Preparate enzimatice i culturi starter

Curs nr. 1
PREPARATE ENZIMATICE I CULTURI STARTER
Industria alimentar este n fapt o biotehnologie. Materiile prime agroalimentare sunt
produse biologice i implicit conservarea lor pn la procesare sau pn la consum implic
controlul i monitorizarea riguroas a activitii enzimelor proprii esuturilor vegetale i
animale! sau a activitii enzimelor elaborate de microflora specific.
"iotehnologia este un domeniu de o vast interdisciplinaritate! situndu#se la
interferena dintre biologie! microbiologie! biochimie i inginerie genetic.
$nzimele proprii esuturilor vegetale i animale sunt eseniale n transformrile pe care
materiile prime folosite n industria alimentar le parcurg pn la produsul finit%e&' maturarea
fructelor i legumelor! germinarea seminelor folosite ca materii prime n industria
panificaiei sau a berii! maturarea brnzeturilor i a preparatelor din carne! maturarea vinurilor
i a buturilor distilate aromate(.
$nzimele pot avea i un rol deteriorativ cu implicaii n modificarea caracterelor
senzoriale implicit cu pierderea valorii nutritive i tehnologice a materiilor prime
agroalimentare.
)lturi de enzimele e&istente n esuturile vegetale i animale netratate termic un rol
important l *oac i microorganismele. +nele microorganisme fac parte din culturi
selecionate! se adaug ntr#un mediu de cultur n mod intenionat! iar activitatea lor este
e&ploatat i direcionat ctre obinerea unui produs alimentar cu valoare biologic ridicat
%produse lactate acide! vin! bere! oet! alcool etilic! brnzeturi! preparate din carne! produse
farmaceutice! etc(.
)lt categorie de microorganisme pot determina alterarea materiilor prime sau a
produselor alimentare. )cest motiv st la baza impunerii unor norme de igien foarte
riguroase.
,n ultima perioad! rolul biotehnologiilor a fost foarte bine conturat de tendine
moderne aplicate sub form de preparate enzimatice mi&te ca adaosuri e&ogene n industria
brnzeturilor! preparatelor din carne! etc. ,n egal msur! i nu mai puin importante! n
conturarea tendinelor moderne sunt mocroorganismele. $le se folosesc sub form de culturi
starter! singulare sau mi&te! n industria laptelui! crnii! etc.
PREPARATE ENZIMATICE
$nzimele se mai numesc i biocatalizatori de natur proteic! solubili! coloidali!
sensibili la aciunea cldurii i puternic dependeni de condiiile de mediu. $nzimele sunt
sintetizate de celule vii.
,ntr#un metabolism desfurarea secvenial a fiecrei etape este posibil numai sub
aciunea biocatalizatorilor. $nzimele pot fi de natur vegetal! animal sau microbian
%fungic sau bacterian(.
1
-).
/
0
1
2
lactaz
Colin acetil transferaza
Preparate enzimatice i culturi starter
curs nr 1
Clasificarea enzimelor
)ceast clasificare a enzimelor este realizat de comisia de enzime a uniunii
internaionale de chimie pur i aplicat%I+P)C('
I. 2&ido#reductazele catalizeaz reaciile de o&id reducere prin transfer de 0
1
sau
electroni prin combinarea unui substrat de 2
1
.
alcool etilic etanal/-).0/0
/
II. 3ransferaze' catalizeaz transferul unei grupri chimice! alta dect protonul de la un
substrat la altul.
)cetil#Co)/colin acetil colin/Co)
III. 0idrolaze' catalizeaz hidroliza legturilor peptidice! glucozilice! a esterilor din diferite
substraturi prin adiia apei
lactoz galactoz/glucoz

Maltoz 1 glucoz
I4. 5iazele ' catalizeaz scindarea legturilor din molecule pe alte ci dect n prezena apei
fructozodifosfat glicerinaldehid difosfat/fosfohidro&iaceton
4. Izomeraze' catalizeaz izomerizarea optic! geometric i n funcie de tipul de rearan*are
molecular racemaze! cistrans! izomeraze! etc
5#alanin .#alanin
4I. 5igaze' catalizeaz formarea legturilor covalente dintre molecule cu consum energetic
preluat din compui macroergici
glutamat6-0
7
glutamin
Uniti de msr ale acti!itii enzimatice
Practic activitatea enzimatic se poate determina n trei variante'
# msurarea cineticii de reacie ntr#un anumit interval de timp
# msurarea gradului de consumare a substratului
# determinarea concentraiei produsului8produilor de reacie
+nitile de msur admise n activitatea evalurii enzimatice sunt'
# unitatea de de activitate enzimatic%u( reprezint cantitatea de enzime care catalizeaz
transformarea a 1 substrat n timp de 1min n condiii standard %39:
;
C! p9 valoarea optim
pentru categoria de enzime testate(
# <atal# reprezint cantitatea de enzime ce catalizeaz transformarea a 1 substrat n timp de
1sec n condiii standard
)ctivitatea enzimatic poate fi caracterizat prin dou noiuni'
# activitatea enzimatic specific# reprezint numrul de uniti enzimatice coninute ntr#un
protein.
1
0
1
2
lactaz
Colin acetil transferaza
).P6P
1
=lutamin sintetaz
)lanin racemaza
aldolaza
0
1
2
maltaz
)lcool dehidrogenaz
)3P
#activitatea enzimatic molar# reprezint numrul de molecule de substrat transformate de
ctre o molecul de enzim n unitatea de timp
Srsa de o"inere a #re#aratelor
I. >esturi animale' ficat! pancreas! inim! rinichi! creier! mucoase recoltate de la nivelul
stomacului sau a intestinelor
II. >esuturi vegetale' cereale germinate! rdcini! semine! frunze! sev%late&(
III. Microorganisme' bacterii! mucegaiuri! dro*dii
Microorganismele reprezin cea mai bun surs de preparate enzimatice deoarece'
#ciclul de dezvoltare%via( este mult mai scurt dect n cazul plantelor sau a animalelor
#se pot obine n cantiti mari denumite i biomase prin cultivare n instalaii cu un principiu
constructiv simplu i folosind medii de cultur relativ ieftine cum ar fi' tre! zer! irot de
semine de floarea soarelui sau soia! e&tracte de porumb! melas
# producia de enzime generat de microorganisme poate fi mult mai optimatizat cu folosirea
unor tulpini mutante! nalt performante! obinute n urma dorinei de a eficientiza parametrii
procesului fermantativ
# preparate enzimatice obinute! n unele cazuri! prezint stabiliti mai bune la temperaturi
ridicate! acest avanta* vizeaz transferuri enzimatice care se impun ca desfurare la
temperaturi situate la ?:#@;
;
C%industria spirtului(
,n cazul adoptrii ca surs a microorganismelor se impun cteva condiii '
#preparatele enzimatice de origine microbian trebuie s fie libere de to&ine sau de substane
cu efect antibiotic! prin urmare trebuie s fie produse de microorganisme nepatogene fr
potenial alergent! to&icogen! antibiotic.
