LUCRARE PRACTICA 1 SI 2

INFLAMATIA ACUTA
Inflama{ia este un proces biochimic gi celular care apare in tesuturile vascularizate, ca reactie de apirare , declangati de pitrunderea unor agen{i patogeni in {esuturile organismului. Cind celulele sau {esuturile sunt afectate, apare un rispuns rapid al lesuturilor inconjur5toare, acest rispuns fiind definit ca PROCES INTLAMATOR. Inflamafia presupune trecerea plasmei qi a substan{elor dizolvate in ea din patul vascular in lesutul intersti{ial din jurul ariei afectate, realizAnd EXUDATUL INT'LAMATOR. Cauzele inflamafiei sunt numeroase gi variate. Este esen{ial de in{eles ci inflama{ia qi infecfia nu sunt sinonime. Infec{ia presupune intotdeauna prezenla inflama{iei, dar inflamatia apare qi in alte situa{ii in care nu este infeclie. Clinic, inflama{ia este caractet'vatd de 5 semne qi simptome (manifestiri locale) descrise inci din primul secol al erei noastre de citre Celsius.

Acesteasunt: -RUBOR(rogeafn)
-TUMOR(tumefiere) -CALOR(cnldurn) -DOLOR(durere) -FLTNCTIO LAEZA (rnodifi carea funcfiei). Cu ocazia investigirii celulare a inflama{iei s-au observat 3 modificlri caracteristice la nivelul microcircula{iei (arteriale, capilare, venule) in zona afectatS: - vasele sanguine sunt obliterate crescAnd fluxul sanguin in zona afectatl; - permeabilitatea vasculari cregte, rezultAnd exudatul inflamator; - Ieucocitele aderl de peretele intern al vaselor , apoi migreazii prin peretele acestora spre
locul afectat. in contrast cu procesele imune care sunt antigen-specifice gi care au "memorie" procesul inflamator este nespecific deoarece se desf5goard aproximativ identic indiferent de stimuli gi se desf[qoarii in acelagi fel chiar qi la a doua expunere la acelaEi stimul. Se vorbeqte despre un proces inflamator acut gi unul cronic. Procesul inflamator acut, spre deosetrire de cel cronic, este autolimitat durAnd pinl cf,nd agresiunea ce a avut loc dispare; aceasta dureazl de obicei 8-10 zile de la debut pAni la vindecare, Inflamafia este considerati cronici daci dureazd peste 4 siiptimAni de la debut Reacfia inflamatorie acuti incepe dupii afectarea celular[, care poate fi cauzat[ de: - traumatisme - privarea de oxigen; - defecte immune sau genetice; - agen{i chimici; - microorganisme; - temperaturi extreme; - radiafii ionizante. Spre deosebire de raspunsul imun care necesiti zile pentru a se declanqa, efectele vasculare ale inflamaliei apar in cAteva secunde.

Manifestiri sistemice ale procesului inflamator acut FEBRA - are pe de o parte efect benefic in procesul de apdrare, deoarece unele microorganisme ce produc inflamatia sunt foarte sensibile la variatiile termice (Treponema palidum, Gonococul). Pe de altd parte este gi un inconvenient prin

LUCRARE PR4CTTCA 1 gr 2
cresterea susceptibilititii celulelor gazdd bacteriile gram negative.

la ac{iunea unor endotoxine elilterate

de

special al de obicei, de o deviere spre stAnga a neutrofilelor creqte, Aceasti cre$tere este insotit5, formulei lui Arneth, predominAnd formele tinererfaln.de cele mature. de citre ficat, cresc in DISPROTEINEMIA - majoritatea sunt proteine inflamafrei., Ele sunt cunoscute ca ficat. Astfel sunt crescu{i: inflamatorii a cdror sintezi se realizeazi in -factori ai coagularii: fibrinogenul, protrombina' factorul VIII' plasminogenul; -proteaze inhibitoare: o-1-antitripsina; -proteine transportatoare: haptoglobinele' ceruloplasmina, feritina; -componen{i ai sistemului complement:C1 , C2, C3, C4' C5' C6; -proteina C reactivE. LEUCOCITOZA

- in

timpul inflama{iei numirul leucocitelor gi

in

proteioelorffi!

