Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
1.2.1 Diferenierea
Celulele meristematice, divizndu-se continuu, dau natere la noi i noi celule care, treptat,
cresc i sufer o specializare morfofiziologic ce poart numele de difereniere.
n procesul de difereniere se pierd caracterele citologice i fiziologice de tip embrionar
specifice celulelor meristematice, evolundu-se spre caliti proprii specializrii funcionale a
diferitelor tipuri de esuturi sau organe n alctuirea crora celulele mature vor intra. n primele faze
de difereniere se remarc o modificare ultrastructural i funcional a celulelor, fenomen denumit
citodifereniere.
Pe msura diferenierii, volumul celulei crete, scade raportul nucleoplasmatic, citoplasma
devine pelicular i parietal, se extinde vacuomul care mpinge citoplasma i nucleul la periferia
celulei.
Plastidomul este constituit din cloroplaste, cromoplaste sau amiloplaste, n funcie de rolul
ndeplinit de celule.
Odat cu avansarea proceselor de difereniere peretele celular poate suferi modificri
secundare de genul depunerilor de celuloz, lignin, mineralizare, gelificare sau chiar lichefiere, care
conduc treptat la o ngreunare a comunicrii intercelulare, intervenind cu timpul un declin fiziologic
sau chiar moartea celulelor (de exemplu la sclerenchim).
Celulele odat difereniate nu se mai divid. Celulele care compun un esut sau organ nu posed
acelai ritm de cretere i se afl sub un permanent endocontrol fitohormonal.
Substanele elaborate de celule pot difuza nspre celulele nvecinate exercitnd un anumit rol
n dezvoltarea acestora fenomen denumit inducie, i care st la baza interrelaiilor dintre esuturi, ce
servesc la organizarea acestora n formaiuni funcionale, respectiv la organogenez.
Dup difereniere i generarea de noi celule se ajunge la situaia n care celulele neoformate
tind s se reorganizeze structural i funcional suferind o citodifereiere, histodifereniere, cu
organizarea de esuturi (histogenez), de organe (organogenez) i n final regenerarea unei noi plante.
Diferenierea celular in vitro nu este foarte variat, unele funcii sunt reduse sau simplificate n timp
ce altele sunt amplificate.
1.2.2 Dediferenierea celular
Dediferenierea const n transformarea progresiv a celulelor din starea de celul specializat
n celul meristematic, rectignd aptitudinea de a se divide.
Dediferenierea natural a celulelor poate fi observat n organele care se ramific sau n cazul
traumatizrii organelor i al generrii, la locul rnirii, de calus. Procesul de dedifereniere este
complex i se instaleaz n momentul n care celulele primesc un impuls inductiv, de obicei
fitohormonal, impuls ce declaneaz transformri la nivel molecular.
n cadrul unui esut nu toate celulele dedifereniaz, puine celule devin centrii generatori de
noi i noi celule suficiente pentru a asigura ndeplinirea fenomenelor de restituie. n caz de
traumatism organele din esuturile lezate beneficiaz de acumularea unor substane cu rol esenial n
inducerea i stimularea proceselor de dedifereniere.
Deci, fitohormonii, condiiile de cultur, natura esuturilor implicate, starea lor fiziologic i
vrsta plantelor donatoare constituie factori ce intervin n procesele de regenerare.
Aptitudinea celulelor de a se dediferenia este foarte inegal rspndit n corpul plantelor i
chiar i n cadrul subunitilor structurale, morfofuncionale, care alctuiesc un organism, existnd
diferene mari n ceea ce privete capacitatea de a se dediferenia, la celule aparinnd aceluiai organ
sau chiar esut.
Celulele explantelor inoculate pe medii aseptice, pentru a putea s-i reorganizeze un mod de
via, trebuie sa sufere un proces de conversie din celule definitivate structural i funcional n celule
meristematice, apte de multiplicare.
Aptitudinea celulelor explantelor inoculate in vitro de a se dediferenia este foarte inegal
rspndit la specii, organe i esuturi variate.
167
168
169
A.Rizogeneza in vitro
Un anumit fragment explantat se comport, n linii mari, ca un minibuta. El difer de un buta
normal, ntruct cel clasic deine bogate rezerve endogene, are muguri i eventual frunze. Mugurii i
frunzele pot i dup desprinderea fragmentului de planta mam s sintetizeze anumii compui
hormonali.
Explantul ns, din cauza dimensiunilor sale reduse i a detarii sale, nu mai beneficiaz de
susineri pe care s le primeasc de la muguri sau de la frunze i rmne n totalitate dependent de
mediul de cultur. n acest caz factorul genetic, mrimea explantului vrsta plantei mam, starea
fiziologic a celulelor pe care le deine, sunt tot atia factori care concur la evoluia ulterioar a
inoculului.
Uneori, ns, in vitro, se produce o pierdere a capacitii rizogene, mai ales ca urmare a
practicrii unor repicri (subculturi) succesive. Se pune problema pstrrii sau a redobndirii
capacitii rizogene. Factorii care condiioneaz meninerea acesteia i mai ales, cei care cauzeaz
pierderea aptitudinii rizogene sunt n mic msur cunoscui.
Lumina poate exercita un efect pozitiv asupra rizogenezei dar numai la o intensitate slab sau
n urma unei perioade scurte de aciune (600 luci mai puin de o or/zi). Temperatura optim pentru
rizogenez este aceea de 26 oC. Uneori, ns, se recomand practicarea unei alternane ntre o
temperatur sczut (5-15 oC) i ridicat, n prezena luminii, a auxinei i a unui mediu bogat n
glucide.
n cele mai multe cazuri, formarea rdcinilor este localizat polar. Rdcinile se formeaz la
polul radicular al explantului, n timp ce generarea mugurilor este localizat la polul foliar. Aportul de
auxin, n concentraie ridicat, poate perturba polaritatea. n concentraii optime auxina stimuleaz
rizogeneza.
B.Caulogeneza in vitro
Formarea de mugurai in vitro, denumit i caulogenez, respectiv formarea de centri
vegetativi, este esenial atunci cnd se urmrete, de exemplu, multiplicarea sau reconstituirea unei
noi plante ori a unui genotip, generat prin hibridare somatic. Inducerea caulogenezei, a formrii de
mugurai i tulpinie, la nivelul inoculilor cultivai in vitro, este stimulat de prezena n mediul de
cultur a citochininelor, adeseori, n condiiile asocierii acestora cu auxinele. De asemenea trebuie
menionat i faptul ca formarea de mugurai la nivelul calusului se afl sub controlul interaciunii
celor dou categorii de fitohormoni. Reuita formrii mugurailor presupune nu doar prezena celor
dou tipuri de fitohormoni, ci i a realizrii unui anumit raport al crui eficien este variabil n
funcie de specie, de proveniena i natura inoculului. Se poate spune deci, c nu este important doar
raportul fitohormonal, ci i natura i concentraia compuilor utilizai ca regulatori de cretere. Uneori,
se poate declana caulogeneza reducnd concentraia de auxin. Alteori, cel mai mare numr de
mugurai este atins atunci cnd se folosesc concentraii relativ ridicate de citochinin. Dar nu exist
reguli general valabile. Adeseori fiecare experien reprezint un caz aparte, iar reacia explantelor, la
balana hormonal din substrat, variaz mult, n dependen de tipul materialului vegetal.
La calus, n inducerea caulogenezei, se obin, uneori, rezultate pozitive prin cultivarea
succesiv a acestuia, ntr-o prim etap, pe un mediu fie cu o concentraie foarte ridicat de 2,4D, fie
n prezena unei auxine mai slabe ca eficien, dar administrat n concentraie mare, asociat eventual
cu o citochinin, n concentraie moderat. Acest calus subcultivat pe un mediu cu aport sczut n
auxin i cu un coninut ridicat n citochinin, ar putea conduce cu succes la declanarea procesului de
nmugurire.
Factorii externi (lumina, temperatura, calitile fizice ale mediului) sunt controversai n ceea
ce privete efectele lor asupra caulogenezei. Aciunea acestora depinde foarte mult de tipul inoculilor
i de etapele parcurse anterior.
Cu toate c numeroase specii necesit o anumit fotoperioad pentru inducie floral, n
general se apreciaz c formarea de mugurai este independent de fotoperioad.
170
Mecanismul habituaiei este nc necunoscut. Se tie doar c, exist anumii factori de mediu
care favorizeaz instalarea acestor fenomene. Dintre ei amintim: auxinele (mai ales 2,4D) i
temperaturile ridicate.
1.2.6 Vitrificarea sau sticlozitatea
Fenomenul de vitrificare sau sticlozitate este un proces de transparentizare a frunzelor i
tulpinilor i a fost semnalat la culturile de salat n ser (Gautheret, 1980). Se apreciaz c, n cazul
acestui fenomen, n anumite condiii (cum ar fi exces de umiditate), organele aeriene ale plantelor
devin translucide ca o consecin a infiltrrii apei n spaiile intercelulare, nlocuindu-se aerul din ele.
n condiii aseptice, plante vitroase pot s apar brusc. Ele sufer transformri
morfofiziologice, frunzele lor recurbndu-se, devenind translucide, sticloase, rugoase, uneori ondulate
i casante, prezentnd o cretere malformat, hipertrofiat. Aspectul general este degenerat.
Studiile amnunite asupra structurii frunzei au artat c frunza nu are celulele difereniate n
cele dou esuturi, palisadic i lacunar. Meristemele lstarilor vitrificai sunt mai mici dect la cei
normali. Celulele sunt mult hidratate i conin clorofil mai puin.
S-a constatat c prin adugarea crbunelui vegetal n mediul de cultur se elimin sau se reduce foarte
mult procesul de vitrificare. De asemenea ridicarea concentraiei de agar la 1-1,1% reduce vitrificarea
(Orlikowska, 1985). Concentraii mai mari de 0,8% de agar duc ns la scderea ratei de multiplicare
i de aceea este foarte dificil de mbinat cele dou aspecte.
CAPITOLUL II
2.1 FENOMENE FIZIOLOGICE CORELATE CU REALIZAREA UNEI
CULTURI IN VITRO
Tehnicile de cultur in vitro folosite n cercetare sau pentru producerea de plante, pornesc de la
aceeai premiz: posibilitatea de a controla ntr-un mod optim factorii de mediu (temperatur, lumin,
compoziia mediului de cultur, pH, umiditate) necesari fragmentului de plant inoculat n condiii
artificiale de mediu, n ncercarea de a analiza funciile sale fiziologice sau de a-l conduce ntr-o
anumit direcie, cum ar fi formarea de noi lstari (micropropagarea).
Tehnicile de cultur in vitro, pe lng aspectul tehnologic, ne permit rezolvarea unui numr de
probleme:
-meninerea unui explant viabil i activ din punct de vedere vegetativ;
-permiterea creterii normale a unui explant reprezentat de o structur organizat (meristem,
vrf de cretere sau mugure);
-inducerea proceselor de difereniere n cazul unor fragmente de calus pentru formarea de
organe sau embrioni somatici;
-inducerea proceselor de dedifereniere, n cazul unor explante formate din celule difereniate
(fragmente de tulpin, frunz, peiol, rdcin, etc.) rezultnd o nou organizare tisular;
-inducerea proceselor de diviziune celular, valabil tuturor cazurilor amintite mai sus.
Aceste probleme au fost parial rezolvate odat cu identificarea regulatorilor de cretere
endogeni de tipul auxinelor (primul grup de fitohormoni recunoscut), giberelinelor, citochininelor,
pentru a numi doar cele trei clase principale de regulatori de cretere. Aceste substane par a determina
orientarea dezvoltrii celulelor n cultura artificial, fapt pentru care li se acord prima atenie atunci
cnd se ncearc explicarea unor fenomene fiziologice.
2.1.1 Regulatorii de cretere
Existena hormonilor vegetali a fost bnuit nc de la nceputul secolului trecut. Numeroase
lucrri tiinifice privitoare la aceste subiect au evideniat prezena lor, dar nu le-au putut identifica
172
dect mult mai trziu. Primii fitohormoni descoperii au fcut parte din clasa auxinelor, n jurul anului
1934, giberelinele i citochininele fiind descoperite mai trziu, n anii 50. Aceste trei tipuri de
regulatori de cretere exercit o aciune stimulativ asupra metabolismului celular. Exist i substane
cu efecte inhibitoare asupra creterii i dezvoltrii celulelor vegetale cum ar fi acidul abscisic,
identificat n anul 1965 i substanele fenolice identificate civa ani mai trziu. De asemenea, etilena,
un compus gazos, a fost recunoscut ca regulator de cretere atunci cnd metodele de msurare a
acesteia au permis detectarea sa n organele plantelor. Etilena poate avea fie efect stimulator, fie efect
inhibitor asupra plantelor.
Aceste substane sunt endogene, ceea ce nseamn c sunt sintetizate de plante. Exist i
fitoregulatori de cretere artificiali cu formule chimice asemntoare celor naturali, prezentnd o
aciune fiziologic similar. Toate aceste substane, sintetice sau naturale, sunt numite regulatori de
cretere i au anumite caracteristice comune:
-acioneaz ntr-o concentraie foarte mic, n concentraie mare sunt toxice, de aceea unele
dintre ele sunt folosite ca erbicide;
-acioneaz numai n interaciune cu ali fitoregulatori, funcia lor fiind determinat de balana
hormonal stabilit ntre ei;
-intervin ntr-un numr de fenomene fiziologice ce implic mai multe moduri de aciune astfel
nct noiunea de hormon (cu un efect rizogenic sau caulogenic specific) a fost abandonat.
O diferen substanial ntre fitoregulatorii de cretere artificiali i cei naturali const n
faptul c cei endogeni pot fi controlai de mecanismele metabolice ale celulelor fiind eliminai
suficient de repede, pe cnd cei artificiali persist mult mai mult fiind deseori preferai aplicaiilor
practice.
2.1.1.1 Auxinele
Auxinele au fost descoperite n urma unor experimente asupra coleoptilului la Gramineae.
Numele de auxine provine din grecescul auxein a crete, determinnd elongarea celulelor (auxesis
cretere ce se refer n special la mrimea celulei dect la numrul de celule).
Este un compus ce are la baz nucleul indolic cu formula de baz C10H9O2N cunoscut sub
numele de acid - indolil acetic (Fig.1).
-stimuleaz diviziunea celulelor cu origine cambial (acest tip de aciune a determinat insuccesele
din primele ncercri de iniierea a culturilor in vitro); Acest efect este descris ca histogenic deoarece
conduce la formarea unui numr de celule asemntoare, numite calus;
-acioneaz asupra sintezei etilenei ntr-o anumit concentraie, etilena intervine n schimb n
reglarea nivelului de auxin cel puin la nivelul vaselor conductoare;
-acioneaz asupra tropismului plantelor i asupra corelaiei dintre organe, n particular asupra
fenomenelor de dominan apical;
-determin ntrzierea cderii frunzelor i a fructelor;
-au aciune rizogenic fiind folosite n special n micropropagarea speciilor ornamentale destinate
comerului de flori tiate;
Aceste efecte numeroase nu pot rezulta doar din aciunea singular a auxinei deoarece
concentraia optim este diferit pentru fiecare tip de aciune n parte i se schimb n funcie de
concentraia celorlali fitoregulatori.
Modul de aciune al auxinelor. Nu se poate da un rspuns precis, dar cercetrile n domeniu au
evideniat existena unor receptori fie membranari, fie citoplasmatici specifici auxinei. Pe baza acestei
ipoteze au rezultat urmtoarele concluzii:
-n funcie de prezena sau absena unuia sau a celuilalt receptor apar diferene de reacie n
concordan cu originea celulei ce reacioneaz la acest fitohormon;
-n funcie de afinitatea receptorului pentru auxin unii sunt angrenai mai repede dect alii.
Au fost descoperii receptori i pentru alte tipuri de fitoregulatori de cretere, de aici se poate
extinde ideea existenei de receptori pentru toate tipurile de regulatori endogeni.
B. Auxinele n plante
Toate plantele sintetizeaz auxine, sintez modulat de stadiul de dezvoltare ale acestora. Sinteza
auxinelor are loc la nivelul frunzelor tinere, a mugurilor i n florile i fructele tinere.
Auxinele circul de la vrful spre baza organelor cu o polaritate puternic pronunat n organele
tinere, dar n cursul transportului lor sunt descompuse de auxin-oxidaze, ceea ce nseamn c auxinele
sunt n concentraie mai mare n apropierea situsurilor de sintez. Astfel, auxinele sunt prezente ntr-o
concentraie suficient n vrful plantelor n cretere, n mugurii florali sau foliari, pentru a asigura
multiplicarea i elongarea celulelor.
C. Auxinele sintetice
De cnd au fost identificate auxinele, s-au sintetizat compui chimici similari acestora, care au
generat n celulele vegetale efecte similare auxinelor endogene, ceea ce confirm existena
receptorilor pentru auxine. Mai mult, fiind influenai mai puin de activitatea auxin-enzimelor , vor
putea avea un efect prelungit n plante.
Printre numeroasele substane folosite, cele mai importante sunt:
-acidul.indolil butiric (AIB);
-acidul naftalen acetic (ANA Fig.2) i derivaii si: acidul naftooxiacetic (ANOA) i
naftilacetilamida (NAD);
-acidul 2,4 diclorfenoxiacetic (2,4 D).
174
175
complex chimic activ de natur purinic, care nu a putut fi iniial identificat. Aceste rezultate au dat
posibilitatea continurii cercetrilor asupra purinelor i n 1956, Skoog a izolat, din ARN denaturat, o
substan activ numit chinetina.
Citochininele sunt nlocuitori ai adeninelor la care sunt cunoscui doi compui endogeni:
-zeatina (Fig.4)
-izopenteniladenina, a crei compui sintetici sunt: chinetina (Kin Fig.4) (6furfurilaminopurina) i benziladenina (BAP) (6-benzilaminopurina).
a)
b)
Fig.4 Citochinine: a) zeatina, b) kinetina
Se mai folosesc i ali nlocuitori ai adeninelor, sintetici, liberi sau n asociere cu zaharuri.
A. Proprietile fiziologice ale citochininelor
Citochininele sunt foarte active n plante i asemeni celorlalte dou clase de fitohormoni
prezentate anterior au o serie de proprieti dintre care:
-au un efect foarte clar asupra diviziunii celulare. n acest proces citochininele sunt
indispensabile, dar ineficiente fr aciunea auxinelor, cele dou complementndu-se reciproc.
Auxinele favorizeaz duplicarea ADN, iar citochininele permit separarea cromozomilor;
-au un rol la fel de important n organogenez stimulnd formarea lstarilor, fiind ns
antagonice rizogenezei;
-exercit un efect de stimulare a metabolismului celular, favoriznd sinteza proteinelor, prin
rolul ce-l joac n compoziia ARN-ului de transfer i protejnd metaboliii de aciunea enzimelor
hidrolitice. Acest efect determin ntrzierea senescenei pn la punctul n care frunzele mature
tratate cu citochinine se comport asemntor celor tinere din punct de vedere metabolic;
-exercit un efect antagonic asupra dominanei apicale stimulnd lstrirea axilar;
Citochininele prezint o importan deosebit n domeniul culturii in vitro deoarece au permis
obinerea unor progrese importante n micropropagarea plantelor. Proprietile citochininelor permit
rezolvarea dificultilor enumerate mai sus, cum ar fi meninerea viabilitii celulelor vegetale,
stimularea diviziunii celulare, orientarea celulelor spre dedifereniere.
B. Citochininele n plante
Prima citochinin endogen a fost identificat n 1963 n embrioni imaturi de porumb, de unde
i numele de zeatin, urmat de izopentenil adenina (IPA), descoperit puin mai trziu n plante
atacate de bacteria Corynebacterium fasciens. Toate plantele conin citochinine sintetizate n special
n rdcini i n embrioni. Aplicarea citochininelor pe frunze determin atragerea substanelor
nutritive spre aceste zone datorit efectului de stimulare a metabolismului exercitat de citochinine la
acest nivel. Creterea n dimensiuni a tuberculilor i fructelor se datoreaz prezenei citochininelor
endogene localizate n aceste organe.
Citochininele se pot asocia cu zaharurile i circula prin plante fr polaritate. Se presupune ca
ele circul ntr-o form inactiv i c rmn localizate la anumite nivele unde vor fi activate ulterior,
ca n cazul aplicaiilor pe frunze.
177
2.1.1.4 Etilena
Etilena (fig.5) este un compus gazos identificat cu mult timp n urm n ncperile de
depozitare a fructelor sau plantelor, dar funcia sa de regulator de cretere nu a fost evideniat pn n
momentul dezvoltrii tehnicilor de analiz n plante. Etilena se afl n plante n cantiti infime i
poate fi produs de toate prile acesteia.
Fig.5 Etilena
Principalele proprieti ale acestui regulator de cretere sunt:
-determin iniierea procesului de maturare a fructelor, etilena fiind folosit la nceput pentru
coacerea fructelor la lmi, iar acum pentru determinarea coacerii simultane a fructelor la mr i cire;
-accelereaz procesele de cdere a frunzelor i fructelor, fiind folosit atunci cnd se urmrete
recoltarea mecanizat a fructelor la cirei i mslini;
-induce formarea florilor la speciile familiei Bromeliaceae (ananas), o proprietate folosit n
horticultur;
-modific ritmul de cretere prin aciunea pe care o exercit asupra polaritii transportului
auxinelor;
-are aciune favorabil asupra tuberizrii.
