasmatic (reticulul endoplasmatic rugos) se sintetizeaz proteinele de export (enzime, hormoni, tropocolagen, anticorpi etc. ). 8.1.2 Etapele biosintezei proteinelor. Realizarea biosinteze i comport patru etape esenfiale: activitivarea aminoacizilor, initierea lantului polipeptidic, elongarea lantului polipeptidic, terminarea si eliberarea lantului polipeptidic. Factorii caracteristici pentru fiecare etapa, participanti in mod catalitic sunt: factori de activare, de initiere, de elongare si de terminare. Pe lng factorii artati mai sus, cu rol in realizarea procesului mai sunt aminoacizii, care constituie "precursorii micromoleculari ("crmizile constitutive") din care se sintetizeaz Iantul polipeptidic.

8.1.2.1 Activarea aminoacizilor si formarea complexului aminoacil-ARN, (AA-ARN,). Procesul reprezint etapa de pregtireasi decurge in dou stadii, cu participarea ATP si a unei enzime caracteristice denumita V aminoaciIARNt-sintetaz (E). Fiecare aminoacil-ARN,sintetaz are trei situsuri active: un situs pentru ATP, comun tuturor tipurilor de enzim, un situs specific pentru aminoacid sl un situs specific pentru ARNtuI corespunztor aminoacidului (in principiu 61 specii ARNQ posibileg in realitate, in celul, aprox. 32 specii existente). p Formarea complexului AA-AMP. Enzima (E) leag mai inti ATP si aminoacid in situsurile corespunztoare, cataliznd o reactie de esterificare a gruparii carboxil la nivelul restului fosforic alfa din ATP, mai srac in electroni. Se formeaz un complex AA-AMP in urma reactiei:

cu stabiliroa unei Iegturi macroergice intro carboxilul aminoacidului gi restul fosforic din AMP, legtur care imprim aminoacidului din complexul AAAMP un nivol ridicat de reactivitate gi pentru care raaciia se numegte "activarea aminoacidului". Formarea complexului aminoacii-ARN,_ Enzima pstreaz compusul AAAMP, Ieag selectiv ARN, corespunztor preluat din citosoi gi catalizoaz un atac inucleoiil ai oxidriiuiui 3` din restul adenilic de Ia captul 3`-terminal, asupra Iegturii carboxi|fosf0rice din complexul AA-AMP, conform reaciiei:

Se formeaz 0 legtur intre aminoacil ei ARN,uI corespunztor, cu un po- { tengial energetic ridicat, de 29,30 kJ/mol (7,0 kcal/mol), apropiat celui NMAGAZINAT intro. legeture macroergice de ATP. Pirofosfatul reliberat in cursul formerii AA-AMP este descompus de 0 pirofosfetaze, cu eliminare de energie, folosite in formaree complexului AAARNt, cet si in schimberile conformationale ale enzimei specifice, schimberi care permit eliberarea complexului AA-ARN, in citosol. Restul aminoacil este legal de molecula ARNt specitice la nivelul situsului eminoacil, adice la nivelul extremitetii 3(cu secveni nucleotidice 5`CCA3`) (vezi Biochimia descriptive). Legaree aminoacidului in pczitie 3` a extremitetii edenilice din ARNt a fost demonstrate experimental. Procesul de activare are loc in citosol si dupe jlegarea de ARNt, aminoacizii pot ti introdusi in mecanismul ribozomal al sintezei proteice.

8.1.2.2 Inigierea Iangului polipeptidic. Experimental sa demonstrat ce sinteza lantului polipeptidlc are loc dinspre capetul Nterminal spre cel CterminaI. Formarea legeturilor peptidice intre aminoacizii componenti ai

proteinei are loc le nivelul ribozomilor. Perioada pentru care ribozomii nu sunt angajati in sinteza proteice ii geseste in citosol disociati in celedoue subuniteti, ier asocieree subunitetilor conduce Ia formarea ribozomilor functionali, fenomen ce introduce trenslatia. Faza de initiere incepe cu formaree produsului formil-metionilARNt. Metionina se leage cu un ARNt speciec (ARNHMET), dupe care gruperea amino este blocate prin formilere, sub actiunea catelitice a unei enzime de trensformilare care foloseste in calitate de coenzime Nw-f0rmil tetrahidrofolatuI(THFN-CH=O) (vezi cap. Wtaminezacidul folic):

Exist dou sg/Iecii moleculare de metionil-ARNQM dintre care numai una, notat metionilARNtft este capabil de a accepta gruparea formilg enzima de transformilare nu catlizeaz formilarea metioninei Iibere. De fapt, f0rmiImeti0ni!ARN Wt este singurul aminoacil-ARNt acceptat in situsul peptidic al ribozomului, Ia prokariote; la eukaricte, aminoacidul de iniyiere este Tntotdeauna metionina gi formilarea nu are loc.

