Sunteți pe pagina 1din 8

Genetica microorganismelor şi inginerie genetică microbiană

Note de curs şi tehnici de laborator

CAP.2. TEHNICI DE GENETICĂ BACTERIANĂ

Notă !
Toate protocoalele de izolare, purificare şi manipulare a materialului genetic din acest manual
sunt prezentate în varianta de tip minimetodă: se lucrează în tuburi tip Eppendorf (Eppi) cu
capacitate de 1.5 ml, iar centrifugările se fac în microcentrifugi, de regulă cu sistem de răcire
(+4oC).

Cap.2.1. Izolarea, purificarea şi evidentierea ADN genomic la bacterii


Indiferent de protocolul aplicat, tulpinile bacteriene se cultivă în mediu de cultură lichid Luria-Bertani
(sau în alt mediu adecvat pentru tulpina respectivă), la 37oC (sau la temperatura optimă pentru tulpina
respectivă) timp de 36h, până la atingerea fazei staţionare de creştere. La majoritatea speciilor
bacteriene este preferabil să se procedeze la o cultivare agitată, orbitală sau magnetică.

A. Izolarea şi purificarea ADN genomic printr-un protocol derivat din tehnica Johnson (1991).
Acest protocol a fost pus la punct în Laboratorul de Genetica microorganismelor şi Biotehnologie,
Universitatea din Bucuresti.

1. Obţinerea sedimentului celular. Din cultura bacteriană se pun 1.5 ml într-un tub tip Eppendorf şi
se centrifughează 10 min la 8000 rpm (celulele vor sedimenta); pentru obţinerea unei cantităţi
suficiente de ADN se recomandă ca sedimentul celular să aibă un volum echivalent cu 25-30 μl.
2. Distrugerea peretelui celular. Se aruncă supernatantul, iar celulele din sediment se resuspendă în
500 μl soluţia I (TEG + lizozim); resuspendarea celulelor se face cu ajutorul vârfului pipetei automate,
apoi tuburile se vortexează; celulele resuspendate în soluţia I se lasă 15 min la 20o - 30oC.
Este important ca soluţia I să aibă un pH de minimum 8.0, pentru că lizozimul nu are activitate la pH<8.
Lizozimul este un complex enzimatic extras din albuş de ou şi are rolul de a sparge peretele celular, atât la marea
majoritate a bacteriilor Gram-negative, cât şi la unele specii de Gram-pozitive. Există însă şi bacterii al căror
perete celular este insensibil la acţiunea lizozimului (de ex. bacteriile din genul Staphylococcus).
Lizozimul sparge doar peretele celular, nu şi membrana celulară, şi ca urmare, liza celulară nu este
completă. Glucoza din soluţia I are rol de stabilizator osmotic, astfel încât protoplaştii/sferoplaştii să nu se spargă
imediat.

3. Liza celulară totală. Se adaugă 25 μl soluţie SDS 20%, astfel încât concentraţia finală să fie 1%.
SDS (sodiumdodecilsulfat) este un detergent, având ca atare capacitatea de a liza membrana celulară.
Liza celulară completă se verifică astfel: până la adăugarea SDS, suspensia bacteriană are un aspect lăptos,
opac; după liza celulară, soluţia se clarifică şi este foarte vâscoasă.

4. Deproteinizare enzimatică. Lizatul celular se tratează 1h la 37oC cu pronază E în concentraţie


finală de 50 μg/ml (se adaugă 1.5 μl din soluţie stoc de pronază E ce are concentraţia de 20 mg/ml);
Pronaza E este o protează nespecifică ce digeră proteinele din lizatul celular.
5. Precipitarea proteinelor cu soluţie salină. Se adaugă 20 μl soluţie KCl 2.5 M (precipită proteine).
Precipitatul este sedimentat prin centrifugare 20 min la 12000 rpm 4oC (sedimentul = proteine
precipitate, resturi de perete celular, de membrane celulare), iar supernatantul se transferă în alt tub Eppi.
6. Deproteinizare cu solvenţi organici. Peste supernatant se adaugă un volum egal de amestec
cloroform:alcool izoamilic (24:1, v/v); cele 2 lichide (lizatul celular, ca soluţie apoasă, şi solventul
organic) se amestecă la temperatura camerei timp de 5-10 min, prin inversarea viguroasă a tubului.
Pentru separarea rapidă a celor 2 lichide, tuburile se centrifughează 7 min la 7000 rpm. Faza apoasă
(superioară) se transferă în alt Eppi cu o pipetă automată, fără a intra în interfaţă.
7. Precipitarea acizilor nucleici. Tubul Eppi se umple până la semnul de 1.5 ml cu alcool isopropilic
aflat la temperatura camerei (20oC), se inversează tubul de câteva ori şi se ţine 10 min la temperatura
camerei; precipitatul este sedimentat prin centrifugare 10-15 min la 15000 rpm. 4oC. Se aruncă
supernatantul prin inversarea tubului, iar ultimele picături se aspiră cu o pipetă automată (cu cât
deproteinizarea este mai înaltă, cu atât sedimentul ADN este mai incolor şi transparent). Sedimentul
se usucă 15 min pe baie de apă (sau termostat) la 37oC. Sedimentul ADN se resuspendă în 20-40 μl
tampon TE pH 8.0.

