Transformri genetice la Catharanthus roseus pentru sporirea produciei de metabolii secundari

Introducere Chataranthus este o plant peren care este originar din regiuni tropicale i este cultivat de obicei ca plant ornamental. Planta crete n regiunile calde n special n sudul Statelor Unite. Planta este stufoas, mic, de pn la 50 cm nlime. Este foarte ramificat i dezvolt o baz lemnoas. Frunzele plantei sunt peiolate, de form alungit, groase, textura lor fiind tare iar aranjarea lor fiind alternativ sau opus (Virmani et al., 1978). Planta este cunoscut n diferite tari sub diferite denumiri (Tabelul 1) i multe dintre specii sunt uor otrvitoare. Florile plantei sunt dispuse cte una i niciodat cte dou iar soiurile moderne prezint petale care se suprapun. Culorea florii variaz de la roz, alb sau un amestec din ambele culori, la o culoare roz pal cu un punct de culoare violet nchis n centru. Numrul de cromozomi pentru toate speciile de Catharanthus este 2n=16. Cu toate acestea, plantele tetraploide cresc mult mai repede, iar florile acestora au o dimensiune mai mare (Virmani et al., 1978). Genul Catharantus cuprinde opt specii (Tabelul 11.1). apte dintre speciile genului sunt cunoscute din Madagascar, una dintre aceste specii fiind gsit doar n India i Sri Lanka, n timp ce una dintre specii este cultivat n China. Planta se crede c este nativ din Indiile de Vest. Este cunoscut mai mult sub numele de brebenoc de Madagascar. Tabelul 1. Catharanthus C. lanceus C. trichophyllus C. longifolius C. pusillus C. scitulus C. coriaceous C. roseus C. ovalis

Catharanthus: o plant medicinal unic Numele genului Catharantus, se refer la floare pur. Catharantus este adeseori considerat sinonim cu Vinca, cu toate acestea, unii autori nu sunt de acord cu afirmaia c Catharanthus i Vinca sunt una i aceeai plant. Astfel c acum sunt considerate dou specii total diferite.

Catharanthus roseus: o surs de alcaloizi indolici terpenoidici utilizai n medicin Plantele de Catharanthus au fost folosite n medicina tradiional din multe pri ale lumii o perioad ndelungat de timp n tratarea a numeroase boli iar existena denumirilor locale ale plantei din diferite ri reprezint o dovad important cu privire la importana acestei plante medicinale (Tabelul 2). Catharanthus roseus vine n diferite nuane cele mai frecvente fiind culoarea roie i alb. Catharanthus roseus a ctigat n ultimii ani o mare popularitate n principal ca plant medicinal pentru rolul su curativ i paliativ n terapia cancerului (Tabelul 3). Planta este aproape sinonim cu tratamentul pentru cancer i nu e de mirare c Consiliul National pentru Cancer din Malaezia (Majlis Kancer National, MAKNA) o folosete ca i logo pentru a simboliza sperana pentru bolnavii de cancer (Loh, 2008). Descoperirea din ntmplare a proprietilor antineoplazice al alcaloizilor produi de Catharanthus n anii 1950 a deschis calea spre descoperirea unor noi medicamente mpotriva cancerului, medicamente derivate din plante. Alcaloizii produi de Catharanthus au o mare importan n medicin iar vincristina (VCR) i vinblastina (VLB), constituie o parte esenial a standardelor schemelor de chimioterapie. Vincristina i vinblastina sunt componente integrate n aproape fiecare dintre regimurile curative ale bolilor maligne metastatice i sunt larg utilizate n regimurile de medicamente adjuvante i neoadjuvante. Oportunitile obinute de la specia Catharanthus au dovedit c ntr-adevr produsele naturale sunt o surs sigur pentru medicin i c pot rezolva multe dintre problemele de sntate cu care se confrunt omenirea (Sharma and Arora, 2006; Arora et al., 2010). Tabelul 2. Denumiri autohtone pentru Catharanthus roseus Denumiri comune Ainskati, Billaganneru, Nayantara, Sadabahar, Ushamanjairi Atay-biya, Chichirica, Kantotan,Brebenel, Tsitsirika Brown mans fancy, Brebenel, Floarea roz, Floarea rosie, Floarea marinarului, Laleaua alba Caca poule Chatilla Chavelita Dua can Liluvha Brebenel de Madagascar Maua Mini-mal, Patti-poo Nayantara Nichinich-so, Nichinichi-so Ninfa Brebenel ri India Filipine Indiile Vestice