Aceste proprieti au unele puncte comune cu auxinele (nflorirea Bromeliaceaelor, corelaii
de cretere) iar unele antagonice (cderea frunzelor i fructelor, tuberizarea). Aciunea antagonic a
etilenei pare a depinde de interaciunea dintre cele dou substane ce pot controla sinteza, concentraia
i circulaia lor.
Aplicaiile practice ale etilenei, dificil de utilizat n starea sa gazoas, au fcut progrese doar
dup descoperirea acidului 2-cloro-etan fosforic. Acest produs, aplicat prin pulverizare penetreaz
esuturile, unde se elibereaz etilena.
Toate prile plantelor sunt capabile s sintetizeze etilena, ns cantitatea cea mai mare se
sintetizeaz n fructe, apoi ntr-o concentraie mai mic n flori i organe rnite.
2.1.1.5 Inhibitori ai creterii
Multe substane au efecte inhibitoare asupra creterii plantelor, printre substanele endogene
enumerndu-se compuii fenolici i acidul abscisic.
A. Inhibitorii fenolici
Inhibitorii fenolici, ntr-un numr mare n plante, inhib metabolismul i intervine n multe
procese fie ca antagonici ai regulatorilor de cretere, fie ca inhibitori ai reaciilor metabolice. Ei
intervin n inducerea strii de laten a mugurilor i seminelor, la nceput prin ncetinirea creterii
acestora urmat de stoparea total a acesteia. Nu se tie exact rolul i mecanismul lor n inducerea
strii de laten.
n culturile in vitro aceti compui sunt deseori sintetizai i eliberai n mediul de cultur, unde
se oxideaz cauznd brunificarea mediului ceea ce duce deseori la moartea explantelor, de aceea n
unele medii de cultur se utilizeaz substane anti-oxidante sau adsorbani pentru a detoxifia mediul.
Exist cteva exemple referitoare la folosirea substanelor fenolice n cultura in vitro, cum ar fi
utilizarea florizinei pentru inducerea nrdcinrii la altoii de mr.
B. Acidul abscisic
178
Acidul abscisic (fig.6) a fost identificat n 1965 i de atunci a fost descoperit n toate plantele.
Acest inhibitor pare s fie sintetizat de fiecare dat cnd o plant este supus unor condiii stresante
(lipsa apei, rnire, cldur excesiv). Existena acidului abscisic n celule este una din cauzele crora
plantele supuse unor factori stresani i ncetinesc activitatea metabolic. ncetinirea activitii
plantelor este reversibil atunci cnd condiiile de stres sunt trectoare i poate induce starea de laten
sau chiar decesul plantei atunci cnd condiiile nefavorabile sunt prelungite.
B. Stadiul vegetativ
Cnd condiiile externe sunt favorabile i starea de laten este ntrerupt seminele germineaz
i din embrion ia natere o nou plant. De creterea plantelor sunt responsabile dou tipuri de
meristeme: meristemul caulinar ce determin creterea prii aeriene a plantei i meristemul radicular,
ce determin creterea prii subterane a plantei.
Meristemul caulinar are o structur bine definit, fiind alctuit dintr-o parte extern, epiderma
de dou sau trei straturi numit tunica, i o parte intern sau corpus. ntr-o seciune transversal se
poate observa o parte apical unde celulele au o activitate mitotic redus, nconjurat de un inel de
celule aflate n diviziune activ, celule responsabile de creterea tulpinii. Diviziunea ncepe de la
inelul iniial: zona epidermal difereniaz n frunze rudimentare spre exterior, iar spre interior n
parenchim cortical i vase conductoare. Centrul este umplut de meristemul medular. Meristemul
caulinar are o funcionare ritmic programat genetic cu o precizie aflat, n primul rnd, n
aranjamentul filotaxic al frunzelor (distribuie corespunztoare unei simetrii particulare fiecrei specii)
i, n al doilea rnd, n forma frunzelor. Se remarc aici c florile ce permit identificarea i
clasificarea plantelor se bazeaz aproape exclusiv pe caracterele morfologice. Ipoteza prezentat mai
sus privitoare la diferenierea celulelor n interiorul embrionului poate fi luat n considerare similar
celei privitoare la meristeme.
La nceput, plantula este hrnit din rezervele nutritive aflate n endospermul seminei, primele
frunzulie, deseori conturate n interiorul embrionului, sunt diferite de frunzele adulte, fiind cunoscute
sub denumirea de frunze juvenile. Planta crete i devine capabil s se hrneasc singur, rdcinile
transport spre frunze srurile minerale i compuii organici odat cu regulatorii de cretere. n
schimb, rdcinile primesc de la frunze substane nutritive bogate n glucozide, vitamine i de
asemenea n regulatori de cretere. Aceste schimburi stau la baza construirii scheletului unei plante,
stabilind corelaii de cretere ntre sistemul aerian i cel subteran al plantei.
181
D. Stadiul de senescen
Stadiul de senescen urmeaz stadiului reproductiv la plantele anuale deoarece meristemele
sunt la sfritul vieii lor, fructificarea epuiznd rezervele, rdcinile nu mai hrnesc planta n mod
normal, schimburile de substane nutritive se reduce i plantele se pregtesc de iernare. La speciile
perene, aceast etap ncepe prin ncetinirea funciilor rdcinilor odat cu debilitarea ntregii plante,
ce devine mult mai sensibil la toate tipurile de atac. Nu este imposibil ca regulatorii cu rol inhibitor
s intervin cel puin la nceputul acestui stagiu fiziologic (acidul abscisic i etilena, alturi de alii).
Aceast scurt prezentare a proceselor fiziologice ce au loc de-a lungul vieii unei plante ne
permite nelegerea importanei interaciunilor ce regleaz morfogeneza plantelor. Astfel,
interaciunile pe distan scurt, predominant genetice, au loc la nivelul embrionilor i al meristemelor
vegetative i regenerative. Alt tip de interaciuni sunt interaciunile dintre organe ce permit plantelor
s recunoasc mediul nconjurtor i variaiile ce intervin la nivelul acestuia. Planta va putea s se
adapteze noilor condiii datorit schimbului de semnale sub forma fitohormonilor sintetizai n
anumite locusuri, circulnd n direcia unui punct int ce rspunde la acel stimul. n cursul deplasrii
lor fitohormonii sunt controlai de sistemele enzimatice existente n plante. Aceste interaciuni sunt de
aa natur nct de-a lungul unui ciclu de via al unei plante, echilibrul endogen dintre regulatorii de
cretere evolueaz continuu i reflect la un moment dat, nu doar starea prezent a mediului
nconjurtor al celulei, ci i ultimele evenimente petrecute cu acea celul. Datorit acestui fapt, la
recoltarea unui explant trebuie s se in seama de valoarea acestui echilibru, ce depinde de stadiul
fiziologic i de vrsta plantei donor, dar i de organul de pe care se prelev, precum i de mrimea i
natura fragmentului excizat.
2.2.2 Selecia explantelor n funcie de stadiul fiziologic i vrsta plantei mam
n funcie de stadiul fiziologic i vrsta plantei donor explantele pot reaciona diferit la
condiiile culturii in vitro. n general, plantele tinere sunt sursa cea mai potrivit de explante,
potenialul de adaptabilitate al explantelor la condiiile artificiale de via diminundu-se cu vrsta
plantei mam.
n cursul embriogenezei, embrionii pot fi excizai din ovul i inoculai pe mediul de cultur
dac se afl n stadiul globular, putnd reproduce un individ normal i complet. Aceast tehnic
prezint un interes sczut atunci cnd se are n vedere micropropagarea (potenialul genetic al
embrionilor este rareori cunoscut cu excepia cazului strict de autogamie). Pe de alt parte, aceast
tehnic permite studierea cerinelor speciale necesare unui embrion izolat. n unele cazuri, de
ncruciare interspecific sau intergeneric, cnd embrionii pot fi avortai sau mor imediat n ovul,
aceast tehnic permite creterea i dezvoltarea normal a acestor embrioni.
esuturile embrionare sunt uor regenerative, dar la unele specii doar din cotiledoane s-au
obinut rezultate notabile, ceea ce a permis specificarea cerinelor nutritive pentru cultura esuturilor
speciilor studiate. Acesta poate fi primul mod de abordare a culturilor in vitro iniiate din explante
btrne. n unele cazuri aceasta este singura cale cunoscut.
Dup germinarea n stadiul juvenil, esutul prelevat prezint un rspuns favorabil in vitro i
este sursa multor succese n domeniu. Odat cu naintarea n vrst a plantei donor, potenialul de
cultur in vitro a explantelor prelevate de la acesta se diminueaz. Acest fenomen este specific mai
ales plantelor perene, i n mod deosebit la arbori. La aceste specii, calitatea tehnic a lemnului nu este
msurabil, cu excepia arborilor aduli. n acest stadiu, totui, pentru multe specii, iniierea culturii
doar din butai nu mai este posibil, deoarece n stadiul tnr acetia au o capacitate rizogenic
ridicat.
Exist dou tehnici ce permit obinerea de puiei la speciile pomicole i arboricole:
-una ar fi utilizarea lstarilor tineri de la baza speciilor pomicole i arboricole. n acest caz
lstarii par a avea caracteristici juvenile i nrdcineaz mai repede (de exemplu la nuc i eucalipt).
La aceste specii esuturile de origine ale noilor lstari sunt genetic apropiate de stadiul juvenil,
probabil datorit faptului c se afl n apropierea rdcinilor;
183
-a doua tehnic este aplicat pentru multiplicarea speciilor pomicole i arboricole tropicale i a
coniferelor. Aceast tehnic permite rejuvenilizarea i obinerea de altoi. Un altoi prelevat dintr-un
arbore sau pom este altoit pe un portaltoi crescut din smn. Altoiul crete i este apoi nlturat fiind
ulterior altoit pe alt portaltoi. Dup mai multe altoiri altoiul ncepe s prezinte caracterele juvenile,
ceea ce-l face apoi apt pentru propagare prin butire.
La culturile in vitro, s-au observat fenomene similare la meristeme. Prima frunzuli ce se
formeaz are caractere juvenile (prima frunzuli a meristemului la vi de vie are caracteristici
similare celei dezvoltate din smn, de asemenea, i la orhidee meristemele dezvolt, n cultura in
vitro, protocorm identic cu cel obinut din smn). Rejuvenilizarea observat este deseori obinut
din prima subcultur, ns uneori sunt necesare mai multe subculturi pentru a obine aceste efect, n
funcie de specie.
ntoarcerea la stadiul juvenil poate fi datorat supresiei de informaii citoplasmatice sau
datorit diminurii considerabile a acestora determinnd astfel posibilitatea regenerrii de noi celule.
Mecanismele exacte ce determin aceste fenomen nu sunt nc pe deplin cunoscute. Se pare c
citochininele sunt implicate, cel puin parial, n acest proces, dar ele nu acioneaz singure.
Cultivarea organelor reproductive in vitro, se poate realiza cu succes atunci cnd plantele
donor sunt n stadiul reproductiv. Se pare c schimbrile ce apar n ritmul de funcionare al
meristemelor este favorabil i determin n esuturi un echilibru optim culturii in vitro.
Se pot obine culturi din esuturi prelevate de la plante aflate n stadiul de senescen, dar
rezultatele sunt n general slabe sau incomplete.
2.2.3 Selecia explantelor n funcie de vrsta explantului
Problemele legate de vrsta explantului apar la speciile perene n care se poate distinge un
stadiu activ i unul lent, latent, ntre care reaciile fiziologice sunt diferite. Astfel, primele
experimente, ce vizau cultivarea de meristeme la plantele lemnoase, au euat atunci cnd s-a ncercat
iniierea unei culturi de esuturi din meristeme prelevate de pe ramuri n vegetaie, dar au avut succes
atunci cnd s-a pornit de la meristeme prelevate din muguri dorminzi.
De-a lungul unui ciclu anual, echilibrul intern al plantelor se schimb. Primvara organele
cresc i analizele relev prezena regulatorilor de cretere de tipul auxinelor, giberelinelor i
citochininelor. Vara transportul fitohormonilor prin vasele conductoare se diminueaz, iar toamna se
sintetizeaz inhibitorii creterii. De aceea, nu e surprinztor faptul c explantele, prelevate de la
aceeai plant n perioade variate ale vegetaiei, vor da rspunsuri diferite chiar dac vor fi plasate pe
acelai tip de mediu.
De aceste considerente trebuie s se in seama atunci cnd se are n vedere micropropagarea
speciilor lemnoase. Unele explante au tendina de a nrdcina uor atunci cnd sunt prelevate n
anumite faze de vegetaie, n special dac sunt excizate n perioada de vegetaie, cnd concentraia de
auxin este maxim.
La speciile cunoscute deja ca recalcitrante la cultura in vitro, pentru realizarea rejuvenilizrii
se poate supune planta mam, pentru o perioad scurt, unui tratament cu temperaturi sczute, unui
regim de lumin particular sau unui tratament cu fitohormoni pentru modificarea echilibrului lor
intern n vederea stimulrii rizogenezei.
condiiile unui mediu de cultur adecvat, structuri organizate (de exemplu, organe). Dac mediul de
cultur nu este potrivit poate tulbura funciile explantului i conduce la dediferenierea celulelor,
genernd calus.
Utilizarea acestui tip de explante este similar unei microbutiri i este tehnica cel mai des
folosit atunci cnd se urmrete micropropagarea pe scar larg a unei specii.
Interesant de amintit este faptul c explantele posed un fel de memorie a tipului de cretere ce
l-au prezentat in vivo, acest fenomen fiind n special ntlnit la speciile lemnoase. La mai multe plante
la care corelaiile de cretere sunt puternice, explantele provenite din ramuri laterale au generat plante
cu rdcini, dar de tipul lianelor, sub forma unor plante culcate la pmnt i nu erecte. Unele cercetri
au evideniat faptul c aceast memorie aparine celui mai apropiat internod de lng meristem.
2.Explantele constituite din diferite tipuri de esuturi, cum ar fi fragmente de tulpin, frunze,
flori i fructe, crora, inoculate pe mediu de cultur, li se induce o reversie complet cu scopul de a
restaura capacitatea celulelor de a se divide i de a-i ctiga din nou capacitatea organogenic.
Pentru aceste explante, n funcie de specie, s-a dovedit c toate prile plantei sunt capabile s
urmeze procesul dediferenierii conducnd spre o nou organizare structural. Dar, n acest caz,
diferenele ntre specii sunt uriae. Unele specii, cum ar fi violetele de Parma, sunt capabile s
regenereze din toate prile plantei (peiol, limb, rdcini, petale, stamine, polen, ovule), alte specii
sunt mai recalcitrante, cum ar fi Actinidia sinensis, la care rezultate notabile au fost obinute doar din
fragmente de tulpin. Unele specii sunt total recalcitrante, nereuindu-se iniierea culturii de esuturi
din explantele amintite, iar la unele conifere s-a reuit obinerea de propaguli doar din cotiledoane.
n general, cele mai bune rezultate au fost obinute, la cele mai multe specii, din fragmente de
limb foliar i tulpini tinere.
2.2.5 Selecia explantelor n funcie de mrimea i natura acestora
Mrimea explantului ce urmeaz a fi cultivat prezint cea mai mare importan. Cu ct
explantul este mai mare cu att echilibrul endogenic al acestuia este mai determinant i mediul de
cultur va avea o influen limitat. n cazul explantelor de dimensiuni mici direcionarea acestuia n
sensul dorit se face mai uor, deoarece explantul este receptiv la substanele din mediul de cultur, i
anume la regulatorii de cretere existeni.
Explantele organizate cuprind n general un nod, un apex sau un mugure (solzii protectori sunt
nlturai), fiind o unitate suficient de complet pentru care mediul va favoriza creterea, sau n cazul
diferenierii axilare, va bloca creterea apical. Pentru meristemele ce trebuie s aib dimensiuni
foarte mici, exist o mrime minim ce conine domul meristematic cu dou primordii foliare. Sub
aceast mrime supravieuirea explantului este foarte dificil i pierderile sunt mari, peste aceast
dimensiune, rspunsul la cultura in vitro este mult mai bun , ns n detrimentul eliminrii virusurilor.
Dimensiunile explantelor variaz ntre 5 i 10 mm, ceea ce corespunde unei manipulri uoare
a materialului vegetal, sub aspectul excizrii sau prelevrii, fasonrii i inoculrii acestora. De
exemplu, prin cultivarea pe acelai mediu de cultur, a mai multe fragmente de peiol de Saintpaulia,
de 1,5; 3; 5 i 7 mm, s-a observat c doar fragmentele de peste 3 mm au generat plantule normale.
Fragmentele de 1,5 mm au generat dou tipuri de rezultate: unele explante s-au vetejit, iar altele au
format doar rdcini. Fr ndoial, n ultimul caz, auxinele prezente n mediu au jucat cel mai
important rol, pe cnd n cazul fragmentelor de dimensiuni mai mari au intrat n joc i fitohormonii
endogeni.
Se pot fasona explante din diferite tipuri de esuturi: epidermal, cortical, parenchim medular,
dar i rspunsurile vor varia. Cel mai regenerativ tip de esut este cel epidermal. esuturile corticale i
cambiale prezint de asemenea rezultate bune, dar rmn deseori n stadiul de calus. Parenchimul
medular este esutul cel mai puin regenerant, aceste esuturi cer o armonizare perfect ntre regulatorii
de cretere, un exemplu fiind dat de Skoog, care a folosit mduv de tutun pentru a determina rolul
echilibrului dintre auxine i citochinine.
Din esuturi epidermale de cteva straturi grosime a fost posibil orientarea regenerrii spre
stadiul caulogenic (lstari), rizogenic (rdcini), calusogenic sau reproductiv. Acest experiment
confirm ipoteza unei activiti crescute a fitohormonilor asupra explantelor de dimensiuni reduse.
185
Cel mai mic explant este constituit dintr-o singur celul, cum e cazul protoplatilor izolai
mecanic sau enzimatic. Protoplatii sunt capabili de a se divide i a reproduce plante, dar nun sunt
capabili de inducerea meristemelor florale.
Observaiile asupra acestui tip de celule au evideniat cteva modificri ce intervin n procesul
dediferenierii: se reduce volumul vacuolar, dispar moleculele specializate, nucleul se mrete,
citoplasma devine mai dens. Dup realizarea acestor modificri celulele ncep s se divid, stadiu
denumit histogenez, uor de realizat prin adiia n mediul de cultur a auxinelor. n al doilea stadiu,
numit organogenez, citoplasma celular devine i mai dens, cu vacuole mici i nucleu voluminos.
Celulele pstreaz capacitatea de a se divide, dar celulele fiice vor fi capabile s se organizeze ntr-o
mas meristematic ce se va dezvolta ntr-un nou individ.
Observnd un explant n cultur se observ formarea, mai nti, a unei formaiuni calusare cu
rol protector. Celulele aflate n imediata apropiere a mediului sunt primele ce ncep s se divid i s
se dediferenieze.
Dac celulele ce vin n contact cu mediul brunific, nu se mai formeaz calus i deci tot
explantul moare. Celulele ce rspund la cultura in vitro au o poziie precis, de exemplu la Begonia
rex, celulele generatoare sunt cele subepidermale situate la baza periorilor glandulari. n general
celulele int, adic celulele ce rspund uor culturii pe mediu artificial, sunt cele epidermale, n
special cele provenite din tunic, dar pot avea i alte origini. Aceste celule se vor organiza ntr-un
meristem, care va dezvolta ulterior o plantul ntreag cu tulpini i rdcini, cum este cazul la Begonia
i Saintpaulia.
La alte specii, cum ar fi Pelargonium, se observ n primul stadiu formarea de calus
(calusogeneza), unde celulele regenerante se divid activ, i doar n al doilea stadiu, ce poate avea loc
pe acelai mediu de cultur sau pe alt mediu, se dezvolt meristemul ce va da natere noii plantule.
Cnd se formeaz meristemul prezint, n funcie de specie, acelai mod de a se dezvolta ca i
explantele organizate, doar c se cere un mediu mai complex pentru a asigura elementele nutritive
necesare dezvoltrii complete pn la stadiul de plantul.
Al doilea proces de organizare, mai puin frecvent, este acela n cursul cruia celulele se vor
comporta ca un ou fertilizat, urmnd etapele embriogenezei. Vom vorbi astfel de embrioni sau
embriogenez somatic. Acest fenomen, descris pentru prima dat la celule de morcov, a fost
descoperit la mai multe specii, att anuale ct i perene.
Ca o trstur general, inducerea embriogenezei depinde n cea mai mare msur de
compoziia mediului de cultur, dar i de genotipul de la care se prelev celulele generatoare. n multe
cazuri embriogeneza somatic, este precedat de formarea de calus, n acest caz izolarea celulelor nu
mai este un factor decisiv (Fig 9).
n cursul dezvoltrii se observ cum celulele se divid i embrionii ajung n stadiul globular,
apoi apare simetrie ntre forme i embrionul evolueaz spre stadiul cordiform i apoi ntr-un embrion
capabil s genereze o plantul (Fig 10).
Pentru celulele capabile s genereze embrioni somatici sunt suficiente dou medii de cultur.
Primul asigur formarea embrionilor, putnd servi i ca mediu de micropropagare, iar al doilea va
induce germinarea embrionilor.