1
Cap.3-1 Tehnici de genetică bacteriană

8. Indepărtarea moleculelor de ARN din extract. La extractul ADN se adaugă soluţie stoc de RNază
A (soluţia stoc are concentraţia de 10 mg/ml) pentru a ajunge la o concentraţie finală de 100-200
μg/ml. Tuburile se ţin 1h pe baie de apă la 37oC.
Se repetă etapele 6 şi 7.
Facultativ : sedimentul ADN se spală cu etanol 70% rece (-20oC) sau cu amestec de etanol 70% - acetat de
amoniu 7.5 M rece (-20oC), ce se toarnă încet pe pereţii tubului pentru a nu disloca sedimentul; se inversează
o
tubul de câteva ori; se centrifughează 10-15 min la 15000 rpm 4 C şi se aruncă etanolul.

9. Dizolvarea sedimentului ADN: sedimentul ADN se usucă 20-30 min pe baie de apă (sau
termostat) la 37oC (tuburile Eppi se pun pe baia de apă cu capacele desfăcute, iar baia de apă se lasă
descoperită); sedimentul se resuspendă în 20-40 μl tampon TE pH 8.0 (funcţie de concentraţia
asteptată şi de necesităţi). Tuburile se ţin aproximativ 10 h la frigider 4oC (pentru dizolvarea completă
a ADN), apoi se stochează la –20oC.

Medii şi soluţii
• Mediul de cultură Luria-Bertani: bacto-triptonă 1%, extract drojdie 0.5%, NaCl 1% pH 7.5
• Soluţia I = TEG + lizozim = Tris 25 mM, EDTA 10 mM, glucoză 50 mM pH 8.2-8.7
lizozimul se adaugă în concentraţie variabilă, funcţie de structura peretelui bacterian al tulpinii analizate (în
general, pentru tulpinile de E.coli este suficientă concentraţia de 2-5 mg/ml)
lizozimul se adaugă numai înainte de folosire şi doar în volumul de TEG ce va fi utilizat în ziua respectivă
(este recomandabil să nu se stocheze ca soluţie nici măcar la congelator).
• SDS 20%, g/v, în a.d.
• KCl 2.5 M, în a.d.
• soluţie stoc de pronază E: 20 mg/ml în a.d. sterilă. Se prepară 100-200 μl soluţie într-un Eppi mic
(de capacitate 0.5 ml) steril, se porţionează în porţii de câte 10-20 μl în tuburi Eppi mici sterile
şi se stochează la –20oC. In funcţie de numărul de tulpini luate în lucru se scot din congelator
una sau mai multe porţii care, odată dezgheţate, se folosesc imediat. Prin recongelare,
enzimele îşi pierd activitatea.
• soluţie stoc de proteinază K: 20 mg/ml în a.d. sterilă. Se prepară, se porţionează similar şi se
stochează la fel ca soluţia de pronază E.
• soluţie stoc de RNază A: 10 mg/ml în a.d. sterilă.
De obicei, se prepară un volum mic (0.5-1 ml) de soluţie stoc de RNazăA, astfel: într-un Eppi de 1.5 ml steril se
pune 0.5-1 ml a.d.s. şi se adaugă o cantitate de RNazăA pentru a obtine o concentraţie de 10 mg/ml. Se agită
pentru dizolvare. La marea majoritate a preparatelor de RNazăA comercializate nu este necesară fierberea
soluţiei. După dizolvare, soluţia se porţionează (în porţii de 10-50 μl) în tuburi Eppi mici (de 0.5 ml). Porţiile se pun
în congelator (la –20oC). Când este necesar, se scoate din congelator o porţie, se decongelează rapid şi se
foloseşte. Deşi RNazaA este o enzimă extrem de stabilă, totuşi îşi pierde semnificativ din activitate după 3
congelări (ca atare, o poie se poate repune o singură dată înapoi în congelator).
• amestec cloroform:alcool isoamilic 24:1 v/v - se prepară extemporaneu
• isopropanol
• etanol 70% rece (-20oC)
• tampon TE: Tris 10 mM , EDTA 1 mM (pH 8)

Izolarea şi purificarea ADN genomic bacterian prin tehnica CTAB (Ausubel, 1994)
La tulpinile bacteriene cu conţinut bogat în polizaharide se recomandă folosirea “tehnicii CTAB” –
tehnică ce permite îndepărtarea în cea mai mare parte a acestor impurităţi din extractul final de ADN
cromosomal (CTAB = cetiltrimetilamonium bromide).
Ca şi în tehnica prezentată anterior, tulpinile bacteriene se cultivă în mediu de cultură lichid Luria-
Bertani (sau în alt mediu adecvat pentru tulpina respectivă), la 37oC (sau la temperatura optimă pentru
tulpina respectivă) timp de 36h, până la atingerea fazei staţionare de creştere.
1. Obtinerea sedimentului celular. Sedimentarea celulelor se face în aceleaşi condiţii ca şi în
tehnica Johnson.
Opţional: în cazul unor tulpini bacteriene cu conţinut în polizaharide extrem de ridicat, se pot efectua 1-2 spălări
ale sedimentului celular (cu resuspendarea totală a celulelor) cu câte 250 μl sarcosyl 0.5%; fiecare din spălări
este urmată de câte o centrifugare de 10 min la 10.000 rpm, cu aruncarea supernatantului;

