Sunteți pe pagina 1din 91

1.

1 CULTURILE IN VITRO: DEFINIIE, CARACTERIZARE I


APLICABILITATE
1.1.1 Definiie
n sens general, prin cultura in vitro se nelege creterea pe medii artificiale, n condiii de
asepsie deplin i de factori ambientali bine controlai, a unor organe, pri de organe, esuturi sau
celule vegetale. Reuita culturii depinde de o multitudine de factori i este vizibil n momentul n
care explantul crete.
Explantul, numit i inocul, este poriunea de plant (organ, esut, celul) care se desprinde de
pe planta donor (planta mam), i se inoculeaz n condiii sterile pe un mediu artificial de cultur.
Evoluia explantului este dirijat de operator n funcie de scopul urmrit. Acesta poate evolua
formnd o nou plant (sau mai multe plante - neoplantule), prin stimularea dezvoltrii organelor
aeriene (tulpina i frunzele) i a rdcinii, sau poate forma calus, prin stimularea nmulirii
nedifereniate a celulelor.
Explantul constituie unitatea vie ce conine n celule ntreaga informaie genetic a plantei
mam i pe baza totipotenei este capabil de a regenera una sau mai multe plante identice cu planta
donor.
Totipotena, este nsuirea celulelor vegetale de a se divide, de a se reproduce i de a forma o
plant identic cu planta mam. Teoretic fiecare celul vie este totipotent, ns n practic s-a
observat c nu toate celulele au capacitatea de a-i exprima acest caracter, datorit pe de o parte
diferenierii celulare i mbtrnirii, iar pe de alt parte gradului mare de specializare al acelor celule.
Astfel, s-a demonstrat practic c, ntr-o plant matur, celulele specializate care constituie
esuturile, de exemplu: traheidele, fibrele libero-lemnoase, sclereidele, etc, la care lipsete citoplasma
i nucleul, nu sunt totipotente. Acest aspect este explicat chiar prin faptul c ntreaga informaie
genetic a celulei totipotente se afl n cromozomii din nucleu.
La plantele cormofite, odat cu naintarea n vrst, o parte din celule i pierd capacitatea de
totipoten sau aceasta se reduce foarte mult. Rmn, ns, anumite zone n care activitatea celulelor
este intens, avnd loc diviziunea i formarea aproape continu de noi celule. Aceste celule sunt mici
n dimensiuni, poligonale, bogate n citoplasm, au vacuol mic i nucleu mare dispus central i
prezint o membran celulozic, formnd esutul cu denumirea de meristem.
Meristemele sunt zonele generatoare de celule necesare creterii n lungime i grosime a
plantelor, fiind dispuse terminal att n tulpin ct i n rdcini.
1.1.2 Caracteristicile culturilor in vitro
Spre deosebire de multiplicarea tradiional, unde se opereaz cu semine sau poriuni mari de
plant (marcote, butai, altoi), la multiplicarea in vitro se folosesc explante mici, de ordinul
milimetrilor sau chiar microscopice (celule, protoplati), explante care n condiii normale de cultur
nu ar reui s creasc opunnd rezisten agenilor patogeni i sintetizndu-i singure substanele
nutritive necesare.
Din acest motiv, pentru reuita culturii de celule i esuturi se cer respectate urmtoarele
condiii:
-prepararea unui mediu de cretere care s asigure o bun nutriie heterotrof a explantului, prin
asigurarea sursei de carbon organic uor accesibil explantelor;
-asigurarea i controlarea factorilor de mediu (temperatur, lumin, umiditate) n limitele optime
pentru fiecare specie, soi i faz de cretere, n funcie de cerinele acestora i scopul urmrit;
-stimularea creterii i diferenierii sau dediferenierii organelor prin utilizarea corespunztoare a
substanelor stimulatoare de cretere;
-asigurarea unei asepsii depline pe tot fluxul de producere a plantelor in vitro, prin dezinfecia
materialului vegetal, sterilizarea mediului i a vaselor de cultur, precum i efectuarea tuturor
operaiilor n hota cu flux de aer laminar steril, folosind instrumentar sterilizat prin flambare.
165

1.1.3 Domenii de aplicare a culturilor in vitro


Datorit spectrului larg de probleme la care culturile in vitro au rspuns afirmativ, sunt
utilizate n prezent n agricultur, silvicultur, farmacie, industria alimentar, industria uoar, etc. n
agricultur, n general i n horticultur n special, culturile de esuturi i celule sunt folosite pentru
multiplicarea unor specii, soiuri sau clone valoroase, pentru ameliorarea speciilor cultivate, pentru
conservarea germoplasmei horticole, pentru obinerea de metabolii secundari.
Avantajele culturii in vitro sunt multiple, dintre care amintim:
-asigur multiplicarea clonal rapid a unor soiuri, hibrizi sau clone valoroase pornind de la
cantiti mici de material vegetal. Teoretic, se asigur o multiplicare exponenial, prin care n circa 6
luni se pot obine 1 milion de plante;
-se poate produce material sditor liber de viroze i micoplasme, material mai viguros, precoce
i productiv;
-necesit spaii mici de cultur i se valorific bine spaiul din laborator prin cultura pe
vertical pe 3-5 nivele suprapuse;
-obinerea de plante haploide, prin cultura de polen, antere sau alte explante de esuturi
generative (cu n cromozomi);
-d posibilitatea obinerii hibrizilor interspecifici prin fecundarea in vitro, hibrizi care n
condiii normale sunt imposibil de obinut;
-selecia de plante rezistente la stres, boli i duntori;
-se evit efectul sezonier de pepinier;
-se pot obine semine artificiale;
-se pot obine plante pe rdcini proprii evitnd astfel cheltuielile de altoire;
-asigur multiplicarea clonal a portaltoilor care nu nrdcineaz n condiii normale de
cultur;
-asigur pstrarea materialului n faza de plantul pn la primirea unor comenzi ferme de
multiplicare.
Cu toate aceste avantaje, exist specii care nu rspund bine la cultura in vitro i care,
deocamdat rmn s fie nmulite tradiional.
Exist ns i cteva impedimente n utilizarea acestei metode pentru nmulirea n mas a
plantelor, cum ar fi:
-necesitatea unui laborator cu dotrile minime: instalaii i aparate indispensabile activitilor
de micropropagare, care sunt costisitoare;
-necesitatea unui personal specializat n multiplicarea clonal i manipularea in vitro;
-utilizarea fitohormonilor, care sunt scumpi i puin accesibili tuturor unitilor de producie;
-nu se poate controla caracterul recalcitrant al unor specii sau soiuri, care nu rspund la
metodele cunoscute de multiplicare;
-exist riscul apariiei i multiplicrii mutaiilor recesive, cu afectarea autenticitii soiurilor;
-riscul apariiei germenilor genetici prin multiplicarea solitar numai a unor tipuri care se
comport bine la acest tip de cultur, cu riscul srcirii bazei de germoplasm pentru unele specii.