Preparate enzimatice i culturi starter
curs nr 7
7
SCHEMA TEHNOLOGIC GENERAL DE OBINERE
A
PREPARATELOR ENZIMATICE DIN DIVERSE SURSE
)vanta*ele prelucrrii surselor de enzime de origine animal i vegetal ' sunt sigure din punct
de vedere a inocuitii i permit obinerea cert a enzimelor singulare %a unui singur tip de
enzim(.
.ezavanta*e'
# vegetalele i animalele prezint un ciclu de via lung! prin urmare obinerea enzimelor este
limitat din punct de vedere cantitativA
# preparatele enzimatice obinute din aceste surse sunt mai termosensibile.
Te$nolo%ia de o"inere a #re#aratelor enzimatice
Implic operaiile schiate n figur! iar tehnicile de prelucrare indicate conduc n special la
trei categorii de preparate enzimatice'
preparatul enzimatic brut este caracterizat de o umiditate sczut! de o conservabilitate mai
ridicat n timpA preparate enzimatice lichide concentrate B sunt amestecuri de enzime n
form apoas ce sunt caracterizate de o conservabilitate mai sczutA pentru obinerea celui
de#al treilea tip de preparat enzimatic se parcurge etapa de fracionare care presupune
separarea enzimelor din preparate mi&te i foarte adesea concentrarea i8sau uscarea. )ceste
preparate enzimatice sunt performante! se folosesc n etape biochimice care necesit o dozare
foarte riguroas! condiionate de aciunea! n cele mai multe cazuri! a unei singure enzime. ,n
form uscat aceste preparate au aciune foarte precis i posibilitate de dozare foarte
riguroas.
C
>esuturi vegetale
>esuturi animale
Microorganisme
%/enzime e&tracelulare(
Preparat enzimatic
de uz industrial
Condiionare
Dtandardizare
Concentrarea
+scarea
5iza pereilor celulari
%omogenizare(
$&tracia Eracionare
Preparate parial
purificate
Preparat
enzimatic
Preparat brut
,n cazul preparatelor enzimatice de origine microbian nainte de etapa de liz a
pereilor celulari att n cazul obinerii enzimelor intracelulare! ct i a celor e&tracelulare! se
impune n prealabil o cultivare avansat. )ceast cultivare avansat are ca obiectiv principal
obinerea unei cantiti masive de biomas. ,n acest scop se recurge la dou tehnici de
fermentare'
# fermentaia de suprafa care se bazeaz pe popularea unui mediu solid cu un
microorganism aerob %mucegaiuri(A
# fermentaia n profunzime care se realizeaz ntr#un mediu lichid! plasat ntr#un reactor! la
care toi parametrii de funcionare sunt riguros monitorizai.
)specte privind obinerea preparatelor enzimatice din surs microbian'
Microorganismul ales n vederea cultivrii i obinerii preparatelor enzimatice trebuie
atent selecionat dup anumite criterii. .intre speciile preferate pentru obinerea
microorganismelor amintim' )spergillius niger! )spergillius orizae! Mucor miehei!
DaccharomFces cerevisiae! Penicillium emersoni! <luFveromFces lactic! "acillus
amFlolichefaciens! "acillus licheniformis! "acillus stearothermophillus.
Microorganismul selectat trebuie s fie recunoscut din punct de vedere al inocuitii. 5a
sfritul fermentaiei tehnicile curente presupun inactivarea microorganismului cu pstrarea
intact a activitii enzimatice.
3rebuie aleas tehnica care s presupun productivitate ma&im n condiii industriale.
,n acest scop se prefer o tulpin care s nu modifice n foarte mare msur vscozitatea
mediului n cursul dezvoltrii celulare n aa fel nct s se poat realiza la nivelul reactorului
o omogenizare ct mai riguroas n vederea asigurrii parametrilor de cultivare n toat masa
supus fermentaiei.
,n cazul selectrii unor tulpini nalt productive pstrarea n stare pur! n vederea
recultivrii! trebuie s se desfoare n condiiile meninerii puritii genetice. ,n cazul
pstrrii pe perioade mai lungi a tulpinilor selecionate se recurge la tehnici ale ingineriei
genetice care s identifice eventualele mutaii la nivel celular. ,n condiii controlate se poate
recurge la hibridizri n scopul ameliorrii potenialului enzimatic celular.
Preparate enzimatice i culturi starter
curs nr C
ASPECTE &I'L'(ICE ALE )ERMENTA*IEI PRINCIPALE
,n cursul fermentaiei microorganismului utilizat ca surs se va dezvolta i va produce
enzim! cele dou procese putnd se desfoare simultan sau uneori complet difereniate n
timp.
,n acest sens se caracterizeaz trei situaii'
creterea n biomas i producia de enzime sunt asociate! se desfoar simultan.
producia de enzime ncepe s fie mai consistent dup o perioad de dezvoltare a biomasei i
continu uneori dup ce biomasa a a*uns la mas constant.
e&ist un interval de laten ntre peroiada de cretere i perioada de elaborare a enzimei.
:
)specte biochimice ale fermentaiei principale'
Celulele microbiene utilizeaz foarte mult 2
1
pentru producia de biomas i respectiv
de enzime %7#1; tone de 2
1
pentru un fermentator de 1;;m
7
(! precum i substane nutritive
din mediu. Gezultatul acestor consumuri const n producia de biomas! de C2
1
i cldur.