Alte proteine scad

in timpul

procesului inflanator: proteine inhibitoare, proteine

transportatoare (transferina), albumina, prealbumina, alfa-1-lipoproteinele, beta-lipoproteinele. Cregterea reactan.tilor de fazi acuti in plasmi gi in special al fibrinogenului se asociazi cu creqterea VSH. Modificarea raportului proteinelor plasnatice duce la creqterea agregabiliii{ii eritrocitare 9i implicit creqterea VSH. Raportul albunine/globuline scade (valoare normall a raportului este

Deqi e o reac{ie nespecifici.n creqterea VSH este un irdicator fidel al rispunsului inflamator acut. Dinamica procesului inflamator este influentatl in afara proprietifilor agentului cauzal gi de terenul pe care se desftqoarii : -virsta; -starea nutri{tionali a organismului;
Principalete teste nespecifice ale inflamafiei acute sunt:

de L,2-lo4),

.VSH; .LEUCOGRAMA;

- FIBRINOGEN; - 'TFCTE nF I ARILITAT[.'SI'RICAT

. ELECTROFOREZA PROTEINELOR;
- REACTIARIVALTA; - HAPTOBLOBINA SERICA; - PROTEINA C REACTIVA.

LT]CRARE PRACTIC,'T 1 EI 2

1. REACTIA RIVALTA

reac{ie biochimici calitativi ce completeaz5 examenul citobacteriologic al lichidului din seroase: pleuri, peritoneu, pericard, articulafii.
Reac{ia Rivalta este
proteinele din lichidele biologice precipiti in mediu slab acid (acid acetic 2Y') daci depiqesc coneentratia de 3go/o.
PRINCTPIUL METODEI

MATERIALE NECESARE

lichidul biologic de analizat (pleural, pericardic, peritoneal); cilindru gradat; acid acetie 2o/"i

api distilati;

TEHNICA DE LUCRU

intr-un cilindru gradat se pun 100m1 apd gi eAteva picdturi de acid acetic 27o. In aceasti apa acidulatd se lasl si cadi o picituri din lichidul biologic de analizat cit mai aproape de suprafa{a apei. Daei reac{ia este pozitivi se formeazi pe traiectul piciturii un nor lin de proteine precipitate, ca ttun fum de !igarl". Reac{ia Rivalta este o metodi rapidi, necesarl pentru diferenfierea unui exudat de un
transudat. Exudatul este consecinla procesului inflamatorn are un conlinut in proteine de peste 3g7o, un pH acid gi coaguleazi (exemple: ascita din TBC peritoneal, cancere abdominale etc.)Transudatul este un lichid neinflamator, ce apare in condi{ii de stazi circulatorie cronici (insuficienfi cardiacii congestivi, staz portalh etc.), cu confinut in proieine sub 3g7o' reaclie ugor alcalini, necoagulabil.
2. LEUCOGRAMA
2.1

Numiritoare

de leucocite

pRINcTpIUL MET9DEI - Singele iecoltat in pipete speciale, diluat cu un lichid hemolizant ce pistreazl intacte leucocitele, este infrodus intr-un hemocitometru, unde acestea se numiri intrun volum determinat. MATERIALE NECESAR,E - pipeti Potain pentru leucocite, formati dintr-un tub capilar cu zece gradalii' cu notatiile 005 9i 1 prelungit cu o bula de dilulie. Deasupra bulei de dilufie notafia este de 11; - lichid de dilu{ie Tiirck (amestec de acid acetic glacial-2ml, albastru de metilen-2 picituri, apa distilati-100m1);

cameri de numirat Biirker-Tiirck; Iameli de sticli; microscop cu obiectiv I0 sau 20; materiale necesare pentru recoltarea sdngelui.

TEHNICA DE LUCRU 1, Se pregltegte camera de numirat Biirker-Tiirck Este necesari o bund aderen{a intre lama gi lamelS, care este asigurata cind se formeazi inelele lui Newton (inele colorate de refrac{ie). 2. Se recolteazi sAnge capilar - dupi inleparea pulpei degetului' prima piciturd se gterge, iar a doua se aspiri in pipeti. 3. Se incarci pipeta cu singe p6ni la diviziunea 0,5 sau 1 9i apoi cu lichid de dilutie pAni la diviziunea 11 (se realizeazi asffel o dilu{ie de 1/20 sau 1/10; capacitatea reali a pipetei este de

LACRARE PRACTICA 1 SI 2
11 volume, dar dilufia este de 1/10 sau 1/20 deoarece un volum de diluent rimene in tubul capilar gi nu dilueazi s6ngele).

ffi''#
,ff
i-44::-i

Camera de numarat

Btuket-Trt* Se

4,
5.