Dominica Guatemala Peru Vietnam Venda Madagascar Kenya Sri Lanka Bangladesh Japonia Mexico Jamaica, USA

Tabelul 3. Alcaloizi ai speciei Carhanthus folosii n tratamentul diferitelor tipuri de cancer Denumire alcaloid Vincristina Tipul cancerului Leucemia acut limfoblastic Boala Hodgkin Limfoame nehodgkiniene Cancer pulmonar cu celule mici Cancer de sn Cancer de col uterin Mielom multiplu Rabdomiosarcom Neuroblastom Tumori embrionare ale copilului Sarcom Ewing Osteosarcom Tumori pedriatice Boala Hodgkin Limfoame nehodgkiniene Limfoame Cancer al placentei Leuemia monocitic Tumora Wilms Limfosarcom Micoza fungoid Carcinoame Sarcoma Kaposi Cancer testicular metastazat Carcinom la sn Coriocarcinomul rezistent la metotrexat

Vinblastina

Vindesina

Catharathus roseus conine peste 120 de tipuri de alcaloizi, desemnai ca fiind alcaloizi indoli terpenoidici (TIAs). Dintre acetia, vincristina i vinblastina avnd o utilitate pe scar larg n tratarea leucemiei, limfoamelor, cancerului pulmonar cu celule mici i a altor forme maligne (Noble, 1990; Pratt et al., 1994). Vincristina a fost o componenta integrant n combinaiile schemelor chimioterapeutice ale leucemiei acute limfoblastice i joac un rol important n tratarea limfoamelor Hodgkin i non- Hodgkin. Aceasta a fost, de asemenea utilizat n asociaie cu ali ageni pentru tratamentul tumorei Wilm, a sarcomei Ewing, a neuroblastomului la copii; a mielomului multiplu, a cancerului de sn i a cancerului pulmonar cu celule mici la aduli. Vinblastina este folosit pentru cancerul de celule ale testiculelor i n faze avansate ale bolii Hodgkin i este frecvent utilizat n asociere cu ali ageni n tratarea carcinoamelor de sn i de vezic, a sarcomei Kaposi i a altor tipuri de cancere (Rowinsky i Donehower, 1977). Alcaloizii idolici ai speciei de Cartharanthus reprezint un interes economic considerabil existnd un potenial al cererii in-house precum i la nivel mondial. Alcaloizii anti-cancer produi de Catharanthus au o mare valoare pe piaa economic dup cum urmeaz: vincristina (3.500.000 $ pe Kg); vinblastina (1.000.000 $ pe Kg) (Veltkamp et al., 1985). Valoarea lor la vnzarea cu amnuntul depete 20.000$ pe gram (Curtin, 1983).
3