Cantitatea de cldur elaborat este situat ntre 1H1;
I
i I!:H1;
I
<J8h! iar cantitatea de
metabolii! respectiv de enzime elaborate! este de ;!1 pn la C; g8l. -u n puine situaii
microorganismele elaboreaz enzime intracelulare care impun tehnici specifice de e&tracie.
Ca materii prime pentru medii de fermentaie se pot folosi'
# surs de C' amidon! celuloz! pulp de sfecl! maltode&trine! glucoz! fructoz.
# surs de -' proteine! hidrolizate proteice! e&tracte de dro*die.
# surse minerale' sruri de Mg! Ee! Ca! P! <! Mn! Kn.
)legerea materiei prime este deosebit de important pentru obinerea unui randament
ma&im n cazul fermentaiilor industriale. ,n mod particular pentru obinerea enzimelor
destinate ndustriei alimentare un element determinant const uurina de a controla gradul de
puritate a unui lot de materii prime. ,n anumite situaii se impune un pretratament termic sau
enzimatic de aducere a mediului industrial la caracteristicile optime.
Procedeul nealimentar de conducere a fermentaiei'
,n acest caz toate ingredientele din mediu sunt transferate n fermentator %reactor(! iar
nainte de a se introduce inoculul %cltura de celule de producie de puritate absolut( mediul
se corecteaz din punct de vedere a valorii de p0 i se aduce la temperatura optim de
nsmnare. Pe parcursul fermentaiei se recurge la prelevare de probe n mod steril! probe
care vor indica'
# evoluia vscozitii mediului
# creterea cantitii de biomas
# consumul nutrienilor de baz din mediu %glucide! proteine(
# evoluia coninutului de 2
1
de la nivelul mediului
# coninutul de enzime! respectiv activitatea enzimatic a mediului.
Prin construcia reactorului! acesta permite ataare de'
# senzori care pot s indice valoarea p0#ului i respectiv s o regleze prin adaos de acid sau
bazA
# senzori de temperatur care s comande reglarea temperaturii mediului prin reglarea
debitului de circulaie a apei reci prin mantaua sau serpentina de rcire cu care este dotat
reactorulA
# senzori de reglare a presiunii care s comande deschiderea unor supape de evacuare a C2
1
n aa fel nct la nivelul reactorului s se menin o presiune situat ntre 1 i 7 barriA
# senzor de dozare a coninutul de C2
1
care poate s indice coeficientul de respiraie! notat cu
LG! care indic corelaia ntre cantitatea de 2
1
asimilat i cantitatea de C2
1
dezvoltat.
1(
1(
7(
I
Procedeul alimentar de conducere a fermentaiei'
,n acest procedeu se umple fermentatorul doar cu 7;M din volumul util de mediu
nutritiv! apoi se introduce inoculul de producie i restul de mediu de fermentare. De
consider finalizat fermentaia dup un timp stabilit e&perimental. )cest procedeu se aplic
n cazul n care sinteza enzimelor este dependent de concentraii ridicate ale unuia dintre
componenii mediului sau n cazul n care creterea microorganismelor ar putea induce i
creterea vscozitii mediului. ,n cazul acestui procedeu alimentarea cu mediu proaspt
%?;M( poate fi repetat efectundu#se n schimb evacuri programate cu condiia ca n
fermentator s rmn dup fiecare evacuare 7;M mediu fermentat care va constitui inoculul
de producie pentru ar*e succesive.
Procedeul continuu de conducere a fermentaiei'
)cest procedeu necesit alimentarea continu a fermentatorului cu mediu i folosirea
unei unei culturi concentrate de microorganisme. ,n acest caz bioreactorul const ntr#o
instalaie alctuit din fermentator cuplat la o unitate de ultrafiltrare. )ceast unitate de
ultrafiltrare are rolul de a recicla biomasa produs. 3ipul constructiv al unui astfel de
bioreactor i implicita opiune de a evacua la debit constant mediul fermentat prezint
urmtoarele avanta*e'
# deto&ifierea mediului de cultur prin eliminarea permanent a metaboliilor formaiA
# dozarea e&act a cantitii de mediu proaspt n funcie de cantitatea de permeat care
strbate membrana de ultrafiltrareA
# celulele au posibilitatea biologic de a se multiplica pn la concentraii relativ mari %n
cazul dro*diilor 7;;g substan uscat8l biomas(. )ceste concentraii permit ndeplinirea
condiiei de Nbarier biologicO la contaminri e&terne.
# permeatul rezultat conine enzime e&tracelulare! nu conine celule i poate fi diri*at direct
ctre pasul urmtor! i anume acela de purificare sau concentrare.
.ezavanta*ele acestui procedeu sunt urmtoarele'
# membranele folosite la unitatea de ultrafiltrare trebuie s fie rezistente la tratamente de
sterilizare cu aburi sub presiune i la tratamente cu dezinfectani chimici.
# costurile energetice ale unei astfel de instalaii sunt destul de ridicate.
# membrana de ultrafiltrare se poate colmata i atunci funcionarea bioreactorului este
ntrerupt.
# chiar la densiti mari de celule la nivelul membranei se poate produce o liz celular!
fenomen care impune necesitatea unei pur*ri a bioreactorului i implicit scade vrsta medie a
celulelor care rmn n sistem.
$&tracia se difereniaz n funcie de procedeu. ,n principiu dup terminarea
fermentaiei se separ partea solid! insolubil %celule microbine i precipitate( de partea
lichid care conine enzimele e&tracelulare. Depararea se poate realiza prin centrifugare!
filtrare sau ultrafiltrare! iar soluia steril obinut se supune apoi unui procedeu de
concentrare. .ac enzimele obinute se vor comercializa n forma unor preparate lichide
atunci concentratul se va stabiliza fie prin adaos de polioli %sorbitol sau glicerol(! fie prin
adaos de sruri %-aCl sau MgD2
C
(. .e asemenea n scopul stabilizrii biologice se opteaz i
pentru adaosuri de bacteriostatici de origine alimentar sau folosii i n alimentaie cum ar fi
benzoatul! sorbatul sau ascorbatul. ,n cazul n care enzimele se vor comercializa n forma
unor preparate enzimatice pulbere atunci concentratele se suplimenteaz cu un suport de
natura amidonului sau de&trinelor! se supun din nou unui tratament de filtrare sterilizant!
dup care se usuc prin atomizare.