2. Distrugerea peretelui celular. Sedimentul celular se resuspendă în 567 μl TEG + lizozim 10 – 30


mg/ml; probele se ţin 15 min la 37oC (pe baie de apă); (concentraţia de lizozim depinde de structura
peretelui celular al tulpinilor bacteriene luate în lucru);

3. Liza celulară totală. Se adaugă 30μl soluţie SDS 10% şi se inversează tuburile de câteva ori (în
această etapă se produce liza celulară şi, deci, suspensia opacă devine o soluţie translucidă şi vascoasă); în
cazul unor bacterii recalcitrante, această etapă poate fi prelungită 10 – 30 min la 37oC (pe baie de
apă);

2
Genetica microorganismelor şi inginerie genetică microbiană
Note de curs şi tehnici de laborator

4. Deproteinizare enzimatică. In fiecare tub se adaugă 5μl soluţie stoc de proteinază K (20 mg/ml);
incubare 1h la 37oC;
5. Precipitarea proteinelor cu soluţie salină. In fiecare tub se adaugă 100 μl soluţie NaCl 5M, se
amestecă puternic; se adaugă 80 μl soluţie CTAB/NaCl, se amestecă din nou şi se incubează 10 min
la 65oC (polizaharidele coprecipită cu proteinele).
6. Deproteinizare cu solvenţi organici. Se efectuează 3 etape succesive (6.a, 6.b şi 6.c):
6.a cu amestec cloroform : alcool izoamilic (CIA): se adaugă 650 μl amestec cloroform: alcool
izoamilic (24:1 v/v) şi se amestecă tuburile prin inversare viguroasă; se centrifughează 12 min la
12000 rpm; se preia faza superioară cu o pipetă automată (fără a intra în interfaţă) şi se transferă într-
un tub Eppi curat;
6.b cu fenol : se aduce cu fenol (redistilat) până la 1 ml şi se amestecă viguros; centrifugare 14
min. 10000 rpm; se preia faza superioară într-un Eppi curat;
6.a cu amestec cloroform : alcool izoamilic (CIA): se aduce cu amestec cloroform : alcool
izoamilic (24:1 v/v) până la 1 ml; amestecare viguroasa; recentrifugare în aceleaşi condiţii, apoi din
nou se preia faza superioară într-un Eppi curat;
7. Precipitarea acizilor nucleici. Se adaugă izopropanol rece (-20oC) până la volum total de 1 ml; se
amestecă prin inversarea tubului; opţional, se poate prelungi precipitarea acizilor nucleici prin
depunerea tubului 15 – 30 min la –20oC sau chiar la –70oC; precipitatul este sedimentat prin
centrifugare 10-15 min la 15000 rpm 4oC; se aruncă supernatantul, iar sedimentul se usucă 20-30 min
pe baie de apă (sau termostat) la 37oC. Sedimentul ADN se resuspendă în 20-40 μl tampon TE pH
8.0.
8. Indepartarea moleculelor de ARN din extract. Se efectuează ca şi în cazul tehnicii Johnson.

9. Dizolvarea sedimentului ADN. Se realizează similar cu etapa corespunzatoare din tehnica


Johnson.

Soluţii
1. tampon TEG (vezi protocolul anterior) în care se adaugă extemporaneu şi numai în volumul care se
foloseşte în ziua respectivă, lizozim în concentraţie finală de 10 – 30 mg/ml;
2. sarcosyl 0.5% g/v în a.d
3. soluţie NaCl 5M (se poate prepară astfel: 2,922g NaCl la volum total de 10 ml cu a.d.)
4. soluţie CTAB 10%, NaCl 0.7M; un volum de 10 ml se prepară astfel: 0,41g NaCl dizolvat în 8ml
a.d.; 1g CTAB adăugat încet; amestecare cu încălzire la 65oC; se aduce la 10 ml cu a.d.
5. soluţie stoc de proteinază K 20 mg/ml
6. amestec cloroform:alcool izoamilic (24:1 v/v)
7. fenol redistilat
8. izopropanol rece (-20oC)
9. soluţie stoc de RNazăA 10 mg/ml
10. etanol 70% rece (-20oC)
11. tampon TE pH 8.0