Costurile ridicate sunt datorate n cea mai mare parte metodelor costisitoare disponibile n prezent pentru producerea acestor compui, precum i a cantitilor sczute obinute din plantele surs, de exemplu, cantitatea de vincristin obinut dintr-o singur plant de Catharanthus roseus este de ordinul a 0.0003-0.0005 % i se ntmpl ca aceast cantitate obtinu s fie cea mai mic dintre toate cantitile de alcaloizi utili obinui (Taylor si Farnsworth, 1975; Curtin, 1983). Este nevoie de aproximativ 500 Kg de frunze pentru a produce 1 g de vincristin pur, aceasta nsemnnd c pentru un necesar de 30 g este nevoie de cca. 10.000-15.000 Kg de frunze. Pentru prelucrare pot fi necesare pn la 16 saptmni. Acesta este unul dintre motivele pentru care preul alcaloizilor este att de mare. n anii 70, provizia anual din ntreaga lume a acestui medicament era de ordinul a 4.5 Kg. Cererea actual a acestor tipuri de alcaloizi dimerici/monomerici este: vincristina: 1 Kg pe an; vinblastina: 12 Kg pe an; ajmalicina: 5000 Kg pe an. India este a treia ar productoare la scara mondial a celor care produc vincristina i vinblastina iar aceti alcaloizi sunt exportai ctre Europa i America (Rama Rao i Gurjar, 1990). ntre anii 1985-86, exporturile de rdcini de Catharanthus din India au fost n valoare de 140.625 $ iar ntre anii 1987-88 de 171.875$. n anii 1993-94 alcaloizii produi de Vinca i care au fost exportai au fost de o valoare mai mare de 210.000$ (Chaudhri, 1996). Cererea pentru aceti alcaloizi pe piaa mondial este ntr-o cretere constant. Catharanthus roseus: plant medicinal supus interveniilor biotehnologice Cererea mondial a alcaloizilor idolici terpenoidici (TIAs) i cantitile mici n care acetia sunt produi de ctre plant, sunt principalii responsabili pentru preul lor ridicat. n acest scop, au fost ndrepatate eforturi imense pentru creterea coninutului de vinblastin i vincristin din plante prin tehnici biologice moderne, incluznd liniile celulare de selecie, biotransformarea i transformrile genetice realizate cu Agrobacterium rhizogenes (van der Heijden et al., 1989, 1998; Saito et al., 1992; Verpoorte et al., 1993; Yeoman i Yeoman, 1997; Arora, 1998; Batra et al., 2004; Arora et al., 2005; Sharma i Arora, 2006; Christie et al., 2009; Junaid et al., 2009; Natali et al., 2009). S-au obinut, astfel, linii celulare de calus rezistente la 5-metil-triptofan (5-MT) (Arora, 1998; Seth i Mathur, 2005). Seth i Mathur (2005) au izolat patru tipuri de linii de calus demonstrnd tolerana diferit la 5-MT, un analog al triptofanului. Liniile selectate au artat un coninut al alcaloizilor mult mai mare n prezena stresului indus de 5-MT. Prezena vindolinei i a catharanthinei a fost pus n eviden n dou dintre linii Nir L-60 i C6 L-120, indicnd o influen pozitiv a acumulrii de triptofan n redirecionarea fluxului metabolic spre sinteza de alcaloizi indolici monomerici. n plus fa de glucozide, Shimoda et al., (2007) au izolat n culturile nedifereniate, patru dizaharide din suspensia celular de Catharanthus roseus dup incubarea cu capsaicin i 8-nordi-hidro-capsaicin. Echevarria- Machado et al., (2007) au studiat rspunsul rdcinilor transformate de Catharanthus roseus la o concentraie sczut de acid salicilic. Pomahacova et al., (2009) au raportat recent o acumulare crescut de ajmalicin i tetrahydroalstonine n celulele de Catharanthus, exprimnd un transportor ABC. Jaleel et al., (2007) a raportat o acumulare de ajmalicina n Catharanthus roseus dup tratarea cu acid giberelic.
4