Preparate enzimatice i culturi starter
?
Curs nr :
E+tracia enzimelor intracellare
Pentru a obine i enzime intracelulare biomasa din fermentator separat de faza lichid
este supus lizei. 5iza peretelui celular poate fi realizat fie sub aciunea enzimelor proprii
microorganismelor! fie sub aciunea enzimelor e&ogene adugate n fermentator co scopul
precis de a elibera enzime intracelulare de peretele celular! sau de structurile cu rol de sintez.
,n cazul n care enzima este periplasmic este suficient un oc osmotic pentru a elibera
citoplasma sau se poate recurge la tehnica unei lize mecanice ceea ce presupune ca biomasa
s suporte iniial o presiune foarte mare situat ntre I;;# 1;;; barri! presiune urmat apoi de
o detent brusc.
Modaliti de comercializare a preparatelor enzimatice'
Preparatele enzimatice se comercializeaz de regul sub form de pulbere. )ceste
pulberi au ca baz un suport care poate fi amidon! maltode&trine! zahr sau sare. 5a aceste
preparate se controleaz granulometria i! respectiv umiditatea. .in punct de vedere al
umiditii pulberile trebuie s aib o umiditate de ma&I;M. Duportul folosit nu trebuie s fie
hidroscopic! pentru a se evita formarea de cocoloae la momentul ntrebuinrii.
,n preparatele enzimatice pulbere i n preparatele enzimatice lichide coninutul de
enzim este raportat la suport i! de aceea cantitatea de preparat comercial este sesizabil mai
mare dect de enzim activ.
Preparatele comerciale microgranulate se obin din enzime e&trase prin ultrafiltrare i!
n aceast situaie se folosesc suporturi! cantitatea de suport fiind calculat n aa fel nct s
se a*ung la o valoare impus care poart denumirea de titru enzimatic. )mestecul respectiv
este pulverizat mpreun cu un agent de legtur numit liant! care reprezint cam ;!1#;!:M
din masa suportului. Picturile pulverizate i fi&ate pe suport sunt uscate apoi ntr#un tunel de
aer cu o temperatur situat ntre ?;#@;
o
C! valoare stabilit n funcie de termosensibilitatea
enzimelor.
Preparatele comerciale lichide sunt formulate n general cu polioli %sorbitol! glicerol(
care se folosesc cam n proporie de 1;#:;M fa de preparatul lichidP. 3ot la preparatele
comerciale lichide se recomand folosirea unui agent cu efect bacteriostatic! n principiu se
folosete benzoatul de -a %C
?
0
:
2
1
-a( n proporie de ;!1#;!1M.
Preparate enzimatice i culture starter
Q
Curs nr. I
PR'CESE )ERMENTATI,E
Procesele fermentative reprezint secvenele cele mai importante n cadrul
biotehnologiilor. Fie c se dorete obinerea cantitii de biomas n scopul extragerii
de la nivelul acesteia a enzimelor extra i intracelulare, fie c se dorete obinerea
biomasei n scopul purificrii, conservrii i folosirii sub form de culturi starter,
controlarea procesului fermentativ prezint un aspect important.
Pentru derularea n condiii optime a procesului fermentativ parametrii de
fermentare trebuie n mod continuu monitorizai, n mod continuu ajustate la valori
optime conform principiului general schiat n urmtoarea figur
!ispozitivele utilizate regleaz pe fiecare etap a procesului parametrii ctre
valori optime i sunt foarte sensibile la variaii datorit caracteristicilor de fidelitate,
rapiditate n emiterea rspunsului, fiabilitate, exactitate i precizie. "n sistemele
fermentative moderne se evalueaz urmtorii parametri
#$scozitatea mediului % se impune datorit faptului c pe parcursul
fermentaiei se modific caracteristicile reologice ale mediului &de curgere'.
(odificarea v$scozitii mediului se poate datora fie consumului unui nutrient
&glicerol', fie acumulrii de produi de fermentaie cum ar fi poliglucidele, dextranul
sau xantanul. ) alt cauz care ar putea determina v$scozitatea mediului ar putea fi
creterea numrului de celule % creterea biomasei la nivelul mediului.
*valuarea caloric de la nivelul mediului . (ajoritatea reaciilor metabolice care
presupun dezvoltarea biomasei sunt reacii exergonice, cldura degajat din proces
fiind direct proporional cu numrul de celule vii. +ldura dezvoltat poate fi
msurat n bioreactoare izolate termic prin mai multe tehnici cum ar fi calorimetria
dinamic, calorimetria n flux, calorimetria continu. +ldura acumulat n proces
reprezint o sum de clduri dezvoltate sau pierdute
m a ag f acum
Q Q Q Q Q + =
, Kj/dm
3
Q
f
= cldura rezultat prin fermentaie
Q
ag
= cldura generat prin agitare
Q
a
= cldura pierdut prin aerare
Q
m
= cldura pierdut n mediu
*valuarea cantitii de +)
,
generate. +ea mai recomandat tehnic &)-ens' de
trasare a cineticii de dezvoltare celular este considerat a fi cea care se bazeaz pe
determinarea cantitii de +)
,
dezvoltat prin fermentaie. .na dintre tehnicile cele
mai cunoscute se bazeaz pe msurarea conductivitii ntr/un mediu cu geloz n
care este captat +)
,
. Principiul metodei se bazeaz pe reducerea conductivitii
mediului prin nlocuirea ionilor )0
/
&hidroxil' n mod progresiv cu ioni +)
1
,/
&carbonat'.
Geglare
bioreactor
Captare semnal %senzori(
)cionare
Comparare cu
valoare optim
@
*valuarea consumului de substrat i formarea de produi de fermentaie .
+reterea i multiplicarea celulelor microbiene ntr/un mediu adecvat presupune n
mod firesc consumul de substrat i acumularea de produi rezultai din metabolism.
!ac procesul fermentativ are ca obiectiv formarea de biomas atunci substratul
consumat se va regsi n celulele nou formate, iar substana uscat solubil din
mediu se va regsi n substana uscat a biomasei.
