REACIA ANTIGEN-ANTICORP

Interaciunea Ag -Ac
Legturi necovalente ntre epitop i domeniul regiunii

variabile a anticorpului:
legturi de hidrogen
legturi ionice

interaciuni hidrofobe
fore van der Waals

Concept lact-cheie

Reversibilitate
Posibilitatea existenei

legturilor multiple

Factori care influeneaz reaciile Ag-Ac

Afinitatea
Aviditatea Raportul Ag:Ac Forma fizic a Ag
Ac n exces
Ag n exces

Echivalen => formarea unei reele

Afinitatea
Intensitatea interaciunii dintre un singur determinant antigenic i un singur situs de pe suprafaa Ac.

Afinitate mare Ac

Afinitate mic

Ac

Ag

Ag

Afinitatea = forelor de atracie i de respingere

Calcularea afinitii
Ag + Ac AgAc
Aplicarea legii aciunii maselor:

Keq =

[AgAc] [Ag] x [Ac]

Keq = constanta de echilibru

Reactivitatea ncruciat
Capacitatea unui situs de combinare al unui Ac de a interaciona cu mai mult de un determinant antigenic.

Capacitatea unei populaii de molecule de Ac de a interaciona cu mai mult de un Ag.

Reacii ncruciate
Ac anti-A

Ac anti-A

Ac anti-A

Ag A

Ag B

Ag C

Epitop identic

Epitop similar

Utilizarea anticorpilor n laborator

Ac policlonali

Ac monoclonali

Producerea Ac policlonali / monoclonali

EXPLORAREA SISTEMULUI IMUN NESPECIFIC

COMPONENTA UMORAL

Componente umorale (dizolvate n plasm)

Reactani de faz acut
Sistemul complement

Derivai ai acidului arahidonic (Prostaglandine, Leucotriene)

Reactanii de faz acut

Apar ca rspuns la leziuni tisulare: infecii, traumatisme,

arsuri. Se manifest prin modificarea compoziiei n proteine a plasmei:

Cresc: proteina C reactiva, 2-macroglobulina, fibrinogenul,

ceruloplasmina, glicoproteina 1-acid, haptoglobina, complementul C3 etc.

Scad: albumina, transferina (cauze: creterea permeabilitii

vaculare-PG, histamin),

Fractiunile electroforetice
Prealbumin Albumin 1- globuline: 1- antitripsina 1- glicoproteina acid 2- globuline: Haptoglobina 2-macroglobulina Ceruplolasmina -globuline: Transferina LDL Factorii de complement -globuline: IgG IgA IgM IgM IgD

Reactani de faz acut.

Proteina C reactiva (CRP = C reactive protein)
Denumire: aglutineaz cu un polizaharid (fraciunea C )

din peretele Pneumococului; Rol: n aprarea antiinfecioas (actioneaza ca o opsonina)

n timpul reaciilor de faz acut concentraia poate

depi valoarea normal de peste 1000-2000 de ori; Concentraia CRP creste rapid in 4-6 ore dup infectare/interv. chirugicala/trauma, si atinge nivelul maxim la 24-72 de ore.

Reactani de faz acut.

CRP
Valoare normal: sub 5 mg/l Nou-nscut: sub 15 mg/l
Valoare crescut: Inflamaie acut Boli reumatice Malignoame Interventii chirurgicale Infeciile virale nu determin creteri ale CRP, sau apar

creteri moderate! Valoare CRP normal nu exclude existena unei boli maligne!

Reactia de aglutinare metoda calitativa/semicantitativa

Aglutinarea apare cnd un anticorp interacioneaz cu

un antigen multivalent, insolubil, cu legarea ncruciat a particulelor antigenice de ctre anticorp i formarea unor agregate mari, insolubile, vizibile macroscopic sau microscopic.

Reacia de aglutinare
Detecteaz creterea nivelului de protein C reactiv circulant:

Principiu: Testul CPR latex

test rapid de aglutinare pe lama pentru detectia directa si semicantitativa a proteinei C reactive in ser.

Reactivul continand anticorpi specifici anti-proteina C reactiva umana aglutineaza in prezenta CRP din serul pacientului.

+
Reacie calitativ

[INSERT FIGURE 17.11]

Reacie semicantitativ

Sistemul complement
Valori normale: Factorul C3: 0,85- 1,93 g/L
Creteri: infecii bacteriene Scderi: consum sporit (activitate citolitica marcata) Imunitate sczut Glomerulonefrit Distrucii celulare hepatice Lupus eritematos Poliartrit reumatoid

Factorul C4: 0,12- 0,36 g/L

Creteri: infecii bacteriene Scderi: Edem angioneurotic (boala Quincke) Lipsa congenital a C4 Glomerulonefrit Lupus eritematos Lipsa de 1-antitripsin Vasculit Afeciuni hepatice Poliartrit reumatoid

Clasificarea tehnicilor imune

Reactia Ag-Ac

n solutie

n gel

Ag/Ac fixat pe suport solid

Tehnici cantitative
Tehnica ELISA
Chemiluminescen ta

Tehnici calitativ e

Tehnici cantitative

Tehnici calitative

Latexaglutina re

Nefelometr ia

Turbidimetr ia

Dubla imunodifuziu ne OUCHTERLO NY

Imunelectro foreza

Imunodifuzi Electroimu noprecipita unea rea simpla radiala simpla Tehnica MANCINI LAURELL

Reacii de precipitare
Principiu:

Reaciile de precipitare au la baz interaciunea anticorpilor cu antigene solubile multivalente. La un anumit raport ntre concentraiile Ag i Ac, se formeaz complexe imune AgAc macromoleculare care i pierd solubilitatea i precipit.

