Caracteristicile decisive ale materialelor biomimetice utilizate pentru grefele vasculare i pentru stenturi reprezint structura suprafeei i caracteristicile

chimice ale materialului de implant care susin adeziunea , proliferarea i diferenierea celulelor endoteliale i a celulellor musculare netede , tipurile de celule majore ale vaselor de snge . Recent , dovezi experimentale ale mai multor laboratoare au indicat o stimulare puternic a activitilor celulare de pe suprafeele nanotubului TiO2 aliniate vertical, n comparaie cu suprafeele amorfe ale TiO2 . Cu toate acestea, exist raportri contradictorii, n ceea ce privete dimensiunea scrii nanometrice i rolul chimiei, i cristalinitatea nanotuburilor care provoac rspunsuri celulare . Aici am demonstrat c nanotuburile de 15 nm ofer o stimulare mult mai puternic de diferenierii a celulelor mezenchimale de celulele endoteliale i a celulelor musculare netede de nanotuburile de 7-10 nm , n timp ce rate ridicate ale apoptozei au fost observate la nanotuburile de 100 nm. De asemenea, adeziunea celulelor endoteliale, proliferarea i motilitatea erau de cteva ori mai mari la nanotuburile de 15 nm dect cele de 100 nm. Mai mult dect att, datele noastre indic o dominare clar a geometriei nanometrice asupra comportamentului celulelor endoteliale n chimia suprafeei i a cristalinitii suprafeei nanotubului TiO2. Aceste rezultate indic faptul c un reglaj fin al suprafeelor TiO2 la scar nanometric va fi un parametru esenial n optimizarea celulelor endoteliale i a rspunsurilor celulelor musculare netede la implanturile vasculare. Recent, s-au acumulat tot mai multe dovezi experimentale care arat c topografia scrii nanometrice este un factor important pentru recunoaterea celular a micromediului biologic i a materialului biomimetic utilizat pentru grefele vasculare, stenturi, sau implanturi osoase. Sensibilitatea rspunsurilor celulare la topografia suprafaei a fost demonstrat cu ajutorul unui model de distan lateral fcut din suprafee nanoporoase auto-organizatoare de Al i Si, sau un model de scar nanometric cu o proeminen a suprafeei bazate pe demixarea polimerului i a dispunerii matriceale a grmezii de aur. Topografia, chimia i energiile suprafeei care se modific pe suprafeele de titan au avut un impact puternic asupra diferitelor rspunsuri celulare i au ajustat rata de succes a implanturilor in vivo. Mai multe publicaii recente au artat c activrile celulare de pe nanotuburile TiO2 sunt conduse de repere topografice ale supraei la nivel de scar nanometric i difer semnificativ de cele nestructurate, suprafeele plate TiO2 sau de suprafeele vaselor de cultur de polistiren, dar rezultatele sunt contradictorii. n timp ce unele grupuri au artat un comportament ale celulelor mbuntit folosind faza anatas ale nanotuburilor de diametrul de 7-10 nm comparativ cu suprafeele plane Ti, studiul nostru a artat anterior o mbuntire n mod semnificativ a activitii celulare a celulelor stem mezenchimale (MSC) pe nanotuburile amorfe de 15 nm n comparaie cu nanotuburile de 70-100 nm. Cu toate acestea, ntr-un alt studiu, proliferarea celulelor musculare netede a fost mai mare pe suprafeele plane TiO2 dect pe nanotuburile de 30 de nm, n timp ce celulele endoteliale au artat o reacie opus. O parte din conflicte se pot datora diferitelor metode utilizate pentru a genera suprafeele TiO2, rezultnd o topologie diferit a suprafeei, a apelor cristaline i a compoziiei chimice. De exemplu, mai multe rapoarte indic un sprijin al celulelor superioare de ctre nanotuburile TiO2 ntr-o form cristalin anatas comparativ cu TiO2 amorf i acoperirea anatas a fost demonstrat pentru a mbunti osteointegrarea implantului. Experimente direct comparative, nu au fost efectuate nc pe suprafeele nanotuburilor TiO2. Mai multe explicaii ale rezultatelor discordante din diferite laboratoare pot fi determinate prin utilizarea diferitelor tipuri de celule, inclusiv a celulelor primare versus liniile celulare, precum i a diferitelor

metode utilizate pentru a evalua activitile celulare. Astfel, factorii dominani care determin activitile specifice ale celulelor i soarta celulelor pe micromediile nanotubulare TiO2 rmn a fi definite pentru fiecare tip de celul cu ajutorul analizelor cantitative i specifice.

Materiale i metode. Formarea nanotuburilor.