Izolarea şi purificarea ADN genomic bacterian prin tehnica GCN


Aceasta tehnică este recomandata în mod special pentru tulpinile bacteriene cunoscute a avea un
conţinut mai bogat în proteine (GCN = Guanidine thiocianat, substanţă cu capacitatea de a precipita
marea majoritate a proteinelor celulare).
Ca şi în cazul protocoalelor anterioare, tulpina bacteriană se cultivă în mediu lichid, cu agitare, la
temperatura optimă. După atingerea fazei stationare, se efectuează urmatoarele etape:
1. Obţinerea sedimentului celular. Sedimentarea celulelor se face în aceleaşi condiţii ca şi în
tehnica Johnson; supernatantul se aspiră cu o pipetă automată.
2. Distrugerea peretelui celular. Sedimentul celular se resuspendă în 150 μl sol TEG + lizozim 10 –
30 mg/ml; resuspendarea celulelor se face cu ajutorul vârfului pipetei automate, apoi tuburile se
vortexează; tuburile Eppi se pun 15 – 30 min la 37oC (pe baie de apă).
3. Liza celulară totală şi degradarea proteinelor. Se adaugă 300 μl soluţie GCN 5M; se amestecă
prin inversarea tubului; se ţine tubul 5 min la temperatura camerei şi apoi 15 min la –20oC;

3
Cap.3-1 Tehnici de genetică bacteriană

4. Precipitarea proteinelor cu soluţie salină. Se adaugă 225 μl soluţie acetat de amoniu 7.5M rece
(-20oC), se amestecă încet prin inversarea tubului (apare un precipitat alburiu); tuburile se ţin apoi 10
min la –20oC;
6. Deproteinizare cu solvenţi organici. Peste supernatant se adaugă amestec cloroform : alcool
izoamilic (24:1, v/v) până la volum total de 1.5 ml; cele 2 lichide se amestecă la temperatura camerei
timp de 5-10 min prin inversarea viguroasa a tubului.
Pentru separarea rapidă a celor 2 lichide tuburile se centrifughează 12-15 min la 12000 rpm 4oC. Faza
apoasa (superioară) se transferă în alt Eppi cu o pipetă automată, fără a intra în interfaţă. Se
readaugă amestec cloroform:alcool izoamilic (24:1 v/v); se repeta operatiunile de amestecare şi
centrifugare; din nou faza superioară se transferă într-un Eppi curat.
7. Precipitarea acizilor nucleici. Se adaugă izopropanol rece (-20oC) până la volum total de 1.5 ml;
se inversează tuburile timp de 1 min şi se ţin la temperatura camerei timp de 10 min.
Acizii nucleici precipitati sunt sedimentaţi prin centrifugare 15 min la 15.000 rpm 4oC; se aruncă
supernatantul, fie cu o pipetă automată, fie prin inversarea tubului;
Facultativ : sedimentul ADN se spală cu etanol 70% rece (-20oC) sau cu amestec de etanol 70% - acetat de
o
amoniu 7.5 M rece (-20 C), ce se toarnă încet pe pereţii tubului pentru a nu disloca sedimentul; se inversează
tubul de câteva ori; se centrifughează 10-15 min la 15000 rpm 4oC şi se aruncă etanolul.

9. Dizolvarea sedimentului ADN. Sedimentul ADN se usucă 20-30 min pe baie de apă (sau
termostat) la 37oC (tuburile Eppi se pun pe baia de apă cu capacele desfăcute, iar baia de apă se lasă
descoperită); sedimentul se resuspendă în 20-40 μl tampon TE pH 8.0 (funcţie de concentraţia
aşteptată şi de necesităţi). Tuburile se ţin aproximativ 10 h la frigider 4oC (pentru dizolvarea completă
a ADN), apoi se stochează la –20oC.