Uneori sunt necesare mai multe subcultivri pe medii fr hormoni pentru a induce germinarea
embrionilor somatici i creterea plantulelor, n timpul acestor subcultivri are loc diluia
fitohormonilor la nivel celular permind astfel dezvoltarea normal a celulelor.
Utilizarea explantelor difereniate este foarte avantajoas deoarece sursa de explante este
nelimitat i rata de multiplicare poate atinge valori considerabile. n funcie de rspuns, aceste
explante prezint unele dezavantaje la nivel genetic.
n primul rnd, celulele ce dau natere noilor plantule sunt somatice i exist probabilitatea ca
celule mutante s genereze embrioni din care s ia natere noi plante.
188
CAPITOLUL IV
4.1 CERINELE NUTRITIVE ALE ESUTURILOR VEGETALE
CULTIVATE N CONDIII ASEPTICE
4.1.1 Mediul de cultur
Explantele vegetale pentru a putea tri, dup desprinderea de planta donator, au nevoie de
condiii speciale de cultur, s fie protejate de agenii patogeni (asepsie total) i s aib ca surs de
hran o soluie nutritiv complex, format din ap, sruri minerale, substane organice i fitohormoni.
Pentru meninerea explantelor la suprafa i pentru ca acestea s nu fie asfixiate, mediul de cultur se
solidific cu un agent de solidificare. Soluia nutritiv complex lichid sau solid se numete mediu
de cultur sau substrat de cultur. Acest mediu de cultur trebuie sa fie steril i cu o compoziie
complex deoarece explantul nu are capacitate de a se hrni autotrof, el triete heterotrof pe baza
substanelor existente n mediu. n funcie de scopul urmrit, evoluia explantului poate fi dirijat prin
modificarea compoziiei mediului, obinndu-se calus sau regenerarea de noi plante prin stimularea
organogenezei.
Compoziia mediului de cultur este specific pentru fiecare specie, soi i faz de dezvoltare,
cerinele fiind diferite i n funcie de explantul folosit, momentul de prelevare i zona din care s-a
prelevat, chiar n cadrul aceluiai soi. n prezent se cunosc i se utilizeaz o serie de medii de cultur
ce poart numele celor care le-au creat: White, Murashige-Skoog, Nitsch, Gamborg, Heller (Tabelul
4.1).
Compoziia mediului s-a stabilit att prin tatonri repetate cu diferite substane, ct i prin
studii ale sevei brute i elaborate la diferite specii, studii privind absorbia i desorbia, schimbul ionic
care exist ntre plant i mediul nconjurtor. n prezent se cunosc destul de bine modificrile pe care
le sufer plantele cnd elementele chimice sunt n exces sau n deficit. Trebuie evitate pe ct posibil
aceste stri de stres pentru plante att la cultura n cmp, ct mai ales la culturile in vitro.
4.1.1.1 Compoziia chimic
A. Compuii anorganici i rolul lor
Apa
Apa reprezint componentul esenial al vieii, al materiei vii. Este utilizat n tot fluxul
tehnologic de producere a plantelor in vitro, de la splarea materialului vegetal i a vaselor de
cultur, pn la utilizarea ei ca solvent pentru celelalte componente i elemente de diluie pn la
concentraia dorit. Pierderea apei din esuturi provoac perturbri metabolice direct proporionale cu
cantitatea de ap pierdut. Stresul hidric este suportat de plante dac este de scurt durat i dac nu se
atinge nivelul de vetejire. n aceast ultim faz plantele sunt capabile de rehidratarea esuturilor puse
n condiii favorabile de umiditate, dac deficitul de ap se menine plantele mor.
La culturile in vitro exist momente cnd explantele pot s-i piard turgescena prin pierderea
apei, momente n care trebuie acordat atenia cuvenit, pentru asigurarea succesului culturii.
Sterilizarea materialului vegetal este o etap critic din acest punct de vedere, deoarece
soluiile utilizate sunt concentrate pentru distrugerea agenilor patogeni. Trebuie corelate foarte bine
timpul de sterilizare i concentraia soluiilor utilizate n funcie de starea de vegetaie a materialului
vegetal, pentru evitarea pierderii apei prin exosmoz. Prelevarea explantelor trebuie fcut repede,
altfel datorit dimensiunilor mici pierd repede apa prin transpiraie, prin rnile care sunt mari
comparativ cu mrimea lui. Manipulrile sub hot trebuie fcute destul de repede deoarece curentul de
aer deshidrateaz relativ uor explantele care stau descoperite.
Pe timpul creterii explantelor n camera de cretere, vasele trebuie s fie nchise pentru a evita
pierderea apei prin transpiraie, ce ar determina concentrarea mediului n elemente nutritive, ar
189
provoca crparea mediului i ca atare slaba cretere a culturilor. Pentru respectarea strict a
concentraiilor soluiilor stoc sau a mediului, apa trebuie distilat, deci eliberat de ionii minerali pe
care i conine. La splarea materialului vegetal dup sterilizare se folosete ap steril, sterilizare ce
se face n autoclav odat cu sterilizarea mediului sau separat.
Srurile anorganice
Substanele anorganice sunt introduse n mediu sub form de sruri. Cele mai utilizate sunt:
azotaii, fosfaii, clorurile i sulfaii de Ca, K, Mg, Mn, Al, Fe, Mo, Zn, Cu, Na, etc. Absorbia
elementelor din mediu se face sub form de ioni, utilizarea uneia sau alteia din sruri este n funcie de
cerinele fiecrei specii i de faza de vegetaie. n funcie de cantitatea de elemente ce se folosete n
mediu, elementele se mpart n:
-macroelemente - utilizate n concentraii de ordinul milimolilor C, O, H, N, K, Ca, P, S,
Mg;
-microelemente sau oligoelemente, utilizate n concentraii de micromoli.
Tabelul 4.1
Principalele medii de cultur utilizate n culturi
in vitro (dup Street, 1977)
Constitueni
Macroelemente
KCl
NaNO3
MgSO4 x 7H2O
NaH2PO4 x H2O
CaCl2 x 2H2O
CaCl2
KNO3
Na2SO4
(NH4)2SO4
NH4NO3
KH2PO4
Ca(NO3)2 x
4H2O
Microelemente
FeSO4 x 7H2O
Na2EDTA x
2H2O
MnSO4 x H2O
MnSO4 x 4H2O
KI
NiCl2 x 6H2O
CoCl2 x 6H2O
ZnSO4 x 7H2O
CuSO4 x 5H2O
H3BO3
FeCl3 x 6H2O
Na2MoO4 x
2H2O
AlCl3
Fe(SO4)3
Constitueni
organici
Inozitol
Acid Nicotinic
Piridoxin HCl
Tiamin HCl
Glicin
Acid folic
Biotin
Zaharoz
190
Heller
White
Nitsch
Murashige
Skoog
Gamborg
750
600
250
125
75
-
65
720
16,5
80
200
300
mg/l
185
166
950
720
68
-
370
440
1900
1650
170
-
250
150
150
2500
134
-
27,8
37,3
27,8
37,3
27,8
-
0,01
0,01
0,03
1,0
0,03
1,0
1,0
-
7,0
0,75
3,0
1,5
-
25
10,0
0,025
10,0
0,25
22,3
0,83
0,025
8,6
0,025
6,2
0,25
10,0
0,75
0,025
2,0
0,025
3,0
0,25
0,03
-
2,5
0,05
0,01
0,01
3,0
2%
100
5
0,5
0,5
2
0,5
0,05
2%
100
0,5
0,5
0,1
2,0
3%
100
1,0
1,0
10
2%
Diferenele ce exist ntre diferite reete de mediu, constau n raportul dintre diferii ioni. Rolul
fiziologic al fiecrui element depinde de forma chimic n care se gsete n mediu, de concentraia
lui, de natura explantului. n prezent se cunosc principalele reete utilizate pentru speciile cultivate
care se preteaz la cultura in vitro. Acolo unde nu s-a experimentat nc, trebuie fcute tatonri pentru
gsirea celei mai adecvate compoziii pentru mediu. Carenele pentru elementele minerale in vitro se
manifest dup 2-3 subculturi, deci trziu, cnd nu se mai poate face mare lucru pentru salvarea
culturii. De exemplu N are rol important n embriogeneza somatic, n funcie de forma lui nitric sau
amoniacal influeneaz vitrificarea. Carena de N duce la acumulri de antociani n vacuolele
celulelor, iar dac aceasta persist provoac dereglri n metabolismul glucidelor i proteinelor.
Potasiul influeneaz creterea esuturilor, carena determin o dezvoltare slab. mpreun cu
calciul, regleaz permeabilitatea membranelor celulare, a fluiditii protoplasmei, intervine n
schimbul ionic la nivelul membranelor.
Magneziul ntr n compoziia clorofilei, carena provocnd dereglri grave n structura
frunzei.
Microelementele exercit roluri metabolice i fiziologice diferite de cele ale macroelementelor.
Intr n compoziia multor combinaii organo-metalice complexe, cu valoare biologic ridicat de tipul
enzimelor, care controleaz ntreg procesul metabolic al plantelor.
B. Compuii organici
Sursele de carbon
Viaa in vitro este aproape n exclusivitate heterotrof, n special n primele faze ale existenei,
pn la formarea unui numr suficient de mare de frunze pe fiecare plantul sau lstar. Datorit acestei
nutriii heterotrofe mediul de cultur trebuie s conin un compus care s asigure carbonul organic
necesar n metabolism. Principalele surse de carbon sunt glucidele. Acestea sunt substanele cele mai
utilizate i mai accesibile plantelor ca surs energetic. Dozele pe litru sunt de cca. 2-3% n funcie de
faza de vegetaie i tipul de explant folosit. Dintre glucide zaharoza rspunde cel mai bine cerinelor
culturilor in vitro.
Aminoacizii
Sunt utilizai ca surse de azot amoniacal disponibil imediat pentru celule i esuturi, fa de
azotul organic care este mai greu accesibil. Se adaug n mediu sub form de compui simpli sau
compleci. Principalii aminoacizi utilizai sunt: glicina, asparagina, acidul aspargic, cisteina, alanina,
glutamina etc.
Vitaminele
Plantele spre deosebire de animale sunt capabile de sinteza vitaminelor, dar nu i esuturile
cultivate in vitro. S-a demonstrat experimental ca in vitro esuturile i plantulele rspund favorabil la
adaosul exogen de vitamine n cantiti mici. Majoritatea vitaminelor sunt termolabile, sunt distruse la
temperaturi ridicate, uneori cu ocazia autoclavrii, dar s-a observat c i substanele reziduale au rol
favorabil asupra culturii.
Principalele vitamine utilizate n mediile de cultur sunt:
-tiamina (vitamina B1, aneurina), se folosete n concentraii cuprinse ntre 0,1-10 mg/l;
stimuleaz creterea vegetativ, sporirea biomasei produs in vitro;
-piridoxina (vitamina B6), 0,1-1 mg/l; precursor a unor coenzime, cataliznd reacii de baza n
metabolismul aminoacizilor;
-riboflavina (vitamina B2), 0,1-1 mg/l, rezistent la temperaturi ridicate (280oC); inhibitor al
creterii rdcinilor, rol n metabolismul celular;
-acidul pantotenic (vitamina B5), este mai puin utilizat ca atare; pantotenatul de calciu se
folosete n concentraii cuprinse ntre 0,5-2,5 mg/l;
-cobalamina (vitamina B12), este mai rar folosit, stimuleaz sinteza nucleoproteidelor;
-acidul nicotinic (vitamina B3, niacina), 0,5-5 mg/l, rezistent la temperaturi ridicate (234237oC); rol n metabolismul intermediar;
191
-biotina (vitamina H), 0,1 mg/l; stimuleaz creterea esuturilor meristematice i proliferarea
celulelor;
-acidul folic, 0,01 mg/l; efect stimulator asupra creterii esuturilor la lumin; la ntuneric are
efect toxic;
-acidul para-aminobenzoic, 1 mg/l; stimuleaz biosinteza acidului pantotenic i a biotinei;
-acidul ascorbic (vitamina C), 1-100 mg/l, prin autoclavare se distruge n bun parte; este
activator general al metabolismului celular;
-vitamina E (tocoferolul), mrete sensibilitatea celulelor la auxine;
-inozitolul (mio-inozitolul, mezo-inozitolul, hexahidroxi-ciclohexan), 100-1000 mg/l; este
considerat att vitamin ct i glucid; stimuleaz diviziunea celular.
Fitoregulatorii
Fitohormonii, fitoregulatorii sau substanele regulatoare de cretere sunt substane organice
utilizate n cantiti mici cu rol de a stimula, inhiba sau controla procesele fiziologice de cretere i
dezvoltare. Exist fitohormoni endogeni, sintetizai de plante i fitohormoni exogeni sau de sintez.
esuturile in vitro nu sunt capabile s-i sintetizeze ntreaga cantitate de care au nevoie, fiind
necesar adugarea lor n mediul de cultur pentru a asigura o bun cretere a explantelor. Cei mai
folosii fitohormoni n culturile in vitro sunt auxinele, citochininele i giberelinele.
Auxinele sunt mult utilizate pentru reglarea proceselor de morfogenez alturi de
citochinine. Auxina natural descoperit este AIA (acidul indolil-acetic) care se produce i prin
sintez pe cale industrial. Cele mai folosite auxine de sintez sunt:
-IBA (acidul 3 indolil butiric); ANA (acidul naftilacetic); 2,4D (acidul 2,4 diclorfenoxiacetic);
ANOA (acidul beta naftoxiacetic).
Aciunea auxinelor este foarte complex datorit intreaciunii pe care o are cu alte substane
regulatoare i interveniei asupra unor procese fiziologice. Rolul auxinelor poate fi redat astfel:
-stimuleaz diviziunea celular;
- influeneaz alungirea celulelor prin mrirea plasticitii peretelui celular;
-modific permeabilitatea membranelor plasmatice pentru ap i ioni;
-rol important n dominana apical;
-inhib formarea embrionilor somatici n suspensiile celulare;
Auxinele sunt sintetizate n partea aerian a plantelor n muguri, frunze, fructele tinere i
bobocii florilor de unde circul n toat planta. Cel mai mult se folosesc ANA i 2,4D care sunt mai
stabile, nu se oxideaz n prezena luminii. 2,4D este mult utilizat pentru inducerea i creterea
calusului i pentru rizogenez. La calus asigur friabilitate mare uurnd separarea calusului pentru
cultura de suspensii celulare i n embriogeneza somatic.
Citochininele sunt substane ce se gsesc n cantiti relativ ridicate n fructe, semine, etc., iar
ca structur au la baz adenina i un nucleu purinic.
Prima citochinin izolat a fost chinetina, experimentat cu succes la culturile in vitro. La scurt
timp s-a sintetizat benzil aminopurina (BAP). n prezent se folosesc pentru culturile de esuturi patru
citochinine dintre care dou naturale (2 IP i zeatin) i doua de sintez (chinetina i BAP).
Efectul fiziologic al citochininelor const n:
-acioneaz asupra diviziunii celulare alturi de auxine;
-stimuleaz formarea mugurilor adventivi i din calus;
-stimuleaz formarea lstarilor laterali;
-stimuleaz sinteza proteic;
-inhib formarea rdcinilor.
Biosinteza citochininelor endogene are loc n rdcini i n embrioni, iar migrarea este
dependent de cea a glucidelor. Sunt substane termostabile suportnd uor autoclavarea.
Giberelinele sunt substane care acioneaz la nivelul ntregii plante i nu asupra celulei, cu rol
n stimularea creterii, nfloririi i fructificrii. Cea mai utilizat giberelin este acidul giberelic (GA3)
fiind i cea mai activ.
Aciunea fiziologic este urmtoarea:
-produce alungirea internodiilor tulpinilor;
192
iar lumina numit lumin alb conine radiaii roii, dar nu se cunosc cu exactitate curbele spectrale
de emisie ale acestora. n general, tuburile fluorescente albe aflate n comer sunt adecvate culturilor
de esuturi.
n ultimul timp au aprut n comer dou tipuri de tuburi fluorescente: tuburi cu lumin cald
i tuburi cu lumin rece, astfel c, o combinaie ntre cele dou tipuri de tuburi s-a dovedit a fi foarte
potrivit pentru culturile incubate n camerele de cretere.
4.2.2 Temperatura
n general, temperatura folosit n camerele de cretere este de 22-24oC. Aceste temperaturi
sunt la pragul critic, deoarece n interiorul vaselor de cultur temperatura poate fi cu 2 pn la 4oC mai
mare dect n camera de cretere. Practic, temperatura din camera de cretere trebuie s fie cu 2 oC
mai mic dect cea necesar speciei cultivate in vitro. Speciile provenite din climatul temperat sunt
obinuite la temperaturi mai sczute dect speciile tropicale, de aceea ar fi de dorit ca pentru speciile
din zonele temperate s se seteze temperatura n camera de cretere la
201 oC , iar pentru cele
o
tropicale la 251 C.
De asemenea, temperatura n camera de cretere va fi diferit i n funcie de scopul urmrit n
cultura in vitro. Astfel, la cartof, s-a observat c o temperatur de cca 19oC, influeneaz pozitiv
formarea minituberculilor, n timp ce la gru, cultura de antere necesit o temperatur de cca 27oC.
De aceea, se recomand ca fiecare unitate de cercetare s beneficieze de cel puin dou camere
de cretere, n care temperatura s poat fi reglat n funcie de necesitile explantelor i tipurilor de
culturi existente.
n natur, plantele sunt supuse unor fluctuaii de temperatur, iar reproducerea lor n camera de
cretere ar fi fr ndoial avantajoas. Totui, prea puine studii au fost fcute n aceste sens pentru a
putea trage o concluzie relevant.
196
CAPITOLUL VI
6.1 INIIEREA UNEI CULTURI IN VITRO
6.1.1 Aspecte generale privind condiiile aseptice de cultur
Prima condiie n realizarea cu succes a unei culturi de celule sau esuturi in vitro este asepsia.
Mediile de cultur sunt foarte favorabile dezvoltrii bacteriilor i ciupercilor, creterea crora este
mult mai rapid dect cea a celulelor vegetale i duce la inhibarea proceselor fiziologice ale esuturilor
cultivate. De aceea un laborator de culturi de esuturi este organizat i pstrat ntr-o asepsie strict
asemeni unei sli de operaie.
Principalele cauze ale apariiei infeciilor n culturile in vitro sunt:
1) Aerul care conine o cantitate mare de organisme patogene de tipul bacteriilor sau fungilor.
2) esuturile vegetale sunt acoperite la suprafa cu fungi i/sau bacterii. Cele mai infectate
organe sunt cele ce se dezvolt n pmnt (rdcini, bulbi, tuberculi). Bacteriile i ciupercile se
dezvolt i n interiorul esuturilor, n vasele conductoare libero-lemnoase sau n spaiile
intercelulare, caz n care este imposibil sterilizarea esuturilor, iar folosirea antibioticelor nu este
recomandat.
3) Corpul uman, care poart numeroase microorganisme pe piele sau n respiraie.
Metodele de eliminare ale acestor surse de infecie sunt:
a) Produsele chimice, care distrug microorganismele:
-hipoclorit de sodiu;
-hipoclorit de calciu;
-mercurobutol;
-clorid mercuric;
-produse bactericide i fungicide;
-etanol 70-80%.
b)Becuri de gaz pentru sterilizarea instrumentarului prin flambare.
c) Aerul cald: la 120oC timp de 20 minute (autoclav), cldur umed pentru sterilizarea
mediilor de cultur i a apei sau 180 oC timp de 2-3 ore, cldur uscat (etuv) pentru sterilizarea
sticlriei.
d) Razele ultraviolete, care distrug doar o parte din spori.
e) Sisteme de filtrare a aerului: se folosesc filtre speciale ce nu permit trecerea particulelor mai
mari de 0,22m. Filtrarea este realizat de un ventilator-extractor ce asigur o ventilaie constant cu o
vitez optim i are avantajul de a menine steril aerul din incinta hotei cu flux laminar. n momentul
de fa toate laboratoarele de culturi aseptice sunt prevzute cu hote cu flux laminar de aer steril.
6.1.2 Prepararea mediului de cultur
Datorit faptului c n prepararea unui mediu de cultur intervin mai muli factori este necesar
alctuirea unei liste de materiale nainte de a se trece la prepararea lui. Pe parcursul preparrii se vor
bifa, pe rnd, toate elementele msurate i introduse, inndu-se seama cu strictee de volumul final al
mediului.
Se vor nota cu atenie toate detaliile legate de proveniena substanelor chimice sau a soluiilor
stoc, erorile, coreciile, proveniena agarului, calitatea apei. n aparena sunt factori ce nu prezint o
mare importan, dar n realitate succesul unei culturi depinde ntr-o foarte mare msur de calitatea
mediului i implicit de factorii menionai mai sus.
Etapele preparrii unui mediu de cultur sunt:
1)Diluia srurilor minerale: macro- i microelemente, apoi ajustarea la volumul final.
2)Msurarea pH-ului, corectarea cu KOH 10N; n general pH-ul este de 5,5-5,8.
3)Adiia zaharurilor (sucrozei) urmat de adiia agarului, care se adaug n ploaie n timp ce
mediul este amestecat tot timpul.
197
se detaeaz vrful rdciniei (cca 5-10 mm) i se inoculeaz tot n vase Petri, 1-2 explante/vas, pe un
mediu de cultur constituit din macroelemente i zaharoz, pH-ul fiind 5,8 (Reinert i Yeoman, 1982).