Se omogenizeazi sAngele diluat

prin agitarea pipetei citeva ninute,

arunci primele 2-3

picituri,
numirat prin apropierea vArfului pipetei de marsinea camerei acoperile cu lamela. Camera are o suprafafii de 9 mm', impnr[itn prin linii triple in 9 pitrate cu suprafafa de I mm2 (fig. 5). Pntratul din mijloc (de I mmz) este este de tip Thoma, fiind utilizat pentru numiritoarea de eritrocite. Pitatele din col{uri sunt impir{ite pri{ linii duble in 16 pitrate cu suprafa{a de l/25 mm2. Aceste suprafe{e se folosesc peniru nurnirarea
Se umple camera de

6.

Se realizeaza numirarea leucocitelor - se numari leucocitele din 4 sau 8 cimpuri cu suprafafa de 1 mm2. Din elementele figurate asezate pe liniile ce delimiteazi suprafala de numirat, se num5r6 numai cele de pe 2 linii de granitd (de exemplu, stiga qi sus),
leucoc ite nunarate -..*^,^,"

leucocitelor.

CALCUL Leucocite / mm'

x dilutie x inaltimea cameret.

Exemplu de calcul: pe suprafafa de 4 mm2 s-au numirat 240 leucocite. I)eci, pe 1 mm2 sunt 60 de leucocite, - daci recoltarea s-a efectuat p^Ani la notalia 0,5, numirul de leucocite/mm3 este: 60 x 20 x l0 = 12000 leucocite/mm' - daci recoltarea s-a efectuat pAni Ia nota{ia 1, numirul de leucocite/mm3 este:60 x 10 x 10 = 6000 leucocite/mm3

VALORI

NORMAI,E:
Fiziologice

L/mm3 = 4000-10000/mm3

VARIATII ALE NUM.{.RULUI DE LEUCOCITE

a.

La nou-nlscut se constati o leucocitozl de 20000-30000/mm3. Dupi 4-5 zile, numirul insi in primul an de via{i valoarea fiziologicl se mentine la 1000-12000/mmr.

scade,

LUCRARE PRACTIC| 1
b.

gI

in ultimile 2 luni de sarcini, la gravide se otrservl o creqtere a numirului de leucocite, chiar din ziua naqterii gi inci o siptimAni, numirul leucocitelor mamei ajungind la 2000030000/mm3.

in timpul menstrua{iei, variafiile numlrului de leucocite sunt ugoare' fie in plus, fie in minus. d. Numliul de leucocite creqte in emofii, efort fizic, putAnd ajunge la 15000-20000/mm3, dar la o ori dupa efort numirul leucocitelor revine la normal. La 3-4 ore dupi ingestia de alimente, existl de asemenea o crestere a numirului de leucocite, care poate sa;jungn la 10000 - 20000/nm3. La unele persoane sensibilizate fa{d de diferite alimente, mai ales pentru lapte gi c-are prezinta o intoleran{i pentru alimentul respectiv, se
c.

permanentii de 2000 - 3000 eremente/mmr, rhri si patologicS. leucopenii sunt congenitale gi rim6n neschimabate Unele o manifestare a nici aibi toati viati, altele sunt trecitoare, dureaza cAteva luni sau ani, apoi dispar secundar'

;".T,tJf,":.:H":tl1'illll"ilti1-."T"0*,"

(pneumpococ, streptococ, meningococ etc.) sau provocate de distrugerea lesuturilor proprii (traumatisme, infarct miocardic) qi cresteri neadaptative, apirute in leucemiirnumirul leucocitelor putind depdgi 100000/mm3, iar in circula{ie sunt aruncate elemente tinere ce nu-gi pot indeplini rolul fagocitar. Cregteri ale numirului de leucococite peste 30000/mm3 sunt cunoscute ca qi reacfii leucemoide, deosebindu-se de leucemie prin absenfa celulelor imature in sAngele periferic ai revenirea numirului Ia normal dupi incetarea ac{iunii factorului declan4ator.b, Leucopenii - reprezinti sciderea numirului de Ieucocite sub 4000/mm3. Pot sd aparii in: unele infec{ii microbiene (febra tifoidi, febre paratifoide, tularemia, bruceloza), infecfii virale (gripa, rujeola, rubeola, hepatita), parazitoze (malarie), infecfii grave de orice naturi (septicemii), dupi iradieri masive cu raze X etc.
2,2 Formula leucocitari
METODA DE DETERMINARE

a. Leucocitozel reprezinti creqteri ale numirului de leucocite peste Q@, reversibile cauzate mai ales de infecfii cu coci