1.2 PROCESE MORFOFIZIOLOGICE LA NIVELUL EXPLANTELOR


CULTIVATE IN VITRO
Explantele inoculate pe medii aseptice i vor relua activitatea metabolic, se vor integra noilor
condiii de via, i vor reamorsa procesele fiziologice vitale i vor ncepe un nou ciclu de via. n
dependen de mediul de cultur, de natura inoculilor, de seria de operaiuni prin care au trecut
prealabil ultimei inoculri, de condiiile de cultur i de scopul urmrit, dup dediferenierea celulelor
i regenerarea de noi celule, evoluia acestora poate fi dirijat. Inoculii pot fi meninui ntr-o stare
primar de organizare cum ar fi: culturi de celule n suspensie (fr a intervenii formarea de agregate
celulare) sau de calus, ori pot fi induse procese de citodifereniere, de morfogenez sau organogenez.
166

1.2.1 Diferenierea
Celulele meristematice, divizndu-se continuu, dau natere la noi i noi celule care, treptat,
cresc i sufer o specializare morfofiziologic ce poart numele de difereniere.
n procesul de difereniere se pierd caracterele citologice i fiziologice de tip embrionar
specifice celulelor meristematice, evolundu-se spre caliti proprii specializrii funcionale a
diferitelor tipuri de esuturi sau organe n alctuirea crora celulele mature vor intra. n primele faze
de difereniere se remarc o modificare ultrastructural i funcional a celulelor, fenomen denumit
citodifereniere.
Pe msura diferenierii, volumul celulei crete, scade raportul nucleoplasmatic, citoplasma
devine pelicular i parietal, se extinde vacuomul care mpinge citoplasma i nucleul la periferia
celulei.
Plastidomul este constituit din cloroplaste, cromoplaste sau amiloplaste, n funcie de rolul
ndeplinit de celule.
Odat cu avansarea proceselor de difereniere peretele celular poate suferi modificri
secundare de genul depunerilor de celuloz, lignin, mineralizare, gelificare sau chiar lichefiere, care
conduc treptat la o ngreunare a comunicrii intercelulare, intervenind cu timpul un declin fiziologic
sau chiar moartea celulelor (de exemplu la sclerenchim).
Celulele odat difereniate nu se mai divid. Celulele care compun un esut sau organ nu posed
acelai ritm de cretere i se afl sub un permanent endocontrol fitohormonal.
Substanele elaborate de celule pot difuza nspre celulele nvecinate exercitnd un anumit rol
n dezvoltarea acestora fenomen denumit inducie, i care st la baza interrelaiilor dintre esuturi, ce
servesc la organizarea acestora n formaiuni funcionale, respectiv la organogenez.
Dup difereniere i generarea de noi celule se ajunge la situaia n care celulele neoformate
tind s se reorganizeze structural i funcional suferind o citodifereiere, histodifereniere, cu
organizarea de esuturi (histogenez), de organe (organogenez) i n final regenerarea unei noi plante.
Diferenierea celular in vitro nu este foarte variat, unele funcii sunt reduse sau simplificate n timp
ce altele sunt amplificate.
1.2.2 Dediferenierea celular
Dediferenierea const n transformarea progresiv a celulelor din starea de celul specializat
n celul meristematic, rectignd aptitudinea de a se divide.
Dediferenierea natural a celulelor poate fi observat n organele care se ramific sau n cazul
traumatizrii organelor i al generrii, la locul rnirii, de calus. Procesul de dedifereniere este
complex i se instaleaz n momentul n care celulele primesc un impuls inductiv, de obicei
fitohormonal, impuls ce declaneaz transformri la nivel molecular.
n cadrul unui esut nu toate celulele dedifereniaz, puine celule devin centrii generatori de
noi i noi celule suficiente pentru a asigura ndeplinirea fenomenelor de restituie. n caz de
traumatism organele din esuturile lezate beneficiaz de acumularea unor substane cu rol esenial n
inducerea i stimularea proceselor de dedifereniere.
Deci, fitohormonii, condiiile de cultur, natura esuturilor implicate, starea lor fiziologic i
vrsta plantelor donatoare constituie factori ce intervin n procesele de regenerare.
Aptitudinea celulelor de a se dediferenia este foarte inegal rspndit n corpul plantelor i
chiar i n cadrul subunitilor structurale, morfofuncionale, care alctuiesc un organism, existnd
diferene mari n ceea ce privete capacitatea de a se dediferenia, la celule aparinnd aceluiai organ
sau chiar esut.
Celulele explantelor inoculate pe medii aseptice, pentru a putea s-i reorganizeze un mod de
via, trebuie sa sufere un proces de conversie din celule definitivate structural i funcional n celule
meristematice, apte de multiplicare.
Aptitudinea celulelor explantelor inoculate in vitro de a se dediferenia este foarte inegal
rspndit la specii, organe i esuturi variate.
167

Fazele de dedifereniere celular pot fi caracterizate astfel:


1.prima faza de dedifereniere:
-amorsarea proceselor de dedifereniere;
-producerea dediferenierii celulelor pn la dobndirea caracteristicilor citologice specifice
unui esut meristematic de tip secundar, cu celule aplatizate asemntoare ca aspect i structur cu
cambiul.
2.a doua faz de dedifereniere:
- dediferenierea n continuare a celulelor pn la stadiul de celule cu caracter de meristem
primar;
-generarea, din meristemele neoformate, de promeristeme sau meristemoizi (centre
organogene), ori de embrioni somatici, iar din acestea regenerarea de plante;
-generarea, prin proliferarea celulelor dedifereniate, a unui calus neorganizat, structurat
omogen. La nivelul acestui esut calusal se pot apoi forma meristemoizi sau centri embriogeni.
1.2.3 Regenerarea
Regenerarea este capacitatea organismelor vii de a-i reface oricare parte le-a fost distrus.
Prin intermediul tehnicilor de cultivare in vitro a organelor, esuturilor sau celulelor vegetale se
exploateaz la maxim capacitatea regenerativ a celulelor explantelor, respectiv se pune n valoare
manifestarea integral a totipotenialitii celulare. Teoretic, toate celulele vii ale plantelor sunt
totipotente. Din celule somatice sau obinut plante diploide, iar din celule generative, prin
androgenez i ginogenez, sau regenerat plante haploide.
Ca i n cazul dediferenierii celulare, se poate spune c i n regenerare exist o mare
variabilitate n ceea ce privete reactivitatea celular, capacitatea regenerativ este manifestat sau nu
de ctre o celul vegetal sau de un grup de celule n funcie de numeroi factori endogeni i exogeni.
Factorii endogeni ce joac un rol esenial n regenerare sunt: vrsta celulelor, gradul de difereniere,
capacitatea de a se dediferenia, coninutul n hormoni, natura balanei hormonale i echipamentul
enzimatic. Factorii exogeni implicai n regenerare sunt:traumele i natura acestora (stresul datorat
introducerii unui explant n cultura in vitro), precum i condiiile de mediu.
Totipotena este deinut de ctre fiecare celul a plantelor dar exprimarea sa aparine numai
anumitor tipuri de celule numite meristemoizi. Acestea sunt celule competente morfogenetic n a
rspunde la variai stimuli i care, n condiii specifice, pot da natere la tulpini, rdcini sau embrioni.
Numrul celulelor dintr-o populaie cultivat in vitro care-i exprim potenialul organogen
sau embriogen se afl sub controlul mai multor factori.
Specia. Exist specii la care regenerarea are loc n special prin organogenez i specii care
regenereaz prin embriogenez, dar i specii care pot regenera att lstari ct i embrioni in vitro.
Genotipul. S-a constatat c nu toate soiurile aparinnd unei specii cultivate au potenial
regenerativ. Astfel, s-au evideniat genotipuri culturabile, ce au permis o regenerare uoar din orice
tip de esut, dar i genotipuri recalcitrante, la care stabilirea unui protocol de regenerare s-a fcut cu
mare dificultate i cu rezultate slabe.
Natura explantului. La unele specii (lucerna) toate tipurile de explante genereaz calus
regenerativ. La altele ns obinerea plantelor in vitro este condiionat de utilizarea anumitor
explante, de exemplu la graminee numai embrionii imaturi, inflorescenele foarte tinere i microsporii
genereaz calusuri regenerative.
Vrsta explantelor. Calusurile iniiate din esuturi tinere regenereaz mult mai bine dect cele
provenite din explante mature. n embriogeneza somatic direct, exprimarea totipotenei depinde de
stadiul de dezvoltare al explantelor. Sunt capabile sa parcurg embriogeneza direct celulele
embrionare, celulele epidermei hipocotilului, celulele nucelei i sinergidele.
Ali factori care influeneaz regenerarea sunt: starea fiziologic a plantei donor, compoziia
mediului de cultur, vrsta culturii, temperatura, fotoperioada, intensitatea i calitatea luminii, stresul
(biotic sau abiotic).