Parametrii evaluai sunt clasificai n urmtoarele categorii
/ parametri fizici &temperatur, viteza de agitare, putere de agitare, debit de gaz,
volum de mediu de cultur, debit de substane suplimantare, viscozitate, capacitate
de spumare'2
/ parametri chimci &p0, potenial redox, oxigen dizolvat, +)
,
dizolvat, coninutul
de compui volatili, determinri al componentelor chimice din mediu sau ale
produilor de fermentaie'2
/ parametri microbiologici.
Preparate enzimatice i culturi starter
Curs nr . ?
Parametri micro"iolo%ici- Te$nici de e!alare
a cre.terii microor%anismelor.
"n timp ce la mucegaiurile inferioare, la care prin cretere are loc diviziunea
nucleelor i nu a celulelor genomice, creterea se apreciaz prin determinare masic
a biomasei formate, la alte microorganisme, la care concomitent cu diviziunea
celular are loc i diviziunea nuclear, creterea se apreciaz fie prin determinarea
global a biomasei formate, fie prin determinarea numrului de celule. !e obicei
pentru obinerea unor rezultate detaliate asupra strii celulelor care formeaz
populaia se recomand folosirea n paralel a mai multor metode i compararea
rezultatelor obinute.
3chema cuprinz$nd metodele directe i indirecte de evaluare a creterii
microorganismelor
1;
(etode indirecte de evaluare a populaiei microbiene
4. !eterminarea concentraiei de celule
,. 5umrarea electronic a celulelor
1. (etode culturale
4. Determinarea concentraiei de celule:
*xamenul direct presupune execuia de preparate umede sau de preparate fixate i
colorate. Pentru numrare se utilizeaz lame calibrate &citometrul 6homa' sau lame
normale din sticl &se aplic tehnica de numrare 7reed n special pentru bacterii'. "n
funcie de numrul mediu de celule i n funcie de gradul de diluie al probei,
rezultatul se exprim n numr de celule8ml. "n prezent sau dezvoltat tehnici noi de
analiz, derivate cu metodele clasice, tehnici care n paralel cu evaluarea numrului
de celule permit i evaluarea strii fiziologice aa celulelor
/ microscopia n fluorescen utilizeaz colorani specifici pentru diferenierea
celulelor vii de cele moarte2
/ microscopia n imunofluorescen permite detectarea unor categorii particulare de
microorganisme cu ajutorul anticorpilor specifici.
(icroscopia permite caracterizarea celulelor i evaluarea cantitativ,
evideniindu/se prin simplitate i prin rapiditate.
Pentru celulele care au tendina de a forma agregate se recomand dispersarea
lor ntr/o soluie care conine agent dispersant, iar pentru celulele care prezint
mobilitate se recomand imobilizarea lor ntr/o soluie de formaldehid ,9.
,. Numrarea electronic a celulelor
5umrarea electronic a celulelor se adopt mai ales pentru suspensii microbiene
lichide i se recomand folosirea aparatului de tip +oulter care are ca principiu de
funcionare
$stimarea
numrului
de celule
.eterminarea
volumetric a
biomasei
$stimarea
global a
biomasei
# "iomas s.u.
# Msurare
Celule Durse de C 2
1
Durse )li
i energie de - nutrieni
Produi C2
1
0
1
2 Cldur
# Metode microscopice
# Metode culturale
# Metode electronice
- Analize
chimice
- pH
Determinare constituieni
celulari (proteine
intracelulare, ATP, NADH
+
)
Analiz
conductometric
Analiz n !
"alorimetrie
(n #lu$)
Dinamic
%enzori selecti&i Analize chimice
%enzori selecti&i
Analize chimice
Deter' &(scozitate
11
Analize chimice
ndice de re#racie
)(scozitate
!e o parte i de alta a unui tub prevzut cu un orificiu calibrat sunt dispui doi
electrozi de platin imersai ntr/un electrolit. 7ornele electrozilor sunt conectate la
tensiune continu la partea superioar a tubului, cuplat la o pomp de vid ce
determin aspiraia, iar celulele din exteriorul tubului trec pe r$nd prin orificiu,
deplas$nd cu fiecare trecere un volum de electrolit egal cu volumul unei celule.
6recerile determin o cretere tranzitorie a rezistenei circuitului, ceea ce genereaz
un impuls electric cu o aplitudine proporional cu volumul celulei. !eoarece
impulsurile sunt de foarte scurt durat, aparatul permite determinarea unui numr
mare de celule ntr/un timp scurt. (ai mult este posibil i clasarea celulelor n
funcie de dimensiunile, respectiv, volumul lor. :ceast tehnic, dei sofisticat, se
aplic cu succes pentru analiza suspensiilor de drojdii, evalu$nd nu numai analiza
numrului lor, ci i v$rsta celulelor numrate corelat cu volumul.
+itometria n flux
:ceasta permite numrarea celulelor i evaluarea strii lor fiziologice prin
msurarea fluorescenei emise de celule marcate n prealabil cu un colorant specific.
Principiul de funcionare a citometrului n flux
!up colorare celulele sunt direcionate printr/un orificiu ngust, trec una c$te
una prin faa unei surse luminoase. Fluorescena emis de fiecare celul este captat
printr/un fotomultiplicator i analizat. ;ezultatele sunt nregistrate pe o histogram
care red numrul de evenimente n funcie de intensitatea fluorescenei emise.
:ceast histogram red n consecin un profil al unei populaii. Pragul de
sensibilitate al metodei aplicat cel mai adesea la populaii de drojdii este de 4<
,
celule
vid
)
electrozi
Prob pentru analize
rezultate
Celule microbiene
-umrare cu citometru
11
celule8ml iar rapiditatea metodei este cam de , minute. :ceast tehinc a fost cu
succes adoptat la numrarea celulelor de must de struguri.
17
Preparate i culturi starter
Curs nr Q
3. Metode culturale
"n prezent sunt cunoscute mai multe tehnici bazate pe cultivarea de
microorganisme i evaluarea de celule
/ metoda cultural =och
/ metoda titrului
/ metoda diluiei
:vantajele constau n stabilirea facil, uoar a numrului de celule vii.
!ezavantajele constau ntr/un volum mare de munc &destinat sterilizrii
sticlriei, a ustensilelor i a mediilor de cultur, timpul de incubare necesar
dezvoltrii microorganismelor fiind difereniat n funcie de natura lor'.