Se poate constata c mediul de cultur recomandat este unul simplu lipsit de microelemente,
vitamine sau hormoni. Se pot utiliza i medii mai complexe, clasice, iar ca surs de carbon organic
poate fi folosit glucoza n loc de zaharoz. Creterea rdcinilor in vitro are loc pe medii de cultur
lichide neagitate. Zilnic se poate urmri dezvoltarea radicelelor secundare, prin aplicarea sub cutia
Petri a unei hrtii milimetrice.
De obicei, dup 21 zile de cultur se constat o plafonare a creterii, moment n care se
recomand subcultivarea rdcinilor, prin excizarea apexului i transferarea lui pe mediu proaspt.
Subcultura se poate face i la interval de 7 zile. Dup aproximativ dou subculturi, este oportun
introducerea n mediul de cultur a tiaminei i a acidului nicotinic, n dozele normale, utilizate pentru
alte tipuri de explante.
Prin cultura de rdcini s-a putut cerceta efectul auxinelor asupra celulelor radiculare. Street
precizeaz c auxina stimuleaz att creterea n lungime a fragmentelor de rdcini de tomate ct i
diviziunea celulelor meristemului apical. Utiliznd culturi de rdcini, pe diferite tipuri de medii, ca i
compoziie i consisten, s-a putut stabili efectul diferiilor fitohormoni de cretere, al elementelor
chimice sau al unor substane organice, n formarea rdcinilor, n creterea lor, precum i urmrile
carenrii celulelor lor n anumite elemente. Prin extrapolarea acestor rezultate, s-a reuit mbogirea,
an de an, a cunotinelor privind funcionarea rdcinilor i rolul lor n metabolismul general.
De asemenea, din cultura de rdcini se poate obine uor calus, mai ales din cele principale
sau din cele ngroate secundar. Procesele de organogenez, la nivelul rdcinilor netransformate n
calus, se rezum la ramificarea acestora n radicele secundare. Geneza de mugurai i tulpinie are loc
la nivelul esutului calusal, provenit din rdcini, sau pe explante radiculare.
6.1.7.2 Cultura de meristeme
Meristemele sunt esuturi de tip formativ, cu celule tinere, ce-i menin, n tot cursul vieii
plantelor, capacitatea de a prolifera, respectiv proprietatea de a se divide, formnd mereu noi celule.
Meristemele sunt localizate n vrful ramificaiilor organelor (tulpini sau rdcini), fiind meristeme
apicale, de tip primar, cu rol n creterea n lungimea organelor; meristeme primare gsim i n
straturile profunde ale rdcinilor i tulpinilor. La organele ce sufer procese de modificare secundar
morfo-anatomic, ngrori, ntlnim meristeme secundare, respectiv cambiul i felogenul. De regul,
prin termenul de cultur de meristeme se nelege cultivarea in vitro a meristemelor apicale, caulinare.
Masivul de celule care alctuiete meristemul apical se apreciaz c msoar maximum 500
(Margara, 1982) sau altfel spus, cca 0,1 mm diametru i 0,25-0,30 mm lungime (Kartha, 1981). n
cazul n care se depete aceast dimensiune, vorbim despre o cultur de apex.
Celulele meristematice dein caracteristici structurale particulare, ce le confer capacitatea de a
se menine ntr-o continu stare de proliferare, cum ar fi:
-au pereii celulari subiri, celulozici, nemodificai secundar;
-sunt bogate n citoplasm, au mitocondrii numeroase, nucleul este mare, cu nucleoli bine
reliefai;
-vacuolele sunt mici i nu dein metabolii.
n raport cu celulele parenchimatice sau cu cele prozenchimatice, celulele meristematice sunt
mici, strns unite ntre ele, fr spaii intercelulare. Meristemele primare au celule de forma poligonal
iar meristemele secundare au form tabular. Celulele derivate din multiplicarea meristemelor
secundare au o dispoziie radial, respectiv toate celulele generate dintr-o celul meristematic mam
sunt dispuse liniar, perpendicular pe celula ce le-a dat natere.
Celulele meristemului apical, caulinar, sunt uniforme din punct de vedere anatomic, dar
arbitrar, la angiosperme, straturile de celule componente sunt submprite n tunica i corpusul.
La meristemul radicular pturile celulare prezint o structur diferit de aceea descris la
tulpin.
202
Forma, mrimea i conformaia meristemului apical, caulinar variaz mult la diferitele specii
dar, n mare, s-au delimitat trei tipuri principale structurale: meristemul criptogamelor vasculare,
meristemul la gimnosperme i meristemul de angiosperme.
Meristemul caulinar terminal este localizat n vrful ramurilor i de regul, este protejat n
mugur. El poate fi apical, axilar sau adventiv.
Mugurele este constituit dintr-un ax, n apexul cruia se afl meristemul. Prin diviziunea
continu a meristemului rezult celule care, pe msur ce se ndeprteaz de apex se difereniaz
funcional. Celulele externe ale masivului tisular (numit con de cretere sau vrf vegetativ) se pliaz,
iar protuberanele rezultate constituie primordiile. Cu timpul, primordiile se difereniaz n primordii
foliare sau florale. De regul, n primordiile florale se produce o cretere a intensitii ratei de
multiplicare celular, aceti muguri devin mai bombai, mai voluminoi. Celulele din zona central se
difereniaz n xilem, floem i esut parenchimatic. Centrifug, dinspre centru spre periferia mugurelui,
se ntlnesc primordii transformate fie n frunzulie, din ce n ce mai mari, fie n boboci, respectiv n
componente florale. Mugurii i bobocii au capacitate regenerativ ridicat, graie faptului c dein
esuturi tinere, slab difereniate i celule meristematice. Meristemele apicale posed o relativ
autonomie, fapt nc insuficient argumentat i dovedit experimental. n evoluia in vitro a explantelor
meristematice, un rol important l are stadiul de dezvoltare al primordiilor. Primordiile florale
recoltate n faze prea avansate de dezvoltare, cultivate in vitro, se transform n floare. Adeseori,
funcie de specie, la nivelul nveliurilor florale se poate induce neogeneza de formaiuni
meristematice adventive.
Cambiul i felogenul sunt meristeme prezente n organele ngroate secundar sau n cele
metamorfozate (rdcini tuberizate). De regul, cambiul constituie o principal zon regenerativ.
esuturile inoculate pe medii aseptice, de regul, difereniate morfofuncional, trebuie s se
dediferenieze, fenomen ce se petrece n etape succesive, pn la rentoarcerea lor la starea de
meristem primar, respectiv neoformarea de meristeme. Fenomenul de dedifereniere celular se
produce i spontan, de exemplu n cazul iniierii unor meristeme, sau al genezei de rdcini secundare
din celulele periciclului radicular.
Dediferenierea celulelor inoculate in vitro poate consta n formarea de calus, dedifereniere
primar, din care se poate ajunge la un stadiu de dedifereniere secundar, cnd o parte din celulele
calusului se transform n meristeme, generatoare de rdcini sau tulpini.
Dediferenierea celulelor inoculate in vitro constituie o condiie a formrii de promeristeme i
de iniiere a organogenezei.
n cultura de meristeme, meristemul este prelevat mpreun cu dou primordii foliare
subiacente acestuia.
Ball (1946) a fost primul care a obinut plantule din meristeme de Lupinus albus i
Tropaeolum majus, prin cultivarea lor in vitro. Aceste experimente au relevat potenialitatea
organogenetic a diferitelor pri ale apexului.
n prezent, o atenie deosebit se acord studiilor privind cunoaterea reaciei meristemului
cultivat in vitro, n raport cu condiia funcional a meristemului in situ, precum i a rolului
primordiilor. Este evident faptul c un meristem izolat, cultivat pe medii aseptice, i poate manifesta
totipotenialitatea sa real; n condiiile inoculrii lui mpreun cu primordiile, ori in situ, aceast
capacitate este mascat de corelaiile existente ca urmare a prezenei alturi de meristem i a celorlalte
esuturi. Dezvoltarea in vitro a meristemului solitar, sau a celui nsoit de primordii, este dependent
de fitohormonii de cretere prezeni n mediul de cultur. Se pare c primordiile, chiar n faza n care
frunzele sunt abia schiate, se pot transforma fie n frunze, fie n muguri floriferi. Experienele de
microchirurgie ale lui Wardlaw (1949), Steeves (1962), Haight i Koehnert (1969), precum i ale altor
autori, au permis stabilirea faptului c tinerele mucroane foliare se afl ntr-o stare nedeterminat nc
morfofuncional. Problema transformrilor morfologice i structurale, n cadrul proceselor de tranziie
care au loc n trecerea strii vegetative a meristemului n stare floral, precum i a celor legate de
reversia meristemelor iniial florale, n meristeme vegetative constituie punctul de plecare n
multiplicarea vegetativ in vitro, pornind de la explante constnd din boboci sau din nveliuri florale.
La conopid, n faza de preinflorescen, Margara (1982) se pot distinge trei categorii de meristeme:
vegetativ, de generare a inflorescenei i de formare a florilor.
203
final, meristemul terminal, apical sau axial genereaz una sau mai multe plante, n funcie de balana
hormonal prezent n mediul de cultur. Meristemele terminale, caulinare ale plantelor lemnoase
ridic probleme speciale, ntruct ele aparin unor plante perene, multianuale, de talie mare, ceea ce
ngreuneaz o alimentare optim a lor cu ap, cu nutrieni i hormoni. Acest lucru constituie
impedimente fiziologice care, pe plan funcional, se traduc printr-o regresie a capacitii regenerative
a celulelor lor, soldat cu o scdere a totipotenialitii acestor meristeme.
Meristemul apical se formeaz n momentul organizrii embrionului i rmne activ n tot
cursul vieii plantei. Excepie fac plantele perene din zonele temperate, la care meristemul apical n
decursul sezonului de iarn se afl n stare de laten.
Prin intermediul culturii de meristeme apicale, terminale sau laterale, se poate realiza o
rapid multiplicare clonal a plantelor, ndeosebi a celor horticole i a unor specii silvice.
Prin cultivarea in vitro a meristemelor se obine o regenerare de plante identice din punct de
vedere genetic cu planta mam donatoare, fapt deosebit de important n horticultur, asigurndu-se
astfel o multiplicare clonal.
Un alt aspect, foarte important, care deriv din nmulirea meristematic a plantelor, este acela
al obinerii de material sditor sntos, n esuturile cruia este prevenit orice fel de atac fitopatogen.
Plantulele generate in vitro din meristeme, nsoite numai de prima pereche de primordii foliare, sunt
libere de viroze, deosebit de pgubitoare i imposibil de evitat i de combtut n condiiile nmulirii
vegetative a plantelor. Numai propagarea plantelor prin semine poate asigura, ntr-o oarecare msur,
eradicarea parial, temporar, a virozelor, tiut fiind faptul c, chiar i prin semine se transmit o serie
de viroze. Dar nenumrate plante horticole nu se pot nmulii prin semine sau, la unele soiuri,
multiplicarea prin semine este dificil (orhidee), ori seminele nu sunt fertile, ceea ce a fcut ca
nmulirea acestora pe cale vegetativ s constituie unica metod de multiplicare a lor. Pe de alt parte,
multiplicarea plantelor pe cale asexuat, prin metode de nmulire vegetativ clasic, a condus la
degenerarea descendenilor ca o consecin a perpeturii, an de an, a infeciilor virale. Astfel, o cultur
sntoas de garoafe (Rudelle, 1977), nmulite timp de cinci ani prin butire clasic, a prezentat o
rspndire n mas a virozelor, multe din ele, cauznd degenerri. Totodat, multiplicarea vegetativ,
prin metode tradiionale, are drept consecin i o perpetuare a unor mutaii somatice.
Virozele plantelor aduc mari daune culturilor, la cartofi i cpun, n floricultur i n
arboricultur, ntruct reduc vigurozitatea plantelor, scad potenialul productiv al acestora, producia
realizat este mediocr i produsele agricole au un grad naintat de depreciere a calitii lor. Butaii
obinui din plante virozate au o capacitate redus de nrdcinare i realizeaz un procent sczut de
prindere. Pe de alt parte, din cauza meninerii n cultur a unor plante virozate se creeaz pericolul
transmiterii virusurilor i la alte plante, prin vectorii biologici prezeni n cultur.
Primele ncercri de cultivare a extremitilor de tulpini i de rdcini sunt citate ca fiind
realizate nc din 1922, de ctre Kotte i de ctre Robbins, la mazre i porumb, dar fr mare succes.
Ulterior, n 1946, Ball a reuit s obin plante din apexuri meristematice la Lupinus albus i la
Trapaeolum majus. Pn n jurul anilor 1949-1950 cultura propriu-zis de meristeme nu era
cunoscut, abia ncepnd din anul 1949, prin lucrrile lui Wetmore i Morel s-au pus bazele
cercetrilor sistematice privind cunoaterea reaciei explantelor meristematice la condiii de cultur,
precum i cu privire la comportamentul in vitro al meristemelor diverselor specii, de diferite
dimensiuni, cultivate n condiii variate de mediu.
Dac meritul de a fi reuit regenerarea de plante din meristeme izolate revine lui Ball, n
schimb prioritatea n ceea ce privete obinerea de plante sntoase, devirozate, prin cultura in vitro a
meristemelor apicale, recoltate de la plante bolnave, revine lui Morel (1959-1960). Inspirat fiind de
rezultatele obinute ntre anii 1949-1950 de ctre Limasset i Cornuet, Morel a avut intuiia de a
cultiva in vitro meristeme apicale de aproximativ 75-100 m lime i 150-200 m nlime, cu 1-2
primordii foliare.
Experienele efectuate de Limasset i Cornuet au constat n urmrirea, prin analize serologice,
a gradului de rspndire i a evalurii intensitii virozrii organelor vegetative aeriene a plantelor la
diferite distane de apex. Ei au constatat o distribuie inegal a virusurilor n corpul plantelor i au
observat un gradient mai sczut de infecie viral, pe msura apropierii de vrful vegetativ, respectiv
de meristemul apical. Cea mai redus infecie viral a fost semnalat n sucul extras din frunzele aflate
205
nc n mugur. Pornind de la aceste fapte, Limasset i Cornuet au extirpat, aseptic o calot de esut
apical sau meristem i cteva primordii foliare i au depus-o pe o frunz tnr de tutun, lezat printro scarificare superficial. Dup trecerea unei perioade de incubaie s-a putut constata c frunzele de
tutun, pe care s-a amplasat exclusiv calota meristematic, au fost virozate n proporie de 60%, n timp
ce frunzele pe care s-au aplicat esuturi subiacente meristemului (primordii foliare mai ndeprtate de
meristem) s-a infectat n procent de 100%. Aceste experiene ia condus pe Limasset i Cornuet la
concluzia c n apexul caulinar migrarea i nmulirea virusurilor este oprit.
nc din 1952, Morel i Martin au intuit faptul c, pornind de la plante virozate, prin
explantarea i cultivarea in vitro a meristemului caulinar, apical, se poate obine o plant sntoas,
conservnd, n acelai timp, caracterele genetice ale plantei mam. Aceast ipotez a fost atestat de
ctre Morel i Martin prin experiene efectuate cu plante de dalie. Cultura de dalii a beneficiat prima
de eradicarea virozelor, prin procedeul imaginat i pus n practic de ctre Morel i Martin. Tulpinile
generate in vitro, neposednd rdcini, au fost transformate n minibutai. Acetia au dat natere la
plante libere de viroze. Au urmat apoi cartofii i orhideele. n 1957, Quak a remarcat c metoda lui
Morel i Martin este posibil de aplicat, cu aceleai rezultate, la garoafe. Din acel moment s-au demarat
cercetrile n scopul stabilirii unor metode intensive, industriale, de controlare i producere a unui
material sditor sntos, cu randament economic asigurat, avnd ca obiectiv obinerea de flori de
calitate superioar.
n acest mod a fost elaborat ipoteza imunitii poteniale a celulelor meristematice la atacul
viral. Dac prelevarea se face de la o plant neinfectat, sau care prezint o infecie viral slab, atunci
cresc i mai mult ansele de a preleva explante meristematice, lipsite de infecii virale.
Din pcate, plantele devirozate nu sunt imune la viroze. Ele se pot mbolnvi tot att de repede
ca i oricare alt plant. De regul, din plantele devirozate, aflate in vitro se asigur multiplicarea lor,
tot pe medii aseptice, prin minibutai, sau se induce formarea de colonii de propagule, sau se
constituie o plantaie mam, donatoare de meristeme ori chiar de butai, plantaie executat n condiii
speciale de protecie, nct plantele s fie ferite de atac zoopatogen.
Concomitent cu eradicarea virozelor, multiplicarea in vitro a plantelor, prin explante
meristematice, asigur i eliminarea din materialul sditor a fungilor i a bacteriilor. Astfel, la garoafe
s-a realizat eliberarea plantelor de infecii cu Fusarium roseum, iar la Pelargonium i Diffenbachia
eradicarea bacteriozelor sistemice (Walkey, 1979).
Cercetrile recente au dovedit ns, c nu toate meristemele sunt libere de infecii virale.
Invazia meristemelor cu virusuri este dependent de tipul meristemului, al virusului i de specia
plantei parazitate. Cu ct explantele meristematice sunt mai mici, cu att ansa prelevrii de celule
lipsite de virusuri este mai mare, dar cu ct inoculul meristematic este mai mare, cu att este mai
ridicat capacitatea lor regenerativ.
Nu toate virozele pot fi eradicate prin procedeele de nmulire meristematic (Martin, 1977).
De exemplu, la cartof, virusul X poate fi nlturat, prin nmulire meristematic, numai n procent de
1%. Unele virusuri pot exista chiar i n meristemele apicale (Hollings, 1962).
Termoterapia vine n ajutorul culturilor de meristeme pentru a completa metodele de
combatere a infeciilor virale, la plante. Termoterapia a fost elaborat de ctre Kunkel, n 1936.
Aceasta const n supunerea plantelor bolnave la temperaturi cuprinse ntre 35-39oC, timp de 2-4
sptmni. n cursul aplicrii termoterapiei virusurile nu se multiplic; ele rmn la nivelul celulelor
n care au fost surprinse n momentul declanrii tratamentului termoterapeutic.
Combinnd cultura de meristeme cu termoterapia se realizeaz, cu anse foarte mari de reuit,
eliminarea virusurilor din plantele generate in vitro. n consecin, mersitemele sunt prelevate de la
plante supuse, prealabil explantrii, tratamentului termoterapeutic. Dar, n aceast situaie, descrete
vitalitatea plantelor donatoare, concomitent cu scderea capacitii de supravieuire i de regenerare a
celulelor meristematice. Pe durata termoterapiei, apexul se alungete iar virusurile, nemultiplicnduse, rmn n celulele bazale ale conului vegetativ, ceea ce nlesnete prelevarea unor explante apicale
mai mari de pn la 1 mm, micornd pericolul recoltrii unor esuturi subiacente meristemului,
infectate cu germeni fitopatogeni. n consecin, explantele meristematice prelevate de la plante
supuse termoterapiei, fiind mai mari, capacitatea lor regenerativ i de cretere va fi mai ridicat, ceea
ce compenseaz epuizarea fiziologic, cauzat de termoterapie.
206
Kassanis (1950) a dovedit c unul din virusurile cartofului, localizat n frunze, poate fi
inactivat la nivelul tuberculilor, prin aplicarea termoterapiei. Dar tot Kassanis a precizat c la tomate
exist virusuri a cror activitate este suprimat abia la 80 oC. acesta a fost unul dintre motivele care i-a
determinat pe cercettori s prelungeasc durata termoterapiei, de la cteva zile la cteva luni i s
ridice temperatura de la 35 la 40oC (Quak, 1977).
Hakkaart i Quak (1964), experimentnd cu meristeme excizate de la crizanteme, de pn la 1
mm lungime cu 2-3 primordii foliare, au constatat c prelungirea duratei de termoterapie de la 10-20
zile la 30 zile a dus la sporirea procentului de plante devirozate, de la 9 la 90% dar prelungirea
tratamentului termoterapeutic peste aceast durat de timp (pn la 50-60 zile)nu a condus la
depirea procentului de plante devirozate.
n unele cazuri, se poate realiza distrugerea virusului din vrful meristematic i n decursul
cultivrii esuturilor in vitro. Astfel, Hollings i Stone (1964), au reuit aceast performan la garoafe,
iar Walkey i colab. (1969) la cire. Aceast eradicare endogen a virozei, n interiorul celulelor
cultivate pe medii aseptice, poate fi un rezultat al unui proces metabolic dereglat, ca o consecin a
traumatizrii celulelor excizate. Cu ct a fost mai mic fragmentul de esut excizat, cu att
traumatismul a fost mai puternic i efectul endogen, distructiv, exercitat asupra virusului, a fost mai
mare (Walkey, 1980). De regul ns, este imposibil s regenerm anumite specii de plante din
fragmente att de mici de esuturi; ori n alte condiii, nu poate fi realizat o traum de o aa amploare
nct s se produc o disturbare a metabolismului virusurilor din celulele explantate, soldat cu
suprimarea atacului viral.
