III .

Descoperirea
medicamentelor cu
masa moleculara mica
3.1 Introducere
Conform datelor OMS , 80% din populatia Africii si un procent insemnat al populatiei
globului , inca folosesc tratamente traditionale (decocturi, tincturi ,siropuri, unguente
);
Medicamentele din aceasta grupa, au masa moleculara < 500 D si sunt sintetizate
pe cale chimica;
3.2 Abordare irationala
Etape:
-colectarea de materiale naturale (1-5 Kg frunze, scoarta de copac , radacini de
plante , muguri, frunze);
- aceasta colectie , sa fie cat mai biodiversificata, pentru ca dupa extractie sa se
obtina cat mai multe structuri chimice(principii active );
3.2.1 Extractia principiilor active
Extractia principiilor active din materiale naturale solventi organici (alcooli);
Etapele abordarii irationale:
Colectarea produselor naturale;
Extractia compusilor pentru screening: generarea compusilor potentiali terapeutici (CPT);
Optimizarea CPT :purificare si modificare pentru a spori proprietatile lor terapeutice ;
Exemplu: inhibator al enzimei de conversie a angiotensinei : teprotid (extras din veninul de
vipera ); in urma optimizarii :captopril si anapril ;
Paclitaxel: initial extras din coaja de tisa (America de Nord), ulterior din ace de tisa;
3.2.2 Screening
Screeningul miilor de compusi pentru a gasi CPT(dintre cei care
interactioneaza cu tintele terapeutice);
Colectia gasita este stocata sub forma unor librarii(nr de compusi dintr-o
librarie este cuprins intre sute de mii si milione);
Dupa screening acesti compusi trebuie purificati;
3.2.3 Purificarea si optimizarea compusilor
Dupa screening si selectarea compusilor ce au interactionat cu tintele:
purificarea (pe coloane cromatografice );
determinarea structurii prin tehnici de spectroscopie.Elucidarea structurii prin
tehnici de difractie de raze X si spectroscopie RMN ;
Teste in vederea determinarii selectivitatii si indicelui terapeutic .
Modificari ale grupelor functionale pentru a optimiza procesul de
interactiune cu tintele terapeutice si a creste eficienta.
Toate aceste teste reduc nr. posibililor candidati pentru testele preclinice ;
Abordarea actuala : cat mai multe teste pe culturi celulare (mai ieftine si
mai rapide) ;
3.2.4 Screening inalt selectiv(High Throughput
Screening-HTS)
Folosirea metodelor de chimie clasica in
operatia de screening a mii de compusi este
extrem de laborioasa;
Tehnologia actuala : utilizarea sistemelor de
automatizare pe baza de roboti :HTS si
screening ultra inalt slectiv UHTS prin care se
pot face mii sau chiar sute de mii de teste
zilnic (teste de interactiune MD tinta
terapeutica )
Componenta principala :
suport ce contine numeroase cavitati(
reactivi+probe) aranjate matriceal (96 , 384,
1536 );
Reactivii sunt fie depusi pe pereti , fie se
gasesc in cavitati in forma lichida;
Probele(MD + receptori) sunt incubate iar
posibilele reactii sunt monitorizate(detectori
radioactivi, fluorescenti sau luminiscenti ).