Patologice
10000/mm3. Pot

fi: cresteri

Executarea frotiului metodei - Se intinde o picituri de sAnge proaspit recoltat pe o lami, in strat sub{ire, in aga fel incflt elementele sI nu fie suprapuse. b. Materiale necesare: - lame curate, degresate - microscop optic, ulei de cedru - singe capilar. c, Tehnica executiirii frofiului de sAnge - Se recolteazi o pielturi de sAnge proaspit pe marginea unei lame glefuite qi cu un coll rupt pentru ca latura sa si fie mai micd decf,t lama pe care se va executa frotiul Q; - Se aplicii apoi pe o laml de sticli, aqezatl pe masa de lucru, intr-un unghi de aproximativ 30o, astfel incit picitura de singe si se intindi prin capilaritate la marginea de contact dintre cele doui lame; - Se imprimi lamei glefuite o migcare de transla{ie uqoari, ceea ce va permitesingelui si se intindi intr-un strat sub{ire;

a. Principiul

LaCRARE PRACTICA

I gI 2

Imediat dupi intinderea frotiului, lama

se

agitd pentru uscarea rapidi a acestuia.

Colorarea oanooticd a frotialui de sdnge

Reactivi si materiale necesare Solu{ia May-Griinwald cu urmitoarea formull: eozinat de albastru de metilen 19, glicerini neutrl - 50m1., alcool metilic - 100m1. Solufie Giemsa confinind: eozinat de azur de metilen - 39, azur de netilen 0r8g, glicerini neutri - 250mlo alcool metilic 200m1. Apa distilatl neutri sau api tamponati. Lame de sticli. Pipete Pasteur, pipete gradate.

Ceas.

solufie Giemsa concentrati la lml api distilati neutri sau api tamponati, dupi care se lasi in repaus 20 de minute , iar ulterior lama se spali sub jet puternic de api qi se lasi pe stativ pentru uscare. / Calcularea formulei leucocitarc Formula leucocitari reprezinti exprimarea procentuali a diferitelor categorii de leucocite gi se calculeazi dupi numirarea a cel pu{in 200 de elemente pe frotiul de sAnge. Tehnica de lucru - Pe frotiu se pune o picitura de ulei de cedru Ei se fixeazi pozitja microscopului, folosind obiectivul cu imersie, diafragmul deschis gi condensatorul sus' solu{ie Giemsa diluati

EtaPele colordrii frotiul se acoperl cu un numir cunoscut de picituri din solufia MayGriinwald gi se lasd 2-3 minute; Colorarea - se face in doi timpi: timpul I - se adaugi peste solu{ia May-Griinwald un numir egal de picituri de api distilati neutri sau api tamponati, se omogenizeazi gi se lasi si se spele, se acoperii lama cu astfel 2 minute; timpul 2 - se indepirteazi solu{ia de pe lami

Fixarea

in propor{ie de 1-2 picituri

firi

Tabel nr, I
1

Tabel pentru calcularea formulei leucocitare

2
3

10

s
E B

L
M
P

Se parcurge frotiul deplasAnd preparatul intr-un singur sens gi in zig-zag pentru a surprinde atit elementele marginale cit gi pe cele din mijlocul lamei (limfocitele au tendin{a de a se grupa spre centru, iar neutrofrlele gi monocitele se disperseazi spre margine Ei in franjuri). Pe misura ce se intAlnesc leucocitele, ele se noteazi pe categorii intr-un tabel (tab. Nr.I), in grupuri de cAte 5 elemente, pentru diversele tipuri celulare folosindu-se notatia: - N = neutrofile nesegmentate - S = neutrofile segmentate

E - eozinofile B = bazofile

LT]CRARE PRACTIAI 1 SI 2

plasmocite Dupi numirarea a200 de elemente se face procentajul hecirei clase de elemente. Numlrul absolut a diferitelor tipuri de leucocite - exprimi nunirul de tip de leucocit continut intr-un mm3 de s6nge. Se calculeazi printr-o regulS de trei simpli, cunoscind distribufia procentuali qi numirul absolut total de leucocite/mm'. Exemplu: numdrul de leucocite este de 6600/mm3 - limfocite 22oh - deci, numirul absolut de limfocite este: (6600 x 22)1100 = 1452 limfocite/mm3
P --