Explicaiile privind modul n care celulele meristematice rezist infeciilor nclin spre
justificri de ordin molecular. Una din ipoteze susine c exist o competitivitate ntre celula gazd i
parazit, n ceea ce privete utilizarea unor enzime implicate n procese de restituie; alt ipotez,
susine c celula meristematic utilizeaz ARN viral, sau c substanele generate n urma traumatizrii
celulelor ar suprima virusurile prezente n celule.
n anul 1978, Walkey, a reuit obinerea de plante sntoase i prin cultivarea in vitro a
esutului gametofitic femel, respectiv ovare sau esut nucelar, sau a meristemului floral.
Trebuie subliniat i marele merit pe care Morel l-a avut n intuirea importanei deosebite a
descoperiri posibilitii de a obine plante sntoase din plante bolnave, precum i a direciilor
aplicative pe care le-a deschis aceast tehnic, efectuat n condiii aseptice. Cele mai mari realizri
le-a avut Morel n multiplicarea in vitro la orhidee. Astfel, n anul 1963, Morel comunica primele
rezultate cu privire la cultivarea in vitro a meristemului apical de orhidee. Acestea se refereau la faptul
c meristemele de orhidee, cultivate pe medii aseptice, genereaz un glomerul de 1-2 mm, de culoare
verde, numit protocorm. Prin ruperea i cultivarea in vitro a fragmentelor va rezulta o mas
globuloas, un glomerul de cca 3-4 mm slab difereniat histologic, constituit dintr-un parechim, cu
celule mari, srace n citoplasm i cu vacuole ntinse. n partea central a glomerulului se disting
cteva fascicule vasculare. Fragmentnd periodic aceast mas i cultivnd-o in vitro s-a putut
remarca o foarte mare capacitate de multiplicare vegetativ a celulelor detaate. n anul 1978,
Murashige afirma c, dintr-un meristem de orhidee, n decursul unui an, prin fragmentri i
subcultivri repetate ale protocormilor, se pot obine cca 4 milioane de noi plante de orhidee.
Protocormul produs in vitro este asemntor cu protocormul de germinaie, rezultat din embrionii
seminelor.
n 1959, Martin a intuit posibilitatea crerii unei bnci cu explante, n care s fie conservat
materialul biologic meristematic sntos. Prin aceast tehnic, astzi, materialul vegetal generat in
vitro este uor conservat, esuturile deinnd nealterat, ntreaga lor capacitate regenerativ.
Valoarea mare a culturii de meristeme const deci n:
-asigurarea uniformitii genetice a materialului sditor, generat in vitro;
-eliminarea agenilor fito sau zoopatogeni;
-creterea la maximum a coeficientului de multiplicare, n cel mai scurt timp, a unui exemplar
vegetal;
-obinerea unui material sditor juvenilizat, imposibil de realizat prin metode tradiionale de
nmulire vegetativ;
207
210
zone regenerative acestea reprezint numai cca 1-10% din totalul masei calusale. Dac regiunile cu
calus de tip regenerativ sunt subcultivate pe medii care s impulsioneze i s susin procesele
regenerative, celulele lui vor da n final natere la plante.
Calusul de tip regenerativ poate fi obinut i din calusul secundar, prin meninerea calusului
regenerativ pe mediu potrivit creterii acestuia i nefavorabil obinerii de plante, intervenindu-se
periodic, prin subcultivri de ntreinere. Pe alt cale se pot identifica i izola insulele de calus
regenerativ, pe msur ce ele apar pe calusul de tip neregenerativ, realizndu-se transferarea lor pe un
mediu de cretere adecvat.
n decursul timpului s-a constatat c se obine mai mult calus din inoculii cultivai la ntuneric
dect din cei crescui la lumin. Regiunile cu calus regenerativ sunt mai greu depistabile pe calusurile
crescute la ntuneric. Procentul de formare al calusului regenerativ crete ns la calusul crescut n
condiii de ntuneric. La gru, calusul trebuie transferat la interval de cinci sptmni, pe mediu
potrivit induciei diferenierii de plante. La calusul de gru, regenerarea se realizeaz pe un mediu
lipsit de fitohormoni de cretere; astfel din calusul de tip regenerativ, n cca 2-5 sptmni dup
transferarea pe mediu adecvat proceselor regenerative, are loc formarea de plante. Pe un astfel de
mediu, calusul de tip regenerativ nu va mai crete. Dac calusul este mixt, componenta neregenerativ
continu s creasc mult; concomitent, ns, din poriunile de calus de tip regenerativ, n cultur se
difereniaz i plante. Dup dou subcultivri ale calusului de tip regenerativ, pe mediu lipsit de
fitohormoni de cretere, potrivit inducerii neoformrii de plante, se recomand transferarea calusului
rmas, pe un mediu coninnd auxin, pentru a favoriza continuarea creterii acestuia.
Plantele obinute sunt detaate de calus i sunt plasate n vase deschise, coninnd perlit, care
va fi udat cu ap de la robinet, urmnd ca dup 1-2 sptmni, plantele bine nrdcinate, s fie
transferate n ghivece cu pmnt n amestec cu perlit.
Calusul poate fi folosit i n obinerea unei culturi de celule, cultivndu-l pe medii lichide,
obinnd-se astfel suspensiile celulare folosite n diferite scopuri.
n vederea obinerii de calus se parcurg urmtoarele etape:
-alegerea materialului vegetal, din care se va executa prelevarea explantelor. Calusul poate fi
obinut din explante provenite din diverse surse: semine, embrioni, rdcini, esut de rezerv, frunze,
ramuri, antere, ovare;
-prepararea mediilor de cultur i alegerea tipului de mediu se vor face n funcie de scopul
propus. Atunci cnd scopul este doar obinerea de calus se poate utiliza un mediu de cultur oarecare,
coninnd substane anorganice (macro i microelemente) i substane organice (surs de carbon
organic, vitamine, aminoacizi i fitohormoni), iar solidificarea mediului se realizeaz cu agar;
-sterilizarea recipientelor i a mediilor de cultur;
-pregtirea materialului vegetal n vederea dimensionrii explantelor. Se realizeaz curirea
organelor i dezinfectarea lor, folosind diverse procedee n funcie de tipul de explant utilizat;
-dimensionarea explantelor este diferit n funcie de specia la care se lucreaz i de tipul de
organ folosit ca surs de explante;
-inocularea explantelor se realizeaz n condiii aseptice, la hota cu flux de aer steril, fie pe
mediu solid fie pe mediu lichid cnd ns este necesar agitarea n vederea aerrii culturii;
-incubarea inoculilor se face fie la ntuneric, fie la lumin, de regul la temperatura de 25oC;
-observarea proceselor de formare a calusului i urmrirea creterii acestuia se face periodic, la
diverse intervale de timp;
-subcultivarea periodic se realizeaz prin fragmentarea calusului i inocularea fragmentelor
pe medii proaspete. Subcultivarea se efectueaz la cca 4-6 sptmni, fiind obligatorie pentru
meninerea viabilitii calusului. Este important inerea unei evidene stricte a numrului de
subcultivri suportate de ctre fiecare fragment de esut calusal;
-urmrirea proceselor de organogenez sau de embriogenez funcie de condiiile n care a fost
cultivat calusul, de provenien i de vrsta acestuia.
esutul calusal are o utilizare variat. El constituie unul din materialele biologice asupra cruia
se pot aplica diferii ageni selectivi, n scopul obinerii de linii rezistente, pentru selecionarea de
plante care s fie tolerante la prezena n mediul lor de via a unui anumit factor de stres. Nabors
(1982) a reuit s obin calus i apoi plante rezistente la concentraii ridicate de NaCl, substan
213
ncepe s se divid i se hrnete din rezervele endospermului. n aceast faz celulele embrionului
sunt heterotrofe; pentru creterea i dezvoltarea lor ele au nevoie de: glucide, aminoacizi, vitamine i
hormoni. n aceast etap explantarea embrionului i inocularea lui pe medii aseptice creeaz
probleme deosebite pentru realizarea cadrului fiziologic optim, adecvat continurii proceselor de
cretere i de dezvoltare.
De regul, la dicotiledonate, embrionul este apt pentru cultivare pe medii aseptice n momentul
n care sunt formate cotiledoanele, respectiv cnd ncepe diferenierea intern a celulelor embrionului.
stadiul critic de transformare endogen a structurii embrionare variaz de la specie la specie i uneori
este dependent de condiiile meteorologice. n unele cazuri, cnd este important izolarea timpurie a
embrionului de sub aciunea plantei mam, poate fi realizat o cretere corespunztoare a acestuia
numai dac embrionul este izolat mpreun cu nucela sau cu esutul nutritiv, sau dac se detaeaz
ovulul n ntregime realizndu-se astfel inocularea lui pe medii aseptice, corespunztoare ca i
compoziie.
Prin cultura in vitro de embrioni se poate prentmpina avortarea sau dezvoltarea anormal a
embrionilor ca urmare a instalrii unei incompatibiliti ntre embrion i esutul nutritiv, aa cum este
cazul hibrizilor sexuali intervarieti interspecii i intergenuri, sau al formrii de hibrizi sterili.
Spre deosebire de cultura de embrioni imaturi, care ridic mari probleme, cultura de embrioni
maturi este mult mai uor de realizat.
Embrionii maturi necesit un mediu de cultur simplu, care are n compoziia sa sruri
minerale i o component glucidic. Adugarea la mediul de baz a vitaminelor (acidul nicotinic,
acidul ascorbic, piridoxin) impulsioneaz creterea esuturilor, iar adugarea fitohormonilor de
cretere are drept scop urmrirea evoluiei embrionilor n prezena acestora, pentru a asigura
stimularea creterii unui anumit organ sau pentru inducerea formrii de calus. n mediile aseptice
destinate culturii embrionilor imaturi, adesea se recomand adiionarea unor extracte naturale:
hidrolizat de casein, lapte din nuc de cocos, suc din fructe de tomate sau extract de endosperm.
n general, dezvoltarea embrionilor in vitro se petrece natural, cu condiia ca ei s fie
explantai n acea faz de formare care s le permit, n continuare parcurgerea evoluiei fireti a
proceselor de ontogenez i s se respecte integritatea lor morfoanatomic; cu ct stadiul n care au
fost prelevai a fost mai timpuriu cu att i factorii de care depinde dezvoltarea lor sunt mai compleci
i greu de reprodus. n timp ce plantulele provenite din embrionii maturi au o dezvoltare similar cu
cei dezvoltai n condiii naturale, sau prezint chiar un uor avans n cretere plantulele dezvoltate din
embrionii imaturi sunt plpnde, iar n sol dovedesc o cretere mai lent i sunt mai firave. Cultura de
embrioni imaturi, recoltai foarte tineri, uneori conduce la obinerea de plantule malformate, chiar
dac mediile de cultur au o compoziie adecvat dezvoltrii acestora.
n unele cazuri, dup polenizarea interspecific sau intergeneric, dezvoltarea embrionilor a
fost extrem de lent, ceea ce a fcut ca explantarea embrionilor i cultivarea lor in vitro, s fie
imposibil. Taira i Larter (1978) au tratat ovulele fertilizate cu acid E-amino-n-caproic, facilitnd
astfel, creterea embrionilor hibrizi, realizai ntre gru i secar, depind barierele fiziologice care
mpiedicau creterea acestora. Deci, pretratamentul florilor femele cu anumii regulatori de cretere,
dup polenizare, impulsioneaz creterea embrionilor pn la faza n care ei pot fi extrai i cultivai,
cu succes, pe medii aseptice.
Prin cultura de embrioni s-a reuit obinerea de plante mature din hibrizi de trifoi 2n x 4n,
mbinndu-se caracterul de perenitate cu cel al calitii furajului realizat (Evans, 1962). Rezultate bune
s-au obinut i n regenerarea de plante din embrionii altor specii furajere, obinndu-se hibrizi
interspecifici de Melilotus, Lotus, Phaseolus, i Medicago.
Tot prin cultura de embrioni s-a reuit obinerea de plante la specii ale cror semine nu
germineaz (banane) sau a celor care se nmulesc greu prin semine (specii forestiere). n unele cazuri
scoaterea embrionilor din starea de laten, prin cultivarea lor pe medii aseptice a constituit o metod
eficient n scurtarea ciclului de dezvoltare a plantelor.
De asemenea, embrionii pot s serveasc i ca esuturi de plecare n multiplicarea i
propagarea rapid a unor plante (la specii ornamentale) atunci cnd acest lucru este dificil de realizat
prin utilizarea altor tipuri de explante.
215
O atenie deosebit trebuie acordat aspectelor teoretice i practice pe care le ridic problemele
de embriologie experimental la gimnosperme. Cea mai veche cultur de embrioni la gimnosperme
este citat ca fiind efectuat de ctre Schmidt n anul 1924, cnd a cultivat pe un mediu organic
embrioni de Pinus sylvestris. Mai trziu, n 1936 Rue a reuit cultivarea in vitro a embrionilor
provenii de la cteva specii: Pinus resinosa, Picea canadensis, Tsuga canadensis i Pseudotsuga
menziensii i a demonstrat, totodat, c embrionul imatur de gimnosperme (de 2-4 mm) poate fi
cultivat pe medii aseptice, pn la stadiul de plantul. Experimentele ulterioare au reliefat faptul c
embrionii de gimnosperme pot fi crescui in vitro, n lipsa megagametofitului (Cachi, 1984).
La cultura de embrioni, presiunea osmotic, sau sursa de carbon organic, joac un rol
important n evoluia acestora, atunci cnd embrionii sunt excizai i sunt cultivai in vitro. De
exemplu, embrionii de Pinus strobus, pe mediu Murashige-Skoog, cun un coninut de 3-6% zaharoz
i hormoni, vor genera plantule, n timp ce pe un mediu cu numai 1-2% zaharoz, se constat o
serioas limitare a dezvoltrii primordiilor radiculare.
Prin cultivarea in vitro a embrionilor de Taxaus embryo s-a reuit scoaterea acestora din starea
de laten, odat cu detaarea i desprinderea lor de sub aciunea megagametofitului.
Cultura de endosperm constituie un excelent instrument pentru studierea problemelor de
morfogenez i se refer la cultura endospermului de tip secundar, derivnd din diviziunea nucleului
secundar al sacului embrionar, avnd celule triploide, gimnospermele avnd un endosperm de tip
primar. Ambele tipuri de endosperm dein un rol important n alimentarea i susinerea creterii
embrionilor. La plantele dicotiledonate, de regul endospermul este consumat n primele faze ale
dezvoltrii embrionului, rolul de depozitare a rezervelor nutritive revenind cotiledoanelor.
Primele experimente constnd n proliferarea endospermului imatur de porumb au fost
efectuate nc din anul 1933 de ctre Lampe i Mills. La Rue, n anul 1947, a realizat creterea
nelimitat a endospermului de porumb. Cercetrile menionate au deschis calea unor experimente prin
care s-a dovedit c acest esut iniial are o capacitate ridicat de proliferare, formeaz uor rdcinie,
mugurai i chiar plantule. n aceast direcie, Straus i La Rue n 1954, au obinut rezultate excelente
cultivnd endosperm de porumb, la 12 zile de la polenizare. Cele mai bune varieti, potrivite pentru
acest scop sunt cele de porumb zaharat. Endospermul de porumb, la 8 zile dup polenizare, nu crete
pe medii aseptice. Deci, pentru reuita iniierii culturii este important stadiul n care se afl
diferenierea celulelor embrionului.
Endospermul matur, doar la cteva specii sau varieti, corespunde scopului inducerii formrii
de calus i anume: Zea mays, Lolium, Santalum, Ricinus, Coffea arabica, Croton, Petroselinum
hortense. Dintre acestea numai la unele specii se manifest procese de organogenez. Endospermul de
porumb, de ricin, precum i la alte specii, genereaz o mas de calus n continu cretere, fr
organogenez, n timp ce la nivelul valusului de Petroselinum se observ embriogeneza.
Cultura de embrioni ofer un important instrument n cercetrile de embriologie i n
embriogeneza experimental, constituind un sistem de tip monitorial n redarea fazelor de cretere ale
diferitelor pri componente ale embrionilor. Aceste etape pot fi studiate n dependen de natura
substratului de cultur, de vrsta embrionului, n funcie de condiiile de mediu, oferind importante
informaii privind interferena diferitelor etape metabolice cu regulatorii de cretere, procesele de
depozitare ale substanelor de rezerv n esuturi, cu factorii care pot intervenii, pozitiv sau negativ, n
formarea i creterea embrionilor.
6.1.7.5 Cultura de ovare, ovule i de esut nucelar
n hibridare poate exista, adeseori, o incompatibilitate ntre partenerii sexuali. De aceea prin
utilizarea metodelor culturilor in vitro se poate, uneori, facilita fie accesul polenului la ovul, fie
acceptarea de ctre ovule a autopolenizrii ori a polenizrii ncruciate, nvingndu-se astfel barierele
de autoincompatibilitate, a celor de incompatibilitate la ncruciri, operaiunile fiind fcute n scopul
obinerii de semine viabile.
Incompatibilitatea dintre ovule i polen este provocat de ctre diferite cauze, de ordin
endogen i anume: o prim selecie a polenului se face la nivelul stigmatului. Aceasta poate prezenta o
216
218
permind obinerea de suspensii celulare cu celule mai uniforme din punct de vedere morfologic i
metabolic.
Rata de cretere a numrului de celule n decursul ciclului de cretere a culturii se modific din
momentul iniierii culturii, pn la oprirea diviziunilor. O prim faz, imediat dup inoculare, const
ntr-o ntrziere a declanrii proceselor de multiplicare i de cretere, dar n urmtoarele 10 zile
numrul de celule per unitatea de volum crete exponenial, urmnd apoi faza de staionare i apoi
faza de declin. Faza exponenial de cretere se caracterizeaz ca o perioad finit de timp, n care rata
de cretere a biomasei, raportat la unitatea concentraiei de biomas este constant. Faza de cretere
exponenial este extins n condiiile n care cultura este iniiat cu o densitate redus a celulelor per
unitatea de volum (Cachi, 1984).
Pentru a menine culturile ntr-o faz de cretere exponenial trebuie prevenit situaia
limitrii nutrienilor din mediu ca o consecin a epuizrii acestora. n acest sens se impune
subcultivarea frecvent a celulelor. Eriksson a subcultivat cultura de Haplopappus gracilis i la un
interval de 48 ore. La o cultur de Acer pseudoplatanus, Dorre i colab. (1971) au realizat subculturile
la un interval de 7 zile, obinnd o densitate iniial de 2 x 105 celule/ml.
Pentru culturile de celule se pot folosi urmtoarele tipuri de dispozitive:
-fermentatoare de cca 1 l sau chiar mai mari, utilizate i n cultura cu volum de mediu limitat,
stabilit iniial;
-chemostate pentru cultura continu, deschis;
-fitostate chemostat pentru reglarea culturii semicontinue aparate n care rata de cretere i
densitatea celular sunt meninute constante, prin fixarea unei rate de introducere a factorilor nutritivi
i hormonali;
-turbiostate sistem deschis de cultur continu, n care mediul proaspt se adaug n
momentul creterii turbiditii culturii i a eliberrii, prin splare i eliminare a excedentului de celule.
O cultur de celule poate fi obinut pe mai multe ci. Cea mai folosit metod const n
realizarea n mediul de cultur lichid a unei suspensii utiliznd ca material iniial calus, pentru ca s se
realizeze o dispersare a celulelor i a agregatelor ce alctuiesc masa de calus, condiie ce poate fi
ndeplinit prin efectuarea unor subculturi repetate de calus, pe medii cu balan hormonal adecvat
scopului respectiv. Cel mai folosit fitohormon este acidul 2,4 diclorfenoxiacetic, n diferite
concentraii. n cazul n care gradul de dispersie al calusului este redus, chiar i n condiiile agitrii
mediilor de cultur lichide, se vor efectua subculturi prin recoltarea supernatantului i diluarea
agregatelor celulare mici n mediu de cultur proaspt.
De asemenea, n acelai scop, se poate practica recoltarea fragmentelor de calus din mediul
lichid i recultivarea lor, din nou pe mediu solid, astfel c, coloniile de celule formate vor avea un
procent mult mai ridicat de dispersie atunci cnd se reiniiaz suspensia celular (Street, 1976).
O alt metod const n omogenizarea organelor plantulelor prin triturare moderat, n
omogenizator de sticl i apoi inocularea pe mediu lichid a suspensiei ce celule rezultate.
n acelai scop se pot utiliza protoplati obinui prin digestie enzimatic.
Cultura de suspensii celulare se menine prin inocularea unei cantiti de mediu, dintr-o cultur
deja existent, avnd o densitate cunoscut de celule, dilund-o cu mediu proaspt. Densitatea
celulelor n subcultur nu trebuie s depeasc iniial 0,5-2,5 x 105 celule/ml. n decurs de 15-25 zile
densitatea va crete pn la cca 4 x 106 celule/ml (Street, citat de Cachi, 1984).
Cultura de celule prezint foarte multe avantaje. Exist specii care constituie modele n ceea ce
privete reacia la condiiile create i la care procesele de citodifereniere, de organogenez i
embriogenez pot fi controlate i dirijate n sensul dorit (morcov, tutun). Astfel, cultura de celule
prezint avantaje deosebite n efectuarea unor studii la nivel celular, privind aspecte ale creterii,
citodiferenierii, ale metabolismului celular. De asemenea cultura de celule, fiind constituit ntr-o
populaie omogen de celule se poate folosi n vederea inducerii variabilitii genetice i seleciei de
mutani, prin expunerea culturii la aciunea unor anumii ageni fizici sau chimici.
