Genetica microorganismelor i inginerie genetic microbian

Note de curs i tehnici de laborator

CAP.2. TEHNICI DE GENETIC BACTERIAN


Not !
Toate protocoalele de izolare, purificare i manipulare a materialului genetic din acest manual
sunt prezentate n varianta de tip minimetod: se lucreaz n tuburi tip Eppendorf (Eppi) cu
capacitate de 1.5 ml, iar centrifugrile se fac n microcentrifugi, de regul cu sistem de rcire
(+4
o
C).


Cap.2.1. Izolarea, purificarea i evidentierea ADN genomic la bacterii
Indiferent de protocolul aplicat, tulpinile bacteriene se cultiv n mediu de cultur lichid Luria-Bertani
(sau n alt mediu adecvat pentru tulpina respectiv), la 37
o
C (sau la temperatura optim pentru tulpina
respectiv) timp de 36h, pn la atingerea fazei staionare de cretere. La majoritatea speciilor
bacteriene este preferabil s se procedeze la o cultivare agitat, orbital sau magnetic.

A. Izolarea i purificarea ADN genomic printr-un protocol derivat din tehnica Johnson (1991).
Acest protocol a fost pus la punct n Laboratorul de Genetica microorganismelor i Biotehnologie,
Universitatea din Bucuresti.

1. Obinerea sedimentului celular. Din cultura bacterian se pun 1.5 ml ntr-un tub tip Eppendorf i
se centrifugheaz 10 min la 8000 rpm (celulele vor sedimenta); pentru obinerea unei cantiti
suficiente de ADN se recomand ca sedimentul celular s aib un volum echivalent cu 25-30 l.
2. Distrugerea peretelui celular. Se arunc supernatantul, iar celulele din sediment se resuspend n
500 l soluia I (TEG + lizozim); resuspendarea celulelor se face cu ajutorul vrfului pipetei automate,
apoi tuburile se vortexeaz; celulele resuspendate n soluia I se las 15 min la 20
o
- 30
o
C.
Este important ca soluia I s aib un pH de minimum 8.0, pentru c lizozimul nu are activitate la pH<8.
Lizozimul este un complex enzimatic extras din albu de ou i are rolul de a sparge peretele celular, att la marea
majoritate a bacteriilor Gram-negative, ct i la unele specii de Gram-pozitive. Exist ns i bacterii al cror
perete celular este insensibil la aciunea lizozimului (de ex. bacteriile din genul Staphylococcus).
Lizozimul sparge doar peretele celular, nu i membrana celular, i ca urmare, liza celular nu este
complet. Glucoza din soluia I are rol de stabilizator osmotic, astfel nct protoplatii/sferoplatii s nu se sparg
imediat.

3. Liza celular total. Se adaug 25 l soluie SDS 20%, astfel nct concentraia final s fie 1%.
SDS (sodiumdodecilsulfat) este un detergent, avnd ca atare capacitatea de a liza membrana celular.
Liza celular complet se verific astfel: pn la adugarea SDS, suspensia bacterian are un aspect lptos,
opac; dup liza celular, soluia se clarific i este foarte vscoas.

4. Deproteinizare enzimatic. Lizatul celular se trateaz 1h la 37
o
C cu pronaz E n concentraie
final de 50 g/ml (se adaug 1.5 l din soluie stoc de pronaz E ce are concentraia de 20 mg/ml);
Pronaza E este o proteaz nespecific ce diger proteinele din lizatul celular.
5. Precipitarea proteinelor cu soluie salin. Se adaug 20 l soluie KCl 2.5 M (precipit proteine).
Precipitatul este sedimentat prin centrifugare 20 min la 12000 rpm 4
o
C (sedimentul = proteine
precipitate, resturi de perete celular, de membrane celulare), iar supernatantul se transfer n alt tub Eppi.
6. Deproteinizare cu solveni organici. Peste supernatant se adaug un volum egal de amestec
cloroform:alcool izoamilic (24:1, v/v); cele 2 lichide (lizatul celular, ca soluie apoas, i solventul
organic) se amestec la temperatura camerei timp de 5-10 min, prin inversarea viguroas a tubului.
Pentru separarea rapid a celor 2 lichide, tuburile se centrifugheaz 7 min la 7000 rpm. Faza apoas
(superioar) se transfer n alt Eppi cu o pipet automat, fr a intra n interfa.
7. Precipitarea acizilor nucleici. Tubul Eppi se umple pn la semnul de 1.5 ml cu alcool isopropilic
aflat la temperatura camerei (20
o
C), se inverseaz tubul de cteva ori i se ine 10 min la temperatura
camerei; precipitatul este sedimentat prin centrifugare 10-15 min la 15000 rpm. 4
o
C. Se arunc
supernatantul prin inversarea tubului, iar ultimele picturi se aspir cu o pipet automat (cu ct
deproteinizarea este mai nalt, cu att sedimentul ADN este mai incolor i transparent). Sedimentul
se usuc 15 min pe baie de ap (sau termostat) la 37
o
C. Sedimentul ADN se resuspend n 20-40 l
tampon TE pH 8.0.