168

1.2.4 Morfogeneza in vitro


ntruct la culturile in vitro morfogeneza prezint aspecte particulare, specifice acestui tip de
cultur, vom adopta termenul de morfogenez n sens larg iar n acest context, vom descrie procesele
de morfogenez sesizabile la nivelul explantelor cultivate in vitro, respectiv organogeneza i
embriogeneza.
Bibliografia existent pn n prezent subliniaz dependena capacitii morfogenetice de
natura explantelor; pe de alt parte sunt numeroase referiri bibliografice care evideniaz relaia care
exist ntre genotip i competena morfogenetic a explantelor cultivate in vitro. Vasil (1984) a
considerat ca factor decisiv n meninerea capacitii morfogenetice, starea fiziologic i de dezvoltare
a explantului. Deci, adeseori, stadiul de dezvoltare al plantei donatoare condiioneaz regenerarea i
reacia explantului , altfel spus un rspuns morfogenetic corespunztor a fost obinut numai atunci
cnd explantul a prezentat un anumit stadiu de dezvoltare. Folosirea unor explante mai tinere sau mai
avansate n dezvoltare, fa de cel optim, adeseori s-a soldat cu formarea unui calus nemorfogen.
Morfogeneza la culturile in vitro este influenat, n mare msur de anumii factori:
-coninutul endogen n fitohormoni i aportul exogen de regulatori de cretere;
-srurile minerale prezente n mediul de cultur (mai ales natura sursei de azot);
-natura i concentraia glucidului din mediul de cultur;
-prezena n substrat a unor compui organici, n special al unor aminoacizi;
-prezena, natura i concentraia gazelor (O2, CO2, C2H4) dizolvate n mediu sau existente n
atmosfera din recipientele de cultur;
-prezena n substrat a unor extracte complexe, de origine biologic, sau a crbunelui activ;
-factorii fizici (lumina, temperatura).
Deci lumina, temperatura, potenialul osmotic al mediului, starea fizic a acestuia, tipul vaselor
de cultur sunt factori care pot influena n sens negativ morfogeneza.
Nu se cunoate nc dac morfogeneza este influenat i n ce msur, de substanele
introduse iniial n mediul de cultur sau de ctre complexul ionic, format n substrat, ca o consecin
a autoclavrii, sau n ce msur schimbrile intervenite n compoziia mediului, sub aciunea
inoculilor, afecteaz morfogeneza.
1.2.4.1 Organogeneza in vitro
Organogeneza in vitro este un proces foarte complex care depinde care depinde de o serie
ntreag de fenomene biologice, aflate n antecedena momentului explantrii esuturilor. Pn n
momentul explantrii esuturilor, celulele viitorului explant au parcurs, mpreun cu sistemul crora le
aparineau, anumite trepte ale ciclului vital, trepte n care diferitele cerine fiziologice au fost
satisfcute, mai mult sau mai puin. Dintre aceste cerine amintim raportul endogen n fitohormoni i
coninutul endocelular n nutrieni, ambele fiind dependente de iluminarea plantelor, de temperatura
mediului ambiant, de aprovizionarea cu sruri minerale. De modul n care au fost asigurate aceste
cerine, prealabile explantrii, vor depinde, n mare msur, reacia explantelor, capacitatea
regenerativ i mai ales organogeneza la nivelul inoculilor, derivai din acestea. Aspectele menionate
au fost foarte clar relevate, mai ales n cazul studiilor de embriogenez somatic i de nrdcinare a
tulpinilor recalcitrante n a genera rdcini adventive. De exemplu, pentru inducerea nrdcinrii
tulpinilor de Sequoia sempervirens sau a altor plante lemnoase, se impune un pretratament, de scurt
durat, a lor cu soluie nutritiv, coninnd 100 mg/l AIB. Cu toate acestea, nici o tulpin nu a
nrdcinat dac tulpinile au fost pstrate, pe o durat lung de timp, n acest mediu; rdcinie s-au
difereniat i au crescut numai dup ce explantele caulinare au fost scoase i reinoculate pe un alt
mediu, lipsit de auxin (Teixeira, 1981).
Din cele prezentate, s-a putut reine faptul c factorul endogen este dominant n obinerea unei
anumite reacii i c pe lng operarea unei modificri n condiiile de incubare ale inoculilor, alegerea
explantului constituie factorul determinant n evoluia acestora in vitro, n procesele de morfogenez.

169

A.Rizogeneza in vitro
Un anumit fragment explantat se comport, n linii mari, ca un minibuta. El difer de un buta
normal, ntruct cel clasic deine bogate rezerve endogene, are muguri i eventual frunze. Mugurii i
frunzele pot i dup desprinderea fragmentului de planta mam s sintetizeze anumii compui
hormonali.
Explantul ns, din cauza dimensiunilor sale reduse i a detarii sale, nu mai beneficiaz de
susineri pe care s le primeasc de la muguri sau de la frunze i rmne n totalitate dependent de
mediul de cultur. n acest caz factorul genetic, mrimea explantului vrsta plantei mam, starea
fiziologic a celulelor pe care le deine, sunt tot atia factori care concur la evoluia ulterioar a
inoculului.
Uneori, ns, in vitro, se produce o pierdere a capacitii rizogene, mai ales ca urmare a
practicrii unor repicri (subculturi) succesive. Se pune problema pstrrii sau a redobndirii
capacitii rizogene. Factorii care condiioneaz meninerea acesteia i mai ales, cei care cauzeaz
pierderea aptitudinii rizogene sunt n mic msur cunoscui.
Lumina poate exercita un efect pozitiv asupra rizogenezei dar numai la o intensitate slab sau
n urma unei perioade scurte de aciune (600 luci mai puin de o or/zi). Temperatura optim pentru
rizogenez este aceea de 26 oC. Uneori, ns, se recomand practicarea unei alternane ntre o
temperatur sczut (5-15 oC) i ridicat, n prezena luminii, a auxinei i a unui mediu bogat n
glucide.
n cele mai multe cazuri, formarea rdcinilor este localizat polar. Rdcinile se formeaz la
polul radicular al explantului, n timp ce generarea mugurilor este localizat la polul foliar. Aportul de
auxin, n concentraie ridicat, poate perturba polaritatea. n concentraii optime auxina stimuleaz
rizogeneza.
B.Caulogeneza in vitro
Formarea de mugurai in vitro, denumit i caulogenez, respectiv formarea de centri
vegetativi, este esenial atunci cnd se urmrete, de exemplu, multiplicarea sau reconstituirea unei
noi plante ori a unui genotip, generat prin hibridare somatic. Inducerea caulogenezei, a formrii de
mugurai i tulpinie, la nivelul inoculilor cultivai in vitro, este stimulat de prezena n mediul de
cultur a citochininelor, adeseori, n condiiile asocierii acestora cu auxinele. De asemenea trebuie
menionat i faptul ca formarea de mugurai la nivelul calusului se afl sub controlul interaciunii
celor dou categorii de fitohormoni. Reuita formrii mugurailor presupune nu doar prezena celor
dou tipuri de fitohormoni, ci i a realizrii unui anumit raport al crui eficien este variabil n
funcie de specie, de proveniena i natura inoculului. Se poate spune deci, c nu este important doar
raportul fitohormonal, ci i natura i concentraia compuilor utilizai ca regulatori de cretere. Uneori,
se poate declana caulogeneza reducnd concentraia de auxin. Alteori, cel mai mare numr de
mugurai este atins atunci cnd se folosesc concentraii relativ ridicate de citochinin. Dar nu exist
reguli general valabile. Adeseori fiecare experien reprezint un caz aparte, iar reacia explantelor, la
balana hormonal din substrat, variaz mult, n dependen de tipul materialului vegetal.
La calus, n inducerea caulogenezei, se obin, uneori, rezultate pozitive prin cultivarea
succesiv a acestuia, ntr-o prim etap, pe un mediu fie cu o concentraie foarte ridicat de 2,4D, fie
n prezena unei auxine mai slabe ca eficien, dar administrat n concentraie mare, asociat eventual
cu o citochinin, n concentraie moderat. Acest calus subcultivat pe un mediu cu aport sczut n
auxin i cu un coninut ridicat n citochinin, ar putea conduce cu succes la declanarea procesului de
nmugurire.
Factorii externi (lumina, temperatura, calitile fizice ale mediului) sunt controversai n ceea
ce privete efectele lor asupra caulogenezei. Aciunea acestora depinde foarte mult de tipul inoculilor
i de etapele parcurse anterior.
Cu toate c numeroase specii necesit o anumit fotoperioad pentru inducie floral, n
general se apreciaz c formarea de mugurai este independent de fotoperioad.
170