Unul din marile obiective urmrite prin culturile de celule l constituie acela al selectrii de
mutante biochimice, cum ar fi mutante rezistente la antibiotice, erbicide, metale grele, sruri, etc. Prin
astfel de experimente au fost create linii celulare mutante, iar modificrile genetice operate la nivel
celular pot fi regsite n plantele regenerate pornind de la celula care a suferit un proces de mutaie.
220
Selectarea liniei celulare se poate face uor prin etalarea suspensiei pe medii de cultur solide,
recoltarea efectundu-se n perioada creterii exponeniale (Cachi, 1984).
Capacitatea regenerativ depinde de gradul de agregare al celulelor, viabilitatea acestora,
vrsta culturii, compoziia substratului i de condiiile de cultur.
ntruct experienele de ameliorare i genetic din cmp sunt costisitoare, necesitnd mult
for de munc i suprafa mare de teren, prin tehnicile de culturi in vitro aceste experimente se
simplific, reducndu-se activitatea, n prima faz, doar n laborator, astfel c se reduc att suprafeele
de lucru ct i timpul necesar obinerii rezultatelor dorite. n plus materialul biologic valoros obinut,
prin cultura de celule se poate pstra timp ndelungat prin crioconservare, n azot lichid.
O problem deosebit este aceea a obinerii de culturi de celule fotoautotrofe. Celulele
cultivate pe medii aseptice dei au clorofil nu pot supravieui n lipsa zahrului din mediul de cultur.
n ncercrile fcute pe medii aseptice s-a constatat c succesul cultivrii esuturilor i celulelor
clorofiliene autotrofe a fost minim, nregistrndu-se o rat sczut a creterii acestora. Vigurozitatea
slab a celulelor crescute n astfel de condiii a fost explicat printr-o activitate fotosintetic sczut,
datorat unor deficiene de cultur, care mpiedic dezvoltarea cloroplastelor i a fotosintezei. Yamada
i colab.(1978) s-au ocupat de aceast problem i au ajuns la concluzia c n realizarea culturilor de
celule fotoautotrofe trebuie s se aib n vedere selectarea de celule care produc mult clorofil.
Lumina puternic stimuleaz sintetizarea clorofilei, dar numai la o concentraie sczut de zaharoz.
Prezena n mediul de cultur a unor concentraii ridicate de zaharoz inhib sinteza clorofilei.
Culturile de celule au implicaii practice deosebite n industria aa zis de tip fermentativ, dup
modelul biotehnologiilor care folosesc microorganismele n scopuri industriale. i n culturile de
celule s-a asimilat i adoptat termenul de fermentatoare pentru recipientele n care se cultiv celule. La
plantele superioare, spre deosebire de microorganisme, produii secundari de metabolism sunt
depozitai n vacuole, nefiind excretai n mediul de cultur. La suspensiile celulare, derivnd din
plantele superioare, durata de fermentaie este de cca 10 ori mai mare dect la culturile de tip
microbian.
Un aspect particular l constituie capacitatea celulelor cultivate in vitro de a transforma
precursori sau anumii compui prezeni n mediul de cultur. Biotransformarea poate fi utilizat
pentru diferite tipuri de reacii: hidroxilare, dehidrogenare, hidrogenare, glicozidare, adiia de carbon,
ruperea lanului de carbon.
Culturile n mediu lichid prezint avantajul unui contact mai bun al celulelor cu nutrienii, se
asigur un schimb de gaze optimizat, se evit neajunsurile provocate de o eventual orientare polar
neadecvat, precum i depozitarea i concentrarea n jurul celulelor a produilor de metabolism,
eliminai n mediu.
6.1.7.7 Cultura altor tipuri de explante
Teoretic, oricare parte a plantei poate fi folosit ca explant pentru iniierea culturilor in vitro.
Inducerea neoformrii de esuturi este dependent de specie, de natura organului, de mrimea
explantului, natura esuturilor prezente n explant, sezonul n care s-a recoltat organul, modul de
sterilizare, compoziia mediului de cultur, orientarea lor pe mediu precum i balana hormonal
folosit n mediul de cultur.
De regul, n afar de meristemele apicale, la nivelul nodurilor, al frunzelor, al
inflorescenelor, cotiledoanelor i mai rar, n poriunea internodal a tulpinilor se constat existena
unei capaciti regenerative, a crei intensitate depinde de specie, de vrsta organului din acre se
preleveaz esuturile, mrimea explantului, orientarea lui pe mediu de cultur, de compoziia mediului
sau de condiiile din camera de cretere.
ntr-un experiment efectuat de Lazr i Cachi (1980-1982), cu explante de crizantem de
natur diferit, cultivate pe mediu de baz cu adaos de AIA (2 mg/l) i BA (2mg/l) s-a constatat c, n
afar de meristeme, alte tipuri de explante folosite de la peduncul floral, peiol, inflorescena,
minibutai frecvent au generat calus. La nivelul calusului s-a observat inducerea proceselor de
organogenez, pe suprafaa superioar, formare de mugurai iar pe cea inferioar, generarea de
rdcinie. Din meristemele apicale, dup dou luni de cultivare pe medii aseptice s-au format plante,
221
complet conformate. Din meristemele axilare, diferenierea plantelor s-a fcut mai lent. Plantele
formate din meristeme au avut o conformaie proporionat i s-au adaptat bine la viaa mediului
septic. Explantele nodale i cele constnd din teaca frunzelor, au generat, pe un explant, un numr
variabil de mugurai. Dintre acetia unul pn la trei s-au dezvoltat, ceilali rmnnd n diferite faze
de cretere. separai i subcultivai pe medii proaspete au format rdcinie i s-au dezvoltat normal.
Inoculii constnd din explante de form cilindric (ex. internod), au prezentat o pregnant polaritate
morfogenetic, chiar dac explantul a fost acoperit de calus.
Procesul de organogenez a fost i mai sczut la fragmentul desprins din mijlocul peiolului
frunzelor. n general, inoculii constnd din internod i mai ales cei dimensionai din peiol au generat
mult mai mult calus dect cei de form i mrime similar, obinui din peduncul floral.
Explantele dimensionate din poriunea limbului foliar, n care nervura principal a frunzei era
bine reprezentat, au generat o cantitate mai redus de calus, n schimb au dat natere la mugurai, din
care s-au format plante (Lazr i Cachi, 1982). n general, lstraii formai la nivelul calusurilor au
un aspect diferit de acela al tulpinielor formate din meristeme, ceea ce atest c din celulele calusului
se pot diferenia plantule cu o conformaie particular, diferit de aceea a plantelor din care au
provenit, nefiind asigurat, pe aceast cale nmulirea clonal.
Concluzia final a constat n aceea c regenerarea i diferenierea rapid a noi plante s-a
realizat din inoculii meristematici. Lstarii pot fi transformai n minibutai i prin aceasta se ridic
coeficientul de multiplicare a clonei respective.
Se poate deci concluziona c, n funcie de specia la care se dorete experimentare, dar innd cont i
de scopul urmrit, natura explantului este diferit, iar rezultatul preconizat a se obine este influenat
de o serie de factori, de la compoziia mediului de cultur, natura fitohormonilor de cretere i
concentraia acestora, pn la vrsta organului donor sau condiiile din camerele de cretere. Exist,
aadar, o gam variat de posibiliti de inducere a unei culturi in vitro, astfel c se pot depista
pentru fiecare specie de cultur, ornamental sau forestier, sursele de explante cele mai potrivite n
vederea realizrii unor astfel de experiene. Iar acolo unde literatura nu ofer posibiliti de inducere a
culturilor de celule, experiena cercettorului poate permite depistarea prin tatonri a celor mai bune
metode n vederea realizrii obiectivelor n acest domeniu.
222
CAPITOLUL VIII
8.1 TEHNOLOGII DE CULTUR IN VITRO
Tehnicile de cultur in vitro a explantelor reprezint o cale optim de cercetare a fiziologiei
plantelor. Aplicaiile practice ale acestor tehnici au fost repede apreciate de vreme ce plantulele
obinute n vase de cultur pot fi aclimatizate pe un substrat normal n condiii naturale de via.
Cronologic, cultura de meristeme a stat la originea primelor aplicaii, deoarece scopul acestor
culturi a fost, n principal, obinerea de plante libere de virusuri. Dup primele succese ce au confirmat
semnificaia metodei, s-au dezvoltat rapid tehnicile de micropropagare pentru a asigura o producie
rapid de plante libere de virusuri.
Acestor dou tehnici, care sunt acum utilizate frecvent n horticultur, le mai pot fi adugate
altele trei, ce nc aparin domeniului cercetare, obinerea plantelor haploide, izolarea i cultura de
protoplati i cultura de calus i suspensii celulare cu scopul producerii de compui medicinali
aromatici. Ultima tehnic vizeaz obinerea de substane farmaceutice direct din culturi de celule
vegetale, fr o cultivare n cmp.
8.1.1 Cultura de meristeme
Meristemele sunt esuturi de tip formativ cu celule tinere ce-i menin pe tot parcursul vieii
plantelor capacitatea de se divide, formnd mereu noi celule. Meristemele sunt localizate n vrful
ramificaiilor organelor tulpini sau rdcini fiind meristeme apicale cu rol n creterea n lungime a
acestora. Importana culturii de meristeme const n principal n utilizarea lor n vederea obinerii de
plante libere de viroze, aceasta fiind i principala aplicaie practic a acestui tip de culturi.
Pentru cultura de meristeme cu scopul devirozrii plantelor se folosesc ndeosebi meristemele
din vrful de cretere al tulpinilor, i anume din mugurii floriferi sau foliari, iar la cartof din ochii de
pe tubercul tocmai pornii n vegetaie.
Mugurele este constituit dintr-un ax principal n apexul cruia se afl meristemul, iar prin
diviziunea continu a meristemului se formeaz primordiile foliare (Fig.17). Formarea meristemelor i
mai apoi organogeneza, adic formarea organelor plantei, sunt procese ce au loc sub influena
fitohormonilor, de aceea meristemele excizate sunt plasate pe medii cu o balan hormonal adecvat.
Observaiile ce au condus la dezvoltarea culturii de meristeme au fost fcute de White, care a
notat c rdcini de tomate infectate cu virus, genereaz n unele cazuri rdcini fr virus. Studii mai
amnunite au fost fcute de Limaset i Cornuet (1949), care au observat c din plante de tutun
infectate cu virus, explantele prelevate prezentau o infecie de intensitate sczut, sau explantele de
dimensiuni mici erau chiar libere de virusuri.
Aceste cercetri au demonstrat c intensitatea infeciei crete dinspre prile juvenile ale
plantei spre cele mature (de exemplu: frunzele aflate n apropierea mugurilor apicali conin cu pn la
150 de ori mai puin virus dect cele aflate la mijlocul plantei).
Aceste cercetri au permis emiterea teoriei conform creia multiplicarea virusurilor a fost
limitat la nivelul sub-meristematic, meristemul fiind liber de virusuri. Morel i Martin au fost primii
care au reuit s regenereze noi plantule din meristeme inoculate pe medii artificiale. Plantele
regenerate au fcut parte din genul Dahlia i erau infectate cu virusul ptrii inelare i virusul
mozaicului. Meristemele cultivate au generat lstari tineri dintre care unii s-au dovedit a fi liberi de
virusuri. Acest prim succes a fost urmat de altele i a deschis calea utilizrii acestei tehnici de cultur
in vitro n horticultur.
Motivul pentru care meristemele sunt libere de virusuri nu este elucidat n ntregime
presupunndu-se c datorit ritmului alert de multiplicare a celulelor la acest nivel genereaz o
anumit imunitate sau poate c n lupta pentru metabolii dat ntre celule i virusuri primele au mai
mult succes. A doua presupunere este verificat prin rezultatele obinute n urma aplicrii
termoterapiei, deoarece temperaturile ridicate avantajeaz multiplicarea celulelor vegetale i reduce
viteza de multiplicare a virusurilor. De fapt, studiile au artat c n unele cazuri de infecie cu anumite
virusuri rezultate notabile s-au obinut doar dup combinarea celor dou metode: cultura de meristeme
cu termoterapia.
Aceast tehnic este aplicat doar la speciile ce permit nmulirea vegetativ i favorizeaz
diseminarea virusurilor. La speciile ce se nmulesc generativ, riscul transmiterii prin intermediul
seminei este foarte limitat, de aceea regenerarea prin cultura de meristem este puin interesant.
Dup alegerea plantei donor se trece la prelevarea vrfurilor de cretere din care, n condiii
sterile, va fi izolat meristemul. n funcie de vrful de cretere se va proceda la sterilizarea materialului
vegetal nainte de izolarea meristemelor. De exemplu, colii tuberculilor sau vrfurile de cretere ale
Saintpaulia sau Gerbera, trebuie sterilizate nainte de prelevarea meristemelor, pe cnd mugurii de
vi de vie, vrfurile vegetative ale garoafelor, crizantemelor sau anghinrii nu necesit sterilizare,
doar schimbarea instrumentarului, cu unul sterilizat, dup fiecare operaiune. Explantele se sterilizeaz
conform metodologiei prezentate anterior i pstrate pn la fasonare i inoculare n ultima ap
distilat steril destinat cltirii. Excizia poate fi fcut la hota cu flux de aer steril sau mai simplu pe
o mas dezinfectat n prealabil. Un binocular este indispensabil efecturii acestor operaiuni,
magnitudinea optim putnd fi de 20 sau 40x. Frunzele tinere sunt nlturate de pe explant prin tiere,
urmnd ca foliolele rudimentare s fie nlturate prin smulgere, iar meristemul izolat cu ajutorul unui
vrf de ac de sering sau cu un bisturiu cu vrf foarte fin. Instrumentarul se schimb foarte des, dup
fiecare operaiune, i se nlocuiete cu unul sterilizat prin flambare. Cnd meristemul este vizibil
(domul meristematic cu o pereche de primordii foliare constituie n general meristemul primar i are o
culoare galben-verzuie transparent) se nltur cu foarte mare grij i ultimele foliole i prin patru
seciuni perpendiculare se izoleaz meristemul. Ultima seciune transversal izoleaz meristemul,
tierea trebuie fcut imediat sub inelul central. Meristemul (0,2-0,3 mm) este preluat pe o lam, ac de
sering sau bisturiu cu lamela foarte fin i inoculat la suprafaa mediului de cultur solid.
Toate operaiunile prezentate anterior trebuie fcute ntr-un timp ct mai scurt pentru a evita
deshidratarea i pentru a limita riscurile contaminrii.
n ce privete substratul nutritiv utilizat, n general, acesta trebuie s fie suficient de bogat n
elemente minerale, n special n potasiu, concentraia cruia trebuie s fie mare ntr-un mediu destinat
micropropagrii. Din acest punct de vedere mediul Murashige-Skoog este optim.
Coninutul n zaharuri trebuie s fie ntre 2 i 6%, n funcie de specie. Mai sunt necesare i
alte componente de tipul microelementelor, vitaminelor i cheailor de fier, n concentraii variabile.
Mediul de cultur artificial este solidificat, n general, cu agar (6 pn la 10mg/l), dar poate fi
i lichid, caz n care schimburile dintre mediu i explant sunt mai bune cu condiia asigurrii unei
aerri optime (pentru a se evita asfixierea explantelor), deci a unei agitaii corespunztoare.
Regulatorii de cretere sunt determinani n realizarea cu succes a unei culturi de meristeme. n
general, auxinele sunt indispensabile multiplicrii celulare. Uneori se adaug i citochinine n
concentraii foarte mici, n special sub form de urme. Deseori sunt necesare i giberelinele pentru
determinarea alungirii axului principal, meristemele aparinnd grupului de explante de tip organizat.
Vasele optime culturii de meristeme sunt cutiile Petri, deoarece volumul de aer de deasupra
meristemelor trebuie s fie mic pentru a evita deshidratarea acestora.
224
propagate vegetativ. De asemenea, aceast metod permite rejuvenilizarea unei specii, ducnd la
obinerea de descendeni viguroi.
Se presupune c fenomenul de rejuvenilizare este datorat tipului de explant (civa milimetri
de esut) care n urma exciziei pierde o parte din memoria citoplasmatic construit de-a lungul
existenei esuturilor parentale.
Trebuie subliniat faptul c dei aceast tehnic permite eliminarea virusurilor din esuturi i obinerea
de plante sntoase, plantele obinute nu sunt imune, rmnnd susceptibile la atacul bolilor i
duntorilor ca i prinii donor. De aceea, este recomandabil s se evite recontaminarea materialului
vegetal obinut, i dac nu este posibil s se rennoiasc cu regularitate materialul semincer.
CAPITOLUL XI
11.1 MICROPROPAGAREA PLANTELOR
11.1.1 Consideraii generale
Spre deosebire de metodele de nmulire clasic, generativ i vegetativ, micropropagarea
plantelor prezint o serie de avantaje, care au impus-o n faa primelor. Aceste avantaje ar putea fi
urmtoarele:
-nmulirea in vitro este mult mai rapid dect cea in vivo, astfel c ntr-un an dintr-un explant
se pot obine peste un milion de exemplare;
-multe specii care nu pot fi nmulite in vivo sau care se nmulesc greu, pot fi nmulite in vitro
n urma parcurgerii unui proces de juvenilizare;
-creterea plantelor nmulite in vitro este mai puternic, fapt datorat juvenilizrii i
devirozrii. Astfel, Cameron i colab. (1986) au observat la cpun, c creterea mai puternic a
explantelor obinute in vitro se datoreaz modificrilor survenite n schimburile gazoase ale acestora;
-este posibil obinerea i nmulirea plantelor libere de virusuri cu toate avantajele care decurg
de aici;
-plantele cultivate in vitro pot fi transportate n condiii de siguran fitosanitar desvrite,
putnd fi schimbate, exportate sau importate;
-pentru iniierea unei culturi in vitro este nevoie de o cantitate redus de material biologic.
Pentru amelioratori acest lucru este foarte important nct se poate realiza o selecie drastic a
materialului biologic i n plus se pot nmulii indivizi deosebii obinui prin hibridri sau mutante
aprute;
-se realizeaz importante economii de teren, spaiu, energie i combustibil;
-ofer posibilitatea controlului total al factorilor de mediu, fapt ce duce la creterea
productivitii i eficienei culturilor i la nlturarea periodicitii produciei determinat de efectul
sezonier. Se poate, de asemenea, planifica producia de plante obinute in vitro n funcie de
necesitile concrete ale pieei;
-nmulirea in vitro permite obinerea plantelor pe rdcini proprii, nlturnd altoirea cu toate
dezavantajele pe care le presupune;
-materialul produs in vitro poate s fie conservat prin diferite metode i folosit n momentul n
care este cerut;
Pentru ameliorarea plantelor, micropropagarea ofer avantaje suplimentare:
-se scurteaz timpul necesar producerii i lansrii unui soi;
-se pot obine i nmulii clone homozigote care s fie folosite pentru obinerea hibrizilor F1;
-prin utilizarea agenilor mutageni n diferite faze i tipuri de culturi in vitro se pot obine i
seleciona mutante valoroase. Procedeul este folosit mai ales la cultura de calus i la regenerarea de
lstari adventivi din mezofil;
-prin cultura explantelor in vitro n condiii extreme se poate realiza selecia la factorii de stres
a genotipurilor noi (ex. selecia la aluminiu);
226
11.1.2.3 Multiplicarea
Faza de multiplicare se ntinde pe mai multe subculturi cu o durat de 3-4 sptmni. n
aceast faz scopul principal este creterea ratei de multiplicare n condiiile meninerii stabilitii
genetice a materialului biologic.
Aceasta se poate realiza, n general, prin creterea cantitii de citochinine din mediu sau prin
realizarea unei balane hormonale favorabile citochininelor.
Numrul de subculturi trebuie s fie limitat, n funcie de specie, i orice prelungire a fazei
respective necesit verificri suplimentare a stabilitii genetice a materialului.
11.1.2.4 nrdcinarea
Faza de nrdcinare sau de pregtire a materialului pentru trecerea in vivo este o faz
important care const n reducerea lstririi axilare, stimularea alungirii lstarilor, inducerea formrii
rdcinilor sau chiar formarea rdcinilor.
Frecvent, n aceast faz se folosesc medii de cultur adiionate cu crbune vegetal, lipsite de
hormoni sau cu concentraii ridicate de auxine. O alt variant const n cultivarea pe un mediu cu o
concentraie ridicat de auxine, o anumit perioad, urmat de cultivarea pe un mediu fr hormoni.
Foarte multe laboratoare opteaz ns pentru realizarea nrdcinrii concomitent cu aclimatizarea
pentru a evita astfel pierderile de timp i reactivi.
11.1.2.5 Aclimatizarea
Este etapa cea mai dificil dintr-un protocol de micropropagare. Lstarii nrdcinai sau cu
primordii de rdcini sunt trecui n amestecuri de pmnt i apoi meninui ntr-un spaiu caracterizat
prin umiditate relativ ridicat i temperatur controlat.
nainte de a fi folosit pentru plantare materialul sditor, att cel de pomi fructiferi i vi-devie, ct i cel de arbori trebuie s petreac cteva luni n cmp (pepiniere) pentru cretere i fortificare.
11.1.3 Cultura de meristeme i apexuri
Meristemele caulinare sunt folosite n mod normal pentru a fi cultivate pe medii aseptice in
vitro.