1
Cap.3-1 Tehnici de genetic bacterian
8. Indeprtarea moleculelor de ARN din extract. La extractul ADN se adaug soluie stoc de RNaz
A (soluia stoc are concentraia de 10 mg/ml) pentru a ajunge la o concentraie final de 100-200
g/ml. Tuburile se in 1h pe baie de ap la 37
o
C.
Se repet etapele 6 i 7.
Facultativ : sedimentul ADN se spal cu etanol 70% rece (-20
o
C) sau cu amestec de etanol 70% - acetat de
amoniu 7.5 M rece (-20
o
C), ce se toarn ncet pe pereii tubului pentru a nu disloca sedimentul; se inverseaz
tubul de cteva ori; se centrifugheaz 10-15 min la 15000 rpm 4
o
C i se arunc etanolul.
9. Dizolvarea sedimentului ADN: sedimentul ADN se usuc 20-30 min pe baie de ap (sau
termostat) la 37
o
C (tuburile Eppi se pun pe baia de ap cu capacele desfcute, iar baia de ap se las
descoperit); sedimentul se resuspend n 20-40 l tampon TE pH 8.0 (funcie de concentraia
asteptat i de necesiti). Tuburile se in aproximativ 10 h la frigider 4
o
C (pentru dizolvarea complet
a ADN), apoi se stocheaz la 20
o
C.

Medii i soluii
Mediul de cultur Luria-Bertani: bacto-tripton 1%, extract drojdie 0.5%, NaCl 1% pH 7.5
Soluia I = TEG + lizozim = Tris 25 mM, EDTA 10 mM, glucoz 50 mM pH 8.2-8.7
lizozimul se adaug n concentraie variabil, funcie de structura peretelui bacterian al tulpinii analizate (n
general, pentru tulpinile de E.coli este suficient concentraia de 2-5 mg/ml)
lizozimul se adaug numai nainte de folosire i doar n volumul de TEG ce va fi utilizat n ziua respectiv
(este recomandabil s nu se stocheze ca soluie nici mcar la congelator).
SDS 20%, g/v, n a.d.
KCl 2.5 M, n a.d.
soluie stoc de pronaz E: 20 mg/ml n a.d. steril. Se prepar 100-200 l soluie ntr-un Eppi mic
(de capacitate 0.5 ml) steril, se porioneaz n porii de cte 10-20 l n tuburi Eppi mici sterile
i se stocheaz la 20
o
C. In funcie de numrul de tulpini luate n lucru se scot din congelator
una sau mai multe porii care, odat dezgheate, se folosesc imediat. Prin recongelare,
enzimele i pierd activitatea.
soluie stoc de proteinaz K: 20 mg/ml n a.d. steril. Se prepar, se porioneaz similar i se
stocheaz la fel ca soluia de pronaz E.
soluie stoc de RNaz A: 10 mg/ml n a.d. steril.
De obicei, se prepar un volum mic (0.5-1 ml) de soluie stoc de RNazA, astfel: ntr-un Eppi de 1.5 ml steril se
pune 0.5-1 ml a.d.s. i se adaug o cantitate de RNazA pentru a obtine o concentraie de 10 mg/ml. Se agit
pentru dizolvare. La marea majoritate a preparatelor de RNazA comercializate nu este necesar fierberea
soluiei. Dup dizolvare, soluia se porioneaz (n porii de 10-50 l) n tuburi Eppi mici (de 0.5 ml). Poriile se pun
n congelator (la 20
o
C). Cnd este necesar, se scoate din congelator o porie, se decongeleaz rapid i se
folosete. Dei RNazaA este o enzim extrem de stabil, totui i pierde semnificativ din activitate dup 3
congelri (ca atare, o poie se poate repune o singur dat napoi n congelator).
amestec cloroform:alcool isoamilic 24:1 v/v - se prepar extemporaneu
isopropanol
etanol 70% rece (-20
o
C)
tampon TE: Tris 10 mM , EDTA 1 mM (pH 8)