Temperatura recomandabil pentru desfurarea optim a proceselor de caulogenez este aceea


de 25 oC.
Folosirea alternativ a mediilor lichide i a celor solide poate exercita un efect benefic asupra
producerii proceselor de morfogenez. Astfel, la orhidee, se cunoate c meninerea protocormilor n
stare submers favorizeaz multiplicarea acestora, dar este inhibat organogeneza. Trecerea
protocormilor din mediu lichid pe mediu agarizat declaneaz organogeneza. Dac dup o perioad de
meninere a protocormilor pe mediu agarizat (cteva sptmni) se submerseaz protocormii, prin
acoperirea lor cu soluie nutritiv diluat, sau cu ap distilat steril, se reuete o stimulare a
proceselor de organogenez (Cachi, 1983).
La monocotiledonate capacitatea caulogen este mai moderat. Aptitudinea cerealelor de a
forma muguri in vitro este foarte variabil. Adeseori aceast capacitate, la nivelul calusului, se pierde
n timp, pe msura practicrii unor subcultivri succesive (mai ales la gru).
1.2.4.2 Embriogeneza somatic
Procesul de formare a embrionului, respectiv succesiunea fazelor de multiplicare celular i de
histogenez finalizate cu formarea unui embrion se numete embriogenez. Indiferent de tipul
embriogenezei, punctul de plecare n formarea viitoarei plante este o unic celul.
Embriogeneza somatic este fenomenul prin care din celule somatice iau natere embrioni.
Aadar dintr-o celul a sporofitului, pe cale sexuat se pot genera embrioni care se aseamn foarte
mult cu embrionii zigotici. Embrionii somatici sunt, deci, un rezultat al multiplicrii repetate a unei
celule somatice i nu a unei celule a gametofitului sau a celulelor generative.
Embriogeneza somatic in vitro a fost semnalat la morcov de ctre Steward i colab. (1958) i
de ctre Reinert (1958, 1959). n inducerea embriogenezei somatice un rol important l-a avut
adugarea n mediul de cultur a laptelui din nuc de cocos datorit citochininelor naturale, aflate din
abunden n acest produs natural.
Prin dezvoltarea tehnicilor de embriogenez somatic s-a reuit o cotitur n cercetrile de
embriologie experimental. Astfel, s-a putut stabili:
-capacitatea embriogen este coninut n fiecare celul, aparent banal i c aceast aptitudine
nu este numai un apanaj al zigotului rezultat din fecundare;
-embrionul n formare are un anumit grad de autonomie i nu este strict dependent de prezena
unui anumit mediu constituit din albumen, aa cum este cazul la embrionul zigotic;
-att embrionul zigotic, ct i cel somatic trec prin faze morfologice identice, tipice cunoscute
n embriogeneza clasic i anume: celula generatoare d natere la un masiv celular care, treptat sufer
o succesiune de transformri denumite arbitrar stadiul globular, stadiul cordiform, stadiul de torpil
sau torpedo.
n embriogeneza somatic prin izolarea i detaarea explantelor se realizeaz eliberarea
celulelor din intercorelaiile fiziologice n care se aflau integrate, prealabil desprinderii lor din corpul
plantei, moment n care se rup nu numai legturile trofice i fitohormonale avute, ci se sisteaz i
eventuala prezen a factorilor inhibitori endogeni care prin represie biochimic controlau i blocau
dezvoltarea haotic a celulelor unui organism.
1.2.5 Habituaia sau anergismul
Habituaia sau anergismul este un fenomen fiziologic care se refer la totalitatea schimbrilor
ereditare survenite spontan, la un moment dat, n raport cu cerinele de aprovizionare a celulelor
cultivate pe medii aseptice; acestea privesc lipsa de reacie, de rspuns, a materialului biologic, la
anumii fitoefectori, regulatori de cretere sau vitamine, prezeni n mediul de cultur.
Habituaia nu se refer numai la reacia inoculilor n raport cu fitohormonii exogeni, ci privete
o gam mai larg de probleme, unele dintre ele nencadrate nc n aceast categorie de manifestri
fiziologice. Astfel, explantul detaat, lipsit de punctul vegetativ (dominana apical), trece prin
transformri particulare, specifice noii stri fiziologice. Celulele sale, devenind autonome, pot
prezenta un comportament deosebit (Gautheret, 1980).
171

Mecanismul habituaiei este nc necunoscut. Se tie doar c, exist anumii factori de mediu
care favorizeaz instalarea acestor fenomene. Dintre ei amintim: auxinele (mai ales 2,4D) i
temperaturile ridicate.
1.2.6 Vitrificarea sau sticlozitatea
Fenomenul de vitrificare sau sticlozitate este un proces de transparentizare a frunzelor i
tulpinilor i a fost semnalat la culturile de salat n ser (Gautheret, 1980). Se apreciaz c, n cazul
acestui fenomen, n anumite condiii (cum ar fi exces de umiditate), organele aeriene ale plantelor
devin translucide ca o consecin a infiltrrii apei n spaiile intercelulare, nlocuindu-se aerul din ele.
n condiii aseptice, plante vitroase pot s apar brusc. Ele sufer transformri
morfofiziologice, frunzele lor recurbndu-se, devenind translucide, sticloase, rugoase, uneori ondulate
i casante, prezentnd o cretere malformat, hipertrofiat. Aspectul general este degenerat.
Studiile amnunite asupra structurii frunzei au artat c frunza nu are celulele difereniate n
cele dou esuturi, palisadic i lacunar. Meristemele lstarilor vitrificai sunt mai mici dect la cei
normali. Celulele sunt mult hidratate i conin clorofil mai puin.
S-a constatat c prin adugarea crbunelui vegetal n mediul de cultur se elimin sau se reduce foarte
mult procesul de vitrificare. De asemenea ridicarea concentraiei de agar la 1-1,1% reduce vitrificarea
(Orlikowska, 1985). Concentraii mai mari de 0,8% de agar duc ns la scderea ratei de multiplicare
i de aceea este foarte dificil de mbinat cele dou aspecte.

CAPITOLUL II
2.1 FENOMENE FIZIOLOGICE CORELATE CU REALIZAREA UNEI
CULTURI IN VITRO
Tehnicile de cultur in vitro folosite n cercetare sau pentru producerea de plante, pornesc de la
aceeai premiz: posibilitatea de a controla ntr-un mod optim factorii de mediu (temperatur, lumin,
compoziia mediului de cultur, pH, umiditate) necesari fragmentului de plant inoculat n condiii
artificiale de mediu, n ncercarea de a analiza funciile sale fiziologice sau de a-l conduce ntr-o
anumit direcie, cum ar fi formarea de noi lstari (micropropagarea).
Tehnicile de cultur in vitro, pe lng aspectul tehnologic, ne permit rezolvarea unui numr de
probleme:
-meninerea unui explant viabil i activ din punct de vedere vegetativ;
-permiterea creterii normale a unui explant reprezentat de o structur organizat (meristem,
vrf de cretere sau mugure);
-inducerea proceselor de difereniere n cazul unor fragmente de calus pentru formarea de
organe sau embrioni somatici;
-inducerea proceselor de dedifereniere, n cazul unor explante formate din celule difereniate
(fragmente de tulpin, frunz, peiol, rdcin, etc.) rezultnd o nou organizare tisular;
-inducerea proceselor de diviziune celular, valabil tuturor cazurilor amintite mai sus.
Aceste probleme au fost parial rezolvate odat cu identificarea regulatorilor de cretere
endogeni de tipul auxinelor (primul grup de fitohormoni recunoscut), giberelinelor, citochininelor,
pentru a numi doar cele trei clase principale de regulatori de cretere. Aceste substane par a determina
orientarea dezvoltrii celulelor n cultura artificial, fapt pentru care li se acord prima atenie atunci
cnd se ncearc explicarea unor fenomene fiziologice.
2.1.1 Regulatorii de cretere
Existena hormonilor vegetali a fost bnuit nc de la nceputul secolului trecut. Numeroase
lucrri tiinifice privitoare la aceste subiect au evideniat prezena lor, dar nu le-au putut identifica
172

