STINGEREA FLUORESCENEI UNEI SOLUII DE FLUORESCEIN PRIN IONII DE

IOD

1. Principiul metodei
Fenomenul de emisie a luminii sub aciunea unei radiaii absorbite se numete
luminiscen. Dup durata emisiei de radiaii, luminiscena poate fi de doua feluri:
fosforescena care dureaz un timp mai ndelungat dup ndeprtarea sursei de iradiere;
fluorescena care dispare imediat dup ncetarea iradierii.
n urma interaciunii fotonilor cu electronii de valen ai moleculelor acetia trec de pe
orbitalii din starea fundamental pe orbitalii cu nivele de energie mai ridicate. O parte din
molecule nu rmn pentru o perioad foarte lung n aceast stare excitat i revin la starea
iniial printr-un proces de relaxare (de obicei datorit proceselor de coliziune cu solventul sau
nsoit de emisie de fotoni) (Figura 1). Acest proces de relaxare n care se emite lumina poart
numele de fluorescen. De remarcat este faptul c lungimea de und a luminii emise este mai
mare dect aceea a lungimii de und cu care s-a excitat proba. Deoarece att starea fundamental
ct i cea excitat sunt degenerate (au mai multe nivele de vibraie n aceste stri) n cazul
excitrii la o singur lungime de und se obine un spectru de emisie (Fig. 2).

Fig.1. Secvena de etape care conduce la

Fig.2. (a) Spectrele de absorbie i (b)

fluorescen

fluorescen
1

2. Noiuni teoretice
Fluorescena este provocat de radiaii de anumite lungimi de und, de obicei din
domeniul vizibil sau ultraviolet, capabile s excite molecula la nivelul electronilor. Dac se
iradiaz o substan cu o radiaie ce corespunde energiei de excitare la un nivel superior,
moleculele substanei vor absorbii aceste radiaii, iar dup un timp foarte scurt vor reveni la
nivelul normal, prin remiterea unei radiaii de fluorescen.
Cazul cel mai frecvent este cel al radiaiei Stokes (S), n care frecvena radiaiei emise
prin fluorescen este mai mic dect cea a radiaiei absorbite. Aceasta are loc datorit faptului c
molecula excitat pierde prin ciocniri intermoleculare o parte din energia sa, astfel c revenirea
are loc pe un nivel de vibraie superior strii fundamentale. n caz contrar se produc radiaii
antistokes (AS).
Exist i posibilitatea ca revenirea s se fac pe acelai nivel de vibraie pe care se afla
naintea excitrii (R); este cazul fluorescenei de rezona, ntlnit mai des n gaze la presiuni
joase unde probabilitatea ciocnirilor intermoleculare este redus.
Fluorescena substanelor poate fi caracterizat prin:

spectre de absorbie i de fluorescen;

durata strii excitate;

randament.
Aceste mrimi variaz cu temperatura, cu concentraia soluiei sau la adugarea de

substane strine (inhibitori sau luminofori). Randamentul de fluorescen, , reprezint raportul

dintre numrul de fotoni emii i cei absorbii de substan.
Stingerea fluorescenei
Stingerea fluorescenei prin mrirea concentraiei (autostingerea) se datoreaz fie unor
ciocniri bimoleculare ntre moleculele de stare fundamental i cele excitate, cu dezactivarea
acestora, fie unor asocieri moleculare. Un efect similar de micorare a randamentului de
fluorescen prin transfer de energie de la molecula excitat l au i unele substane strine,
numite i stingtori, iar eficiena stingerii depinde de concentraia acestor impuriti. Acest
fenomen este exprimat prin ecuaia liniar a lui Stern-Volmer:

unde: randamentul de fluorescen n absena stingtorului; c randamentul de fluorescen

n prezena stingtorului; c concentraia stingtorului; k constanta de vitez a reaciei de
stingere; timpul de via al speciei fluorescente.
n cazul n care stingtorul nu modific spectrul de emisie, randamentul de fluorescen
este

proportional

cu

intensitatea

fluorescenei

astfel

nct

ecuaia

devine:

Dac stingerea urmeaz un mecanism de transfer prin ciocnire, viteza unei asemenea
reacii va fi controlat difuziv, constanta de vitez k depinznd numai de temperatura i
vscozitatea solventului (n Poisen):

Cunoscnd constanta de vitez k, din panta dreptei (egal cu k) se poate calcula timpul
de via al speciei existente.
3. Scopul lucrrii
Se va determina timpul de via al speciei excitate din variaia fluorescenei unor soluii
de fluorescein sub influena ionilor de iod. Fluoresceina este una din cele mai studiate specii
fluorescente pentru caracterizarea sistemelor biologice (n special a proteinelor)
4. Modul de lucru
Se vor prepara o serie de soluii de fluorescein cu concentraii diferite de ioni de iod,
conform tabelului de mai jos, folosind iodura de potasiu 0,69 N i fluorescein 210-3 % n
soluie tampon cu pH = 9,2 (tampon Borax este necesar folosirea soluiei tampon pentru a
asigura acelai grad de disociere a substanei fluorescente n soluie, ntruct ionii i moleculele
nedisociate posed proprieti de fluorescen diferite).
Nr. Crt.
1
2
Normalitatea soluiei 0,345 0,29
de KI
mL sol. KI
5
4,2

3
0,24

4
0,17

5
0,12

6
0,055

7
0,014

8
0,007

9
0,0014

10
0

3,5

2,5

1,7

0,8

0,2

0,1

0,02

mL sol. Fluorescein

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

mL sol. tampon

4,5

5,3

7,8

8,7

9,3

9,4

9,48

9,5

nainte de nregistrarea spectrelor de fluorescen se va nregistra spectrul de absorbie al

soluiei de fluorescein 210-3 % pentru a determina lungimea de und de excitare.
5. Prelucrarea datelor experimentale
Se reprezint grafic raportul dintre intensitatea relativ a soluiei fr stingtor i cele ale
soluiilor cu stingtor (I/Ic) n funcie de concentraia ionilor de iod. Din panta dreptei se
calculeaz , lund pentru calculul lui k,

= 0,01 Poisen.

ntrebri:
1. Descriei pe scurt principul spectral de emisie prin fluorescen.
2. Ce este randamentul de fluorescen?
3. n ce condiii se produce stingerea unei substane fluorescente?
3. Cum se determin timpul de via al fluoresceinei n prezena stingtorului KI?
Descriei modul de lucru.