L = Iimfocite M = monocite

VALORJ NORMALE AIE FORMULEI LEUCOCITARE 1-4V" Neutrofi le nesegmentate 50 - 70o/" Neutrofile segmentate 1 - 49/o Eozinofile 0-lo Bazofile 20 - 400 Limfocite 4 - 80/". Monocite

Varia{iile cantitative ale numirului de leucocite se insotesc ile modificiri in formula

Ieucocitari, Leucocitozd cu neutrolilie - infecfii localizate sau generalizate; - acutiziiri ale bolilor cronice; - intoxicafii endogene sau exogene; - LGC (leucemia granulocitard cronici) etc. 2. Leucopenie cu neutropenie - in unele infecfii bacteriene (febra tifoidii, febre paratifoide); - infec(ii virale (gripi, rujeol6, rubeoli); - colagenoza; - afec{iuni hematopoetice cu hipoplazie medulari; - agranulocitozi; - boli autoimune citotoxice-citolitice etc' 3. Leucopenie cu limfopenie - infectii supraacute; - boala Hodgkin; - dupi tratament cu cortizon sau citostatice imunosupresive etc. 4. Leucocitozd ca limfocitozd - debutul TBC; - alte boli infecfioase; - LLC (leucenie limfatici cronici) etc. 5, Leucocitozd cu eozinoJilie - stiri imunoalergice; - parazitoze; - sindrom Liifler; boali Hodgkin; - LGC cu eozino{ilie etc. 6. Leucocitozd cu bax,oJilie

1.

LUCRARE PRACTTCI|

I SI 2

Malarie; intoxica{ie cu plumb; tumori maligne; LGC etc.

boli infecfioase (mononucleoza infec{ioas5, febra tifoidi); pzrazitoze(malaria, trepanozomiaza); leucemiemielomonocitari; boala Hodgkin etc.

7. Monocitozd

Proteina C reactivi (PCR) este o roteini serici prezenti la persoanele slnitoase rn cantitate minimi, ce nu poate fi decelat[ prin tehnici uzuale. Numele de PCR derivf de la proprietatea sa de a precipita frac{iunea c polizaharidica a pneumococului.
PCR este un marker precoce al inflamafiei acute deoarece creqte Ia 2-4 ore de la debutul procesului inflamator.

precipitare Mancini),

Informa{ii asupra PCR se obfin prin metode calitative (dubla difuziune Qucherony, in caplar sa rea{ia latex-PCR) sau metode cantitative (imunodfuziunea radiald

PRINCIPIIJL METODEI - Testul PCR este un test de aglutinare rapidi pentru detectarea directl qi semicantitativl pe cartonagul PCR, Reactivul este o suspensie de particule latex reacoperite de anticorpi antiproteinii C reactivi umantr, care se aglutineazi in prezenll PCR din
serul analizat,

MATERIALE NECESART 1. PCR latex - suspensie de particule latex reacoperite de anticorpi antiproteinl C uman5, hidroxid de sodiu 0,959/1. preparatul este calitrrat in maniera de a detecta intre 6mgA 9i

2. Control pozitiv - ser uman, hidroxid de sodiu 0,959/1, 3. Control negativ - ser animal, hidroxid de sodiu 0,951.
4. 5. 6.
Agitator de unici IWODDELUCRU

250mg/l PCR

Egantion - ser stabilizat 48 de ore Ia 2-8oC (serul hemolizat gi lipidic nu este adecvat pentru test, risc6nd si furnizeze rezultate eronate). Agitator reglabil la 100 rpm.

folosinli.

f. 2. 3. 4. 5.

in prealabil reactivii se aduc la temperatura camerei. Se pun 50pl din egantion qi cite o picituri din fiecare control in cercurile individuale de pe
cartela test. Se agitl uqor flaconul latex inainte de a se utiliza. Se pune cAte o picituri de PCR latex in fiecare cerc, lAng5 egantionul de testat, Se amestecl cu un agitator de unici folosinfi astfel incAt si fie acoperitd in totalitate aria {iecirui cerc. Pentru fiecare eqantion se folosegte un nou agitator. Se introduce in agitatorul reglabil, la 100 rpm, timp de 2 minute.