dect mult mai trziu. Primii fitohormoni descoperii au fcut parte din clasa auxinelor, n jurul anului
1934, giberelinele i citochininele fiind descoperite mai trziu, n anii 50. Aceste trei tipuri de
regulatori de cretere exercit o aciune stimulativ asupra metabolismului celular. Exist i substane
cu efecte inhibitoare asupra creterii i dezvoltrii celulelor vegetale cum ar fi acidul abscisic,
identificat n anul 1965 i substanele fenolice identificate civa ani mai trziu. De asemenea, etilena,
un compus gazos, a fost recunoscut ca regulator de cretere atunci cnd metodele de msurare a
acesteia au permis detectarea sa n organele plantelor. Etilena poate avea fie efect stimulator, fie efect
inhibitor asupra plantelor.
Aceste substane sunt endogene, ceea ce nseamn c sunt sintetizate de plante. Exist i
fitoregulatori de cretere artificiali cu formule chimice asemntoare celor naturali, prezentnd o
aciune fiziologic similar. Toate aceste substane, sintetice sau naturale, sunt numite regulatori de
cretere i au anumite caracteristice comune:
-acioneaz ntr-o concentraie foarte mic, n concentraie mare sunt toxice, de aceea unele
dintre ele sunt folosite ca erbicide;
-acioneaz numai n interaciune cu ali fitoregulatori, funcia lor fiind determinat de balana
hormonal stabilit ntre ei;
-intervin ntr-un numr de fenomene fiziologice ce implic mai multe moduri de aciune astfel
nct noiunea de hormon (cu un efect rizogenic sau caulogenic specific) a fost abandonat.
O diferen substanial ntre fitoregulatorii de cretere artificiali i cei naturali const n
faptul c cei endogeni pot fi controlai de mecanismele metabolice ale celulelor fiind eliminai
suficient de repede, pe cnd cei artificiali persist mult mai mult fiind deseori preferai aplicaiilor
practice.
2.1.1.1 Auxinele
Auxinele au fost descoperite n urma unor experimente asupra coleoptilului la Gramineae.
Numele de auxine provine din grecescul auxein a crete, determinnd elongarea celulelor (auxesis
cretere ce se refer n special la mrimea celulei dect la numrul de celule).
Este un compus ce are la baz nucleul indolic cu formula de baz C10H9O2N cunoscut sub
numele de acid - indolil acetic (Fig.1).

Fig.1 Acidul - indolil acetic


A. Proprietile fiziologice ale auxinelor
Auxinele intervin n multe fenomene fiziologice, iar aciunile lor depind de concentraiilor i de
interaciunile cu ali regulatori de cretere. Studiind cteva din efectele lor s-a putut concluziona c:
-exercit o aciune clar asupra elongrii celulare, aceste efect urmeaz creterii plasticitii
peretelui celular i penetrrii apei n celul. Apoi rezistena peretelui scade i celula crete n lungime;
-modific permeabilitatea membranei plasmatice, ceea ce duce la o descrcare de ioni de H+,
determinnd o cretere a aciditii responsabil de diminuarea rezistenei peretelui celular i o
absorbie de ioni de K+;
-influeneaz n general metabolismul celular i n particular sinteza ARN-ului ribozomal
(ribozomii particip la sinteza proteinelor);
173

-stimuleaz diviziunea celulelor cu origine cambial (acest tip de aciune a determinat insuccesele
din primele ncercri de iniierea a culturilor in vitro); Acest efect este descris ca histogenic deoarece
conduce la formarea unui numr de celule asemntoare, numite calus;
-acioneaz asupra sintezei etilenei ntr-o anumit concentraie, etilena intervine n schimb n
reglarea nivelului de auxin cel puin la nivelul vaselor conductoare;
-acioneaz asupra tropismului plantelor i asupra corelaiei dintre organe, n particular asupra
fenomenelor de dominan apical;
-determin ntrzierea cderii frunzelor i a fructelor;
-au aciune rizogenic fiind folosite n special n micropropagarea speciilor ornamentale destinate
comerului de flori tiate;
Aceste efecte numeroase nu pot rezulta doar din aciunea singular a auxinei deoarece
concentraia optim este diferit pentru fiecare tip de aciune n parte i se schimb n funcie de
concentraia celorlali fitoregulatori.
Modul de aciune al auxinelor. Nu se poate da un rspuns precis, dar cercetrile n domeniu au
evideniat existena unor receptori fie membranari, fie citoplasmatici specifici auxinei. Pe baza acestei
ipoteze au rezultat urmtoarele concluzii:
-n funcie de prezena sau absena unuia sau a celuilalt receptor apar diferene de reacie n
concordan cu originea celulei ce reacioneaz la acest fitohormon;
-n funcie de afinitatea receptorului pentru auxin unii sunt angrenai mai repede dect alii.
Au fost descoperii receptori i pentru alte tipuri de fitoregulatori de cretere, de aici se poate
extinde ideea existenei de receptori pentru toate tipurile de regulatori endogeni.
B. Auxinele n plante
Toate plantele sintetizeaz auxine, sintez modulat de stadiul de dezvoltare ale acestora. Sinteza
auxinelor are loc la nivelul frunzelor tinere, a mugurilor i n florile i fructele tinere.
Auxinele circul de la vrful spre baza organelor cu o polaritate puternic pronunat n organele
tinere, dar n cursul transportului lor sunt descompuse de auxin-oxidaze, ceea ce nseamn c auxinele
sunt n concentraie mai mare n apropierea situsurilor de sintez. Astfel, auxinele sunt prezente ntr-o
concentraie suficient n vrful plantelor n cretere, n mugurii florali sau foliari, pentru a asigura
multiplicarea i elongarea celulelor.
C. Auxinele sintetice
De cnd au fost identificate auxinele, s-au sintetizat compui chimici similari acestora, care au
generat n celulele vegetale efecte similare auxinelor endogene, ceea ce confirm existena
receptorilor pentru auxine. Mai mult, fiind influenai mai puin de activitatea auxin-enzimelor , vor
putea avea un efect prelungit n plante.
Printre numeroasele substane folosite, cele mai importante sunt:
-acidul.indolil butiric (AIB);
-acidul naftalen acetic (ANA Fig.2) i derivaii si: acidul naftooxiacetic (ANOA) i
naftilacetilamida (NAD);
-acidul 2,4 diclorfenoxiacetic (2,4 D).

174

Fig.2 Acidul naftalen -acetic


n practic, auxinele endogene pot fi folosite, fiind mai puin toxice dar i mai puin eficiente
deoarece activitatea acestora este rapid inhibat de aciunea auxin-oxidazelor. De aceea produsele
sintetice le-au luat locul chiar dac implic un risc mai mare de toxicitate.
n aplicaiile agricole, compuii auxinici sunt folosii pentru cicatrizarea rnilor rezultate n
urma tierilor anuale din pomicultur, n evidenierea fructelor partenocarpice sau pentru ntrzierea
cderii frunzelor sau a fructelor pn la recoltare, ca urmare a efectului invers exercitat de acidul
abscisic.
i n domeniul culturilor in vitro se folosesc aceleai substane urmrindu-se n principal
efectele rizogenice i de multiplicare a celulelor pe care acestea le genereaz.
2.1.1.2 Giberelinele
Asemeni auxinelor, efectul giberelinelor a fost evideniat nainte ca acestea s fie identificate.
Primele observaii (1926) au fost fcute pe plante de orez atacate de o ciuperc (Giberella fujikuroi)
care prezentau internoduri mult elongate i frunze clorotice. Extractul apos din ciuperc a provocat
simptome similare la plantele testate, ceea ce a condus la ideea existenei unei substane responsabile
de aceste efecte.
Prima giberelin identificat a fost acidul giberelic sau GA3 (un complex izolat n 1939 i
numit giberelina A). Aceast prim descoperire a fost urmat de descoperirea altor gibereline pn
cnd n plante i n ciuperci au fost identificate n total aproximativ cincizeci de gibereline. Acetia
sunt toi compui endogeni. n practic, giberelinele folosite sunt extracte purificate.
Cea mai folosit giberelin este GA3 (Fig.3) i mai puin folosite sunt amestecul GA4+GA7 sau
GA7. Este posibil ca n urmtorii ani s fie folosite gibereline sintetice, avnd n vedere c primele
gibereline sintetice au fost obinute prin anii 80.