Procesele moleculare care regleaz genele i activeaz metabolismul alcaloizilor indolici terpenoidici sunt pe departe de a fi pe deplin nelese i o mare parte dintre aceste procese trebuiesc descoperite. O serie de cercettori au ncercat s elucideze structura i funcia enzimelor cheie precum i cile enzimatice i reglarea molecular cu scopul de a spori producia de metabolii secundari. Perspectivile tehnicii hairy roots Rdcinile firoase hairy roots, care sunt produse ca rezultat al transferului de ADN-T de la Agrobactrium rhizogenes, o bacterie gram-negativa, n genomul plantei (Banerjee et al., 1995; Doran, 1997) au fost subiectul unor investigaii intense datorate potenialului lor imens ca i surs alternativ de alcaloizi idolici terpenoidici. Cu toate acestea, n ceea ce privete transformrile genetice la Catharanthus roseus sunt destul de anevoioase iar obinerea de clone cu cretere rapid a fost destul de dificil. n ultimii ani au fost realizate mai multe ncercri pentru obinerea unor clone cu o dezvoltare rapid i de cretere a nivelului de acumulare a alcaloizilor n organele plantelor cultivate in vitro aa cum ar fi metoda hairy roots (Hughes et al., 2004; Arora et al., 2005). Hong et al., (2006) au realizat culturi cu rdcini firoase de Catharanthus roseus care s-au realizat cu genele rol ABC din ADN-T al tulpinei bacteriene A4 de Agrobacterium rhizogenes. Liniile de rdcini adventive (de tip hairy), cu genele rol ABC au dezvoltat un sindrom de tip slbatic de rdcini adventive (de tip hairy) n ceea ce privete creterea i morfologia ntr-un mediu de cultur solid. Rdcinile adventive (de tip hairy) transgenice nu au produs cantiti detectabile de manopin i agropin care, de altfel, adeseori sunt sintetizate abundent n liniile rdcinilor adventive (de tip hairy) de tip salbatic. Absena acestor opine nu pare s determine ca liniile cu gene rol ABC s aib un nivel mai mare de alcaloizi indolici terpenoidici dect liniile cu rdcini adventive (de tip hairy) de tip slbatic. Spre deosebire de liniile de tip slbatic, liniile cu genele rol ABC au produs nivele foarte similare ale totalului de alcaloizi, n pofida diferenelor mari n coninuturile individuale de alcaloizi. Aceast lucrare demonstreaz c cele trei gene rol ABC sunt suficiente petru a induce la genul Catharanthus roseus rdcini adventive (de tip hairy) de nalt calitate. Chung et al., (2009) au izolat recent patru noi tipuri de glucozide flavonoide mpreun cu cei trei compui cunoscui din extractul metanolic din rdcinile adventive (de tip hairy) de Catharanthus roseus. Structura acestor componente a fost elucidat pe cale spectroscopic. Aceste noi glucozide flavonoide au inhibat att activitatea MMP-9 ct i producia de TNF- n celulele THP-1 tratate cu lipo-polizaharide. Aceste rezultate arat c este posibil transformarea genului Catharanthus i producerea unor componente cimice variate. Magnotta et al., (2007) au raportat recent expresia dicetilvindoline-4-Oacetiltransferazei n rdcinile adventive (de tip hairy) de Catharanthus roseus. n aceast lucrare se relateaz realizarea cu succes a inducerii rdcinilor adventive (de tip hairy) n anumite genotipuri de Catharanthus roseus din India folosind diferite tulpini de Agrobacterium rhizogenes precum i optimizarea condiiilor pentru cultivarea unor clone selectate cu cretere rapid.

