Descoperirea si izolarea endonucleazelor de restrictie in anul 1960 de catre Arber Smith si Nathans a pus baza unei noi clase

de markeri genetici: RFLP- Restriction Fragment Length Polymorphisms. Acesti markeri permit analiza variatiei ADN deoarece substituirea unei singure baze in secventa de recunoastere a unei enzime de restrictie schimba pattern-ul fragmentelor de restrictie rezultate. Aceasta noua tehnologie permite pentru prima data analiza secventelor non-codante, a modificarilor nedetectabile ce au loc in secventa codificatoare a unei proteine, precum si studiul modificarilor in secventa codificatoare. Prima cartare genetica bazata pe ADN si studiile legate de aceasta a avut la baza markerii RFLP. In plus, analiza RFLP a ADN-ului mitocondrial si ribozomal a fost utilizata in genetica populatiilor, filogenetica si studiul bio-geografic. Cel mai mare obstacol in calea utilizarii analizei RFLP intr-o gama mai mare de studii a fost necesitatea unei sonde de hibridizare adecvata pentru detectarea polimorfismului. Astfel, in ciuda disponibilitatii unui numar aproape infinit de markeri, datorita lipsurilor tehnologice exploatarea ulterioara a acestor markeri a fost impiedicata.