Fig.3 Acidul giberelic


Toi aceti compui au un nucleu similar (nucleul giberelic) diferind doar prin calitate i
poziia substituenilor n nucleu.

175

A. Proprietile fiziologice ale giberelinelor


Proprietile fiziologice ce urmeaz a fi descrise corespund acidului giberelic (GA3). Nu toate
giberelinele au activitate similar, unele sunt inactive sau doar forme intermediare, ceea ce le face
dificil de studiat, iar mai mult, nu toate plantele posed aceleai gibereline.
Principalele proprieti ale acidului giberelic sunt:
-acioneaz asupra elongrii internodurilor, uneori determinnd rezultate spectaculoase (ex: sau obinut plante de varz cu tulpina de 3 m), dar nu asupra tuturor speciilor. Doar unele dintre
varietile pitice ale unor specii pot atinge talii normale n urma aplicrii de GA3, n general varietile
pitice nu reacioneaz la efectul de elongare al acidului giberelic. Acidul giberelic acioneaz i asupra
pedunculilor florali, mpiedic maturizarea timpurie (cu 15 pn la 20 de zile la Cyclamen) sau
alungirea inflorescenelor prea dezvoltate (ex: la viele de vie cu ciorchini deni, acidul giberelic a
inhibat dezvoltarea racemelor laxe);
-n cultura in vitro giberelinele acioneaz i la nivelul meristemelor, care, n absena acestora,
prezint un aspect globular;
-stimuleaz metabolismul celular deoarece favorizeaz sinteza enzimelor hidrolitice. S-a
dovedit c la seminele de orz, acumularea -amilazei, o enzim cu rol n transformarea amidonului n
zaharuri solubile, este datorat acidului giberelic, care acioneaz direct sau dup asocierea cu un
receptor. Giberelinele acioneaz, de asemenea, n prezena auxinelor, i sunt deseori stimulate de
sinteza sau inhibarea sintezei auxin-oxidazelor;
-acioneaz asupra nfloririi, avnd ca efect fie inhibarea inducerii florale, cum ar fi cazul
pomilor fructiferi, sau stimuleaz nflorirea speciilor ce necesit temperaturi sczute pentru a nflori,
astfel nct n prezena giberelinelor aceste specii nfloresc i fr temperaturi sczute (morcov). La
alte specii, ce necesit de asemenea temperaturi sczute pentru nflorire, prezena giberelinelor induce
doar alungirea tulpinii fr formarea florilor (sfecl). Aceste contradicii n aparen au o explicaie
simpl: n plantele prezentate mai sus frigul acioneaz doar asupra creterii tulpinii, pe cnd n
cellalt caz asupra procesului de nflorire. Astfel, giberelinele, i exercit doar rolul de stimulatori ai
elongaiei neinfluennd, n acest caz, procesele fiziologice normale;
-acioneaz asupra formrii fructelor partenocarpice la pr, mandarin, prun;
-exercit o aciune complex asupra germinrii seminelor sau pornirii n vegetaie a mugurilor
dorminzi, atunci cnd condiiile climaterice (temperaturi sczute) nu permit acest lucru, inducnd i
ramificarea sau creterea ramurilor la Hydrangea;
-n organogenez, aciunea giberelinelor poate fi antagonic. Par a se opune fenomenului de
dedifereniere, neputnd fi folosite in vitro n acest scop, acionnd ns asupra meristemelor apicale
sau axilare i asupra butonilor florali, prin stimularea creterii i dezvoltrii acestora.
B. Giberelinele n plante
Giberelinele au fost descoperite att n plante ct i n ciuperci cu o distribuie inegal. Unele
gibereline se pot ntlni doar n plante, altele doar n ciuperci i unele n ambele grupe (acizii
giberelici 1,3,4,7,9). Unele plante posed doar un fel de gibereline, n alte specii se afl i acioneaz
mai multe tipuri de gibereline.
Locurile de sintez a giberelinelor se afl la nivelul frunzelor foarte tinere, n mugurii foliari i
florali, n lstarii activi, n vrful rdcinilor i n embrioni.
Giberelinele circul liber prin plant fr existena unei polariti fiind asociate deseori
zaharurilor, eliberndu-se n situsurile int.
2.1.1.3 Citochininele
Citochininele au fost descoperite n timpul studiilor efectuate asupra esuturilor vegetale
cultivate in vitro. S-a descoperit i acum este bine cunoscut faptul c adiia de lapte de nuc de cocos
n mediile artificiale de cultur are un efect favorabil asupra multiplicrii celulare i n lstrire.
Cercetrile ce au ncercat s descopere factorul responsabil de aceste efecte au dus la izolarea unui
176

complex chimic activ de natur purinic, care nu a putut fi iniial identificat. Aceste rezultate au dat
posibilitatea continurii cercetrilor asupra purinelor i n 1956, Skoog a izolat, din ARN denaturat, o
substan activ numit chinetina.
Citochininele sunt nlocuitori ai adeninelor la care sunt cunoscui doi compui endogeni:
-zeatina (Fig.4)
-izopenteniladenina, a crei compui sintetici sunt: chinetina (Kin Fig.4) (6furfurilaminopurina) i benziladenina (BAP) (6-benzilaminopurina).

a)
b)
Fig.4 Citochinine: a) zeatina, b) kinetina
Se mai folosesc i ali nlocuitori ai adeninelor, sintetici, liberi sau n asociere cu zaharuri.
A. Proprietile fiziologice ale citochininelor
Citochininele sunt foarte active n plante i asemeni celorlalte dou clase de fitohormoni
prezentate anterior au o serie de proprieti dintre care:
-au un efect foarte clar asupra diviziunii celulare. n acest proces citochininele sunt
indispensabile, dar ineficiente fr aciunea auxinelor, cele dou complementndu-se reciproc.
Auxinele favorizeaz duplicarea ADN, iar citochininele permit separarea cromozomilor;
-au un rol la fel de important n organogenez stimulnd formarea lstarilor, fiind ns
antagonice rizogenezei;
-exercit un efect de stimulare a metabolismului celular, favoriznd sinteza proteinelor, prin
rolul ce-l joac n compoziia ARN-ului de transfer i protejnd metaboliii de aciunea enzimelor
hidrolitice. Acest efect determin ntrzierea senescenei pn la punctul n care frunzele mature
tratate cu citochinine se comport asemntor celor tinere din punct de vedere metabolic;
-exercit un efect antagonic asupra dominanei apicale stimulnd lstrirea axilar;
Citochininele prezint o importan deosebit n domeniul culturii in vitro deoarece au permis
obinerea unor progrese importante n micropropagarea plantelor. Proprietile citochininelor permit
rezolvarea dificultilor enumerate mai sus, cum ar fi meninerea viabilitii celulelor vegetale,
stimularea diviziunii celulare, orientarea celulelor spre dedifereniere.
B. Citochininele n plante
Prima citochinin endogen a fost identificat n 1963 n embrioni imaturi de porumb, de unde
i numele de zeatin, urmat de izopentenil adenina (IPA), descoperit puin mai trziu n plante
atacate de bacteria Corynebacterium fasciens. Toate plantele conin citochinine sintetizate n special
n rdcini i n embrioni. Aplicarea citochininelor pe frunze determin atragerea substanelor
nutritive spre aceste zone datorit efectului de stimulare a metabolismului exercitat de citochinine la
acest nivel. Creterea n dimensiuni a tuberculilor i fructelor se datoreaz prezenei citochininelor
endogene localizate n aceste organe.
Citochininele se pot asocia cu zaharurile i circula prin plante fr polaritate. Se presupune ca
ele circul ntr-o form inactiv i c rmn localizate la anumite nivele unde vor fi activate ulterior,
ca n cazul aplicaiilor pe frunze.