"n cazul metodei =och evaluarea numrului de celule se realizeaz indirect, n
funcie de numrul de colonii dezvoltate n c$te dou plci Petri &((:, 7+:',
inoculate n paralel.
(etoda =och poate fi combinat cu metoda diluiei, deoarece plcile se
inoculeaz deobicei dup minim 1 diluii succesive ale suspensiei de celule
&reconstitue proba de analizat'. ;ezultatul se exprim n numr de microorganisme8
mm, c$nd exist certitudinea dezvoltrii individuale a celulelor, i de cele mai multe
ori n ufc8 l, unde ufc> uniti formatoare de colonii.
(etoda titrului se bazeaz pe un calcul statistic a numrului cel mai probabil de
microorganisme.
(etodele culturale sunt n prezent mult simplificate prin utilizarea Petrifilm/
urilor care sunt discuri pe care este plasat mediul de cultur specific, deshidratat i
acoperit cu o folie permisiv la aer. ?a inocularea a 4 ml suspensie de celule, apa
coninut de suspensie rehidrateaz stratul de mediu, iar prin incubare creterea
microorganismelor este posibil.
Determinarea global a biomasei
!eterminarea global a biomasei permite estimarea celulelor dezvoltate n
mediu. +a variante tehnice se adopt determinarea global a biomasei substanei
uscate sau determinarea volumetric a biomasei.
Determinarea global a biomasei substanei uscat
7iomasa microbian recuperat de obicei prin centrifugare este splat
succesiv de ,/ 1 ori cu soluie 5a+l <,@9, n scopul ndeprtrii impuritilor i a
mediului de fermentare antrenat de celule, apoi uscat la temeperatura de 4<A
<
+
p$n la greutate constant.
:ceast tehnic nu se aplic dec$t n cazul mediilor n care singurele particule
n suspensie sunt microorganismele.
!ezavantajul acestei metode const n faptul c nu se poate face o difereniere
ntre celulele vi i cele autolizate la nivelul biomasei.
"n cazul mediilor lichide cu o densitate redus de celule se recurge la filtrare
prin membrane cu dimensiunea porilor mai mic dec$t a celulelor dezvoltate &<,,,/
1C
<,BA Cm', apoi se recurge la uscarea membranelor la 4<A
<
+ sau n cuptor de
microunde i aflarea prin diferen a biomasei depuse.
Determinarea volumetric a biomasei
!eterminarea volumetric a biomasei repreint estimarea volumului ocupat de
biomasa separat prin centrigugare n tuburi de centrigugare gradate.
Metode indirecte
(etodele indirecte de evaluare a populaiei microbiene se bazeaz pe
manerarea concentraiei unor componeni celulari i, consider$nd concentraia
acestora per celul aproximativ constant, stabilirea prin echivalen a concentraiei
biomasei.$
4. !eterminarea constituienilor celulari repreint tehinca de evaluare
cantitativ a unor componeni aflai n concentraie constant la nivelul celulei
componeni cum ar fi :6P, :!5, :;5, 5:!0.
"n unele situaii i coninutul unor categorii de proteine poate s ofere indicaii
valoroase.
*xemplificativ, principiul metodei de identifcarea a :6P/ului se bazeaz pe
emisia luminoas produs prin oxidarea luciferinei n prezena :6P/ului. :ceast
emisie se obine n c$teva secunde, conform ecuaiei de mai jos, i se determin
spectofotometric.
3e consider coninutul mediu de :6P n celulele microbiene ca fiind
aproximativ Ax4<
/D
gr :6P8 celul sau 4mg :6P8 g s.u. biomas.
!eterminarea concentraiei proteice intracelulare relev capacitatea celulelor
de a biosintetiza proteine.
!eoarece biosinteza de proteine este corelat cu creterea n biomas aceast
tehnic poate s aib acelai principiu cu metoda =hilda sau se poate baza pe
hidroliza proteinelor i dozarea aminoacizilor.
Preparate i culturi starter
Curs nr @
Culturi starter de micriorganisme
utilizate n bio!rocese
!ef +ulturile starter sunt acele culturi care se obin plec$nd de la o cultur
pur stoc, cu trecere prin culturi intermediare &pasaje', devenind apte ulterior de a fi
folosite pentru obinerea unor produse alimentare fermentate.
) prim clasificare cu caracter general se realizeaz n baza numrului de specii
coninute de cultura starter. "n acest sens culturile starter pot fi singulare &conin o
singur specie de microorganisme' sau mixte &conin dou sau mai multe specii de
microorganisme'.
3copul folosirii culturilor starter este acela de a dirija procese biologice prin
care se asigur produsului gradul de inocuitate dorit i n multe situaii se asigur i
conservabilitate.
luciferaz :6P E luciferin E )
,
oxiluciferin E :(P E , &P
i
' E lumin
1:
:lte roluri constau n asigurarea unor nsuiri senzoriale specifice i n unele
cazuri asigurarea unor nsuiri nutritive deosebite.
+ondiii pe care trebuie s le ndeplineasc culturile starter utilizate n
industria alimentar
4. Pentru a/i satisface calitatea tehnologic, culturile starter trebuie s conin
un anumit numr de celule viabile pe unitatea de mas sau unitatea de volum,
deoarece procesele biologice nu pot fi generate dec$t de celule active.
,. Pentru a satisface calitatea biologic culturile starter pot s conin un
numr minim, sau de dorit s nu conin, germeni aparin$nd unor specii strine de
cultur &cuturile starter trebuie s conin un numr redus de germeni'.
1. +ulturile starter nu trebuie s conin celule care s genereze substane
antibiotice utilizate n scop terapeutic.
B. +ulturile starter trebuie s posede activiti specifice n ceea ce privete
elaborarea compuilor dorii, sau s posede activiti specifice pe direcia asimilrii
unor componeni &culturi strater care elaboreaz ca activitate specific acid lactic sau
culturi care reduc coninutul de azot aminoacidic'.
A. +ulturile starter trebuie s fie nsoite de pachete informaionale. 6rebuie s
fie declarate cu nume tiinific ntreg, speciile noi trebuie nregistrate i respectiv
verificate de instituii specializate.
D. !epozitarea n vederea perpeturii i a obinerii n regim continuu a
culturilor trebuie s se realizeze n colecii cu nomenclator, respectiv n micoteci bine
gestionate.