Datorit totipotenei de care dau dovad meristemele caulinare, ele vor fi capabile s genereze
n final plante ntregi.
n general, se folosesc pentru iniierea de culturi meristematice, meristemele terminale i cele
axilare (laterale). Acestea sunt capabile s genereze in vitro plntue care sunt folosite apoi pentru
nmulirea rapid.
Primele ncercri de cultivare a meristemelor caulinare i radiculare in vitro au fost fcute n
1922 de ctre Kotte la mazre i de ctre Robbins la porumb. Abia n 1946, Ball a reuit s obin
plante din apexuri meristematice de Lupinus albus i Tropaeollum majus. Ulterior, Wetmore i Morel,
citai de Cachia-Cosma (1984), au studiat comportarea meristemelor provenite de la diferite specii, n
diferite condiii de cultur.
Epoca optim pentru prelevarea meristemelor variaz de la caz la caz. De regul se evit
perioadele de laten a organelor, cnd activitatea meristematic este redus.
La garoafe, cel mai mare procent de supravieuire l-au avut meristemele recoltate primvara
sau toamna devreme, pe cnd cele recoltate iarna au nrdcinat mai uor, iar cele recoltate vara au
prezentat cel mai ridicat grad de devirozare.
La cartof, meristemele recoltate primvara i vara formeaz plante care nrdcineaz mai bine
dect cele recoltate n a doua parte a anului.
Prelevarea meristemelor se face dup sterilizarea prealabil a materialului vegetal.
228
229
n tabelele 11.1 i 11.2 sunt prezentate cteva din realizrile obinute prin cultura de meristeme
i apexuri la plantele horticole lemnoase, pomi i arbuti fructiferi, arbori i arbuti ornamentali. Sunt
indicate att mediile de cultur folosite, ct i rezultatul cercetrilor.
11.1.5 Cultura de fragmente uninodale
Metoda const n secionarea lstarilor crescui in vitro n poriuni uninodale urmat de
cultivarea acestora pe un nou mediu de cultur.
Din mugurii axilari vor lua natere noi lstari care dup o anumit perioad de timp vor fi
secionai din nou.
Primele experiene privind cultura de fragmente uninodale, obinerea de lstari i nrdcinarea
acestora au fost efectuate de Galston (1947, 1948) i Gorter (1965) la asparagus.
230
Tabelul 11.1
Denumirea
speciei
Ananas
comosus
Castanea
sativa
Citrus sp.
Cocos
nucifera
Rezultat
Lstari axilari
MS (1962)
Lstar unic
Lstar unic
MS (1962)
Rodriquez (1982 b)
K(h)
Rodriquez (1982 b)
K(h)
Vieitez i Vieitez
(1980 b)
Bouzid (1975) A
lstari
Proliferare
lstari
Lstari axilari
i adventivi
Rizogenez
Lstari
devirozai
Fragaria
Proliferare
lstari
Lstari
30
5,5
30
30
5,5
30
5,5
30
5,8
30
68,4
6,5
30 glucoz
20
1 ANA;
1 KIN
1-2 ANA;
12% CM
2,5 AIA;
0,1 KIN
10% CM
DSouza (1982) BM
Autori
1,8 ANA;
2 AIB; 2 KIN
25% CM
1 AIB
Matheus i Rangan
(1979)
Zepeda i Sagawa (1981)
Rodriquez (1982 c)
0,06 AIB;
1 BAP
0,1 BAP
Rodriquez (1982 c)
Mullin i colab.
(1974) B
White (1954) - sruri
5,75,8
Adams (1972)
Boxus (1974 a)
5,2
5,6
30
22 glucoz
Mullin i colab.
(1974)
4,5
30 glucoz
1 AIA
231
232
Rezultat
Proliferare
lstari
Proliferare
lstari
Calus
Lstari axilari
i adventivi
Proliferare
lstari axilari
Cretere lstari
Lstari axilari
Proliferare
lstari
Lstari axilari
Autori
MS (1962)
5,3
20
1,1 BAP
Lane (1979)
Jones i colab.
(1977)
MS (1962)
5,2
30
30
6,5
1 AIB; 1 BAP;
0,1 GA3
0,3 AIA; 1 KIN;
Mante i Tapper
(1983)
LS (1965)
5,7
30
5-8
2 BAP
5,8
30
0,5 BAP
Donnelly (1982)
5,7
30
Skirvin i Chu
(1978)
Goldy i Lyrene
(1984)
Smagula i Lyrene
(1984)
5,8
30
10
Donnelly i colab.
(1982)
Skirvin i Chu (1978)
5,7
30
10 2IP;
5,7
30
5 2IP
Smagula i Lyrene
(1984)
Ma i colb. (1978)
Tabelul 11.2
Denumirea
speciei
Hedera helix
Lavandula
augustifolia
Pinus
sylvestris
Syringa
vulgaris
Weigela
florida
Rezultat
nrdcinare
(sub lumin
puternic)
nrdcinare
(sub lumin
slab)
Lstari
Calus
nmugurire
Dezvoltare
lstari
4 lstari/expl.
5,8
20
Hackett (1970)
5,8
20
Polito i Alliata
(1981)
Kharta (1974)
5,6
20
5,5
Bornman i Janson
(1980)
Wetmore (1954)
5,65,8
MS (1962)
Autori
Hackett (1970)
20
Quazi (1980)
50,5
6-7
1 ANA; 4 BAP;
10% CM
2,2 BAP; 1-2 2IP
20
10
15% CM
30
6,5
2,25 BAP
Hackett (1970)
Bornman i Janson
(1980)
Wetmore (1954)
Calvert i Stephens
(1986)
233
Pentru realizarea acestei tehnici se pot folosi ca explante iniiale meristeme, vrfuri de lstari
(apexuri), muguri aflai la subsioara bracteelor la unele tipuri de inflorescene, precum i alte organe
capabile s genereze lstari in vitro.
De regul, n mediul de cultur, nu se adaug citochinine care s anuleze efectul dominanei
apicale. Se urmrete de fapt, alungirea lstarilor pentru a obine un numr ct mai mare de noduri.
Iniierea culturii este foarte important. n vederea stabilizrii trebuie realizat juvenilizarea
materialului iniial.
La speciile lemnoase un alt aspect important l reprezint necesitatea ntreruperii dormansului
mugurilor dup inoculare. Acest lucru este posibil prin tratamente cu temperaturi sczute (0-5 oC),
mrirea duratei perioadei de iluminare (16 h), asociat cu temperaturi sczute, urmat apoi de
creterea temperaturii.
Uneori se recomand creterea concentraiei de citochinine i gibereline.
La speciile erbacee, dormansul se poate ntrerupe prin etiolarea materialului.
Rata multiplicrii este direct proporional cu viteza de cretere a lstarilor, respectiv cu
numrul de frunze care se formeaz.
De regul, lstarii formai din apexuri cresc i se alungesc mai rapid dect cei formai din
muguri axilari. De aceea, ei sunt trecui n vase de cultur separate.
Folosirea mediului de cultur n dublu strat (solid i lichid) a avut ca efect accentuarea vitezei
de cretere a lstarilor de gutui BA-29 (Stnic F. i colab., 1996).
De asemenea, folosirea apei structurate, i a unor glico-steroizi naturali (Ecostim) a stimulat
creterea lstarilor de mr (Svulescu Anca i Stnic F., 1996).
La liliac (Syringa vulgaris), stimularea creterii lstarilor este posibil prin folosirea zeatinei
sau a 2IP (Pierik i colab., 1986).
La Araucaria cunninghammii (Mott, 1981), la realizarea regenerrii, pot fi folosii numai
lstari ortotropi. La cafea, n schimb are loc o transformare a lstarilor plagiotropi n ortotropi (Pierik,
1987).
Metoda de fa se folosete cu succes la foarte multe specii (vi-de-vie, pr, trandafir, ieder,
salcie pletoas), (tabelele 11.3 i 11.4).
Dup mai multe cicluri de multiplicare este necesar inducerea nrdcinrii lstarilor obinui.
Acest lucru este realizabil prin folosirea unor tratamente cu auxine combinate sau nu cu incubarea la
ntuneric.
n faza de alungire a rdcinilor, concentraia de auxine trebuie redus.
11.1.6 Cultura de lstari axilari
Aceast metod presupune, spre deosebire de cultura de fragmente uninodale, stimularea
creterii lstarilor axilari prin creterea concentraiei de citochinine, fr stimularea alungirii lstarului
mam.
Creterea concentraiei de citochinine are ca efect eliminarea dominanei apicale a mugurelui.
Acest lucru este posibil i prin eliminarea apexului lstarului iniial.
Principiile acestei metode sunt cunoscute nc din 1925. Ea a fost aplicat pentru prima dat de
ctre Hackett i Anderson (1967) la garoafe, de ctre Adams (1972) i Boxus (1973, 1974) la cpun
i de Pierik (1973, 1974, 1975) i Murashige (1974) la gerbera. Dup descoperirea chinetinei,
eliminarea dominanei apicale a fost posibil prin folosirea acesteia, iar ulterior prin utilizarea altor
citochinine.
Frecvent, aceast metod de micropropagare este folosit n tandem cu cultura de fragmente
uninodale. Astfel, n prima etap dintr-un explant uninodal se obine un lstar, apoi acest lstar este
trecut pe un mediu cu un coninut ridicat n citochinine i este stimulat formarea lstarilor axilari.
Cultura de lstari axilari are o serie de avantaje:
-este simpl;
-rata de multiplicare este relativ ridicat;
-stabilitatea genetic este asigurat;
234
-este unica metod de multiplicare in vitro eficient la plantele care cresc n rozet (ex:
cpun).
Necesarul de citochinine este diferit n funcie de specie. La multe specii s-a observat scderea
necesarului de citochinine odat cu creterea numrului de subculturi datorit acumulrii acestora dar,
mai ales datorit juvenilizrii lstarilor.
Concentraia citochininelor trebuie corelat i cu stadiul de dezvoltare al materialului biologic.
Astfel, materialul juvenil necesit o cantitate mai redus de citochinine n mediul de cultur dect cel
provenit de la plante adulte (Sequoia sempervirens, David, 1982).
Frecvent se recomand s se foloseasc medii cu concentraii sczute de auxine i concentraii
ridicate de citochinine. Raportul citochinine:auxine cel mai recomandat este de 10:1.
Felul citochininelor folosite este i el important. Cele mai multe specii reacioneaz bine la
utilizarea BAP (benzil aminopurin) i mai puin bine la chinetin sau 2-iP.
Tidiazuronul i compuii de substituie ai piridil-fenil-ureei stimuleaz, uneori, mai mult
lstrirea axilar dect citochininele (Read i colab., 1986).
n multe situaii se recomand distrugerea mugurelui apical i asocierea acestei msuri cu
aplicarea citochininelor. Pentru creterea eficienei metodei, citochininele trebuie aplicate dup ce
lstarul s-a alungit.
Creterea concentraiei de citochinine aduce, uneori, formarea calusului, ceea ce trebuie evitat
pentru a reduce probabilitatea apariiei variabilitii somaclonale.
La unele specii (Ananas), formarea lstarilor este uneori stimulat de folosirea mediului de
cultur lichid.
De regul, capacitatea de proliferare scade odat cu creterea numrului de subculturi, acest
fenomen fiind frecvent nsoit i de formarea calusului.
Astfel, la cpun, de exemplu, depirea unui numr de 12 subculturi a avut ca efect apariia
unor modificri fiziologice majore.
Metoda lstririi axilare poate fi folosit att pentru plantele care cresc n rozet ct i pentru
plantele care formeaz lstari normali.
Mrirea concentraiei de citochinine din mediul de cultur, n vederea stimulrii lstririi
axilare, poate avea ca efect apariia fenomenului de tuf, fenomen care poate continua i dup
subcultivarea explantelor pe medii lipsite de citochinine n vederea alungirii sau nrdcinrii.
n prezent, metoda este mult folosit la micropropagarea materialului sditor pomicol, n multe
ri fiind generalizat (Italia, Frana, Anglia).
n tabelele 11.5 i 11.6 sunt prezentate cteva din cercetrile efectuate n micropropagarea prin
lstrire axilar la plantele horticole lemnoase.
11.1.7 Organogeneza adventiv
Organele i esuturile cultivate in vitro n anumite condiii au capacitatea de a diferenia centri
meristematici care ulterior dau natere la lstari sau rdcini, iar uneori la structuri de tip embrioid.
Formarea adventiv a lstarilor i rdcinilor poart denumirea de organogenez. Aceasta
poate fi de dou feluri: direct sau indirect, dup cum organele respective se formeaz direct din
explantele inoculate sau se trece printr-o faz intermediar de calus.
n general, factorii care influeneaz pozitiv organogeneza i formarea lstarilor adventivi sunt
numeroi:
-plantele juvenile au o capacitate organogenetic ridicat; la gimnosperme regenerarea de
lstari adventivi este posibil doar folosind embrioni, puiei tineri sau pri ale acestora (David, 1982);
-zaharurile stimuleaz organogeneza direct cu formarea de lstari;
-giberelinele i acidul abscisic inhib organogeneza;
-lumina stimuleaz, n general, procesul de organogenez.
Exist i o serie de specii care necesit o perioad de ntuneric.
235
Tabelul 11.3
Denumirea
speciei
Acer negundo
Betula
verrucosa
Paulownia
tomentosa
Quercus
robur
Rezultat
Calus
Calus
Muguri axilari
Lstari
Lstari
Salix
babylonica
Salix
madsudana
Lstari
Lstari
adventivi i
axilari
Lstari axilari
Tilia cordata
Vinca minor
236
Proliferare
lstari
5,6
5,8
Chalupa
(1984) WPM
Stapfer i Heuser
(1985)
5,65,8
20
3 ANA;
15%CM
0,05 AIB;
0,6 BAP
0,1 ANA;
1 BAP
0,2-1 BAP
30
30
6,5
20
15
Glucoz
15
Glucoz
20
6,5
0,01 ANA;
0,05 BAP
20
30
0,2-1 BAP;
0,1 ANA sau
AIB
0,018-0,18 ANA
14,4 BAP
Autori
Radojevic i colab.
(1980)
Chalupa
(1981)
Burger i colab.
(1985)
Chalupa
(1981)
Daguin i Letouze
(1986)
Daguin i Letouze
(1986)
Bhojwani
(1980)
Chalupa
(1981)
Stapfer i Heuser
(1985)
Tabelul 11.4
Denumirea
speciei
Rezultat
Actinidia
deliciosa
Armeniaca
vulgaris
Castanea
mollissima
Lstari
nrdcinai
70% lstari
Castanea
sativa
Citrus sp.
Corylus
avellana
Juglans
hindisii x J.
regia
Juglans regia
Olea europea
Proliferare
lstari axilari
Proliferare
lstari axilari
Proliferare
lstari
Proliferare
lstari
Embriogenez
direct
Multiplicare
lstari
Lstari
Proliferare
lstari
Autori
5,5
20
5,2
20
0,1 ANA;
40 Ad;
2 2IP
5,5
20
6,5
0,1 BAP
30
0,1 BAP
5,5
30
1 BAP
5,7
30
10
5,5
30
1 BAP;
100 AdS;
0,1-1 AIB
5,5
30
2
gelrite
0,001 AIB;
1 BAP;
Harada
(1975)
Snir
(1984)
Yang i colab.
(1986)
San Jose i colab.
(1984)
Vieitez i Vieitez
(1980 b)
Navarro i colab.
(1975)
Perez i colab.
(1986)
Driver i Kuniykuhi
(1984)
30
30
0,15 ANA;
0,1 BAP;
0,5 AIB;
0,5 GA3;
Chalupa
(1981)
Rugini i Fontanazza
(1981)
5,8
237
Rezultat
Pyrus
communis
Lstar unic
Lstar unic
Rubus idaeus
Theobroma
cacao
Vaccinium
corymbosum
Vaccinium sp.
238
Proliferare
lstari axilari
Lstari axilari
1-2 lstari/expl.
Lstari axilari
5,8
30
0,45 BAP
5,0
20
6,5
Passey i Jones
(1983)
Cohen i Elliot
(1979)
Lloyd i McCown
(1981) WPM
Smagula i Lyrene
(1984) WPM
5,2
30
0,22 2,4 D
1 BAP;
0,1 GA3
0,2 BAP
5,7
30
5 2IP
5,2
30
5 2IP
5,7
30
5 2IP
Autori
Shen i Mullins
(1984)
Snir
(1981)
Passey i Jones
(1983)
Cohen i Elliot
(1979)
Wolfe i colab.
(1983, 1986)
Smagula i Lyrene
(1984)
Tabelul 11.5
Denumirea
speciei
Rezultat
Plantule
Ananas
comosus
Plantule
Lstari multipli
Lakshni Sita
(1974)
MS (1962)
MS (1962)
Castanea
sativa
Cretere lstari
Proliferare
lstari
Lstar unic
0,5 x MS (1962)
Vieitez i Vieitez
(1980)
MS (1962)
Proliferare
lstari
Cretere lstari
i rdcini
Dezvoltare
lstari
8 lstari/
explant
Lstar unic
LS (1965)
5,2
30
Jones i Vine
(1968)
Jones i Vine
(1968)
LS (1965)
5,65,8
5,65,8
5,2
40
Glucoz
40
Glucoz
29,9
Heinz i Mee
(1979)
Anderson
(1978, 1980)
5,8
40
5,7
30
Ficus carica
Glossularia
redinata
Malus x
domestica
Mussa sp.
Rubus idaeus
Proliferare
lstari
5,8-6
20
30
30
6,5
-
5,5
30
30
5,8
30
1 ANA
1,8 ANA, 2 AIB,
2 KIN
25%CM
1-2 BAP
0,18 ANA, 0,1
BAP, 0,03 GA3
0,5 BAP, 0,1
AIB, 0,1 GA3
Autori
Lakshni Sita
(1974)
Mapes (1973)
Matheus i Rangan
(1979)
Zepeda i Sagawa (1981)
Vieitez i Vieitez
(1980)
Muriithi
(1982)
Pontikis i Melas
(1986)
Jones i Vine
(1968)
Jones i Vine
(1968)
Van Nieuwkirk i colab.
(1986)
Cronauer i Krikorian
(1984)
Anderson
(1979)
239
Tabelul 11.6
Cultura de lstari axilari la arbori i arbuti ornamentali
(dup Stnic, 1999)
Mediu de cultur pH
Zaharoz
Agar
Fitohormoni
(g/l)
(g/l)
(mg/l)
Denumirea
speciei
Rezultat
Clematis sp.
Cotoneaster
dammeri
Crataegus
rachzacantha
Fraxinus
americana
Hydrangea
macrophylla
Lstari multipli
Lstari multipli
LS (1965)
LS (1965)
5,8
30
30
6
7
10 BAP
1 BAP
Lstari multipli
LS (1965)
5,8
30
1 BAP
Lstari multipli
5,2
20
Lichid
5-10 BAP
5,5
20
5,75,8
5,5
20
2
gelrite
7
1,8 BAP
Proliferare
lstari
Plantule
Lloyd i McCown
(1981)
Gamborg
(1968)
Miller i Murashige
(1976)
Kartha (1974)
20
2 2,4D, 4 BAP,
10%CM
Proliferare
lstari
Rumary i Thrope
(1974)
5,9
30
Lavandula
augustifolia
Picea glauca
240
6 lstari/explant
1 BAP
Autori
Kratz i Langhans (1978)
Norton i Boe
(1982)
Norton i Boe
(1982)
Heiman i Preece
(1983)
Bailey i colab.
(1986)
Stoltz (1984)
Quazi (1980)
Rumary i Thrope
(1984)
241
Tabelul 11.7
Denumirea
speciei
Actinidia
deliciosa
Amygdalus
communis
Ananas
comosus
Armeniaca
vulgaris
Castanea
sativa
Cerasus
avium
242
Explant
Fragmente
rdcini
Fragmente
lstari
Fragmente
lstari
Lstari
Lstari
20
1 Z, 40 Ad
Harada (1975)
30
6,5
1Z
5,7
22,5
Hisajima (1982)
Hisajima (1982)
5,5
5,5
30
30
6
6
Lstari
MS (1962)
5,8
30
Calus
Matheus i Rangan
(1981)
0,5 x MS (1962)
30
6,5
0,023 AIB, 2
BAP, 60 AdS
0,0225 BAP
0,0225 BAP,
0,005 AIB
0,1 ANA, 0,7
BAP
5%CM
Kwei i colab.
(1980)
Monette (1986)
Monette (1986)
30
0,5-1 AIB
20
6,5
30
30
Seirlis i colab.
(1979)
Lstari
Fragmente
lstari
Epicotil
Fragmente
lstari
Harada (1975)
5,5
Autori
MS (1962)
Skirvin (1980)
5,7
5,2
Hisajima (1982)
Hisajima (1982)
Ruginii i Verma
(1982,1983)
Matheus i Rangan
(1981)
Zepeda i Sagawa
(1981)
Skirvin (1980)
Citrus sp.