Izolarea i purificarea ADN genomic bacterian prin tehnica CTAB (Ausubel, 1994)
La tulpinile bacteriene cu coninut bogat n polizaharide se recomand folosirea tehnicii CTAB
tehnic ce permite ndeprtarea n cea mai mare parte a acestor impuriti din extractul final de ADN
cromosomal (CTAB = cetiltrimetilamonium bromide).
Ca i n tehnica prezentat anterior, tulpinile bacteriene se cultiv n mediu de cultur lichid Luria-
Bertani (sau n alt mediu adecvat pentru tulpina respectiv), la 37
o
C (sau la temperatura optim pentru
tulpina respectiv) timp de 36h, pn la atingerea fazei staionare de cretere.
1. Obtinerea sedimentului celular. Sedimentarea celulelor se face n aceleai condiii ca i n
tehnica Johnson.
Opional: n cazul unor tulpini bacteriene cu coninut n polizaharide extrem de ridicat, se pot efectua 1-2 splri
ale sedimentului celular (cu resuspendarea total a celulelor) cu cte 250 l sarcosyl 0.5%; fiecare din splri
este urmat de cte o centrifugare de 10 min la 10.000 rpm, cu aruncarea supernatantului;
2. Distrugerea peretelui celular. Sedimentul celular se resuspend n 567 l TEG + lizozim 10 30
mg/ml; probele se in 15 min la 37
o
C (pe baie de ap); (concentraia de lizozim depinde de structura
peretelui celular al tulpinilor bacteriene luate n lucru);
3. Liza celular total. Se adaug 30l soluie SDS 10% i se inverseaz tuburile de cteva ori (n
aceast etap se produce liza celular i, deci, suspensia opac devine o soluie translucid i vascoas); n
cazul unor bacterii recalcitrante, aceast etap poate fi prelungit 10 30 min la 37
o
C (pe baie de
ap);

2
Genetica microorganismelor i inginerie genetic microbian
Note de curs i tehnici de laborator
4. Deproteinizare enzimatic. In fiecare tub se adaug 5l soluie stoc de proteinaz K (20 mg/ml);
incubare 1h la 37
o
C;
5. Precipitarea proteinelor cu soluie salin. In fiecare tub se adaug 100 l soluie NaCl 5M, se
amestec puternic; se adaug 80 l soluie CTAB/NaCl, se amestec din nou i se incubeaz 10 min
la 65
o
C (polizaharidele coprecipit cu proteinele).
6. Deproteinizare cu solveni organici. Se efectueaz 3 etape succesive (6.a, 6.b i 6.c):
6.a cu amestec cloroform : alcool izoamilic (CIA): se adaug 650 l amestec cloroform: alcool
izoamilic (24:1 v/v) i se amestec tuburile prin inversare viguroas; se centrifugheaz 12 min la
12000 rpm; se preia faza superioar cu o pipet automat (fr a intra n interfa) i se transfer ntr-
un tub Eppi curat;
6.b cu fenol : se aduce cu fenol (redistilat) pn la 1 ml i se amestec viguros; centrifugare 14
min. 10000 rpm; se preia faza superioar ntr-un Eppi curat;
6.a cu amestec cloroform : alcool izoamilic (CIA): se aduce cu amestec cloroform : alcool
izoamilic (24:1 v/v) pn la 1 ml; amestecare viguroasa; recentrifugare n aceleai condiii, apoi din
nou se preia faza superioar ntr-un Eppi curat;
7. Precipitarea acizilor nucleici. Se adaug izopropanol rece (-20
o
C) pn la volum total de 1 ml; se
amestec prin inversarea tubului; opional, se poate prelungi precipitarea acizilor nucleici prin
depunerea tubului 15 30 min la 20
o
C sau chiar la 70
o
C; precipitatul este sedimentat prin
centrifugare 10-15 min la 15000 rpm 4
o
C; se arunc supernatantul, iar sedimentul se usuc 20-30 min
pe baie de ap (sau termostat) la 37
o
C. Sedimentul ADN se resuspend n 20-40 l tampon TE pH
8.0.
8. Indepartarea moleculelor de ARN din extract. Se efectueaz ca i n cazul tehnicii Johnson.
9. Dizolvarea sedimentului ADN. Se realizeaz similar cu etapa corespunzatoare din tehnica
Johnson.

Soluii
1. tampon TEG (vezi protocolul anterior) n care se adaug extemporaneu i numai n volumul care se
folosete n ziua respectiv, lizozim n concentraie final de 10 30 mg/ml;
2. sarcosyl 0.5% g/v n a.d
3. soluie NaCl 5M (se poate prepar astfel: 2,922g NaCl la volum total de 10 ml cu a.d.)
4. soluie CTAB 10%, NaCl 0.7M; un volum de 10 ml se prepar astfel: 0,41g NaCl dizolvat n 8ml
a.d.; 1g CTAB adugat ncet; amestecare cu nclzire la 65
o
C; se aduce la 10 ml cu a.d.
5. soluie stoc de proteinaz K 20 mg/ml
6. amestec cloroform:alcool izoamilic (24:1 v/v)
7. fenol redistilat
8. izopropanol rece (-20
o
C)
9. soluie stoc de RNazA 10 mg/ml
10. etanol 70% rece (-20
o
C)
11. tampon TE pH 8.0