Foliile de titan (99,6 % puritate, Advent Ltd. ) au fost utilizate pentru producerea suprafeelor nanotubulare. Acoperirile formate din nanotuburi TiO2 comandate, autoasamblate de diferite diametre au fost aplicate folosind o celul electrochimic cu o configuraie de trei electrozi. Plasa de platin servete ca un contra electrod, i un electrod capilar Haber - Luggin cu Ag / AgCl ( 1 M KCl ) a fost utilizat ca i electrod de referin . Tratamentele electrochimice au fost efectuate n conformitate cu lucrrile anterioare raportate la 1 (M H3PO4 care conine 0,12 M HF ) cu un potenial aplicat de la 1 V pn la 20 V timp de 1 or la o temperatur ambiant Numai pentru experimentul cu fluorura de mare ( Figura 3 ) s-au efectuat anodizri n H3PO4 coninnd 0,3 M HF fr o procedur de splare ulterioar pentru meninerea concentraiei de fluorur de mare. Prin urmare, nanotuburile ridicate n fluor cuprind o concentraie de fluorur de 4 ori mai mare dect nanotuburile preparate n conformitate cu standardele ( stare HF sczut la 2 % F - concentrare dup mbibarea cu ap ). Toi electroliii au fost preparai din produse chimice cu grad reactiv i ap deionizat timp de mai multe zile. Morfologia diferitelor straturi de nanotuburi a fost investigat cu ajutorul unui microscop electronic de scanare FE - SEM 4800 ( Hitachi ). Pentru a produce structuri definite de oxid de titan, probele au fost calcinate la 450 C. n funcie de diferitele diametre i lungimi ale straturilor individuale ale nanotuburilor, mostrele cu diametre mai mici de 20 nm au fost inute timp de 20 min n cuptor pentru ca morfologia s rmn. Toate celelalte diametre au fost recoapte timp de 1 or. Structurile cristaline ale straturilor nanotuburilor formate au fost identificate utiliznd un difractometru cu raze X ( Phillips X'pert MPD PW3040 ). Investigaiile SEM au dovedit c, dup recoacere i conversia anatas, straturile TiO2 i-au pstrat integritatea structural. Pentru experimentele celulelor, mostrele au fost sterilizate prin utilizarea unei autoclave la 121 grade Celsius, nainte de nsmnarea celulelor. XRD-ul de nalt rezoluie a straturilor nanotuburilor dup autoclavare au artat c tuburile trebuie s fie amorfe. Compoziia chimic a mostrelor a fost caracterizat de spectroscopia de fotoelectroni prin raze X (PHI 5600 XPS), folosind radiaia monocromatic KR ( 1486.6 eV , 300 W), ca surs de interes. Energia de legtur a elementelor int (Ti 2p , 1s O , F1S , C 1s , 2p P , N 1s) a fost determinat la transmiterea energiei de 23,5 eV, cu o rezoluie de 0,1 eV, folosind energia de legtur de carbon (C1s : 284.8 eV) ca referin . VEGF ( factorul vascular endotelial de cretere) i 10 % din serul fetal de viel (FCS) pentru testul de proliferare celular i imunohistochimie. Celulele stem mezenchimale ale obolanului (SCM) au fost izolate din mduvele osoase proaspete din femurul obolanului de 4 sptmni, iar celulele clonale au fost selectate i extinse n continuare aa cum este descris anterior. Celulele clonale rein multipotenialitatea i sunt difereniate n mai multe linii mezenchimale, incluznd osteoblastiile, chondroblastul, adipocitele, mioblastul, miofibroblastul i celulele endoteliale n diferite condiii experimentale in vitro . Pentru vizualizarea n timp real a adeziunii celulare i a proliferrii, celulele MSC au fost transfectate stabil cu GFP ( proteina fluorescenta verde). Pentru analiza motilitii celulare a celulelor

