Tehnica PCR

PCR (polymerase chain reaction - reac ia n lan a polimerazei) este o tehnic de

biologie molecular ce permite amplificarea (clonarea) in vitro a unui fragment specific de
AD! Prin aceast metod se poate amplifica de p"n la #$
%
ori orice fragment de AD dorit
i nu este necesar separarea prealabil a acestuia de restul AD-ului din prob! &ehnica
PCR este foarte sensibil' poate s detecteze i s amplifice chiar i o singur molecul de
AD din orice tip de prob biologic! &ehnica a fost a fost inventat de ctre (ar) *ullis n
#%+,- cruia i s-a acordat premiul obel pentru chimie n anul #%%.!
Pentru ca un fragment de AD s poat fi amplificat- nu este necesar cunoa terea
ntregii sale secven e- ci doar a secven elor de /$-.$ nucleotide de la e0tremit ile sale!
Aceste secven e cunoscute sunt folosite pentru a proiecta dou oligo-dezo0inucleotide
sintetice- fiecare fiind complementar c"te uneia din cele dou catene ale dublului heli0
AD- la nivelul celor dou e0tremit1i ale fragmentului care urmeaz a fi amplificat! Aceste
dou oligonucleotide servesc ca primeri (amorse) pentru sinteza de AD in vitro 2i ele
determin e0tremit1ile fragmentului de AD care va fi ob1inut n urma amplificrii!
Etapele amplificrii prin PCR
&ehnica PCR presupune parcurgerea a trei etape succesive- care se repet ciclic de /3-
.3 de ori! Acestea au loc ntr-un termociclor automat- care poate nclzi 2i rci tuburile
con1in"nd amestecul de reac1ie ntr-un timp foarte scurt! Amestecul de reac ie cuprinde proba
biologic ce con ine AD-ul de interes- perechea de primeri- cei patru dezo0iribonucleozid
trifosfa i (d&P)- ioni de *g
/4
(*g56
,
sau *gCl
/
) i o AD polimeraz termostabil!
7tapele amplificrii PCR sunt'
1. Denaturarea
Are loc la temperatura de %,
$
C 2i const n separarea celor dou catene ale AD
dublu helicoidal- datorit ruperii legturilor de hidrogen dintre bazele azotate complementare!
2. Hibridizarea (8annealing9)
Aceast etap are loc la o temperatur cuprins ntre 3$-:$
$
C! 5cderea temperaturii
permite celor doi primeri s hibridizeze la nivelul secven1elor complementare din cadrul
AD genomic' ei 8scaneaz9 toat lungimea acestuia- iar acolo unde gsesc o secven1 de
AD complementar se fi0eaz prin legturi de hidrogen! ;nul din primeri hibridizeaz la
captul .< al uneia din cele dou catene ale AD-ului int- iar cellalt primer la captul . < al
catenei complementare! Primerii con in- n general- /$-.$ nucleotide!
3. Extensia el!n"area# sinteza $D%&
Are loc la o temperatur cuprins ntre :+-=/
$
C! >n prezen1a celor patru d&P 2i a
unei AD polimeraze termostabile- are loc sinteza selectiv a regiunilor de AD situate ntre
secven ele de AD la care au hibridizat primerii! ?iecare primer este elongat n direc ia
3<@.<- pe baza complementarit1ii cu catena matri1!
Principala AD polimeraz termostabil utilizat pentru amplificarea PCR este Taq
polimeraza- e0tras din bacteria termofil Thermus aquaticus!
C"nd succesiunea celor trei etape este repetat- fragmentele nou sintetizate servesc ca
matri1e la r"ndul lor- iar dup c"teva cicluri produsul predominant este o specie unic de
fragmente de AD a cror lungime corespunde distan1ei dintre cei doi primeri utiliza i! >n
practic- pentru amplificarea eficient a AD- sunt necesare /3-.3 cicluri de reac1ie- fiecare
cuprinz"nd cele trei etape de denaturare- hibridizare 2i sintez a AD! ?iecare ciclu dubleaz
cantitatea de AD sintetizat n ciclul anterior- deci are loc o cre2tere e0ponen1ial a
numrului de copii ale fragmentului de interes- aAung"ndu-se la o amplificare de #$
:
-#$
%
ori-
#
n func1ie de numrul de cicluri! Durata unui ciclu este n Aur de 3 minute- astfel nc"t tehnica
PCR permite amplificarea AD n decurs de dou-trei ore- comparativ cu c"teva zile
necesare pentru metodele de clonare standard- cu aAutorul bacteriilor!