177

2.1.1.4 Etilena
Etilena (fig.5) este un compus gazos identificat cu mult timp n urm n ncperile de
depozitare a fructelor sau plantelor, dar funcia sa de regulator de cretere nu a fost evideniat pn n
momentul dezvoltrii tehnicilor de analiz n plante. Etilena se afl n plante n cantiti infime i
poate fi produs de toate prile acesteia.

Fig.5 Etilena
Principalele proprieti ale acestui regulator de cretere sunt:
-determin iniierea procesului de maturare a fructelor, etilena fiind folosit la nceput pentru
coacerea fructelor la lmi, iar acum pentru determinarea coacerii simultane a fructelor la mr i cire;
-accelereaz procesele de cdere a frunzelor i fructelor, fiind folosit atunci cnd se urmrete
recoltarea mecanizat a fructelor la cirei i mslini;
-induce formarea florilor la speciile familiei Bromeliaceae (ananas), o proprietate folosit n
horticultur;
-modific ritmul de cretere prin aciunea pe care o exercit asupra polaritii transportului
auxinelor;
-are aciune favorabil asupra tuberizrii.
Aceste proprieti au unele puncte comune cu auxinele (nflorirea Bromeliaceaelor, corelaii
de cretere) iar unele antagonice (cderea frunzelor i fructelor, tuberizarea). Aciunea antagonic a
etilenei pare a depinde de interaciunea dintre cele dou substane ce pot controla sinteza, concentraia
i circulaia lor.
Aplicaiile practice ale etilenei, dificil de utilizat n starea sa gazoas, au fcut progrese doar
dup descoperirea acidului 2-cloro-etan fosforic. Acest produs, aplicat prin pulverizare penetreaz
esuturile, unde se elibereaz etilena.
Toate prile plantelor sunt capabile s sintetizeze etilena, ns cantitatea cea mai mare se
sintetizeaz n fructe, apoi ntr-o concentraie mai mic n flori i organe rnite.
2.1.1.5 Inhibitori ai creterii
Multe substane au efecte inhibitoare asupra creterii plantelor, printre substanele endogene
enumerndu-se compuii fenolici i acidul abscisic.

A. Inhibitorii fenolici
Inhibitorii fenolici, ntr-un numr mare n plante, inhib metabolismul i intervine n multe
procese fie ca antagonici ai regulatorilor de cretere, fie ca inhibitori ai reaciilor metabolice. Ei
intervin n inducerea strii de laten a mugurilor i seminelor, la nceput prin ncetinirea creterii
acestora urmat de stoparea total a acesteia. Nu se tie exact rolul i mecanismul lor n inducerea
strii de laten.
n culturile in vitro aceti compui sunt deseori sintetizai i eliberai n mediul de cultur, unde
se oxideaz cauznd brunificarea mediului ceea ce duce deseori la moartea explantelor, de aceea n
unele medii de cultur se utilizeaz substane anti-oxidante sau adsorbani pentru a detoxifia mediul.
Exist cteva exemple referitoare la folosirea substanelor fenolice n cultura in vitro, cum ar fi
utilizarea florizinei pentru inducerea nrdcinrii la altoii de mr.
B. Acidul abscisic
178

Acidul abscisic (fig.6) a fost identificat n 1965 i de atunci a fost descoperit n toate plantele.
Acest inhibitor pare s fie sintetizat de fiecare dat cnd o plant este supus unor condiii stresante
(lipsa apei, rnire, cldur excesiv). Existena acidului abscisic n celule este una din cauzele crora
plantele supuse unor factori stresani i ncetinesc activitatea metabolic. ncetinirea activitii
plantelor este reversibil atunci cnd condiiile de stres sunt trectoare i poate induce starea de laten
sau chiar decesul plantei atunci cnd condiiile nefavorabile sunt prelungite.

Fig.6 Acidul abscisic


Proprietile acidului abscisic sunt similare celor ale compuilor fenolici.
Astfel, cele mai importante proprieti ale acidului abscisic sunt:
-aciune favorabil asupra cderii frunzelor i fructelor;
-determin creterea permeabilitii celulelor fa de ionii de potasiu, ceea ce poate influena
nchiderea stomatelor;
-acioneaz asupra nfloririi. Aplicarea acidului abscisic la plantele de zi scurt cultivate n
condiii perfecte de periodism, poate inhiba complet nflorirea acestora (Volubilis) sau inhiba parial
(Chenopodium rubrum), sau chiar stimula nflorirea (Plumbago). n cazul n care plantele de zi scurt
sunt supuse unor condiii de zi lung poate induce nflorirea unora dintre specii i inhibarea altora.
Aplicat asupra plantelor de zi lung, acidul abscisic poate inhiba nflorirea atunci cnd plantele sunt
supuse unor condiii normale de fotoperiodism (spanac, Lolium temulentum). Aceste observaii pot
conduce la supoziia c nopile lungi favorizeaz sinteza acidului abscisic, dar aceast supoziie este
prea simpl pentru explicarea modului diferit de aciune a acidului abscisic.
Acidul abscisic este foarte puin folosit n culturile in vitro, i n funcie de speciile folosite i
de condiiile de cultur utilizate poate induce reacii foarte diferite i greu de interpretat.
Concluzii
Regulatorii de cretere endogeni sunt prezeni n plante pe tot parcursul vieii acestora, dar
prezena acestora nu este constant. Concentraiile lor se schimb n cursul diferitelor stagii
fiziologice i sunt diferite pentru fiecare parte a plantei, pentru aceeai etap fiziologic. Variaia
continu n plante a coninutului n regulatori de cretere determin problemele legate de alegerea
momentului de recoltare a explantului.
Tehnicile de cultur in vitro pot fi controlate de echilibrul fitohormonal, dintre care cele mai
importante sunt auxinele i citochininele.
Raportul citochininauxin influeneaz procesele fiziologice din explante, determinnd
evoluia acestora n diferite sensuri n funcie de concentraia celor doi fitohormoni. Astfel, dup
Skoog, comportamentul fiziologic al explantelor va fi:
-dac raportul auxine citochinine este mare, se induce rizogeneza;
-dac raportul este subunitar se induce lstrirea, explantele tind spre o funcionare
caulogenic;
-dac raportul este apropiat de unitate, explantele au tendina s genereze formaiuni calusare.
Aceast schem general este ntotdeauna valabil, chiar dac exist variaii n funcie de tipul
de explant i mai ales n funcie de specia luat n cultur. Pe lng aceti fitoregulatori principali
exist i ali regulatori de cretere ce s-ar putea dovedi indispensabili, dar n cele mai multe cazuri
acetia au doar rol stimulator sau favorizant i rareori esenial.
179