endoteliale mlEND, acestea au fost marcate folosind trackerul celulelor fluoresecence-CM DII (Invitrogen) nainte de placarea cu celule aa cum este descris anterior. Pentru diferenierea MSC n celulele endoteliale sau n liniile celulelor, MSC au fost ntinse pe cipurile nanotuburilor TiO2 la o densitate celular de 5000/cm2 i cultivate n mediul de cultur al celulelor endoteliale (Promocell) suplimentate cu 50 ng / ml VEGF, 10 ng / ml FGF (factor de cretere fibroblast), 10 ng / ml IGF (insulina- ca factor de cretere), i 1% din FCS timp de 6 zile. Pentru diferenierea celulelor musculare netede, MSC au fost cultivate n DMEM-ul ridicat n glucoz, suplimentat cu 10 ng / ml TGF - _1 ( transformarea factorului de crestere - _1 ) i 10 % din FCS timp de 5 zile. Celulele progenitoare endoteliale umane au fost izolate din probele de snge proaspete din cordonul ombilical cum s-a descris anterior. Fraciunea rezultat a celulelor CD133 ( + ) a fost sortat din nou pentru a crete puritatea sa de pn la 98 %. Celulele izolate au fost cultivate n agentul 199 (M199 , GIBCO - BRL) suplimentate cu 20 % ser fetal bovin timp de 7 zile, placate pe diferite nanotuburi i stimulate pentru diferenierea celulelor endoteliale cu agentul 199 coninnd 5 ng / ml FGF - 2 (factorul uman de cretere a fibroblastelor recombinante, SIGMA ) i 10 ng / ml VEGF (factorul de cretere al endoteliului vascular) timp de 7 zile. Urmrind TiO2, implantarea necesit activarea migraiei i a diferenierii proliferrii endoteliale, un proces denumit neo angiogenez, care implic recrutarea de celule endoteliale la locul leziunii. Dou mecanisme comune ale neo - angiogenezei, i anume, migraia endotelial i germinarea celulelor endoteliale preexistente, precum i recrutarea de celule precursoare endoteliale din circulaie sunt critice n direcionarea celulelor pentru integrarea implantului de os cu succes. Celulele progenitoare endoteliale extinse in vitro de la celulele stem de stimulare CD133 ( + ) cu VEGF ( factorul de cretere al endoteliului vascular), s-au dovedit a contribui la neoangiogenez dup transplantul de celule din inima accidentului vascular cerebral al animalului model sau ischemia la nivelul membrelor a animalului model. Aici am demonstrat c suprafeele nanotuburilor TiO2 n intervalul 15-30 nm diametru furnizeaz indicii topografice specifice pentru a susine adeziunea, proliferarea, migraia i diferenierea celulelor endoteliale, care propun utilizarea unor astfel de suprafee nanostructurate cum ar fi materialele biomimetice adecvate pentru utilizarea grefelor vasculare. Rspunsurile celulelor endoteliale i MSC la suprafeele nanotuburilor TiO2 sunt n mare msur independente de coninutul de fluor i de structura cristalin a TiO2 dar stau la baza unui control riguros de topografie la scar nanometric. Constatrile sunt ntr-o anumit msur, n conformitate cu studiile anterioare cu privire la rolul dimensiunii nanometrice ale rspunsurilor celulare la suprafeele structurate. Adeziunea celular mbuntit i formarea de contact focal n intervale de distan distincte de 100 nm s-au dovedit prin utilizarea unui model protruziv nano punctiform de aur i a unor suprafee amorfe a unhui nanotub din alumin. Celulele endoteliale aortice bovine au expus contacte focale sporite, ntindere i mobilitate pe celulele nanotuburilor de 70 de nm fa de suprafeele plane TiO2, nanomodelele, dei mai mici dect 70 nm nefiind investigate n aceste studii . Aparent, celulele recunosc i rspund foarte sensibil la diferenele de distanare de jos de 1 nm i folosesc indicii nanotopografici pentru a explora i interpreta mediul lor. Intervalele scrii nanometrice de 28 i 58 nm sunt nc n msura de a susine contactele celulelor, dar o distan de 100 nm i chiar i mai mare rezult ntr-o ataare i rspndire a celulelor limitate, iar acest eec de adeziune conduce la contactul celulelor instabile i imature i organizarea deficit cytoskeletal. Descoperirile noastre indic un interval de dimensiune destul de ngust cu spaiere de 15-20 nm ca i indicaie topografic optim pentru sprijinul aderenei celulelor, proliferarea, migraia i evenimentele de difereniere, care sunt mediate de formarea de contacte focale. Propunem ca

spaierea de 15-20 nm s fie definit de mrimea domeniului extracelular (aproximativ 10-12 nm35) i, astfel, s se permit sau s se induce gruparea integrinelor n aproape cea mai bun modalitate de ambalare, care rezult din activarea optim. Dei nanotuburile TiO2 cu diametru mai mic de 15 nm nu au putut fi testate n adeziunea celular, deoarece acestea s-au dovedit a fi structural instabile, studiile noastre anterioare privind nanotuburile lateral similare ZrO2 aliniate cuprinse ntre 10 i 50 de nm au demonstrat c nanotuburile de 15 nm sunt, de fapt, mult mai eficiente n adeziunea i activarea celular dect nanotubul de 10 nm. Acest lucru sugereaz c o distan de 10 nm poate fi prea mic pentru a permite gruparea i confirma ipoteza noastr c ar putea exista o "fereastr" de 15-30 nm pentru recunoaterea celular optim a suprafeelor nanostructurate, mai degrab dect pentru creterea reciproc i liniar n adeziunea celular cu nanospaieri care scad pentru a netezi suprafeele. n concluzie, rezultatele noastre cu privire la rspunsurile dependente a mrimii nano a mai multor tipuri de celule, inclusiv MSC, osteoblastele, osteoclastele, 10 celule endoteliale i celulele musculare netede ale nanotuburilor TiO2 permit concluzia cum c o topografie nanostructurat ntr-o fereastr ngust de 15-20 nm nu este limitat la un anumit tip de celule , dar poate fi mai degrab o constant a aderenei mezenchimale sau a celulelor endoteliale, definit de dimensiunile geometrice i topografia integrinei mediate a contactelor celulei-matrice .