INTERPRETARE
examineazi qi se indici prezenfa sau absenla aglutinirii. O aglutinare vizibili indici prezen{a PCR peste 6mgll /t^-ce se scoate

Dupi

din agitator,

se

/{*-\ \- -/

LUCRARE PRACTICA 1 $12

LIMITELEMETODEI
Factorul reumatoid din egantion interferE cu dozarea de PCR. Interferen{a este eliminati folosindu-se un absorbant. Se adaugi o piciturl de absorbant pe fiecare eqantion inainte de a se adiuga PCR latex.
Cregteri ale PCR poate

si apari in: 1, Toate cazurile de inflama{ie, precedflnd cre$terea haptoglobinei (cu 2-3 zile)

gi

fibrinogenului (cu 3 zile) 2. Afec{iuni reumatismale (reumatism articular acut, poliartriti reumatoidi). 3. Boli autoimune, tip colagenoze. 4. Dupn interven{ii chirurgicale; normal concentra{ia PCR trebuie si scadi dupi 2-3 zile ile la interven(ie. Daci titrul se mentine crescut gi dupii 4 zile de la interven{ie este posibili o complicafie infeclioas5.

TBSTE DE DISPROTEINEMIE)

Disproteinemia se inso{egte de un dez-echilibru coloidal al serului, ce poate fi pus in evirlen{E prin reac{ii de floculare nespecifice. In reacfiile de floeulare sau de labilitate coloidalS substan{a striinii introdusi in ser (siruri ale metalelor grele, precipitanfr organici, substan{e coloidafe) joaci rol de agent declangator allabilitifii serice. Testele de disproteinemie sunt metode de rutini, ugoare, executate cu reactivi qi aparaturl simpli. Lipsa de specificitate le limiteazi valoarea in diagnostic, Iiind importante in urmirirea in dinamici a evolu{iei bolii qi stabilirea prognosticului, Iiinil ultimele care se
negativeazi.

Dintre numeroasele teste de disproteinemie cunoscute gi utilizate vom prezenta urmitoarele:

4.1 Reac{ia

ir

activitatea practicii

TIMOL (metoda MAC LAGAN)

PRINCIPIUL METODEI - solufia tampon cu pH = 7,8 saturattr cu timol produce precipitarea serurilor disproteinemice. Reacfia se bazexzh pe formarea unui complex de globuline, {ofolipide, colesterol Ei timol. MATERIALE NECESARE - ser proaspit (sAngele se recolteazi diminea{a pe nemAncate) - reactiv tampon veronal cu pH de 7'8 - solutie trmol lo/o in alcool etilic 96o - eprubete TEIINICA DE LUCRU La 0,1 ml ser proaspit se adaugi 6 ml reactiv tampon veronal-timol, se agit[ gi dupi 30 min se evalueazi turbiditatea, prin comparare cu o gama de etalonare. REZTILTATE - Rezultatul se exprimd in unitEfi Mac Lagan. VALORI NORMALE: 0-4 uniti{i Mac Lagan VALORI PATOLOGICE Valori crescute pot si apari in proeese inflamatorii (valori mai mari de 6 llML), in afecfiuni hepatice (hepatiti acutd, hepatite cronici activi), in alte boli inso{ite de disproteinemie (tumori, nefropatii, colagenoze).

ft6]t \- ,

LACRARE PRACTICA 1 SI 2
Reac{ia este importantd pentru diagnosticul diferen{ial dintre icterele hepatice (valori crescute) qi icterele mecanice (valori normale).
4.2 Reacfia cu sulfat de zinc

(festul KLt{I(EL)

PRINCIPI'L METODEI

este o reac{ie de precipitare a serului cu sulfat de zinc, indicAnd o cre$tere a gamma-globulinelor qi a beta-globulinelor.

MATERIALE NECESARE - 0,1 ml ser proaspit - 6 ml reactiv sulfat de zinc tamponat cu pH = 7,5
eprutrete TETINICA DE LUCRU La 0,1 ml ser proaspit se adaugi 6 ml reactiv sulfat de zinc tamponat. Reac{ia este pozitiv5 dacl dupi 30 min se produce o turbiditate mai nult sau mai pu{in intensi care se poate aprecia fie la scara de timol, fie la fotocolorimetru (cu lungimea de undi de 470 nm).

VALORI NORMALE - 2-8 unitlfi Mac Lagan (la copii

se

obiinalori mai scizute, iar la virstnici

vloareamaximi poate ajunge la 12 UML) VALORI PATOLOGICE - Valorile crescute indici o creqtere a gamagloulineor, putAnd si apari in hepatite acute qi cronice.

Reprezinti unul din cele nai simple teste de disproteinemie, ugor de realizat qi cu un cost
redus.