Recomandari generale pentru izolarea şi purificarea ADN genomic la bacterii


1. Alegerea protocolului de lucru funcţie de particularităţile tulpinii bacteriene analizate
Protocolul de lucru trebuie ales funcţie de informaţiile pe care le avem în prealabil despre tulpina
respectivă. Astfel, pentru tulpinile cu conţinut ridicate de polizaharide se preferă tehnica CTAB, pentru
cele cu conţinut ridicat de proteine – tehnica GCN, iar pentru tulpinile “obişnuite” este suficient un
protocol de tip Johnson.
2. Construirea propriei variante tehnice, adaptata pentru tulpina analizata
In afară de aceste 3 protocoale de bază, pot fi construite diverse variante tehnice combinate astfel
încât să fie optime pentru o anumită tulpină bacteriană.
3. Spargerea celulelor bacteriene
Spargerea celulelor bacteriene presupune 2 etape: distrugerea peretelui celular (cu obţinere de
protoplaşti/sferoplaşti) şi spargerea membranei plasmatice (ce conduce la liza celulară totală).
Distrugerea peretelui celular este realizată experimental de cele mai multe ori cu ajutorul unor enzime.
La marea majoritate a bacteriilor este suficientă folosirea lizozimului. La bacteriile Gram-negative se
folosesc concentraţii mai mici de lizozim (între 5-15 mg/ml, la tulpini de la laborator de E.coli fiind
suficient 1-1.5 mg/ml), în timp ce bacteriile Gram-pozitive necesită concentraţii mai mari de lizozim
(15-30 mg/ml). Pe de altă parte, există şi bacterii cu o asemenea structură a peretelui celular, încât
lizozimul este ineficient şi sunt necesare alte tipuri de enzime (de ex. distrugerea peretelui celular la
tulpinile de Staphylococcus este realizată cu lizostafin – complex enzimatic produs tot de anumite
tulpini de stafilococ)
4. Deproteinizarea cu solvenţi organici
Pentru o deproteinizare suficientă a extractelor de ADN de multe ori sunt necesare etape de tratare cu
solvenţi organici – fenol şi/sau cloroform. Cel mai bun deproteinizant este fenolul, redistilat şi
tamponat cu Tris pH 5.6, 7.8 sau 10. Schema completă de deproteinizare cu solvenţi organici
cuprinde urmatoarele etape în care lizatul celular este tratat (prin amestecare) cu volum egal de:
1. fenol
2. fenol:cloroform:alcool izoamilic (25:24:1 sau 16:33:1 v/v); nu este necesară prepararea
volumului total de amestec de 50 ml, ci prin calculare poate fi preparat un volum mai mic
3. cloroform:alcool izoamilic (24:1 v/v)
După fiecare din cele 3 etape este necesară o centrifugare pentru separarea mai rapidă a celor doua
faze. Apoi faza superioară (apoasă = lizatul celular) este transferată în alt Eppi şi peste ea se adaugă
amestecul urmator.
Nu pentru orice tulpină şi nu în orice situatie este necesară parcurgerea tuturor celor trei etape de
deproteinizare cu solvenţi organici (funcţie de manipulările ulterioare la care va fi supus ADN extras).
Astfel, în cazul în care ADN-ul va fi supus unor digestii cu endonucleaze de restricţie, este
recomandabil să se efectueze o deproteinizare cât mai înaltă.

4
Genetica microorganismelor şi inginerie genetică microbiană
Note de curs şi tehnici de laborator

5. Adaptarea oricărui protocol funcţie de necesităţi, respectiv renunţarea la diverse etape de


purificare.
6. Precipitarea acizilor nucleici.
7. Prepararea şi stocarea soluţiilor folosite.
8. Stocarea extractelor de ADN.
In cazul în care în etapa anterioară se foloseşte o concentraţie finală de SDS mai mare de 1%, atunci se
recomandă folosirea proteinazei K (în loc de pronază E) în concentraţie finală de 100-300 μg/ml

Cap.2.2. Determinarea spectrofotometrică a purităţii şi concentraţiei ADN cromozomal izolat


Inainte de a folosi ADN-ul extras şi purificat, în diverse manipulări moleculare, este necesar să
se verifice puritatea şi integritatea lui.
υ Verificarea purităţii ADN se realizează de regulă spectrofotometric, ţinând cont de
următoarele considerente :
a) moleculele ADN (atât formele dublu-, cât şi cele moncatenare) prezintă absorbanţa maximă
la lungimi de undă ce variază între 257 şi 260 nm; cel mai frecvent, ADN de origine bacteriană
prezintă peak-ul specific la λ = 258 nm;
b) absorbanţa maximă pentru proteinele rămase eventual în extract este la λ=280 nm ; rămase
există şi unele proteine care absorb radiaţiile luminoase cu λ=260 nm, dar contribuţia lor la absorbanţa
totală a unui extract ADN la λ=260 nm este echivalentă cu cea a absorbanţei la λ=300 nm
c) unele polizaharide absorb radiaţiile luminoase cu λ = 230 nm
d) absorbanţa la 220 nm este dată de oligonucleotide ce reprezintă de obicei molecule de ADN
fragmentat în mod artificial în timpul tehnicilor de extracţie şi purificare
In funcţie de valorile A260 şi A280 se poate stabili gradul de contaminare proteică, astfel :
- raportul A260 / A280 optim este de 1.8-2.0
- dacă acest raport este mai mic de 1.7, atunci contaminarea proteică a extractului ADN este
semnificativă
- raportul poate fi îmbunătatăţit printr-un nou tratament cu amestec cloroform:alcool izoamilic,
urmat de precipitare cu etanol 100% rece (-20oC); pentru a creşte procentul de ADN precipitat, se
recomandă adăugarea unei soluţii NaCl pâna la concentraţia finală 0.1 M înainte de a adauga etanol.
Gradul de contaminare cu ARN a extractului este indicat de valori mai mari de 2.0 ale raportului
A260 / A280. In această situatie se recomandă un tratatment cu RNazaA aplicat extractului de ADN,
urmat de deproteinizare şi reprecipitarea moleculelor de acizi nucleici.
Gradul de contaminare cu polizaharide se determina în funcţie de valoarea raportului A260 /A230 ,
care trebuie să fie mai mare de 2. Daca obtinem valori mai mici de 2, acest lucru este o dovada a
prezentei polizaharidelor în extractul ADN. Polizaharidele pot fi indepartate prin precipitare cu etanol,
precedata de tratamentul cu soluţie NaCl în concentraţie finală de 0.1 M.
Se constată deci, că pentru a aprecia gradul de puritate a unui extract ADN este necesară
citirea spectrofotometrică a valorilor absorbanţei
la mai multe lungimi de undă (este absolut
necesară folosirea unor cuve de cuarţ – cuve ce
permit trecerea radiaţiilor luminoase din spectrul
UV). In paralel, dacă performanţele tehnice ale
spectrofotometrului o permit, se recomandă şi
determinarea întregului spectru de absorbţie al
probei, în domeniul λ = 200 – 350 nm, pentru a
putea astfel evidenţia eventualii contaminanţi
din extract ce prezintă peak-uri la alte lungimi
de undă decat cele menţionate (Fig.2.1.).