Izolarea i purificarea ADN genomic bacterian prin tehnica GCN
Aceasta tehnic este recomandata n mod special pentru tulpinile bacteriene cunoscute a avea un
coninut mai bogat n proteine (GCN = Guanidine thiocianat, substan cu capacitatea de a precipita
marea majoritate a proteinelor celulare).
Ca i n cazul protocoalelor anterioare, tulpina bacterian se cultiv n mediu lichid, cu agitare, la
temperatura optim. Dup atingerea fazei stationare, se efectueaz urmatoarele etape:
1. Obinerea sedimentului celular. Sedimentarea celulelor se face n aceleai condiii ca i n
tehnica Johnson; supernatantul se aspir cu o pipet automat.
2. Distrugerea peretelui celular. Sedimentul celular se resuspend n 150 l sol TEG + lizozim 10
30 mg/ml; resuspendarea celulelor se face cu ajutorul vrfului pipetei automate, apoi tuburile se
vortexeaz; tuburile Eppi se pun 15 30 min la 37
o
C (pe baie de ap).
3. Liza celular total i degradarea proteinelor. Se adaug 300 l soluie GCN 5M; se amestec
prin inversarea tubului; se ine tubul 5 min la temperatura camerei i apoi 15 min la 20
o
C;

3
Cap.3-1 Tehnici de genetic bacterian
4. Precipitarea proteinelor cu soluie salin. Se adaug 225 l soluie acetat de amoniu 7.5M rece
(-20
o
C), se amestec ncet prin inversarea tubului (apare un precipitat alburiu); tuburile se in apoi 10
min la 20
o
C;
6. Deproteinizare cu solveni organici. Peste supernatant se adaug amestec cloroform : alcool
izoamilic (24:1, v/v) pn la volum total de 1.5 ml; cele 2 lichide se amestec la temperatura camerei
timp de 5-10 min prin inversarea viguroasa a tubului.
Pentru separarea rapid a celor 2 lichide tuburile se centrifugheaz 12-15 min la 12000 rpm 4
o
C. Faza
apoasa (superioar) se transfer n alt Eppi cu o pipet automat, fr a intra n interfa. Se
readaug amestec cloroform:alcool izoamilic (24:1 v/v); se repeta operatiunile de amestecare i
centrifugare; din nou faza superioar se transfer ntr-un Eppi curat.
7. Precipitarea acizilor nucleici. Se adaug izopropanol rece (-20
o
C) pn la volum total de 1.5 ml;
se inverseaz tuburile timp de 1 min i se in la temperatura camerei timp de 10 min.
Acizii nucleici precipitati sunt sedimentai prin centrifugare 15 min la 15.000 rpm 4
o
C; se arunc
supernatantul, fie cu o pipet automat, fie prin inversarea tubului;
Facultativ : sedimentul ADN se spal cu etanol 70% rece (-20
o
C) sau cu amestec de etanol 70% - acetat de
amoniu 7.5 M rece (-20
o
C), ce se toarn ncet pe pereii tubului pentru a nu disloca sedimentul; se inverseaz
tubul de cteva ori; se centrifugheaz 10-15 min la 15000 rpm 4
o
C i se arunc etanolul.
9. Dizolvarea sedimentului ADN. Sedimentul ADN se usuc 20-30 min pe baie de ap (sau
termostat) la 37
o
C (tuburile Eppi se pun pe baia de ap cu capacele desfcute, iar baia de ap se las
descoperit); sedimentul se resuspend n 20-40 l tampon TE pH 8.0 (funcie de concentraia
ateptat i de necesiti). Tuburile se in aproximativ 10 h la frigider 4
o
C (pentru dizolvarea complet
a ADN), apoi se stocheaz la 20
o
C.