F. "nainte de utilizare n producie culturile starter trebuie testate din punct de
vedere al inocuitii, n conformitate cu legislaia n vigoare, iar la intervale regulate
culturile se ofer spre testare instituiilor specializate n scopul depistrii unor
mutaii nedorite.
G. *ventualele specii, identificate ca av$nd potenial patogen sau toxicogen, vor
fi supuse unui control riguros realizat pe toate tulpinile folosite n industria
alimentar pe termen lung n ceea ce privete toxicitatea, carcinogenitatea i
mutagenitatea.
6oate aceste condiii impuse apar cu titlu de obligativitate absolut din
urmtoarele motive
/ celulele provenite din culturi starter se pot consuma odat cu produsul
alimentar2
/ coninutul intracelular rmas n stare nemodificat n urma diverselor
tratamente de natur fizic, chimic sau biologic, se regsete n stare parial
modificat n produs la fel i produii metabolismului celular &produse alimentare
fermentate i supuse unor operaii de cretere a conservabilitii/ pasteurizarea'2
/ multe produse alimentare sunt definite n proporie de @@9 de produi ai
metabolismului celular, chiar dac microorganismele generatoare sunt eliminate din
aceste produse, ntreaga lor compoziie chimic este dependent de activitatea pe
care celulele respective au desfurat/o n produs.
1I
Preparate i culturi starter
Curs nr 1;
Culturile starter "olosite n industria la!telui
!in toate industriile care se bazeaz pe activitatea microorganismelor, cea mai
mare beneficiar este industria laptelui. "n general culturile starter de bacterii lactice
sunt folosite deoarece elaboreaz o serie de metabolii, un beneficiu pentru produsele
finite obinute. 7acteriile lactice produc
/ acid lactic i n general acizi organici care manifest acinuea de cretere a
aciditii2
/ substane din categoria bacteriocine, care eliberate n mediul de cultur
acioneaz prin inhibarea bacteriilor de contaminare sensibile2
/ peroxizi organici cu rol de protecie a metabolismului benefic pentru produsul
finit.
7acteriile lactice exploatate n interesul generrii metaboliilor exemplificai i
a altor categorii responsabili de formarea gustului i a aromei aduc produselor i alte
beneficii
7acteriile lactice intr n competiie cu microorganismele de alterare i cu
eventuale microorganisme cu caracter patogen n ceea ce privete consumul de
substane nutritive i, datorit acidifierii mediului ca o consecin a acumulrii de
acid lactic n principal microorganismele de alterare i patogene sunt inhibate. +ele
mai importante microorganisme vizate n sensul inhibrii sunt staphilococii,
salmonelele, ?Hsteria monocitogenes, +lostridium botilinum. :lturi de aceste
microorganisme sunt inhibate i cele cu aciune proteolitic i respectiv cele cu
aciune decarbixilazic. Prin urmare n produsele finite obinute se vor forma
cantiti reduse de amine biogene. Pentru consumul uman, produsele lactate acide
reprezint un aport benefic, deoarece aciditatea lactic favorizeaz aciunea pepsinei
&enzim digestiv parte component a sucului gastric' care produce hidroliza
proteinelor, produce coagularea cazeinei din lapte/ degradat n continuare la r$ndul
ei de tripsin &enzim pancreatic'.
:ciditatea pe care produsele lactate acide o transfer mediului intestinal
blocheaz dezvoltarea microflorei patogene i favorizeaz aciunea bifidobacteriilor
manifestat prin creterea rezistenei sistemului imunitar.
#articulariti ale obinerii culturilor starter de
bacterii lactice destinate industriei la!telui
$a!tele, mediu de cultur "olosit n industria !roductoare de culturi starter.
?aptele nu este un mediu complet ideal care s asigure multiplicarea bacteriilor
lactice la randamente maxime. (otivele care stau la baza acestei afirmaii sunt
urmtoarele
?aptele crud nu are o compoziie optim de substane nutritive azotate, de
vitamine i de alte categorii de factori de cretere indispensabili bacteriilor lactice.
3usinem acest motiv cu urmtoarele precizri
exist specii care se comport diferit din punct de vedere al asimilrii glucozei
i lactozei. +a exemplu avem ?actobacillus bulgaricus i 3treptococcus thermophillus
specii care se folosesc pentru obinerea iaurtului lactoza doar dac aceasta a fost n
1?
prealabil hidrolizat n prezena I/ galactozidazei, adic n consecin pot s
foloseasc drept carbohidrat doar glucoza.
:zotul neproteic din lapte nu este suficient pentru bacteriile lactice. "n
consecin acestea pentru a/i furniza azotul aminoacidic suficient, trebuie s posede
i activitate proteolitic. :ctivitatea proteolitic constituie un criteriu de clasificare a
tulpinilor de bacterii lactice n tulpini aa/numite lente rapide. !iferenele dintre
aceste tulpini constau n absena i, respectiv, prezena unor plasmide care conin
gene responsabile de sinteza proteinazelor i a peptidazelor. 6ulpinile lente utilizeaz
peptidele hidrolizate de ele nsele, deoarece posed un echipament enzimatic cu
aciune proteolitic. 6ulpinile lente pierd totui aceast caracteristic dup divizare,
n cursul dezvoltrii, n timp ce tulpinile rapide pstreaz plasmidele respective dup
divizare.
3ursa de azot, respectiv, tipul de protein solicitat este dependent de specia
cultivat. !e exemplu ?actobacillus bulgaricus prefer ca surs de azot I/cazeina, pe
care o gsete n lapte, n schimb ?euconostocii prefer azotul din extractele de
drojdie folosite ca suplimente. "n general laptele conine doar A/ ,<9 din totalul de
aminiacizi i a peptidelor necesari dezvoltrii optime a ?euconostocilor i a
3treptococilor.
:daosul de substane stimulatoare &extract de drojdie, extract din pancreas,
sirop de porumb' are ca scop mbogirea laptelui cu aminoacizi, peptone, vitamine,
substane minerale sau suplimentarea laptelui cu enzime proteolitice necesare
degradrii proteinelor existente iniial n lapte. "n cazul bacteriilor lactice, este
necesar ca laptele s conin citrat de magneziu, respectiv citrat de mangan. (etalele
aduse de aceste sruri constituie oligoelemente necesare dezvoltrii n mod special a
leuconostocilor. "n ceea ce privete laptele folosit ca mediu de obinere a bacteriilor
propionice acestea trebuie s conin pe l$ng extract de drojdie i factori de cretere
cum ar fi biotin, acid pantotemic, tiamin.