Catharantus roseus: sistemul modelului plantei medicinale Au fost testate cinci tipuri de Catharanthus roseus si anume: Red-flowered (4n=32), White-flowered (4n=32), Nirmal (2n=16), BRT-1 si BRT-2 pentru sensibilitatea lor fa de diferite tulpini de A. rhizogenes. Explantele (frunze, peiol, embrion, petale, micro-lstari, antere i sepale), obinute de la plantele cultivate n sere au fost sterilizate cu ajutorul a unei soluii de 0.1%HgCl2 timp de 2-6 minute urmat de o splare cu ap dublu distilat. Tulpini de Agrobacterium rhizogenes: achiziia, cultura i ntreinerea Tulpinile bacteriene utilizate n vederea transformrii au fost obinute dintr-o varietate de surse, att din India ct i din afara sa. A fost testat eficiena transformrii i specificitatea gazdei pentru diferite tulpini de Agrobacterium rhizogenes i anume: A4, LBA-9402, NCPPB1855, SV2, SV4, R-1000, ATTC-15834, ATCC-11325 si MAFF-301724. Tulpinile de A. rhizogenes au fost meninute pe plci solide de YMB (Hooykaas et al., 1977) prin realizarea unor striaii printr-un orificiu de inoculare. Apoi bacteriei i s-a permis s se dezvolte ntr-un mediu lichid la o temperatur de 252C pe un agitator rotativ (New Brunswick, USA) la 100 rotaii/minut. Au fost folosite pentru infecie celulele bacteriene aflate n faza exponenial de cretere (OD 1.0 la 660nm). Infecia i co-cultivarea explantelor Explantele de la nivelul frunzelor, peiolului, petalelor, sepalelor, embrionilor, anterelor i micro-lstarilor au fost inoculate cu diferite culturi de tulpini de A. rhizogenes vechi de 48 de ore prin rnirea cu ajutorul unor ace sterile. Explantele netratate au fost deasemenea placate simultan pentru a servi drept control. Explantele proaspt inoculate au fost pstrate n ntuneric n primele 24 de ore pentru a mpiedica deshidratarea bacteriei datorat expunerii la lumin n timpul ferestrei de competen pentru transformarea esuturilor rnite (Binns si Thomashow, 1988). Explantele infectate au fost recultivate pentru 3-7 zile pe un substrat semi-solid fr hormoni de cretere, i apoi au fost transferate pe un mediu de meninere (ntreinere) coninnd Kn (1.0mg/l) + BAP (0.4mg/l) + NAA (0.2mg/l). Explantele au fost dezinfectate prin transferare pe un mediu de ntreinere suplimentat cu 250 g/l cefotaxim (Sigma) sau cefalexina (Lupin Laboratories, India) + 100g/l ampicilin timp de 3 pn la 4 perioade (pasaje) de 3-5 zile fiecare, dup care concentraia de cefalexina a fost redus la 100g/l i culturile s-au meninut pe acest mediu pentru nc dou pn la patru perioade. Creterea i ntreinerea culturilor sterile de hairy roots Frecvena transformrilor i a dezvoltrii rdcinilor adventive de tip hairy, a fost studiat pe durata unui pasaj de cultur de 4-8 sptmni. Frecvena de transformare a fost determinat ca fiind numrul de explante cu rdcini firoase/numrul total de explante. Rdcinile adventive de tip hairyau fost excizate (extirpate) i transferate pe un mediu de ntreinere, prima dat pe un mediu solid iar mai trziu pe un mediu lichid. Rdcinile adventive de tip hairy, sterile (fr bacterii), aflate n faza activ de cretere au fost apoi cultivate pe 60 ml de mediu lichid suplimentat cu IBA (1.0 mg/l). Culturile au fost p strate pe agitatoare rotative cu o vitez constant de vibraie de 80 rotaii/minut la o temperatur de 25
6

 2C n condiii de ntuneric. Rdcinile au fost subcultivate la intervale de 4 s ptmni n timp ce mediu a fost schimbat la fiecare 15 zile. Transformrile individuale care au avut loc sau meninut ca i clone separate. Confirmarea naturii transformrilor rdcinilor de tip hairy Rdcinile adventive de tip hairy, transformate (o greutate de 50 mg) au fost extrase i analizate prin electroforeza pe hrtie i apoi colorate cu nitrat de argint, conform metodei de cercetare dezvoltat de Petit et al., 1983 i Morgan et al., 1989. 5-10 l din extract au fost reperate pe hrtia tip Whatman de 3 mm i supus electroforezei la 15 V/cm timp de 30 de minute n recipientul tampon care conine acid formic, acid acetic, ap distilat (3:6:91, v/v/v, pH 9.8). Dup uscarea peste noapte, electroforetogramele au fost colorate cu nitrat de argint (Trevelyan et al., 1950), fixate cu soluie de tiosulfat de sodiu (10% w/v n ap) i splate cu ap de robinet. Spoturile obinute au fost comparate cu cele autentice de manopin. A fost efectuat deasemenea caracterizarea molecular a liniilor de hairy roots pentru a confirma natura transformrii i prezena plasmidei Ri din ADN-T din rdcinile adventive de tip hairy. A fost extras ADN atat din rdcinile neafectate (drept probe de control) ct i din rdcinile adventive de tip hairy, prin metoda cetil- metil bromurei de amoniu. Pentru detectarea genei rol A s-au folosit primeri. ADN-ul total izolat din rdcinile transformate a fost supus digestiei cu enzima de restricie EcoRI i apoi a fost evaluat prin tehnica PCR, pentru a se confirma prezena de ADN-T din plasmida bacterian. Reacia PCR a fost efectuat dup cum urmeaz: n primul ciclu: denaturarea iniial la 94C timp de 1 minut, rcire (clire) la 50C pentru 1 minut, extensia pentru 2 minute la 72C, care apoi a fost urmat de 35 de cicluri succesive realizate n aceleai condiii. Pentru realizarea urmtoarelor benzi de amplificare au fost efectuate reacii PCR la trei temperaturi distincte de rcire (clire): 55, 60 si 65C. ADN-ul extras din rdcinile de Catharanthus care s-au presupus a fi transformate a demonstrat prezena produsului de amplificare corespunztor genei rol A, atunci cnd a fost vizualizat pe gel de agaroz TAE 1.2% colorat cu bromur de etidiu. Folosind rdcini netransformate nu s-au obinut produi de amplificare. Extracia i analiza chimic a alcaloizilor indolici terpenoidici (TIAs) Extracia alcaloizilor s-a realizat prin modificarea metodei realizate de Kutney et al., (1980). Pe scurt metoda este descris dup cum urmeaz: 2.5g rdcini adventive de tip hairy (recoltate dup 5 sptmni) cu 50 ml metanol. Omogenatul a fost incubat la 55C timp de 2 ore. Extractul metanolic a fost uscat iar reziduul dizolvat n H2SO4 2.5% (10ml) i splat de trei ori cu un volum de acetat de etil. pH-ul fazei apoase a fost ajustat la 9.5 cu o soluie de NH4OH (28.4%). Aceast soluie alcalin a fost extras de trei ori cu 25 ml de acetat de etil. Faza organic a fost recuperat i supus uscrii prin evaporare. Reziduul a fost dizolvat n 1 ml metanol (calitate HPLC) i apoi folosit n analiza HPLC. Rdcinile de control din recoltele crescute in vitro din plante netransformate au fost extrase deasemenea n aceiai manier. Analiza HPLC a fost realizat pe Waters Modular System (Sistemul modular al apei) compus din pomp cromatografic 501, detectoare acordabile de absorban 484, integrator 745 B i injector 46K. Pentru analiz s-a utilizat o coloan -Bondapak C18 (3.9 mm, 1.0 x 300mm). Faza mobil a fost: MeOH: CH3CN:NH4Oac (0.001M): trietil amina
7