Recomandari generale pentru izolarea i purificarea ADN genomic la bacterii
1. Alegerea protocolului de lucru funcie de particularitile tulpinii bacteriene analizate
Protocolul de lucru trebuie ales funcie de informaiile pe care le avem n prealabil despre tulpina
respectiv. Astfel, pentru tulpinile cu coninut ridicate de polizaharide se prefer tehnica CTAB, pentru
cele cu coninut ridicat de proteine tehnica GCN, iar pentru tulpinile obinuite este suficient un
protocol de tip Johnson.
2. Construirea propriei variante tehnice, adaptata pentru tulpina analizata
In afar de aceste 3 protocoale de baz, pot fi construite diverse variante tehnice combinate astfel
nct s fie optime pentru o anumit tulpin bacterian.
3. Spargerea celulelor bacteriene
Spargerea celulelor bacteriene presupune 2 etape: distrugerea peretelui celular (cu obinere de
protoplati/sferoplati) i spargerea membranei plasmatice (ce conduce la liza celular total).
Distrugerea peretelui celular este realizat experimental de cele mai multe ori cu ajutorul unor enzime.
La marea majoritate a bacteriilor este suficient folosirea lizozimului. La bacteriile Gram-negative se
folosesc concentraii mai mici de lizozim (ntre 5-15 mg/ml, la tulpini de la laborator de E.coli fiind
suficient 1-1.5 mg/ml), n timp ce bacteriile Gram-pozitive necesit concentraii mai mari de lizozim
(15-30 mg/ml). Pe de alt parte, exist i bacterii cu o asemenea structur a peretelui celular, nct
lizozimul este ineficient i sunt necesare alte tipuri de enzime (de ex. distrugerea peretelui celular la
tulpinile de Staphylococcus este realizat cu lizostafin complex enzimatic produs tot de anumite
tulpini de stafilococ)
4. Deproteinizarea cu solveni organici
Pentru o deproteinizare suficient a extractelor de ADN de multe ori sunt necesare etape de tratare cu
solveni organici fenol i/sau cloroform. Cel mai bun deproteinizant este fenolul, redistilat i
tamponat cu Tris pH 5.6, 7.8 sau 10. Schema complet de deproteinizare cu solveni organici
cuprinde urmatoarele etape n care lizatul celular este tratat (prin amestecare) cu volum egal de:
1. fenol
2. fenol:cloroform:alcool izoamilic (25:24:1 sau 16:33:1 v/v); nu este necesar prepararea
volumului total de amestec de 50 ml, ci prin calculare poate fi preparat un volum mai mic
3. cloroform:alcool izoamilic (24:1 v/v)
Dup fiecare din cele 3 etape este necesar o centrifugare pentru separarea mai rapid a celor doua
faze. Apoi faza superioar (apoas = lizatul celular) este transferat n alt Eppi i peste ea se adaug
amestecul urmator.
Nu pentru orice tulpin i nu n orice situatie este necesar parcurgerea tuturor celor trei etape de
deproteinizare cu solveni organici (funcie de manipulrile ulterioare la care va fi supus ADN extras).
Astfel, n cazul n care ADN-ul va fi supus unor digestii cu endonucleaze de restricie, este
recomandabil s se efectueze o deproteinizare ct mai nalt.

4
Genetica microorganismelor i inginerie genetic microbian
Note de curs i tehnici de laborator
5. Adaptarea oricrui protocol funcie de necesiti, respectiv renunarea la diverse etape de
purificare.
6. Precipitarea acizilor nucleici.
7. Prepararea i stocarea soluiilor folosite.
8. Stocarea extractelor de ADN.
In cazul n care n etapa anterioar se folosete o concentraie final de SDS mai mare de 1%, atunci se
recomand folosirea proteinazei K (n loc de pronaz E) n concentraie final de 100-300 g/ml


Cap.2.2. Determinarea spectrofotometric a puritii i concentraiei ADN cromozomal izolat
Inainte de a folosi ADN-ul extras i purificat, n diverse manipulri moleculare, este necesar s
se verifice puritatea i integritatea lui.
Verificarea puritii ADN se realizeaz de regul spectrofotometric, innd cont de
urmtoarele considerente :
a) moleculele ADN (att formele dublu-, ct i cele moncatenare) prezint absorbana maxim
la lungimi de und ce variaz ntre 257 i 260 nm; cel mai frecvent, ADN de origine bacterian
prezint peak-ul specific la = 258 nm;
b) absorbana maxim pentru proteinele rmase eventual n extract este la =280 nm ; rmase
exist i unele proteine care absorb radiaiile luminoase cu =260 nm, dar contribuia lor la absorbana
total a unui extract ADN la =260 nm este echivalent cu cea a absorbanei la =300 nm
c) unele polizaharide absorb radiaiile luminoase cu = 230 nm
d) absorbana la 220 nm este dat de oligonucleotide ce reprezint de obicei molecule de ADN
fragmentat n mod artificial n timpul tehnicilor de extracie i purificare
In funcie de valorile A
260
i A
280
se poate stabili gradul de contaminare proteic, astfel :
- raportul A
260
/ A
280
optim este de 1.8-2.0
- dac acest raport este mai mic de 1.7, atunci contaminarea proteic a extractului ADN este
semnificativ
- raportul poate fi mbuntatit printr-un nou tratament cu amestec cloroform:alcool izoamilic,
urmat de precipitare cu etanol 100% rece (-20
o
C); pentru a crete procentul de ADN precipitat, se
recomand adugarea unei soluii NaCl pna la concentraia final 0.1 M nainte de a adauga etanol.
Gradul de contaminare cu ARN a extractului este indicat de valori mai mari de 2.0 ale raportului
A
260
/ A
280
. In aceast situatie se recomand un tratatment cu RNazaA aplicat extractului de ADN,
urmat de deproteinizare i reprecipitarea moleculelor de acizi nucleici.
Gradul de contaminare cu polizaharide se determina n funcie de valoarea raportului A
260
/A
230
,
care trebuie s fie mai mare de 2. Daca obtinem valori mai mici de 2, acest lucru este o dovada a
prezentei polizaharidelor n extractul ADN. Polizaharidele pot fi indepartate prin precipitare cu etanol,
precedata de tratamentul cu soluie NaCl n concentraie final de 0.1 M.
Se constat deci, c pentru a aprecia gradul de puritate a unui extract ADN este necesar
citirea spectrofotometric a valorilor absorbanei
la mai multe lungimi de und (este absolut
necesar folosirea unor cuve de cuar cuve ce
permit trecerea radiaiilor luminoase din spectrul
UV). In paralel, dac performanele tehnice ale
spectrofotometrului o permit, se recomand i
determinarea ntregului spectru de absorbie al
probei, n domeniul = 200 350 nm, pentru a
putea astfel evidenia eventualii contaminani
din extract ce prezint peak-uri la alte lungimi
de und decat cele menionate (Fig.2.1.).