Dup terminarea amplificrii- ampliconul (produsul PCR) este supus mi"rrii
electr!f!retice 'n "el. 7lectroforeza AD se realizeaz- n general- n gel de agaroz!
*oleculele de AD- av"nd o ncrcare negativ conferit de gruprile fosfat ionizate- vor
migra spre anod pe o distan variabil- n func ie de talia lor molecular' moleculele mai
lungi migreaz cu o vitez mai mic (deci pe o distan mai mic ntr-un interval de timp dat)
fa de moleculele mai scurte- deoarece nt"mpin o rezisten mai mare la trecerea prin porii
gelului de agaroz!
7lectroforeza AD se poate realiza i n gel de poliacrilamid- n cazul moleculelor
mai mici de 3$$ perechi de nucleotide- acest suport av"nd o rezolu ie mai bun i permi "nd
separarea moleculelor care difer ca lungime printr-un singur nucleotid!
Pentru a putea vizualiza benzile de AD migrate n gel- AD-ul este marcat cu un
colorant fluorescent n lumina ;B i anume bromura de etidiu!
7lectroforeza care urmeaz unei amplificri PCR permite verificarea c"torva aspecte-
care trebuie s fie cunoscute nainte ca ampliconul s fie utilizat pentru investiga1ii ulterioare'
- verificarea formrii produsului PCR (deci reu ita amplificrii)C
/
- verificarea dimensiunii ampliconului- care corespunde distan ei dintre secven ele
AD la care hibridizeaz cei doi primeri utiliza i la amplificarea PCRC aceasta se realizeaaz
prin compararea cu o scar etalon (amestec de fragmente de AD de mrimi diferite
cunoscute- care sunt migrate n acela i timp cu ampliconul)!
(tilitatea tehnicii PCR
PCR a devenit o tehnic larg utilizat pentru o varietate de aplica ii n domenii
diverse! C"teva dintre acestea sunt'
#! Diagnosticul medical
- diagnosticul molecular' tehnica PCR permite amplificarea unui fragment int dintr-
o anumit gen- n vederea investigrii ulterioare- prin diverse tehnici (e0! digestie cu
endonucleaze de restric ie- secven are) a unor muta ii asociate cu diverse boli geneticeC
- depistarea precoce a unor forme de cancer- prin detectarea muta iilor n genele care
controleaz ciclul celular i repararea AD- responsabile de apari ia canceruluiC
- detectarea bacteriilor i virusurilor cu aAutorul primerilor specifici (e0! virusul DEB
la pacien ii care nu au dezvoltat un rspuns imun i nu pot fi detecta i prin cercetarea
anticorpilor anti-DEB- detectarea bacilului tuberculozei- care are o cre tere lent pe medii de
cultur- etc)C diferen ierea tulpinilor patogene de cele nepatogene prin identificarea unor gene
specifice!
/! 5ecven area AD- n diverse scopuri!
.! &ehnologia AD recombinant- care implic inserarea unei secven e de AD de la
un anumit organism ntr-un plasmid sau n materialul genetic al altui organism!
,! Determinarea nivelului de e0presie al anumitor gene- prin PCR cantitativ (sau R&-
PCR F PCR n timp real)!
3! >n medicina legal- criminalistic' tehnica PCR permite identificarea suspec ilor
prin analiza AD dintr-o prob biologic redus cantitativ rmas la locul crimei (fir de pr-
pictur de s"nge- etc!)!
:! Paleontologia molecular' amplificarea i analiza AD din probe prelevate din
organisme fosile umane sau animale vechi de mii de aniC acest lucru este posibil datorit
faptului c AD este o molecul remarcabil de stabil n timp!
.