PRINCIPIUL METODEI -Daci s6ngele este tratat cu un anticoagulant qi lisat in repaus, eritrocitele vor sedimenta dupi un interval de timp. Metoda utilwatL este metoda lVestetgreen.
MATERIALE NECESARE

materiale necesare pentru recoltarea sAngelui sAnge 1,6 ml (recoltat f5,ri stzz , prin suspendarea garoului) solu{ie citrat de sodiu 3'8% (0,4m1) seringi de 2ml. pipete Westergreen de 300mm. (gradati in milimetri de la 0 la 200) stativ Westergreen (stativ)

TEHNICA DE LUCRU 1. Se recolteazi 1,6m1 sAnge

(ftrd stazn) in seringi de 2ml ce confine 0,4m1 citrat de sodiu 3,87o sterilS, urmatd de agitarea prin inclinare succesivi orizontali-verticali la recoltarea cu seringa, sau rotirea (agitarea) flaconului cu anticoagulant (EDTA) la recoltarea a 2ml singe direct in
flaconul cu anticoagulant. 2. Se aspiri s6nge in pipeta Westergreen pAni la marca superioari (fig'6b). 3. Se apasi vflrful pipetei pe dopul de cauciuc aI stativului Westergreen pi se fixeazi pipeta perfect Yertical (fi g.6b). 4, Din acest moment se porneEte ceasul. 5. Se citegte cu cff{i milimetri a scizut coloana de eritrocite la o ori, respectiv doui ore.

LUCRAhE PRACTTCA

Sr

Determinare vsH: a. stativ westemgrcen; b. aspiratea sangelui in pipeta llesterngreen pdnd Ia marca superioard; c. Citirea coloanei de plasma Ia I ord

VALORINORMALE - dupi o ori 4-6mm (h bnrbafi 10mm, la femei 15mm) - dupi doui ore 7-16mm (la birba{i 8mm, la femei 16mm)
Surse de eroare:

Influenla temperaturii: VSH creqte cu temperatura. intre 20 qi 21 'C varia{iile sunt de mica importan{a qi qi determinarea se poate face la temperatura camerei. In cazul unor varia{ii mari ale temperaturii se recomanda ca tubul si se introduca in termostat la o temperaturi
constantl de 20 in cazul bolnavilor cu crioglobulinemie, VSH efectuat la temperatura camerei poate da erori mari, datoriti impiedicirii sedimentirii eritrocitelor prin gelificarea plasmei, simulAnd viteze normale sar. uqor cres"ute. in astfel de imprejuriri stativul se mentine la termostat, la 37 oc. Determinarea trebuie sd se facd imediat dupd recoltarea singelui, orice intirziere putAnd si scadl VSH-ul. Trebuie respectati propor{ia dintre anticoagulant qi sdnge.
oC,

vARrATrr FrzroLoGIcE Sedimentarea hematiilor este cauzati de faptul ci densitatea eritrocitelor (1093) este superioari densitl(ii plasmei (1029) 9i este influen{ati de numirul de hematii, raportul
albumine/globuline, proteinemie. Stabilitatea suspensiei eritrocitare este conferiti in primul rAnd de incircitura electrici negativi a membranei datorati in mare parte prezentei acidului neuraminic. Astfel, cu cAt o anenie este mai pronunlat5, eu atAt for{a de respingere dintre eritrocite va {i mai mici, ca urmare hematiile vor sedimenta mai repede, determinAnd creqterea VSH-ului. intr-o poliglobulie, prin cregterea forlei de respingere dintre eritrocite, VSH-ul diminui. Plasma are in general o incircituri electricE pozitiv5, dependenti in mare misuri de raportul dintre albumine/globuline. Albuminele, care se gisesc in concentrafie mai mare qi au

LUCRARE PRACTICA 1 $I 2 sarcini negative, miresc stabilitatea sistemului qi de aceea VSH diminui. Globulinele au sarcini pozitive mai multe gi miresc incircitura pozitivi a plasmei cu diminuarea VSH. Creqterea fibrinogenemiei este urnatl de aderarea moleculelor de fibrinogen la membrana hematiilor, cu sciiderea consecutivi a sarcinilor pozitive gi creqterea VSII. De asemenea, sciderea viscozitifii s6ngelui, consecin{a a sclderii numlrului de eritrocite, a proteinemiei sau a ambelor (hemodilufie) mireste VSH.