Fig.2.1. Exemplu de DNA scan

Determinarea concentraţiei ADN


Cea mai simplă metodă de determinare a concentraţiei ADN dintr-un extract se bazează pe citirea
absorbanţei la λ = 260 nm. Astfel, se pot folosi următoarele formule:
A260 = 1 corespunde la 50 μg ADN d.c. / ml
A260 = 1 corespunde la 33 μg ADN m.c. / ml
A260 = 1 corespunde la 40 μg ARN m.c. / ml
A260 = 1 corespunde la 20 μg oligonucleotide / ml

5
Cap.3-1 Tehnici de genetică bacteriană

Având în vedere faptul că în marea majoritate a cazurilor valoarea concentraţiei ADN este
importantă pentru manipulările ulterioare ale acestuia, este absolut necesar ca înainte de
determinarea concentraţiei să se estimeze gradul de puritate al extractului, şi respectiv, determinarea
exactă a A260 (totodată, dacă spectrul de absorbţie evidenţiază peak la λ = 258 nm, atunci această
valoare trebuie folosită pentru determinarea concentraţiei, şi nu A260). Este de asemenea
recomandabil ca determinarea concentraţiei ADN pe baza A260 să fie corelată şi cu aspectul ADN în
gel electroforeză.
Atunci când întregul volum al probei este foarte mic astfel încât nu permite citire
spectrofotometrică nici măcar în cuve cu volum de 50-100 μl, estimarea concentraţiei ADN poate fi
realizată şi cu ajutorul electroforezei în gel de agaroză. In acest caz se incarca în gel un volum mic de
proba, iar alaturat se incarca mai multe godeuri cu concentraţii de ADN cunoscute (de exemplu, se pot
folosi dilutii ale unei probe de ADN standard, comercializat, cu concentraţie cunoscuta). Concentraţia
probei este apoi apreciata în comparatie cu intensitatea spoturilor fluorescente emise de soluţiile
cunoscute (se foloseşte coloratie cu bromura de etidium). Aceasta metodă permite detectarea unor
cantităţi extrem de mici de ADN (1-5 ng).
Alte conversii importante legate de concentraţia ADN sunt date de urmatoarele formule:
1 kb ADN d.c. (sare de sodiu) = 6.6 x 105 dal
1 kb ADN m.c. (sare de sodiu) = 3.3 x 105 dal
1 kb ARN m.c. (sare de sodiu) = 3.4 x 105 dal
Greutatea moleculara medie a unei nucleotide = 330 dal
1 μg de ADN de 1000 bp = 1.52 pmol (3.03 pmol de capete)
1 pmol de ADN de 1000 bp = 0.66 μg

Formule pentru conversiile molare ale ADN d.c :


pmol x N x 660pg/pmol x 1μg/106pg = μg
şi
μg x 106pg/1μg x pmol/660pg x 1/N = pmol

unde N = numarul de perechi de nucleotide


660 pmol/pg = greutatea moleculara medie a unei perechi de nucleotide
Pentru ADN m.c. se folosesc aceleaşi formule, singura diferenţă fiind înlocuirea valorii de 660 cu
valoarea de 330.

Verificarea electroforetica a integritatii ADN


Migrarea moleculelor de acizi nulceici în gel de agaroză în camp electric este o tehnică folosită
extrem de frecvent în biologia moleculara. Aceasta tehnică este aplicata în foarte multe variatii, funcţie
de tipul de molecule supuse electroforezei, precum şi funcţie de scopul electroforezei respective.
Astfel, electroforeza în gel de agaroză (EGA) constituie o metodă standard pentru separarea,
purificarea şi identificarea moleculelor de ADN, inclusiv din amestecuri ce nu pot fi separate adecvat
prin alte tehnici.
Pentru verificarea integritatii ADN-ului cromozomal, precum şi pentru estimarea gradului de
contaminare cu ARN, extractul este supus unei electroforeze în gel de agaroză în sistem submers, în
placă orizontală.
Principiul general al electroforezei acizilor nucleici este următorul :
La pH alcalin sau neutru, acizii nucleici au sarcină electrică globală negativă. Ca urmare, dacă sunt
plasate într-un câmp electric, moleculele de acizi nucleici migrează la anod (+).