(1:2:2.5:0.2%), la un debit de 1ml/minut. Absorbana a fost monitorizat la o lungime de und maxim max de 280nm. Alcaloizii idolici terpenoidicii au fost identificai prin datele timpilor de retenie precum i prin metoda intensitii peak-urilor. Optimizarea explanturilor vs specificitatea genotipurilor tulpinilor bacteriene Pentru standardizarea parametrilor producerii de rdcini firoase hairy roots au fost testate 5 genotipuri de Catharanthus roseus i anume: red-flowered, white-flowered, Nirmal, BRT-1, BRT-2. Tipurile de explante folosite au fost: frunze, peiol, ovule fertilizate, embrioni, petale, sepale, micro-lstari i antere. Plantele crescute n sere i cele crescute in vitro au demonstrat a fi sursa ideal pentru recoltarea explantelor pentru expunerea la infecia cu A. rhizogenes. Dintre diferitele tipuri de explante testate, frunzele i micro-lstarii au rspuns cel mai bine la producerea de rdcini adventive de tip hairy. Rdcini care s apar din explantele netransformate (cele de control) nu au putut fi observate. Atunci cnd pentru infecia cu A. rhizogenes s-au utilizat ca explante frunzele s-a observat o producere a rdcinilor adventive de tip hairyla toate cele cinci genotipuri. Totui, gradul de succes depinde de specificitatea tulpinii bacteriene. Tulpinile bacteriene LBA-9402, SV2, SV4 i NCPPB-1855 au fost capabile s produc rdcini adventive de tip hairy la toate genotipurile testate. MAFF-301724 a produs rdcinile doar la genotipul redflowered iar A4 nu a putut produce rdcini la genotipul white-flowered. Rdcinile produse folosind MAFF-301724 nu au putut supravieui datorit creterii exagerate a bacteriei (suprainfectrii). n general, succesul diferitelor tipuri de tulpini bacteriene de a aduce transformarea rdcinilor firoase hairy roots la Catharanthus este n urmtoarea ordine: SV4>LBA-9402>NCPPB-1855>A4>SV2>MAFF-301724. Tulpina Ri R-1000 nu a putut produce rdcini adventive de tip hairy la nici unul dintre genotipurile testate. Similar, capacitatea diferitelor tipuri de explant de a se supune transformrilor genetice a fost n urmtoarea secven micro-lstarii>frunze>peiol. Explantele din petale, sepale i ovule nu au rspuns la cea mai mare parte a tulpinilor bacteriene testate. Afinitatea (sensibilitatea) genotipurilor fa de infecia cu A. rhizogenes a fost n urmtoarea ordine Nirma > redflowered > white-flowered >BRT-1 > BRT-2. Genotipurile BRT-1 i BRT-2 au afinitate doar la tulpina bacterian SV4. Aceste rezultate sunt n conformitate cu tendinele observate de ctre Porter (1991) care a prezentat, deasemenea c genotipul este principalul determinant al specificitii gazdei fa de infecia cu A. rhizogenes. Frecvena transformrilor la genotipurile red-flowered i Nirma variaz de la 0.02-0.12, 0.02-0.25 i 0.03-0.06, respectiv atunci cnd explantele de frunze i de micro lstari (muguri) au fost supui la co-cultivarea cu diferite tulpini ale plasmidului Ri. Fazele iniiale ale transformrii au fost caracterizate prin apariia n urmtoarele 10-15 zile a unor protuberane de culoare alb. Perioada dup care ncep s apar rdcinile de tip hairy variaz n funcie de tulpina bacterian utilizat. Pentru tulpinile bacteriene A4 i SV4, numrul de zile necesare pentru apariia rdcinilor adventive de tip hairy variaz ntre 28 i 38, n timp ce pentru SV2 i LBA-9402 variaz ntre 25 i 30 de zile. Tulpinii bacteriene NCPPB i este necesar cel mai lung timp pentru inducerea apariiei rdcinilor adventive de tip hairy adic ntre 40 i 48 de zile n timp ce tulpinii bacteriene MAFF-301724 i sunt
8