Fig.2.1. Exemplu de DNA scan


Determinarea concentraiei ADN
Cea mai simpl metod de determinare a concentraiei ADN dintr-un extract se bazeaz pe citirea
absorbanei la = 260 nm. Astfel, se pot folosi urmtoarele formule:
A
260
= 1 corespunde la 50 g ADN d.c. / ml
A
260
= 1 corespunde la 33 g ADN m.c. / ml
A
260
= 1 corespunde la 40 g ARN m.c. / ml
A
260
= 1 corespunde la 20 g oligonucleotide / ml

5
Cap.3-1 Tehnici de genetic bacterian
Avnd n vedere faptul c n marea majoritate a cazurilor valoarea concentraiei ADN este
important pentru manipulrile ulterioare ale acestuia, este absolut necesar ca nainte de
determinarea concentraiei s se estimeze gradul de puritate al extractului, i respectiv, determinarea
exact a A
260
(totodat, dac spectrul de absorbie evideniaz peak la = 258 nm, atunci aceast
valoare trebuie folosit pentru determinarea concentraiei, i nu A
260
). Este de asemenea
recomandabil ca determinarea concentraiei ADN pe baza A
260
s fie corelat i cu aspectul ADN n
gel electroforez.
Atunci cnd ntregul volum al probei este foarte mic astfel nct nu permite citire
spectrofotometric nici mcar n cuve cu volum de 50-100 l, estimarea concentraiei ADN poate fi
realizat i cu ajutorul electroforezei n gel de agaroz. In acest caz se incarca n gel un volum mic de
proba, iar alaturat se incarca mai multe godeuri cu concentraii de ADN cunoscute (de exemplu, se pot
folosi dilutii ale unei probe de ADN standard, comercializat, cu concentraie cunoscuta). Concentraia
probei este apoi apreciata n comparatie cu intensitatea spoturilor fluorescente emise de soluiile
cunoscute (se folosete coloratie cu bromura de etidium). Aceasta metod permite detectarea unor
cantiti extrem de mici de ADN (1-5 ng).
Alte conversii importante legate de concentraia ADN sunt date de urmatoarele formule:
1 kb ADN d.c. (sare de sodiu) = 6.6 x 10
5
dal
1 kb ADN m.c. (sare de sodiu) = 3.3 x 10
5
dal
1 kb ARN m.c. (sare de sodiu) = 3.4 x 10
5
dal
Greutatea moleculara medie a unei nucleotide = 330 dal
1 g de ADN de 1000 bp = 1.52 pmol (3.03 pmol de capete)
1 pmol de ADN de 1000 bp = 0.66 g

Formule pentru conversiile molare ale ADN d.c :
pmol x N x 660pg/pmol x 1g/10
6
pg = g
i
g x 10
6
pg/1g x pmol/660pg x 1/N = pmol

unde N = numarul de perechi de nucleotide
660 pmol/pg = greutatea moleculara medie a unei perechi de nucleotide
Pentru ADN m.c. se folosesc aceleai formule, singura diferen fiind nlocuirea valorii de 660 cu
valoarea de 330.


Verificarea electroforetica a integritatii ADN
Migrarea moleculelor de acizi nulceici n gel de agaroz n camp electric este o tehnic folosit
extrem de frecvent n biologia moleculara. Aceasta tehnic este aplicata n foarte multe variatii, funcie
de tipul de molecule supuse electroforezei, precum i funcie de scopul electroforezei respective.
Astfel, electroforeza n gel de agaroz (EGA) constituie o metod standard pentru separarea,
purificarea i identificarea moleculelor de ADN, inclusiv din amestecuri ce nu pot fi separate adecvat
prin alte tehnici.
Pentru verificarea integritatii ADN-ului cromozomal, precum i pentru estimarea gradului de
contaminare cu ARN, extractul este supus unei electroforeze n gel de agaroz n sistem submers, n
plac orizontal.
Principiul general al electroforezei acizilor nucleici este urmtorul :
La pH alcalin sau neutru, acizii nucleici au sarcin electric global negativ. Ca urmare, dac sunt
plasate ntr-un cmp electric, moleculele de acizi nucleici migreaz la anod (+).