Protocolul de lucru :
1. Tamponul de electroforeză – cele mai folosite tampoane în electroforeza acizilor nucleici sunt
TBE, TAE şi TPE (cel mai folosit în ultimii ani este TBE).
TBE 1X – Tris 0.089 M, acid boric 0.089 M, EDTA 0.002 M pH 8.0-8.5
TAE 1X – Tris 0.040 M, acid acetic 0.040M, EDTA 0.002 M pH ~ 8.5
TPE 1X – Tris 0.090M, acid fosforic 0.090M, EDTA 0.002 M pH ~ 8.0-8.5
Notă : de obicei, soluţiile tampon pentru electroforeza acizilor nucleici se prepară în forma de soluţii stoc de 5
ori mai concentrate (5X) fata de soluţia de lucru (1X).

2. Prepararea gelului de agaroză


Este preferabil să preparati numai volumul de agaroză necesar pentru un gel.
a. volumul de agaroză necesar se calculeaza funcţie de tavita în care va fi turnat, astfel încât gelul să
aiba o grosime de 3 – 4.5 mm; se cantareste agaroză (cel mai comod, într-un vas Erlenmeyer) şi
peste ea se adaugă volumul de tampon necesar pentru a obtine concentraţia de agaroză dorita;

6
Genetica microorganismelor şi inginerie genetică microbiană
Note de curs şi tehnici de laborator

(concentraţia de agaroză poate varia între 0.6-1%, funcţie de dimensiunea moleculelor de ADN ce
urmeaza a fi supuse electroforezei şi de marca şi tipul de agaroză folosit); în general, pentru gelul de
verificare a unor extracte de ADN cromozomal, se foloseşte o concentraţie de 0.7-0.9%
b. pentru dizolvarea completă a agarozei se incalzeste recipientul pe bain-marie (sau 1 min la cuptorul
cu microunde) pâna la fierbere; dacă în laborator nu există cuptor cu microunde, cea mai comoda
varianta este de a pune vasul Erlenmeyer (acoperit cu o placuta Petri) pe o sita cu azbest la un bec
Bunsen; nu trebuie să dea în foc, iar fierberea se continua la flacara mica până la dizolvarea completă
a agarozei; apoi se raceste la 45-50oC. Atentie: Fie că incalziti soluţia de agaroză pe flacara, fie la
cuprotul cu microunde, flaconul trebuie să aiba dop/capac, dar nu inchis fest.
Notă : funcţie de aplicatie (de scopul electroforezei) există comercializate diverse tipuri de agaroză. Pentru un
gel de verificare se poate folosi cel mai simplu şi mai ieftin tip de agaroză.

2. Turnarea gelului
In majoritatea cazurilor (inclusiv în gelurile de verificare a ADN cromozomal) se efectuează
electroforeză în placă orizontală în sistem submers. Asemenea aparate sunt formate dintr-un tanc de
electroforeză şi o tavita în care se yorna gelul de agaroză.
a. se inchide tavita aparatului de electroforeză cu banda adeziva sau, dacă există, cu suportii de
cauciuc;
b. se monteaza pieptenul astfel incât dintii acestuia să nu atinga tavita (să nu patrunda în toata
grosimea gelului); pieptenul se alege corelat cu volumul de proba ce urmeaza a fi incarcat în gel.
c. se toarnă gelul cald (45-50oC), în grosime de 3-5 mm; se lasă 20-45 min (funcţie de temperatura
ambianta) pentru racirea şi solidificarea gelului fără a se misca tavita sau pieptenul
d. se indeparteaza banda adeziva şi pieptenul fără a se rupe gelul

3. Pregatirea probelor
Pentru pregatirea probelor de ADN se procedeaza astfel:
a. se calculeaza volumul de proba ce urmeaza a fi incarcat în gel, corelat cu volumul godeurilor
lasate de dintii pieptenului; se calculeaza volumul soluţiei de BFE sau BFER astfel încât acesta să
reprezinte 1/4 - 1/6 din volumul probei; astfel, pentru geluri de verificare a unor extracte de ADN
cromozomal (obtinute prin minimetode), se recomandă incarcarea a 5μl (din volumul de 20-40 μl
al extractului), care se amestecă cu 2 μl BFE. Atentie: pentru verificarea unor asemenea extracte
de ADN cromozomal, se recomandă folosirea BFE, şi nu a BFER, astfel încât în gelul de
electroforeză să poata fi detectate şi eventualele molecule de ARN contaminante.
b. pentru fiecare proba de ADN se foloseşte un tub Eppi mic (de 0.5 ml) curat în care se pune intai
volumul de BFE sau BFER; apoi se pune volumul de proba, şi se amestecă circular cu vaful
pipetei automate, urmat de 1-2 aspirari; în caz că s-au format bule de aer, se bate usor tubul de
masa sau se centrifughează 20-30 sec.
c. Tubul cu restul de proba se pune inapoi în frigider/congelator
Pentru economie de timp, probele se pot pregati în timp ce se solidifica gelul.

4. Montarea electroforezei şi incarcarea probelor


a. tavita cu gelul solidificat se asaza în tancul de electroforeză
b. în tanc se toarnă tampon TBE 1X pH 8.3 (sau alt tampon de electroforeză), pâna la nivelul la care
lichidul acopera gelul sub forma unei pelicule de 1-2 mm grosime
c. în godeurile formate de dintii pieptenului în gel se toarnă probele pregatite conform pct. 3.a.