1Q
%&'()C*) #)C%
4. !efiniia i clasificarea enzimelor
,. .niti de msur ale acvitii enzimatice
1. 3urse de obinere a preparatelor enzimatice. :vantajele obinerii i folosirii
preparatelor emzimatice microbiene.
B. 3chema tehnologic general de obinere a preparatelor enzimatice.
A. Particulariti ale procedeelor de obinere a preparatelor enzimatice
microbiene.
D.:specte biologice ale fermentaiei principale
F. Procedeul nealimenatat de desfurare a fermentaiei.
G. Procedeul alimentat de desfurare a fermentaiei.
@. Procedeul continuu de desfurare a fermentaiei.
4<. *xtracia enzimelor intracelulare
44. (odaliti de comercializare a preparatelor enzimatice.
4,. Parametrii evaluai n sistemele fermentative.
41. !eterminarea concentraiei de celule.
4B. 5umrarea electronic a celulelor.
4A. +itometria n flux.
4D. (etode culturale de evaluare a preparatelor microbiene.
4F. !eterminarea global a biomasei.
4G. !efiniie. +ondiii pe care trebuie s le ndeplineasc culturile starter
utilizate.
4@. :vantajele folosirii culturilor starter de bacterii lactice n industria
alimentar.
,<. ?aptele ca mediu de obinere a culturilor starter de bacterii lactice.
3tudii
)u fost ntreprinse de a lungul anilor e&perimente pentru a determina efectul culturilor vii de acid lactic n a
limita bolile de diaree. Dtudiile variaz de la culturile utilizate! dozele si grupul targhet %sntoi vs bolnavi(!
cauza diareei %viral sau bacterian(! formatul e&perimental.
Isolauri si colab.! %1@@1( a studiat ?1 de copii cu vrsta cuprins ntre C i C: de luni care sufereau de diaree
acut viral %mai mult un rotavirus(! cu o durat de mai puin de ? zile i un grup de Q copii de control fr
simptome gastrointestinale pt efectul lui 5actobacillus == de a diminua efectele diareei.
Dubiecii au fost mprii la ntmplare n 7 grupe pentru a primi tratamente alimentare diferite. =rupul I %1C
de subieci(! a primit lapte fermentat cu 5actobacillus 11: g cu 1;
1;#11
+EC de dou ori n fiecare zi. =rupul II
%17 de subieci( a primit 5actobacillus sub form de pudr uscat congelat cu 1;
1;#11
+EC de dou ori n
fiecare zi. =rupul III %1C de subieci(! au primit iaurt fermentat i pasteurizat 11: g n fiecare zi %placebo(.
Eiecare diet a fost administrat pe parcursul a : zile. 2biectivul principal a fost rehidratarea pacienilor!
prioritar terapiei nutriionale. 3oate produsele alimentare au fost obinute de 4alio .airies %Einlanda(. .urata
1@
efectiv de diaree a fost redus %@: M limita de baz( la grupurile care au primit 5actobacillus sub form de
pudr sau produs fermentat %1!C zile(! comparativ cu grupul care a primit doza placebo %1!C zile(.
)cest studiu a artat c durata de diaree poate fi redus utiliznd culturi de 5actobacillus == n diata normal
imediat dup rehidratare. )cest studiu a fost bine controlat iar concluziile par *ustificate.
D#au realizat studii care au artat efectul culturilor lactice asupra constipaiei. =raf %1@Q7( a studiat 1: de
pacieni aduli care sufereau de constipaie sever. Pacienilor li s#au administrat ori lapte fermentat obinuit
ori lapte acidofil fermentat pe parcursul a cte C sptmni fiecare. Pacienii au nregistrat un comportament
abdominal i intestinal %crampe! gaze! senzaia de scaun(. Pacienii au cronometrat de asemenea timpul de
edere la baie! permind calcularea efectiv a timpului trecut dintre scaune. -u a e&istat nicio diferen
statistic n rezultatele numerice. )cest studiu nu arat nicio diferen ntre laptele fermentat acidofil si cel
fermentat normal! cu privire la calmarea constipaiei. .in fericire! nu a fost obinut nicio informaie
standard! aa c nu poate fi fcut niciun comentariu asupra efectului laptelui fermentat n comparaie cu
laptele nefermentat asupra constipaiei.
Constipaia afecteaz ma*oritatea pacienilor n vrst spitalizai! care recurg la medicamentaie pentru
tratare. )lm i colab. %1@Q7( a studiat C7 de pacieni n vrst spitalizai %7I femei i I brbai! cu vrsta ntre
:;#@:( i efectul laptelui acidofil asupra constipaiei. 3oi pacienii au utilizat cteva tipuri de la&ative n mod
regulat pentru un timp ndelungat. Ma*oritatea au e&perimentat limitri de mobilitate moderate spre severe.
)ceti subieci au fost mprii n dou grupe. Perioada e&perimental pentru grupul I a fost de :I de zile iar
pentru grupul II! C1 de zile! cu perioade intermitente de e&erciiu fizic! de 7I i respectiv C; de zile. 5aptele
fermentat acidofil a fost administrat dup bunul plac la micul de*un n timpul perioadei e&perimentale.
Protocolul e&perimental a fost mi&t! aa c pacienii au servit dup controlul propriu. Gezultatele au artat c
consumul a 1;;#7;; ml lapte acidofil pe zi reduce nevoia de la&ative la pacienii constipai n vrst i
spitalizai. Preparatul din lapte acidofil a fost mai eficient dect un preparat de lapte btut. .in pcate! nu au
fost fcute controale pe lapte nefermentat i nu au fost realizate analize statistice a acestor date. 3otui!
rezultatele au artat c nevoia de la&ative a fost evident redus. 3otodat! arat un efect benefic marginal
asupra constipaiei! datorit consumului de lapte fermentat acidofil. %$ffect on consumption of lactic cultures
on human health! MarF $llen Danders! )dvances in food and nutrition research! vol 7? )cademic press!
1@@7(.
1;