VARIATII PATOLOGICE

Cregterea VSH-ului:

boala se gaseqte in evolufie, sciderea VSH, neinso{itd de semne de vindecare, denoti epuizarea capacititii de reac(ie a organismului) disglobulinemii (macroglobulinemia monoclonalii Waldenstriim, maladia Kahler). in aceste boli se observa cele mai mari valori ale VSH,de oicei pest 100mm/h, cu o sedimentare rapidii, chiar din primele 10 -15 ninute, cancer evolutiv (un VSH normal nu exclude prezen{a unui neoplasm) puseuri acute de boli de colagen gi LED dupi distrugeri tisulare: infarct miocartlic, interven{ii chirurgicale. VSH are o perioad^ deltenfa de 20-30 ore, spre deosebire de leucogrami care se modifici mai

orice proces inflamator orice proces infec{ios (dI

indicii

ci

repede.

Sciderea VSH-ului

- hepatita epidenici - stiri alergice - policitemie,poliglobulie - insuficien{i cardiaci - talasemie

De asemenea, efectuarea VSH-ului poate oferi informa{ii ecundare privind examinarea aspectului plasmei qi al stratului leucocitar in tubul de VSH: - aspectul plasmei: - galben-auriu - icter; - foarte deschis (incolor) - anemie; - tulbure - Iipidemie; - strat leucocitar foarte gros - leucemie.

6.

DETERMINART,A FIBRINOGENULUI

PRINCIPIUL METODEI - Fibrinogenul din plasmi se coaguleazi cu exces de calciu, iar cheagul de fibrini se dizolvi in solufie alcalini qi se dozeazi proteina cu reac{ia biuretului.
MATIRIALE NECESAR,E

- plasmi; - reactivulbiuretului; - cloruri de sodiu, solutie 0,97o; - cloruri de calciu solu{ie 0r257o; - hidroxid de sodiu solufie 37o.

METODADE LUCRU

/-tz-l \

, r'^,,

--/

LUCRARE PRACTICI 1

$I

Se recolteazi prin punctie venoasd 2 ml sAnge intr-o eprubeti de centrifugd cu anticoagulant (oxalat de amoniu). o Se separi apoi plasma prin centrifugare. . intr-o eprubeti se dilueazi 0,5 ml plasmi cu 2,5 ml clorurd de sodiu 0r97o qi se adaugi 2,5 ml cloruri de calciu, se amesteci gi se tine 30 de minute la 37oC. r Cu o bagheti se scoate cheagul, se spali in 2 eprubete succesive (una cu clorurl de sodiu 0,97o Ei una cu api distilati), apoi se zvAnti. . Cheagul se pune intr-o eprubeti $i se adugi 0,5 ml hidroxid de sodiu 3%' Se {ine 15 secunde intr-o baie care fierbe, agitAnd eprubeta, apoi se lasl 30 de minute la 37oC. o Se adaugi 3 ml reactiv de lucrun se amesteci gi se tine 30 de minute la temperatura camerei, Se incilzegte 1 minut la 37oC qi se misoari extinctia probei @P) Ia l= 546nm fa{i de un blanc cu 0,5 ml hidroxid de sodiu 37o gi 3 ml reactiv de lucru. CALCUL Coeficientul de extinc{ie procentual al reacfiei biuretului la X,= 546nm este E=2,77. EPx2,6 = E yt,r.g"^ / l}0mlplasma

VALORI NORMALE: Fibrinogen/l00m| plasmi = 200

- 400 mgoh'

VARIATII PATOLOGICE: Scideri ale valorii fibrinogenului poate sii apari in: alcoolism,
neoplasm gastric sau dupd gastrectomii, boli infec{ioase grave, stadiile tardive ale cirozei atrofice (prin deficit de sintezi de citre un factor hepatic prezent in ciroze). Cregteri pot si apard in: afecfiuni cardiorenale cu edeme, afecfiuni coronariene, infarct miocardic, hepatite acute, afec{iuni reumatismale, infec{ii microbiene, cregterea fibrinogenului determinAnd qi accelerarea VSH. Fibrinogenul cregte nespeciJic tn inJlamagiL

Haptoglobina este o alfa2-globulinii cu valoare normali de 30-180 mg%o. Creqte nespecific

in inflamatii de aproximativ 2-4 ori.

si scadi in hemoliza intra gi extravasculari prin haptoglobini - hemoglobinii gi in hepatopatii cronice severe.
Poate

cre$terea

eliminirii complexului

Va fi studiati in cadrul exploririi metabolismului proteic,

)60

+z