5. Pornirea electroforezei
a. se pune capacul aparatului de electroforeză
b. se aranjeaza firele de legatura cu un cap la electrozii aparatului de electroforeză şi cu celalalt la
bornele sursei de curent (electrodul dinspre godeuri se cupleaza la catod)
c. se porneste sursa de curent şi se fixeaza la inceput la 1.5 V/cm până la intrarea probelor din
godeuri în gel; apoi se poate mari voltajul la maximum 5V/cm şi se lasă aproximativ 2h
Notă : de obicei, se recomandă 2-2.5 V/cm şi un amperaj de până în 20 mA; la valori prea mari de amperaj sau
de voltaj benzile de ADN se distorsioneaza prezentand asa-numitul fenomen de “smiling”.

6. Colorarea gelului
a. la expirarea timpului de migrare se intrerupe alimentarea cu curent electric
b. se scoate tavita cu gelul şi se coloreaza (prin imersare într-un cristalizor) cu bromura de etidium
(EtBr) 0.5 - 1μg/ml timp de 20 min; apoi gelul se spală 30 min în apă distilata, tot în cristalizor.
O altă varianta de colorare consta în introducerea colorantului direct în tamponul TBE 1X
înainte de turnarea acestuia în tancul de electroforeză. Colorarea se va realiza deci, simultan cu
migrarea moleculelor de acizi nucleici. In această situatie, se recomandă folosirea unei concentraţii
mai mici de EtBr (0.3 - 0.5 μg/ml). In afara de economia de timp.

7
Cap.3-1 Tehnici de genetică bacteriană

Bromura de etidium este un agent intercalant (se intercaleaza între bazele azotate ale acizilor nucleici) de tip
fluorocrom, care este excitat de lumina UV (λ=250-310 nm) şi emite în vizibil (λ=520 nm), determinând colorarea
moleculelor de ADN în roz-violet.

7. Vizualizarea moleculelor de ADN din gel


a. moleculele de ADN se vizualizeaza prin asezarea gelului pe transiluminator UV (λ=302 nm)
b. se face o poza cu aparat de fotografiat obisnuit (şi cu un filtru rosu) sau cu un aparat polaroid
(Fig.2.2.)

Soluţii
1. Soluţie stoc TBE 5X pH 8.0-8.5 - 500 ml
Tris 27 g
Acid boric 13.75 g
EDTA.Na2 0.372 g
Mod de preparare: într-un balon cotat de 500 ml se pun 27 g Tris, se adaugă 2-300 ml a.d. şi se
amestecă până la dizolvare; după dizolvarea Tris se adaugă EDTA şi inca ~ 100 ml a.d. şi se
amestecă până la dizolvare; la urma se adaugă şi acidul boric şi inca a.d. şi se dizolva. Se verifica pH-
ul şi apoi se aduce la semn. Aceasta soluţie reprezintă stocul de TBE 5X, care este stabil 2-3
saptamani la temperatura camerei şi 2-3 luni la frigider (4-8oC).
Soluţia de lucru TBE 1X se prepară extemporaneu din soluţia stoc 5X, şi doar volumul necesar.
2. Soluţie TE pH 8.0 : Tris 10mM, EDTA 1mM se prepară de obicei 50-100 ml şi se poate
autoclava
3. Soluţie BFE
albastru de bromfenol 0.4 %
sucroza 55.0 %
Se prepară, de regula, folosind 1 ml TBE 1X, dizolvand intai albastrul de bromfenol şi apoi
sucroza.
4. Soluţie BFER
albastru de bromfenol 0.4 %
RNazaA 100 μg/ml
sucroza 55.0 %
Se prepară, de regula, folosind 1 ml TBE 1X, dizolvand componentele în ordinea mentionata
(albastrul de bromfenol, RNazaA, sucroza); RNazaA se adaugă din soluţie stoc de 10mg/ml.
sucroza sau glicerina dau vâscozitate amestecului; albastru de bromfenol este folosit ca marker de
migrare ∏ când spotul albastru a migrat pâna aproape de capatul gelului se opreste curentul electric
5. Soluţie stoc de RNază A 10mg/ml
6. Soluţie stoc de bromura de etidium 10 mg/ml
De obicei, se prepară 5-10 ml soluţie stoc, astfel: se cantareste cantitatea dorita de bromura de
etidium şi se dizolva în a.d. Soluţia se stochează la frigider (2-3 luni) în sticla bruna (pentru că
substanta se descompune la lumina).
Atentie ! : bromura de etidium este extrem de toxica şi are un foarte puternic efect mutagen; ca atare, este
obligatorie manipularea ei cu manusi de laborator.

1 2 3 4 5 6

Fig.2.2. Exemplu de electroforeză în gel de agaroză pentru ADN genomic


(Godeuri: 1- E. coliB CTAB; 2- E.coliB Wizard; 3- Sl3; 4- Sl4; 5- Sl5; 6- E.coli V517)