necesare doar 20-25 de zile. n mod similar, numrul de zile necesar pentru o co-cultur de a realiza efectiv transformarea variaz n funcie de genotipul destinat i de tulpina bacterian utilizat. Perioada de co-cultivare pentru tulpinile bacteriene A4 i SV4 a fost de 4-7 zile, n timp ce pentru SV2 i LBA-9402 a fost de 5-7 zile. n cazul tulpinilor NCPPB-1855 i MAFF301724 le-au fost necesare mai puine zile pentru co-cultivare adic 3-5 zile i respectiv 2-3 zile. Acestor tulpini bacteriene, cnd le este permis creterea pentru o perioad mai lung de timp, se dezvolt excesiv att pe explante ct i n jurul acestora. Timpul necesar transformrii a fost mai mare n raport cu relatrile anterioare (Parr et al., 1988; Bhadra et al., 1993; Bhadra i Shanks, 1995). Aceasta poate fi pus pe seama diferenelor de genotip i a tipurilor de tulpini de Agrobacterium rhizogenes utilizate n cursul prezentei investigaii. Realizarea de culturi sterile de rdcini Dup a doua sptmn de la inocularea explantelor pe un mediu de agar simplu cu antibiotice cefalexin (250 mg/l) i ampicilina (100 mg/l), sa constatat esenial s se realizeze subcultura explantelor pe un mediu de ntreinere care s conin Kn (1.0mg/l) + BAP (0.4mg/l) + NAA (0.2 mg/l) pentru supravieuirea sntoas a explantelor co-cultivate i pentru apariia ulterioar din acestea a rdcinilor de tip hairy. S-a observat o rat foarte mare a mortalitii sau o rat mare de inhibare a creterii rdcinilor de tip hairy atunci cnd au fost cultivate pe un mediu fr auxin MSO. n timp ce clonele N-1 i N-5 aveau un aspect subire i de culoare maro deschis, clonele N-2 i N-3 care au fost expuse la o elongare limitat le-a oferit un aspect n form de stea. Clonele N-4 i N-5 au produs n mod regulat rdcini cu ramuri distantate i cu extremiti lucioase cu o mulime de fire de rdcin. Aceste trsturi caracteristice ale acestor clone indic afinitatea pentru creterea n bioreactoare. Aceste clone ale rdcinilor de tip hairy, au fost crescute apoi n mediu lichid MS (fr NH4NO3) + IBA (1.0mg/l), pentru meninerea i caracterizarea n continuare deoarece cel mai bun rspuns a fost obinut pe acest tip de mediu. Shen et al., (1988) a relevat faptul c pentru creterea rdcinilor de tip hairy uneori este necesar adugarea de auxine exogene. Pentru a stabili natura transformrilor liniilor individuale de rdcini, fiecare clon a fost testat pentru a determina prezena opinelor. Rdcinile de tip hairy transformate conin manopina, care a prezentat pe hrtia electoforetic aproape aceai mobilitate ca i manopina autentic. n plus, rdcinile transformate au prezentat de asemenea trsturile caracteristice rdcinilor de tip hairy adic: lipsa geotropismului i o rat ridicat de proliferare a celulelor epidermice hairy. Analiza creterii clonelor rdcinilor de tip hairy Profilul de cretere a diferitelor clone ale rdcinilor de tip hairy pe un mediu lichid MS cu jumtate-rezisten suplimentat cu IBA (1.0 mg/l) a relevat faptul c a fost atins un indice de cretere foarte sczut, care variaz ntre 1.42 n cazul clonei N-3 pn la 3.36 n cazul clonei 3.36. n cazul folosirii a culturilor n dou faze, s-au putut observa mbuntiri semnificative a creterii n cazul clonelor N-1, N-4 i N-5. n cazul procedurii modificate, clonele rdcinilor de tip hairy vechi de 2 sptmni, au fost transferate din mediul lichid pe un mediu de agar-gel cu aceeai compoziie, dar cu o
9