Corylus
avellana
Diospyros
kaki
Fragaria
Glossularia
redinata
Juglans regia
Explant
Fragmente
lstari
Lstari
Fragmente
rdcini
Fragmente
lstari (5 cm)
Calus
Calus
Calus
Fragmente
lstari
Fragmente
lstari
Lstari
Semine
5,7
20
6,5
5,7
30
6,5
30 -40
10
5 BAP, 80 AdS
20
8-10
1 KIN, 2 Ad
20
8-10
5,65,8
5,6
30
30
5,5
30
30
30
1 KIN, 2 Ad,
1GA3
1 ANA, 0,1-1
KIN
0,2-1 AIB, 1,1
BAP, 1 GA3
0,1 AIB, 0,49
BAP
0,1-0,3 ANA,
0,1-0,6 BAP
9 BAP
5,65,8
Chalupa (1981)
0,5 x Rodriguez
(1982)
5,5
Autori
Skirvin i colab.
(1980)
Skirvin i colab.
(1981)
Murashige i colab.
(1972)
Kitto i Young
(1981)
Radojevic
(1975)
Radojevic
(1975)
Yokoyama i Takeuchi
(1976)
Anderson i colab.
(1982)
Walender (1985)
Chalupa (1981)
Rodriguez
(1982)
243
Malus x
domestica
Morus alba
Musa
acuminata
244
Explant
Fragmente
lstari
Cotiledon
Calus
Calus din
cotiledon
Calus din
embrion
Lstari
5,2
30
Jones (1977)
5,2
30
Lstari
LS (1965)
5,2
29,9
Kartha (1974)
Kartha (1974)
White (1943)
5,8
5,8
30
30
20
8
8
6,5
20
6,5
Muguri
dorminzi/lstar
Fragmente
lstari
Fragmente
lstari
Muguri
Lstari
Zimmerman
(1984)
Lakshmi-Sita
(1976)
Lakshmi-Sita
(1976)
MS (1962)
Krikorian i Cronauer
(1984)
20
5,6
30
1 BAP
5,6
30
10 BAP
5,6
5,8
30
40
8
-
10 BAP
4,95 BAP, 10%CM
White (1943)
Autori
Jones (1977)
Liu i colab. (1983)
Liu i colab. (1983)
Mehra i Sachdeva
(1979)
Mehra i Sachdeva
(1979)
Snir i Erez
(1980)
Van Nieuwkirk
i colab.(1986)
Zimmerman
(1984)
Oka i Ohyama
(1981)
Oka i Ohyama
(1981)
Oka i Ohyama (1981)
Krikorian i Cronauer
(1985)
Denumirea
speciei
Explant
Musa
cavendishii
Calus
MS (1962)
Lstari
Lstari
Musa spp.
Musa textilis
Persica
vulgaris
Phoenix
dactylifera
30
6,5
5,8
40
5 BAP
Mante i Tepper
(1983)
Miller (1982)
Skirvin i Chu (1978)
LS (1965)
5,7
30
5-8
5,7
5,7
20
30
30
8
6,5
8
Thompson i Gordon
(1977)
Tisserat (1984)
30
30
0,5 x MS (1962)
5,65,8
5,65,8
5,8
Lstari
MS (1962)
5,8
4 BAP
5-8 mm lstari
MS (1962)
30
4 BAP
Lstari
Lstari
Fragmente
lstari
Calus
Fragmente
lstari
Semine
Pistacia vera
10 2,4D
Autori
Ma i colab.
(1978)
Cronauer i Krikorian
(1984)
Mante i Tepper
(1983)
Miller (1982)
Skirvin i Chu (1978)
Tisserat i colab.
(1979)
Tisserat i colab.
(1982)
Tisserat i colab.
(1984)
Barghchi i Alderson
(1983)
Barghchi i Alderson
(1983)
Barghchi i Alderson
(1985)
245
Ribes nigrum
Explant
Fragmente
lstari
Fragmente
lstari
Fragmente
lstari
Fragmente
lstari
Fragmente
lstari
Fragmente
lstari
Fragmente
lstari
Fragmente
lstari
Lstari
Lstari
Pietropaolo i Reisch
(1984)
Skirvin (1980)
5,8
30
1,1 BAP
5,7
20
6,5
Nu sunt menionai
Pietropaolo i Reisch
(1984)
Skirvin (1980)
Jones (1977)
5,2
30
Lane (1979)
5,2
30
Jones i Hopgood
(1979)
Lane (1979)
MS (1962)
5,8
30
LS (1965)
5,75,8
5,7
30
Shen i Mullins
(1984)
Singha (1982)
20
1,35 BAP
5,65,8
5,7
5
40
Glucoz
30
20
Flegmann i
Wainwright (1981)
Jones i Vine (1968)
6,5
Gelrite
Donnely (1980)
Snir (1981)
Lstari cu
noduri
Welander
(1985)
5,2
30
MS (1962)
Jones i Vine (1968)
Donnely (1980)
Snir (1981)
Rubus idaeus
246
Autori
Welander
(1985)
Tabelul 11.8
Denumirea
speciei
Explant
Acer rubrum x
Acer saccharum
Fragmente
lstari
Calus
Calus
Betula pendula
Betula verucosa
Biota orientalis
(thuja)
Chaenomeles
japonica
Crataegus
rachyacantha
Fraxinus
americana
Frunze
Fragmente
lstari
Calus
Hipocotil
Fragmente
lstari
Fragmente
lstari
Fragmente
lstari
Autori
MS (1962)
5,7
30
10
0,1-0,5 Thidiazuron
Simola (1985)
Srivastava i
Steinhauer (1981)
Srivastava (1985)
Srivastava (1985)
5,6
5,8
20
40
6
6
5,8
5,8
30
30
6,5
6,5
Simola (1985)
Srivastava i
Steinhauer (1981)
Srivastava (1985)
Srivastava (1985)
30
Thomas i Tranvan
(1982)
LS (1965)
5,4
30
2 AIA; 5 Z; 2 GA3
0,5 ANA; 5 2 iP; 30
Ad
0,05 AIB; 0,2 BAP;
20 AdS
0,1 AIB; 1,1 BAP
5,8
30
2,5 BAP
LS (1965)
5,8
30
0,1-1 BAP
Lloyd i McCown
(1981)
5,2
20
0,5 1 BAP
Chalupa (1981)
Chalupa (1981)
Thomas i Tranvan
(1982)
Norton i Boe
(1982)
Norton i Norton
(1986)
Heiman i Preece
(1983)
247
249
Tabelul 11.9
Denumirea
speciei
Actinidia
deliciosa
Mangifera
indica
Pheonix
dactylifera
Autori
Harada (1975)
5,5
20
Harada (1975)
Litz (1984)
5,7
30
Litz (1984)
5,7
60
1 2,4D
Litz (1984)
LS (1965)
5,7
30
Tisserat (1979)
Thompson i Gordon
(1977)
Tisserat (1984)
5,65,8
5,65,8
30
10 2,4D; 3 2iP; 40
AdS
10 2,4D; 3 2iP
30
Litz (1984)
Tisserat (1982)
Tisserat (1984)
Tabelul 11.10
Denumirea
speciei
Hedera helix
Ilex aquifolium
Larix decidua
Picea abies
Quercus rubra
250
Embrioni
maturi
Internod
Banks (1979)
LS (1965)
Nagmani i Bogna
(1985)
Von Arnold i Erikson
(1981)
Von Arnold i Erikson
(1981)
MS (1962)
Autori
5,7
5,6
5,8
30
40
20
5
10
8
Banks (1979)
Hu i Sussex (1972)
Nagmani i Bogna (1985)
5,8
34,2
10
3
gelrite
6,5
30
251
culturilor de embrioni este relativ uoar datorit faptului c smburii sau seminele protejate
de endocarp sau tegumente pot fi sterilizate la concentraii ridicate.
Compoziia mediului de cultur este cu att mai complex cu ct embrionii se afl
ntr-un stadiu de dezvoltare mai timpuriu.
Dup inoculare, embrionii se las la ntuneric timp de 30-60 zile la temperatura
camerei pentru germinare, dup care sunt trecui la lumin.
11.1.11 Microaltoirea in vitro
Const n altoirea n condiii aseptice a unui apex meristematic pe un portaltoi obinut
din semine sau din minibutai.
Portaltoii folosii trebuie s ndeplineasc urmtoarele condiii:
-s posede semine cu o bun capacitate germinativ pe mediile de cultur;
-minibutaul s aib esuturi elastice i turgescente;
-minipuietul s posede cambiu activ, uor depistabil;
-esuturile s fie rezistente la oxidare;
-s posede un aparat radicular bine format, capabil s creasc n mediul de cultur.
Portaltoiul poate fi obinut din semine. n acest sens seminele sunt scoase din starea
de laten fie prin tratamente cu fitohormoni (citochinine i gibereline), sau prin tratamente cu
temperaturi sczute. Se nltur apoi endocarpul, iar apoi se determin viabilitatea seminelor
prin imersie timp de cteva ore, a unor probe de semine ntr-o soluie de clorur de 2,3,5
trifenil-tetrazoliu, 1%. Viabilitatea seminelor este evideniat prin culoarea esuturilor
seminelor n culoare rou intens.
Materialul este apoi sterilizat prin imersie n alcool 70% cca 1 min., urmat de imersia
n hipoclorit de sodiu 7% timp de 20 minute, iar n final se cltesc seminele n cinci reprize
cu ap distilat steril.
Germinarea seminelor se face pe mediu Murashige-Skoog solidificat cu 7 g/l agar.
Incubarea se face la 22-24oC, la ntuneric.
Portaltoii se pot obine i din minibutai, care, sub form de fragmente uninodale se
preleveaz de pe plante libere de viroze.
Pregtirea altoiului. Altoiul const dintr-un apex meristematic provenit fie din lstari
crescui in vitro, fie de la lstari sau ramuri in vivo.
Altoirea propriu-zis se face prin nlturarea cotiledoanelor de la portaltoii obinui din
semine care apoi sunt secionai transversal. Se secioneaz de asemenea, transversal
portaltoii vegetativi. Apexul meristematic, de dimensiuni foarte reduse se detaeaz i se
aeaz pe zona cambial a portaltoiului secionat.
Planta altoit se trece apoi ntr-un vas steril, pe mediu lichid pentru a asigura o atmosfer
saturat n umiditate. Aclimatizarea se realizeaz cnd minialtoiul atinge 1,5-2,5 cm lungime,
prin transplantarea plantei altoite n condiii normale (Stnic, 1999).
252
CAPITOLUL XIV
14.1 TRANSFERUL PLANTELOR DE PE MEDIUL DE CULTUR
N SOL ACLIMATIZAREA
O plant provenit din cultura in vitro difer din multe puncte de vedere de una
provenita din mediul in vivo (Fossard, 1977; Grout si Aston, 1978; Grout si Debergh, 1982;
Sutter, 1985) prin urmtoarele aspecte:
1. La plantele crescute n condiii in vitro stratul de cear (cuticular) de la suprafaa
frunzelor i tulpinilor este foarte slab dezvoltat deoarece umiditatea relativ ntr-un vas de
cultura este de 90-100%, iar plantele nu au avut nevoie s se protejeze mpotriva deshidratrii.
Acest fapt are repercusiuni nefaste pentru plantulele transferate direct in vivo, care vor suferi
pierderea unei cantiti mari de apa din esuturi, deoarece umiditatea aerului in vivo este mult
sczut comparativ celei in vitro. Frunzele unei plante regenerate in vitro sunt moi, subiri i
prezint o activitate fotosintetic mult redus, deoarece i pot procura carbonul necesar din
mediul de cultur i anume din zaharurile din mediul de cultur, astfel c, atunci cnd o
plantul regenerat in vitro va fi trecut in vivo va trebui s se readapteze la o activitate
fotosintetic intens. De asemenea, frunzele plantelor provenite din cultura in vitro prezint,
pe lng un numr sczut de celule palisadice, necesare pentru captarea eficient a luminii, i
multe spaii aerifere n mezofil. Stomatele lor nu funcioneaz normal, iar trecerea plantelor
de la mediul in vitro la cel in vivo constituie sursa cea mai important de stres hidric. n
culturile de celule conexiunile vasculare, dintre lstari i rdcinue, sunt slab dezvoltate, ceea
ce duce de asemenea la o slab circulaie a apei dintr-o parte a plantei n alta. Plantele in vitro
au o hrnire heterotrof, pe cnd cele in vivo au o hrnire autotrof, acest fapt constituind un
alt factor de stres pentru plntuele transferate n sol. Ele trebuie s-i dezvolte activitatea
fotosintetic pentru a-i putea procura carbonul necesar.
Din cele de mai sus se poate concluziona c aclimatizarea plantulelor trebuie s fie un
proces lent, care s permit trecerea treptat a plantelor de la condiiile in vitro la cele in vivo,
ceea ce presupune adaptarea la o umiditate relativ sczut, la dezvoltarea mecanismelor de
nchidere i deschidere a stomatelor, la accelerarea procesului fotosintetic. Wardle i colab.
(1983) au demonstrat c scderea umiditii aerului in vitro la Brassica oleracea Botrytis a
dus la formarea unei pelicule de cear mai groas pe stratul cuticular, ceea ce a condus la o
evaporare cuticular mult sczut i la creterea procentului de plante aclimatizate.
Aclimatizarea poate fi fcut prin generarea unei umiditi crescute n mediul in vivo
unde vor fi transferate plantulele provenite din mediul in vitro, prin utilizarea unor aparate
speciale, generatoare de cea, i prin meninerea unei luminoziti i temperaturi relativ
constante i sczute. O alt metod de aclimatizare prevede lsarea vaselor de cultur
deschise, ntr-un mediu steril, pentru a permite aclimatizarea treptat a plantulelor la condiiile
exterioare. De asemenea, mai este posibil folosirea unor substane antiperspirante, care sunt
pulverizate pe frunzele plantulelor transferate n sol, reducnd astfel procesul de evaporare al
apei din esuturi (Sutter i Hutzel, 1985), dei aceast metod poate avea i efecte adverse.
2. Rdcinile plantelor provenite din cultura in vitro sunt mai vulnerabile i nu
funcioneaz foarte bine in vivo, prezentnd foarte puini sau deloc periori absorbani. Aceste
rdcini vor muri n scurt timp fiind nlocuite de altele generate direct n sol. Dezvoltarea
periorilor absorbani in vitro poate fi determinat prin meninerea culturilor, pentru o
perioad de timp, pe mediu lichid. Sistemul radicular slab dezvoltat determin o supravieuire
slab a unei plante n condiiile de mediu natural, in vivo, mai ales n condiiile unei
transpiraii intense. Pentru o plant provenit din cultura in vitro este vital pierderea unei
cantiti ct mai mici de ap din esuturi.
253
3. Plantele care n condiiile mediului lor natural de via triesc n simbioz cu fungi
(micorize) sau bacterii (ex: Leguminosae:Rhizobium) simt lipsa acestei simbioze atunci cnd
sunt transferate n condiii in vitro, dar mai ales dac sunt din nou transferate in vivo. Mai
multe studii au artat c inocularea unor plante in vitro mpreun cu microorganismul
simbiont a determinat o cretere i dezvoltare mai bun a explantelor i o supravieuire
crescut atunci cnd s-a procedat la aclimatizarea acestora.
Dhawan i colab. (1986) au demonstrat c adiia de Rhizobium n timpul aclimatizrii
plantelor de Leucaena a dus la formarea nodulilor la peste 80% dintre plantulele care au
supravieuit transplantrii n sol, iar supravieuirea acestora a avut o rat cu 90% mai mare
fa de cele care nu au nodulat. Morandi i colab. (1979) au raportat c plantele produse in
vitro de Rubus idaeus au crescut mult mai bine dac au fost inoculate cu cteva
microorganisme din specia Glanus mycorrhiza. De asemenea, Struller i colab. (1984) au
raportat c micorizele joac un rol important n micropropagarea plantulelor de plop;
inocularea explantelor mpreun cu micorize din specia Paxillus involutus a determinat o
cretere cu 75% a plantelor comparativ cu cele inoculate fr micorize.
Atunci cnd se iau n considerare problemele asociate cu sistemele radiculare nefuncionale trebuie avut n vedere urmtoarele msuri speciale:
-permiterea formrii rdcinilor in vitro, ce vor putea ulterior fie s se dezvolte n rdcini
subterane proprii, fie mcar s asigure supravieuirea plantulei pn la formarea unor rdcini
subterane proprii;
-permiterea dezvoltrii in vitro a rdcinilor, atunci cnd e posibil, prin meninerea culturilor,
o perioad de timp, cu rdcinile n mediul lichid, acestea fiind apoi capabile s preia toate
funciile unei rdcini normale, atunci cnd va fi transferat n sol;
-transferarea ntregii faze de nrdcinare n mediu in vivo. nrdcinarea n sol nu este
realizabil la toate speciile de cultur, dar poate fi stimulat prin nmuierea bazei lstarilor n
soluie de auxin. Totui pentru multe specii faza de nrdcinare este bine s aib loc in vitro
mai ales pentru speciile care nu nrdcineaz uor nici n condiii normale de cultur, cu ar fi
speciile ierboase.
Atunci cnd se recurge la aclimatizarea unor plntue obinute prin tehnicile de
regenerare in vitro, trebuie s se in seama de urmtoarele:
1.Pentru a evita infeciile cu fungi sau bacterii:
-agarul de pe rdcinuele explantelor (ce conine zaharuri) trebuie ndeprtat prin splarea
acestora cu ap cldu;
-solul sau substratul solid, n care vor fi trecute plntuele regenerate in vitro, trebuie s fie
sterilizat prin meninerea la temperaturi ridicate (n etuv la 180oC pentru 3 ore) sau prin
iradiere cu radiaii gama.
2.Asigurarea unor condiii ct mai sigure de via, prin executarea tratamentelor de
combatere a insectelor, bacteriilor, fungilor, melcilor (limax), determin o rat mai mare de
supravieuire a plantelor transferate in vivo, care sunt destul de sensibile.
3.Pentru a se evita rnirea rdcinuelor se recomand folosirea, pentru nceput, a unui
sol uor.
4.Pentru a mbunti aclimatizarea plantulelor la condiiile in vivo, nrdcinarea este
bine a avea loc pe medii de cultur srace n sruri minerale (MS concentrat la jumtate sau
KNOP).
5.Uneori este necesar un tratament cu temperaturi sczute (4-8 sptmni la 5oC) in
vitro sau imediat dup transferul in vivo, pentru a scoate plantulele din perioada de laten.
Acest procedeu este necesar mai ales plantelor cu bulbi, arbutilor i plantelor lemnoase, dar
i cerealelor care necesit o perioad de vernalizare pentru a putea produce semine.
254
6.Plantele care formeaz protocorm (cormofitele) sau bulbi, trebuie transferate n sol
n aceast form (protocorm, bulbi), ceea ce va crete ansele de aclimatizare i supravieuire
ale acestora.
7.Transferarea lstarilor generai in vitro pe un mediu fr zaharuri i mbogirea
mediului nconjurtor cu CO2 poate duce la o aclimatizare mai uoar a plantelor (Langford i
Wainwright, 1986).
Mai jos sunt prezentate pe scurt ultimele descoperiri n domeniu:
1.n unitile comerciale, transferul plantelor pentru aclimatizare se face direct n
straturi acoperite cu folie de plastic, ceea ce ajut la meninerea umiditii (uneori se folosesc
i pulverizatoare de ap n acest scop), iar luminozitatea i temperatura trebuie s fie relativ
sczute.
2.Lstarii obinui in vitro la unele specii (Gerbera i Rhododendron) sunt transferai
direct pe un substrat artificial, care va permite nrdcinarea acestora. Laboratoarele Twyford
au confecionat un tip de ldie de plastic prevzute cu 400 de orificii, care vor fi umplute cu
substrat pentru nrdcinare. Acestea vor permite scurgerea surplusului de apa i susinerea
optim a lstarilor. nrdcinarea lstarilor n ldiele perforate va avea loc ntr-o ncpere
semisteril, climatizat, n care umiditatea aerului este meninut ridicat. Imediat ce
nrdcinarea este suficient i lstarii ncep s creasc, butaii sunt transferai din ldiele
perforate direct n ser.
Speciile lemnoase sunt n prezent nrdcinate mai mult in vivo dect in vitro,
deoarece astfel se economisete mai mult timp i bani. La specii ca Rhododendron, Kalmia,
Amelanchier, Betula, Vaccinium, Syringa vulgaris (Zimmerman, 1985) i n general la toate
speciile lemnoase, care sunt propagate comercial, se aplic acest tip de nrdcinare.
3.Compania Milcop din Frana a produs un substrat artificial pentru nrdcinare, pe
baz de polypropilen, autoclavabil, stabil biologic, inert chimic, permind o aerare bun.
Acest substrat este disponibil sub form de fulgi, fiind potrivit pentru nrdcinarea in vitro.
Pentru o nrdcinare direct, in vivo, exist blocuri (cuburi) mici, din acelai material, n care
lstarii pot fi plasai cu uurin.
Pe baza celor prezentate mai sus, se poate presupune c, n viitorul apropiat, vor
aprea pe pia tot mai multe tipuri de substraturi artificiale, ce vor face aclimatizarea
plantulelor mult mai eficient i mai uoar, dect a fost n trecut. Trecerea direct a butailor
in vivo este important, pentru c va duce la eliminarea fazei de nrdcinare in vitro, care este
relativ costisitoare i necesit o perioada de timp suplimentar, ceea ce crete perioada dintre
doua generaii de plantule, fapt nedorit de companiile comerciale productoare de material
semincer. Astfel micropropagarea va deveni o tehnic uzual i mai la ndemn, necesitnd
doar camere de cretere special amenajate pentru aclimatizarea i nrdcinarea butailor
direct pe substraturile artificiale.
255