Cercetri recente aucoiauus la identificarea a cel putin 9 factori implicati in sinteza lantului proteic, in etapa de initiere, elongare sau determinare. (` in continuare, formil-metionil-ARN, impreun cu subunitatea 30S a ribozomului gi cu ARN-ul mesager formeaz un complex de initiere. La formarea coimplexului de initiere particip $i trei proteine numite factori de initiere 5i notati ca: IFQ1, lF2 gi IF-3, precum 5i GTP. Subunitatea 30S se leag de ARN", pe un loc specitic. situat la cca. 10 nucleotide de la captul 5` al ARNm (cu participarea

factorului lF3). FormilmetioniI-ARNt se leaga de complex, recunoscnd, prin anticodon, codonul AUG de pe ARNm (legtura Hind accentuata de factorul lF2). Preccmplexul de initiere se leaga de subunitatea 50S, formndu-se complexul activ de initiere 703. ln acesta, formil-meti0nilARNt ocup Iocul din ribozom denumit situs peptidic (P). in ribozom mai exista un al doilea loc, adiacent, denumit situs aminoacidic (A), care in complexul activ de initiere pregatit pentru faza de elongate este gol. Dementionat ca legarea subunittii 50S in vederea formrii ribozomului functional este insotita de hidroliza de GTP.

Ilustrarea grafic a fazei de initiere a sintezei proteice ia prokariote este redat in tig. 8.1.2.2.2. 8.1.2.3 Elongarea Iantului pclipeptidic. Cregterea catenei poiipeptidice se realizeaza de asemenea pe suportul material ribozomal, prin adaugarea succesiva de resturi aminoacil aduse de ARNt specmci. Etapa incepe cu atagarea unui aminoacil-ARNt pe locul A din ribozom. Acidui inserat este in functie de codonul din ARNmi care se afla in Iocui A, deoarece anticodonul de pe aminoacil-ARNt trebuie sa corespunda codonului. lnsertia necesita GTP gi o proteina numit factor de elongare (EF-Tu). Cnd amineacilARNt este legat de Iocui A, are loc hidroiiza GTP gi GDP Iegat de factorul EFTu se desprinde de pe ribozom (refacerea GTP are loc prin reactia cu al doilea factor de elongare, denumlt EFTs, reactie prin care se reface complexul GTP cu EF-Tu, gata pentru un nou ciclu de elongare).

Acum s-a format un complex ln care fMet-ARNt ocup locul P, lar amlnoacll-ARNt ocupa locul A. Urmeaz formarea unei legturi peptidice prin transferul formllmetionlnel (de pe locul P) pe gruparea amino din amlnoacilARNt ul de pe locul A. Reactia este catalizat de peptidil-transferazi, o enzim care face parte din subunltatea 50S a ribozomulul. Urmarea formrli Iegturli peptidlce este c pe locul P rmne un ARNt descrcat, lar pe locul A se gseete un dipeptidilARNt. Urmeaz elapa de translocare ln care ARNt descrcat prseste locul P, lar peptidllARNt se mut de pe locul A pe P; cocncomltent cu aceast deplasare ARNm se mlsc cu trel nucleotide spre captul 3`. ln acest fel codonul urmtor de pe ARNm este gata pentru a tl recunoscut (citit) de catre anticodonul unui aminoaclIARNt corespunztor. Translocarea necesit un al treilea factor de elongare, numit EFG (sau translocaz) sl hldrollza unel molecule de GTP. Procesul elonagrii (la prokariote) se red schematizat in fig. 8.1.2.3.1.

Dupa translocare, procesul alongarii so repet, deoarece pe Iocul A se fixoaz un alt aminoacilARNt, gi anuma cel specificat de codonul din ARNm aprut in droptul locului A. Astfal, mesajul genetic raprezentat do codonii din ARNm este "citit" de anticodonii ARNt $i tradus in formarea legturii peptidice, intra aminoacizi, in sacvanta specificat de gona copiata da ARNm.