Protocolul de lucru :
1. Tamponul de electroforez cele mai folosite tampoane n electroforeza acizilor nucleici sunt
TBE, TAE i TPE (cel mai folosit n ultimii ani este TBE).
TBE 1X Tris 0.089 M, acid boric 0.089 M, EDTA 0.002 M pH 8.0-8.5
TAE 1X Tris 0.040 M, acid acetic 0.040M, EDTA 0.002 M pH ~ 8.5
TPE 1X Tris 0.090M, acid fosforic 0.090M, EDTA 0.002 M pH ~ 8.0-8.5
Not : de obicei, soluiile tampon pentru electroforeza acizilor nucleici se prepar n forma de soluii stoc de 5
ori mai concentrate (5X) fata de soluia de lucru (1X).

2. Prepararea gelului de agaroz
Este preferabil s preparati numai volumul de agaroz necesar pentru un gel.
a. volumul de agaroz necesar se calculeaza funcie de tavita n care va fi turnat, astfel nct gelul s
aiba o grosime de 3 4.5 mm; se cantareste agaroz (cel mai comod, ntr-un vas Erlenmeyer) i
peste ea se adaug volumul de tampon necesar pentru a obtine concentraia de agaroz dorita;

6
Genetica microorganismelor i inginerie genetic microbian
Note de curs i tehnici de laborator
(concentraia de agaroz poate varia ntre 0.6-1%, funcie de dimensiunea moleculelor de ADN ce
urmeaza a fi supuse electroforezei i de marca i tipul de agaroz folosit); n general, pentru gelul de
verificare a unor extracte de ADN cromozomal, se folosete o concentraie de 0.7-0.9%
b. pentru dizolvarea complet a agarozei se incalzeste recipientul pe bain-marie (sau 1 min la cuptorul
cu microunde) pna la fierbere; dac n laborator nu exist cuptor cu microunde, cea mai comoda
varianta este de a pune vasul Erlenmeyer (acoperit cu o placuta Petri) pe o sita cu azbest la un bec
Bunsen; nu trebuie s dea n foc, iar fierberea se continua la flacara mica pn la dizolvarea complet
a agarozei; apoi se raceste la 45-50
o
C. Atentie: Fie c incalziti soluia de agaroz pe flacara, fie la
cuprotul cu microunde, flaconul trebuie s aiba dop/capac, dar nu inchis fest.
Not : funcie de aplicatie (de scopul electroforezei) exist comercializate diverse tipuri de agaroz. Pentru un
gel de verificare se poate folosi cel mai simplu i mai ieftin tip de agaroz.

2. Turnarea gelului
In majoritatea cazurilor (inclusiv n gelurile de verificare a ADN cromozomal) se efectueaz
electroforez n plac orizontal n sistem submers. Asemenea aparate sunt formate dintr-un tanc de
electroforez i o tavita n care se yorna gelul de agaroz.
a. se inchide tavita aparatului de electroforez cu banda adeziva sau, dac exist, cu suportii de
cauciuc;
b. se monteaza pieptenul astfel inct dintii acestuia s nu atinga tavita (s nu patrunda n toata
grosimea gelului); pieptenul se alege corelat cu volumul de proba ce urmeaza a fi incarcat n gel.
c. se toarn gelul cald (45-50
o
C), n grosime de 3-5 mm; se las 20-45 min (funcie de temperatura
ambianta) pentru racirea i solidificarea gelului fr a se misca tavita sau pieptenul
d. se indeparteaza banda adeziva i pieptenul fr a se rupe gelul

3. Pregatirea probelor
Pentru pregatirea probelor de ADN se procedeaza astfel:
a. se calculeaza volumul de proba ce urmeaza a fi incarcat n gel, corelat cu volumul godeurilor
lasate de dintii pieptenului; se calculeaza volumul soluiei de BFE sau BFER astfel nct acesta s
reprezinte 1/4 - 1/6 din volumul probei; astfel, pentru geluri de verificare a unor extracte de ADN
cromozomal (obtinute prin minimetode), se recomand incarcarea a 5l (din volumul de 20-40 l
al extractului), care se amestec cu 2 l BFE. Atentie: pentru verificarea unor asemenea extracte
de ADN cromozomal, se recomand folosirea BFE, i nu a BFER, astfel nct n gelul de
electroforez s poata fi detectate i eventualele molecule de ARN contaminante.
b. pentru fiecare proba de ADN se folosete un tub Eppi mic (de 0.5 ml) curat n care se pune intai
volumul de BFE sau BFER; apoi se pune volumul de proba, i se amestec circular cu vaful
pipetei automate, urmat de 1-2 aspirari; n caz c s-au format bule de aer, se bate usor tubul de
masa sau se centrifugheaz 20-30 sec.
c. Tubul cu restul de proba se pune inapoi n frigider/congelator
Pentru economie de timp, probele se pot pregati n timp ce se solidifica gelul.

4. Montarea electroforezei i incarcarea probelor
a. tavita cu gelul solidificat se asaza n tancul de electroforez
b. n tanc se toarn tampon TBE 1X pH 8.3 (sau alt tampon de electroforez), pna la nivelul la care
lichidul acopera gelul sub forma unei pelicule de 1-2 mm grosime
c. n godeurile formate de dintii pieptenului n gel se toarn probele pregatite conform pct. 3.a.