Metoda dublei imunodifuzii Ouchterlonytehnic calitativ

Reactie de precipitare in gel.

Se efectueaz 2 godeuri n gel:

ntr-un godeu se pune o soluie de Ag,

Incubare 12-48h (la 37 )

n cellalt godeu se pune o soluie de Ac.

Reacia de precipitare: la zona de echivalen se formeaz un precipitat vizibil .

Metoda dublei imunodifuzii Ouchterlony. Aplicatii

1.Testarea prezenei unor anticorpi serici: Ag complementar cunoscut => identificarea prezentei unui Ac Amestec de Ag cunoscute => identificarea prezenei mai multor Ac

 2. Testarea identitii antigenelor:

Metoda dublei imunodifuzii Ouchterlony. Aplicatii

Ex.: ntr-un godeu a fost amplasat un amestec de anticorpi, iar acetia, la

contactul cu antigenele din cele dou godeuri, genereaz linii de precipitare independente. Caz 1: antigene identice. Caz 2: un astfel de model demonstreaz non -identitatea celor dou antigene . Caz 3: este prezent o linie de precipitare similar modelului de identitate, dar care prezint un pinten suplimentar. Acesta reflect faptul c cele dou antigene au epitopi n comun, dar c antigenul y prezint i epitopi suplimentari, responsabili pentru reacia suplimentar a unor molecule de Ac .

Metoda dublei imunodifuzii Ouchterlony. Aplicatii

Imunelectroforeza. Tehnica calitativ

Reprezint o variant a precipitrii n gel, n care unul dintre componentele

reaciei Ag-Ac, de obicei antigenul, este supus nti separrii n cmp electric.
Dup separarea electroforetic a fraciunilor antigenului, se realizeaz un

godeu lung paralel cu direcia de migrare a proteinelor, n care va fi introdus Ac sau amestecul de Ac.
Moleculele de Ac i de Ag difuzeaz n gel i, n zona de echivalen apar

arcuri de precipitare.
Este efectuat, de obicei, cnd este necesar confirmarea prezenei unui

component monoclonal detectat prin electroforez.

Imunelectroforeza

Imunelectroforeza nu este o metod cantitativ.

Imunelectroforeza

Imunodifuziunea radial simpl (Tehnica Mancini) Tehnic cantitativ

Este un test cantitativ pentru antigene. Acest test este efectuat ntr-un gel care conine o concentraie constant,

uniform de Ac, n ntregul volum al gelului. Diferite concentraii de Ag dizolvate n volume standard sunt plasate ulterior n godeurile rotunde realizate n gel.
Plcile

sunt lsate la incubat cel puin 24 ore, perioad n care Ag difuzeaz n gel. Pe msur ce Ag se deprteaz de godeu, concentraia acestuia scade proporional cu ptratul distanei parcurse. Cnd concentraia Ag ajunge la un raport optim cu concentraia Ac din gel (zona de echivalen), se formeaz o linie de precipitat sub form de inel centrat de godeu. Diametrul inelului (d) este un indicator al concentraiei antigenului.

Imunodifuziunea radial simpl (Tehnica Mancini)

[Ag] ~ d2

Imunodifuziunea radial simpl (Tehnica Mancini)

[Ag] ~ d2

Electroimunoprecipitarea simpl (tehnica Laurell)-Tehnic cantitativ

Gel de agaroz cu anticorpi

prencorporai;
Decupare godeuri la catod; n

care se pipeteaz serurile de control i probele de la bolnavi;

Migrare n cmp electric;

Se

formeaz conuri de precipitare a caror lungime este proporionala cu concentraia antigenului in proba analizata.

Explorarea aprrii imune specifice

COMPONENTA UMORAL

Imunoglobuline
Recunosc moleculele de

antigen i reacioneaz n mod specific cu acesta

Activeaz mecanismele

efectoare menite s le ndeprteze (fagocitoza, sistemul complement)

Clasele de imunoglobuline

IgA, IgG, IgM n ser

IgA g/L Sub 1 lun
1-6 luni 7-24 luni
0,00-0,02 0,03-0,82 0,14-1,08

IgG g/L
7,0-14,8 3,0-10,0 5,0-12,0

IgM g/L
0,05-0,30 0,15-1,09 0,43-2,39

3-6 ani
7-12 ani 13-16 ani

0,23-1,90
0,29-2,70 0,81-2,32

5,0-13,0
7,0-16,5 7,0-15,5

0,50-1,99
0,50-2,60 0,45-2,40

Peste 16 ani 0,69-3,82

7,2-16,9

0,63-2,77

Metode de dozare - turbidimetrie

Determinarea atenuarii

intensitii unei radiaii luminoase care nu i schimb drumul optic;

Metode de dozare - nefelometria

Msurarea intensitii unei

radiaii luminoase reflectate sub un anumit unghi;