doz suplimentar de 60mg/l de sulfat de adenin. Proliferarea rdcinilor pe mediu cu agar a fost mai bun atunci cnd rdcinile au fost plasate pe un disc de hrtie de filtru sterilizat aezat deasupra mediului iar incubarea a fost realizat n ntuneric. Dup 1 sptmn de la apariia a 3-5 extremiti de rdcini de novo, cu fire de rdcin foarte fine, ntreaga mas a rdcinii a fost retransferat n mediul lichid cu o compoziie similar sub lumina difuz (1822C). n acest stadiu al culturii, cantitatea de mediu lichid pe vas de 250 ml (cu gt ngust), a variat de la 60-70 ml de mediu lichd. A fost obinut un randament de aproape trei ori mai mare n producia de biomas (pn la 5 sptmni de cretere) atunci cnd s-a folosit 15-20 ml de mediu lichid pe vas n comparaie cu utilizarea anterioar de 60-70 ml mediu lichid pe vas. n procedura modificat a fost necesar reaprovizionarea coninutului de IBA n mediu la o rat de 5 ml la fiecare zece zile pentru a susine creterea. Concluzii Aa cum a fost relatat i de ctre ali cerecttori, studiile actuale asupra Catharanthus roseus au artat faptul c genotipurile de Catharanthus roseus din India, nu reprezint un sistem potrivit pentru transformrile genetice mediate de Agrobacterium rhizogenes. Cu toate acestea, problemele ntmpinate n obinerea rdcinilor de tip hairycu o cretere rapid, au fost depite cu succes. Motivele pentru care obinerea transformrilor genetice la Catharanthus roseus sunt anevoioase pot include prezena unui numr foarte mare de alcaloizi la nivelul frunzei i al altor tipuri de explante. Aceste fito-chimicale inhiba dezvoltarea bacteriilor i inseria plasmidei n timpul fazei de co-cultivare a ciclului de transformare. n scopul depirii problemelor ridicate de reaspingerea fa de transformrile mediate de Agrobacterium rhizogene, pe viitor ar fi de interes explorarea a trei posibiliti i anume: ar trebui verificate rezistena tulpinilor de Agrobacterium rhizogenes la extracte pure de alcaloizi; plantele mutante cu un coninut foarte sczut de alcaloizi ar trebui dezvoltate i folosite pentru infeciile bacteriene; trebuie intreprinse eforturi pentru a produce rdcini de tip hairy haploide.

10