8.1.2.4 Terminarea asamblarii Iangului polipeptidic. Somnalizarea sfr$itului sintezei proteice este detorminata de aparitia, pe ARNm in dreptul locului A a unui codon "non sans" (UAG, UAA sau UGA), moment in care nemaitiind speciticat nici un alt aminoacid (gi cu interventia unor factori de terminagiez RF1, RF-2 $i RF-3) are loc cprirea sintezei. RF-1 recunoagte c0d0nii UAG 5i UAA iar RF-2 recun0a$te tripieta UAA 5i UGA. Al treiea factor gi GTP-ui au r0I in aliberarea Iangului polipeptidic sintetizat precum gi a ARNt corespunztor ultimului aminoacid din secveni, a ARNm gi a ribozomului nefunciionai (ribozom disociat in subunitgila 30S $i 50S). Fig. 8.1.2.4.1. red faza de terminare a sintezei ilaniului polipeptidic. terminagiez RF1, RF-2 $i RF-3) are loc cprirea sintezei. RF-1 recunoagte c0d0nii UAG 5i UAA iar RF-2 recun0a$te tripieta UAA 5i UGA. Al treiea factor gi GTP-ui au r0I in aliberarea Iangului polipeptidic sintetizat precum gi a ARNt corespunztor ultimului aminoacid din secveni, a ARNm gi a ribozomului nefunciionai (ribozom disociat in subunitgila 30S $i 50S). Fig. 8.1.2.4.1. red faza de terminare a sintezei ilaniului polipeptidic.

Creeterea ehcientei traducerii se realizeaz prin angajarea simultan a mai multor ribozomi in citirea ARNm, fiecare de la captul 5` terminal spre 3`. ln felul

acesta, la un anumit moment, un ribozom va fi purttorul unui lant polipeptidic mai lung sau mai scurt, functie de momentul in care a inceput citirea. Ribozomii mai apropiati de captul 5` al ARNm, spre cleosebire de cel mai Tndeprtati de acesta, vor purta Ianturi polipeptidice mai scurte, avnd inc "de citit" 0 mare portiune de ARNm. Asocierea mai multor ribozomi cu traducerea aceleaei molecule de ARNm constituie ansamblul denumit poliribozom sau polizom (fig. 8.1.2.4.2.)

8.1.2.5 Prelucrri posttranslayionale ale Iangului pclipeptidic. Lantul pclipeptidic astfel sintetizat nu este pr0dusuI final. Gruparea formil de la captul N-terminal este hidrolizat de 0 deformilaza, iar uneori metionina terminal este eliberat prin hidroliz, inca in timpul cat lantul polipeptidic este in sinteza. Odata cu eliberarea de pe rib0z0m pct avea I0c scindari ale lanturilor polipeptidicez indeprtarea prin aminopeptidaze a unor resturi de aminoacizi de Ia capatul N-terminal, scindari specifice cu indeprtarea unor portiuni mari din lant (ca in cazul transformrii proinsulinei in insulin). Pot avea l0c mcdificari specitice ale resturilcr Iaterale ale aminoacizilor (hidroxilarea prolinei si lizinei in colagen, de exemplu), atasarea glucideler cu formare de gIic0pr0teine, fosforilarea un0r proteine, atasarea gruprii prostetice Ia enzimele complexe, formarea legaturilor disulfidice prin intermediul resturilor de cisteina.` Consecinta

este formarea prcteinelor finale functicnale cu 0 structura bine determinata. De subliniat ca Ianturile polipeptidice se spatializeaz pe msura ce se sintetizeaza, astfel ca multe proteine au, in mare, geometria finala, inainte ca ultimii aminoacizi sa fie atasati. 8.2 Energetica biosmtezei protemelor.

Formarea proteinelor structurale si functlonale necesita un consum mare de energie. Formarea unei legafuri peptidice impune consumarea energiei a cel putin 4 legturi macroergice (ATP si GTP; dou pentru activarea aminoacidului cu formarea de amin0acilARNt si dcu in decursul procesului efectiv de sinteza a legaturii-CO-NH-), adic aproximativ 30,56x4=122,2kJ (29,2 kcal). Energia Iibera standard de hidroliza a unei Iegaturi peptidice este aproximativ -20,9 kJ (-5 kcal); variatia energiel libere la formarea legaturii peptidice este de 101,3kJ (24,1l<cal), ceea ce indica un proces endergonic. Utilizarea unei cantitti atat de mari de energie poate H interpretat ca 0 masura pentru acuratetea transcrierii mesajului , genetic inglobat in structura ARNm, la nivelul catenei polipeptidice nou sintetizate. Wteza procesului de sintez este apreciabil: a fost stabilit ca 0 caten polipeptidic a hemoglobinei (aprox. 140AA) se formeaz la 37 grade Celsius, in aproximativ 20s.