Semnalele de la acesti detectori: scorul
operatiei de screening ;
Scor inalt: interactiune MD-tinta;
detector
suport
cavitati
Sistem HTS
Detectie fluorescenta
Avantajele HTS si UHTS :
Reducerea timpului de screening(fara un astfel de sistem screeningul avea
o durata pana la cateva luni sau chiar ani);
Intreg sistemul este automatizat (sortare, pozitionare, amestec reactanti si
masurare);
Sistemele HTS pot analiza pana la 10.000 interactiuni zilnic iar cele UHTS
pana la 200.000;
Interactiuni posibile: reactii de legare medicament-tinta, reactii de modificare
a unor activitati enzimatice;
Reducerea cheltuielilor prin utilizarea unor cantitati mici de reactivi (prin
folosirea unor tehnologii de litografiere-tehnologia inkjet -se pot folosi
cantitati foarte mici 10
-9
-10
-12
l pentru 1536 cavitati;)
Sistemul de evaluare a interactiunii medicament-tinta terapeutica este foarte
sensibil;
3.3 Abordare rationala
Premisa de baza: cunoasterea structurii 3D si secventa
aminoacida a tintei terapeutice;
Aceste informatii cresc foarte mult probabilitatea de a gasi
MD potrivit , care sa interactioneze specific ;
Exista doua metode standard de determinare a structurii :
difractia de raze X si spectroscopia RMN;
Etapele abordarii rationale :
Determinarea structurii proteinelor tinta prin difractie XRD (X Ray
Difraction) si spectroscopie RMN (Rezonance Magnetic Nuclear ) ;
Modelarea interactiunii medicament-receptor prin metodele chimiei
computationale si bioinformatica;
Sinteza chimica si testarea prin HTS;
3.3.1 Bioinformatica
Folosirea tehnologiilor informationale pentru colectarea
si analiza datelor biologice;
Domeniul este initiat in 1980 cand US Energy
Department a lansat o serie de proceduri pentru
stocarea informatiilor privind secventele de ADN: baze
de date GenBank, ulterior transferata catre Healths
National Center for Biotechnology Informatic, NCBT;
Proiectul Genomului Uman : prim exemplu de aplicatie
a bioinformaticii , fiind astfel necesare capacitati foarte
mari de stocare a datelor in domeniul terabitilor 2
40
biti;
Cresterea capacitatii de stocare :necesitat dezvoltarea
unor algoritmi rapizi de cautare;
3.3.2 Chimie computationala
Metoda de abordare in silico: cuprinde o serie de tehnici si algoritmi folositi
pentru a determina asa numita relatie structura activitate (SAR-structure-
activity relationships);
La interactiunea ligand(MD)-proteina(tinta terapeutica ) aceasta isi modifica
conformatia si implicit activitatea biologica;
SAR =f(legatura ligand-proteina si de modificarea conformationala);
Metodologie :
Screening` virtual prin utilizarea unor liganzi generati(pe baza unor biblioteci
de compusi ) de catre computer ;
Pentru a creste sansele de succes acesti compusi vor trebui sa aiba
proprietati specifice medicamentelor;Exista o lege semiempirica (Lipinsk rule
of 5 ) conform careia un medicament are o absorbtie si o permeabilitate
mica daca :
Are mai mult de 5 legaturi de H donoare (suma gruparilor OH si NH
2
);
Masa moleculara > 500 D;
logP(coeficient de partitie octanol/apa )> 5-indica liofilicitatea;
Are mai mult de 5 legaturi de H acceptoare (suma atomilor de N si O);
Procesul de screening are loc prin generarea virtuala a unor tinte cu ajutorul
informatiilor din difractia XRD si spectroscopia RMN;
Procesul este intalnit sub denumirea :docking simulation
(simularea ancorarii);
Aceasta abordare este mai putin costisitoare si mai
eficienta decat calea conventionala , cea chimica ;
Permite ca o baza larga de compusi virtuali sa fie testati
pe situsurile de interactiune ale unor proteine tinta;
Analiza cantitativa a acestor interactiuni(legaturi de
hidrogen, van der Waals, electrostatice) se face prin
intermediul unor scoruri, determinati fie prin aplicarea
unor metode din fizica clasica sau prin utilizarea unor
functii specifice mecanicii cuantice;
Afinitatea acestei interactiuni :
Exprimata de exemplu prin metoda campului de forte;
Calcularea variatiei energiei libere dupa procesul de ancorare;

Rezultatele acestor simulari : obtinerea

unor posibili candidati cu actiune
medicamentoasa (compusi principali-
leading compounds) , care ar urma sa fie
sintetizati prin metode specifice chimiei
combinatoriale;
3.3.3 Chimie combinatoriala
Initiata in 1980 :Mario Geysen