5. Pornirea electroforezei
a. se pune capacul aparatului de electroforez
b. se aranjeaza firele de legatura cu un cap la electrozii aparatului de electroforez i cu celalalt la
bornele sursei de curent (electrodul dinspre godeuri se cupleaza la catod)
c. se porneste sursa de curent i se fixeaza la inceput la 1.5 V/cm pn la intrarea probelor din
godeuri n gel; apoi se poate mari voltajul la maximum 5V/cm i se las aproximativ 2h
Not : de obicei, se recomand 2-2.5 V/cm i un amperaj de pn n 20 mA; la valori prea mari de amperaj sau
de voltaj benzile de ADN se distorsioneaza prezentand asa-numitul fenomen de smiling.

6. Colorarea gelului
a. la expirarea timpului de migrare se intrerupe alimentarea cu curent electric
b. se scoate tavita cu gelul i se coloreaza (prin imersare ntr-un cristalizor) cu bromura de etidium
(EtBr) 0.5 - 1g/ml timp de 20 min; apoi gelul se spal 30 min n ap distilata, tot n cristalizor.
O alt varianta de colorare consta n introducerea colorantului direct n tamponul TBE 1X
nainte de turnarea acestuia n tancul de electroforez. Colorarea se va realiza deci, simultan cu
migrarea moleculelor de acizi nucleici. In aceast situatie, se recomand folosirea unei concentraii
mai mici de EtBr (0.3 - 0.5 g/ml). In afara de economia de timp.

7
Cap.3-1 Tehnici de genetic bacterian
Bromura de etidium este un agent intercalant (se intercaleaza ntre bazele azotate ale acizilor nucleici) de tip
fluorocrom, care este excitat de lumina UV (=250-310 nm) i emite n vizibil (=520 nm), determinnd colorarea
moleculelor de ADN n roz-violet.

7. Vizualizarea moleculelor de ADN din gel
a. moleculele de ADN se vizualizeaza prin asezarea gelului pe transiluminator UV (=302 nm)
b. se face o poza cu aparat de fotografiat obisnuit (i cu un filtru rosu) sau cu un aparat polaroid
(Fig.2.2.)

Soluii
1. Soluie stoc TBE 5X pH 8.0-8.5 - 500 ml
Tris 27 g
Acid boric 13.75 g
EDTA.Na
2
0.372 g
Mod de preparare: ntr-un balon cotat de 500 ml se pun 27 g Tris, se adaug 2-300 ml a.d. i se
amestec pn la dizolvare; dup dizolvarea Tris se adaug EDTA i inca ~ 100 ml a.d. i se
amestec pn la dizolvare; la urma se adaug i acidul boric i inca a.d. i se dizolva. Se verifica pH-
ul i apoi se aduce la semn. Aceasta soluie reprezint stocul de TBE 5X, care este stabil 2-3
saptamani la temperatura camerei i 2-3 luni la frigider (4-8
o
C).
Soluia de lucru TBE 1X se prepar extemporaneu din soluia stoc 5X, i doar volumul necesar.
2. Soluie TE pH 8.0 : Tris 10mM, EDTA 1mM se prepar de obicei 50-100 ml i se poate
autoclava
3. Soluie BFE
albastru de bromfenol 0.4 %
sucroza 55.0 %
Se prepar, de regula, folosind 1 ml TBE 1X, dizolvand intai albastrul de bromfenol i apoi
sucroza.
4. Soluie BFER
albastru de bromfenol 0.4 %
RNazaA 100 g/ml
sucroza 55.0 %
Se prepar, de regula, folosind 1 ml TBE 1X, dizolvand componentele n ordinea mentionata
(albastrul de bromfenol, RNazaA, sucroza); RNazaA se adaug din soluie stoc de 10mg/ml.
sucroza sau glicerina dau vscozitate amestecului; albastru de bromfenol este folosit ca marker de
migrare cnd spotul albastru a migrat pna aproape de capatul gelului se opreste curentul electric
5. Soluie stoc de RNaz A 10mg/ml
6. Soluie stoc de bromura de etidium 10 mg/ml
De obicei, se prepar 5-10 ml soluie stoc, astfel: se cantareste cantitatea dorita de bromura de
etidium i se dizolva n a.d. Soluia se stocheaz la frigider (2-3 luni) n sticla bruna (pentru c
substanta se descompune la lumina).
Atentie ! : bromura de etidium este extrem de toxica i are un foarte puternic efect mutagen; ca atare, este
obligatorie manipularea ei cu manusi de laborator.


1 2 3 4 5 6

Fig.2.2. Exemplu de electroforez n gel de agaroz pentru ADN genomic
(Godeuri: 1- E. coliB CTAB; 2- E.coliB Wizard; 3- Sl3; 4- Sl4; 5- Sl5; 6- E.coli V517)

8