8.3 Reglarea biosintezer protemelor

8.3.1 Reglarea la procariote. Jacob ei Monod (1961) au propus 0 ipoteza privind mecanismul molecular de reglare a sintezei proteice. lpoteza, contirmata ulterior la prokariote, pe cale experimentala, se refera la controlul transcrierii mesajului genetic in ARNm, etapa cheie in realizarea sintezei proteice. Conform acestei teorii, denumita teoria operonului, in cuprinsul unei molecule de ADN-cromozomial se afla mai multe gene. Gena reprezinta un fragment de secvent nucleotidic din ADN care detine informatia pentru sinteza unei proteine.

Geneie care definesc structura proteinelor sunt numite "gene structuraIe". Asociat acestora exista 5i "gena` operator" care reprezinta 0 secven;51 de nucleotide din segmentul urmtor de ADN. Ea are rol de control asupra transcrierii genei structurale in ARNm ce urmeaza sa funcgioneze ca matriga idirect pentru sinteza ~pr0teinei. in vecinatate se gseete 0 "gena promotor", care marcheaza Iocul in care ARN-poIimeraza-ADN-dependenta (enzima ce asigur realizarea transcripiiei) incepe sa acgioneze in sensul sintezei ARNm. iimpreun (geneie structuraie, gena operator gi gena promotor) constituieunitate functional numita "operon". in acelas timp o "gen reglatoare" asigura sinteza unei proteine specifice, numita represor, care la rndul sau controleaza gena operator. Fixarea represorului impiedica transcrierea genei stmcturale in , ARNm. in tig. 8.3.1.1. se red modelul reglajului genetic al biosintezei proteinelor la bacterii. _ . 8 La baza procesului de reglare a biosintezei proteice stau doua mecanisme, inductia si represia, explicabile prin teoria operonului; cele doua mecanisme pot fi urmarite in procesul biosintezei unor proteine-enzime.

8.3.1.1 Inductia enzimatic are rol stimulator, in sensul ca sinteza unei proteine enzimatice este facilitata de prezenta in concentratie mare a substratului corespunzator acestei enzime (substrat, agent inductor). Asa

bunaoara, unele bacterii intr-un mediu de cultura bogat in lactoza (S) sintetizeaza in exces lactaza (enzima specifica). Conform teoriei operonului, sinteza lactazei este codihcata intr-un fragment de ADN care reprezinta gena structuraie si este transcrisa intrun lant de ARNm sub controlul genei operator. Daca se formeaza sau se adauga in mediu, substrat, adica Iactoza, atunci acest agent inductor, se leaga de represor (sintetizat sub stimulul genei reglatoare) si se va forma un complex represor-inductor in care este blocata actiunea represorului de tixare pe gena operator. in acest fel, gena operator eliberat va ti capabila sa controleze transcrierea genei structuraie in ARNm si in final va induce (stimula) sinteza enzimei iactaz. in absenta substratului (S) sinteza enzimei este inhibata (nu se realizeaza).

8.3.1.2 Represia enzimatic exercita efect inhibitor asupra sintezei unei proteine. Ca agent represor (corepresor) pentru sinteza unei enzime poate functiona un metabolit, intermediar sau final, din cadrul unui sir de reactii in care intervine respectiva enzima. Aceasta poseda efect inhibitor asupra sintezei proteineienzima care catalizeaza acel sir de reactii. Arginina (metabolit intermediar in ciclul ureogenetic), in concentratie mare, inhiba isinteza enzimei ornitin-carbamiItransferaz (OCT), care catalizeaza formarea citrulinei din ornitina si carbamilfosfat (vezi Ureogeneza). Arg are rolul unui agent represor (corepresor) care se combina cu represorul genetic (sintetizat sub actiunea genei reglatoare). Complexul represorcorepresor devine activ, se fixeaz pe gena operator si blocheaza transcrierea genei structuraie in ARNm si deci reprima (inhib) sinteza OCT. in absenta acumulrii metabolitului (Arg), represorul este inactiv, gena operator controleaza transcrierea genei structuraie in ARNm si are loc sinteza enzimei.

8.3.2 Reglarea la eucariote. lnductia si represia enzimatica au fost studiate la bacterii, unde reglareasintezei proteice prin controlul transcriptiei este deosebit de eficace, dat fiind timpul de existenta foarte scurt al ARNm (T1/2

de ordinul minuteior), la aceste specii. Desi datele obtinute in privinta inductiei si represiei au putut fi confirmate si Ia eucariote, la aceste specii, modelul operonului nu are rol exclusiv in reglarea biosintezei proteinelor, dat Hind faptul ca durata de existenta a ARNm aici este semnificativ mai mare (T1/2 de aprox. o