(Melbourne) sintetizeaza simultan mai
multe proteine;
Este una dintre cele mai importante
tehnologii dezvoltate de cercetatorii din
industria farmaceutica , pentru a
reduce costurile si durata asociata
dezvoltarii unui nou medicament;
Principiu : prepararea simultana a unui
numar foarte mare de compusi in
conditii similare, folosind
automatizarea si miniaturizarea ->
librarii combinatoriale;
Are la baza existenta unor elemente
de baza (building blocks: A
1
-A
n
; B
1
-B
n
)
obtinute din chimia computationala ,
carora li se aduga diverse grupe
functionale pentru a spori afinitatea
acestora pentru receptori proteici;
Exista doua tipuri de metode :
Sinteza paralela ;
Metoda split and mix;
Sinteza conventionala
De regula se desfasoara in faza
solida prin atasarea elementelor de
baza, pe suporti de polistiren cu
ajutorul unor grupari de legatura ;
Exemplu:
presupunem ca avem 8 amine A
1
-A
8
,
pe care le atasam pe acesti suporti;
dupa atasare se elimina excesul de
amine ce nu a reactionat cu substratul
(prin spalare);
se adauga apoi acizii carboxilici(B
1
-
B
12
) pentru a forma amidele dorite (96
suporti , reactiile decurg in conditii
identice , intreg procesul este
automatizat);
Dupa desfasurarea reactiilor, compusii
sunt indepartati (cu ajutorul unor
radiatii UV) fiind ulterior supusi
testelor de screening
3.3.4. Genomica si proteomica
Genomica:folosirea biologiei moleculare si genetice la studierea intregului
genom al unui organism.Expresia genica si monitorizarea ei in cazul
anumitor afectiuni, ajuta la intelegerea mecanismelor moleculare ce stau la
baza afectiunii;
Procesul implica :
Identificarea regiunii din genom , de interes;
Generarea unor clone ale regiunii;
Purificarea ADN din clone;
Secventierea ADN-ului purificat;
Proteomica :folosirea biologiei moleculare, geneticii si biochimiei la
studierea structurii si functiilor unor proteine exprimate de celule. Intelegerea
proteomicii ajuta la elucidarea cailor ce caracterizeaza patologia asociata
unei boli.Numarul proteinelor estimate in organism este in jur de 2 mil., ele
fiind implicate in functii vitale din organism.Existenta unei boli in organism
este adesea asociata cu disfunctia unei proteine , iar majoriatea tintelor
terapeutice (receptori , enzime) au natura proteica.
Intelegerea functiei acestor proteine contribuie la descoperirea si
dezvoltarea unor medicamente mai eficiente.
Metabolomica masurarea si interpretarea variatiilor in
timp ale concentratiei , activitatii si fluxul unor metaboliti
endogeni din celule , tesuturi sau din probe
biologice(urina, sange ,saliva).
Inregistrarea acestor modificari , ajuta la studierea cailor
de interactiune dintre celule, tesuturi si organe;
Analiza cantitativa a substraturilor enzimatice sau a
produsilor unor reactii biochimice , reprezinta date utile
despre starea de sanatate sau boala a unui organism
permitand o mai buna evaluare a posibilului MD,
candidat in terapia afectiunii aflata in tratament.
3.4 Abordarea antisens
Daca terapia clasica are ca idee interactiune MD cu
proteine ce stau la baza patologiei asociata unei
anumite boli , abordarea antisens consta in
identificarea genelor implicate.
Aceasta abordare utilizeaza catene scurte de
oligonucleotide(OGN), care se pot lega de ADN-ul
sau ARN-ul celular, blocand astfel expresia unei
gene , implicata in patologia bolii respective;
Denumirea de antisens provine de la faptul ca
aceste segmente sunt complementare secventei
de ADN sau ARNm ce codifica informatia(sens)
care ar urma sa fie supusa transcriptiei sau
translatiei genice.
Medicamentele din aceasta clasa trebuie sa fie
caracterizate printr-un grad ridicat de specificitate ,
existand doua directii principale :
Legarea OGN de ADN dublucatenar impiedicand
desfacerea ADN sau impiedicand legarea de ADN a
unor factori de transcriptie
Legarea de ARNm impiedicand astfel procesul de
translatie ;
Desi abordarea este eleganta exista cateva
obstacole in aplicarea clinica:
OGN au grupari polare , existand astfel serioase
probleme de difuzie in interiorul celulei;
OGN trebuie sa interactioneze cu ADN sau ARNm
prin legaturi de hidrogen ;
MD nu trebuie sa aiba un efect toxic.
Pana in prezent exista un singur medicament
antisens pe piata VITRAVEN(fomivirsen)-
tratamentul retinitei cu ciclomegalovirus