2.2 ALEGEREA EXPLANTULUI


Celulele vegetale vii au capacitatea potenial de a intra n diviziune i de a reproduce un
individ ntreg similar plantei donor. Aceast capacitate denumit totipotena celular, indic faptul
c fiecare celul deine toate informaiile necesare regenerrii unei plante ntregi, proprietate ce este
tot mai mult exploatat n culturile in vitro.
Chiar dac toate celulele au totipoten nu este uor, cel puin pentru moment, s se foloseasc
n practic aceast calitate, ns cu ct cercetrile avanseaz, cu att numrul acestora va crete.
Este mai uor de ales un grup de celule, de exemplu un explant, capabil s reacioneze n
condiii artificiale de cultur unde s evolueze spre multiplicare clonal mai mult sau mai puin
semnificativ n funcie de rspunsul obinut. Micropropagarea face posibil obinerea de plante
identice din punct de vedere genetic cu planta mam, ns uneori este i surs de variabilitate genetic
atunci cnd explantul este supus anumitor condiii.
nainte de a decide criteriile de selecie ale unui explant este necesar cunoaterea evoluiei
fiziologice ce va ajuta la nelegerea diferenelor dintre comportamentul celulelor unui segment de
plant atunci cnd este detaat de planta mam.
2.2.1 Etapele fiziologice ale unei plante
n contextul reproducerii sexuate se poate preciza, ntr-o manier simplist, c ciclul de via al
unei plante se mparte n patru stadii principale.
A. Embriogeneza
Embriogeneza ncepe cu fecundarea unei oosfere de ctre un anterozoid. Oul astfel format este
protejat de ovul unde ncepe s se divid. Celulele se organizeaz la nceput ntr-o mas sferic (faza
globular a embrionului), apoi se dezvolt forme simetrice reprezentnd cotiledoanele rudimentare
(faza cordiform a embrionului dicotiledonat) dup care se dezvolt structurile cotiledonare,
hipocotilul, gemula i radicula (stadiul de torpedou al embrionului). De la acest stadiu ncepe
diferenierea celular. Specializarea celulelor este nc foarte puin datorat unei funcionri
programate i mai mult datorit unui program genetic ce se va pstra i n celulele mature ce n
anumite condiii se vor comporta similar unor celule gametice, dnd natere unor organe sau embrioni,
de aceast dat somatici.
n momentul de fa, nu se cunoate pe deplin mecanismul diferenierii celulare. Se presupune
c poziionarea celulelor n relaie cu celelalte celule, dar i cu mediul de cultur, determin un schimb
de semnale biochimice, ce moduleaz funcionarea fiecrei celule.
n contextul ipotezei mai sus menionate, diferenierea celular intervine ca urmare a dou
cauze: pe de o parte, datorit ereditii genetice a celulei (fiecare celul are acelai echipament
informaional genetic), n care acioneaz programul embriogenic, iar pe de alt parte, datorit
poziionrii specifice a celulei care va fi recunoscut de structurile membranare. Aceste structuri
filtreaz informaiile i permit sau mpiedic circulaia unuia sau altui semnal capabil s modifice
programul informaional spre un anumit tip de celul.
Sfritul acestei prime etape este marcat, n general, dup ce substanele sunt depozitate n
albumen sau cotiledoane, de deshidratarea seminei, ce induce intrarea embrionului n starea de
laten. Seminele pot fi apoi diseminate, putndu-se pstra i rezista condiiilor nefavorabile din
mediul nconjurtor.
180

B. Stadiul vegetativ
Cnd condiiile externe sunt favorabile i starea de laten este ntrerupt seminele germineaz
i din embrion ia natere o nou plant. De creterea plantelor sunt responsabile dou tipuri de
meristeme: meristemul caulinar ce determin creterea prii aeriene a plantei i meristemul radicular,
ce determin creterea prii subterane a plantei.
Meristemul caulinar are o structur bine definit, fiind alctuit dintr-o parte extern, epiderma
de dou sau trei straturi numit tunica, i o parte intern sau corpus. ntr-o seciune transversal se
poate observa o parte apical unde celulele au o activitate mitotic redus, nconjurat de un inel de
celule aflate n diviziune activ, celule responsabile de creterea tulpinii. Diviziunea ncepe de la
inelul iniial: zona epidermal difereniaz n frunze rudimentare spre exterior, iar spre interior n
parenchim cortical i vase conductoare. Centrul este umplut de meristemul medular. Meristemul
caulinar are o funcionare ritmic programat genetic cu o precizie aflat, n primul rnd, n
aranjamentul filotaxic al frunzelor (distribuie corespunztoare unei simetrii particulare fiecrei specii)
i, n al doilea rnd, n forma frunzelor. Se remarc aici c florile ce permit identificarea i
clasificarea plantelor se bazeaz aproape exclusiv pe caracterele morfologice. Ipoteza prezentat mai
sus privitoare la diferenierea celulelor n interiorul embrionului poate fi luat n considerare similar
celei privitoare la meristeme.
La nceput, plantula este hrnit din rezervele nutritive aflate n endospermul seminei, primele
frunzulie, deseori conturate n interiorul embrionului, sunt diferite de frunzele adulte, fiind cunoscute
sub denumirea de frunze juvenile. Planta crete i devine capabil s se hrneasc singur, rdcinile
transport spre frunze srurile minerale i compuii organici odat cu regulatorii de cretere. n
schimb, rdcinile primesc de la frunze substane nutritive bogate n glucozide, vitamine i de
asemenea n regulatori de cretere. Aceste schimburi stau la baza construirii scheletului unei plante,
stabilind corelaii de cretere ntre sistemul aerian i cel subteran al plantei.

Fig.7 Meristem apical


Corelaiile, specie specifice, vor favoriza dezvoltarea unuia sau a altui mugure caulinar, ceea
ce va conduce la dezvoltarea formei specifice fiecrei plante (arbore, tufi, tulpini ntortochiate sau
mprtiate, etc). Aceast arhitectur poate fi modificat prin curarea de uscturi sau ramuri
nefolositoare, prin conducerea ramurilor sau prin aplicarea regulatorilor de cretere. n contrast
frunzele i menin forma.

181

Fig.8 Meristem radicular


Aceast diferen indic faptul c principalele corelaii implic, n general, informaii despre
ntietatea mugurilor, care e controlat mai degrab de fenomene de cretere relative dect de
motenirea genetic.
Stadiul vegetativ dureaz, n funcie de specie, de la cteva sptmni la cteva luni pe an, un
an pentru plantele bienale sau mai muli ani pentru cele perene. n ultimul caz, sistemul vegetativ va fi
construit pe parcursul mai multor sezoane, perioadele de cretere alternnd cu cele de repaus. Aceast
succesiune, care reflect adaptarea plantei la climatul mediului nconjurtor, este determinat de
stimulrile sau inhibrile reliefate ca rspuns la variaiile condiiilor de mediu (temperatur, lumin,
secet, umiditate, etc). Plantele ce intr n perioada de laten i sisteaz creterea, substanele
glucizidice nefolosite sunt pstrate n rezerve, iar frunzele speciilor lemnoase cad, sau prile aeriene
ale plantelor ierboase se usuc. Atunci cnd revin condiiile favorabile (latena mugurilor este indus
de obicei de temperaturile sczute) rencep creterile, formarea frunzelor i a prilor aeriene.
C. Stadiul reproductiv
Stadiul reproductiv este marcat de modificrile de ritm n funcionarea meristemului caulinar.
Inelul iniial nceteaz progresiv s mai funcioneze i se observ c celulele centrului latent intr n
diviziune activ iniiind formarea florii sau a inflorescenei. Diferenierile ncep la margini unde se
formeaz staminele i prile fertile ale plantei: staminele i pistilul. Florile angiospermelor sunt
considerate lstari modificai constituite dintr-un ax central i anexele sale sterile (periantul) sau fertile
(staminele i pistilul).
Aceste nou program este la fel de precis ca i precedentul i se presupune c mecanismele de
difereniere sunt similare. Instalarea strii generative este progresiv i la nceput poate fi reversibil,
n unele condiii este posibil s se revin la starea vegetativ.
Modificrile modului de aciune pot fi controlate fie de plant i n aceste condiii variaiile
climatice nu au nici un efect, fie de variaiile climatice (temperatur, lumin, umiditate), caz n care
planta percepe aceste variaii i drept rspuns emite stimuli ce vor direciona meristemul spre stadiul
reproductiv. La unele specii, existena un timp ndelungat a condiiilor nefavorabile de mediu poate
duce la mpiedicarea nfloririi. Floarea constituie ultimul stadiu n viaa unui meristem, asigurnd prin
fertilizare, continuitatea speciei. La unele specii perene ierboase unele meristeme terminale nu pot
induce formarea florilor. Aceast caracteristic permite plantei s supravieuiasc mai muli ani
(Saintpaulia, cerenel-Geum urbanum, cpun, etc). Dac aceste meristeme sunt induse artificial s
nfloreasc, plantele nfloresc i mor comportndu-se asemeni unei plante anuale.
Cercetrile asupra naturii stimulilor ce acioneaz asupra meristemelor florale nu sunt
concludente, tiindu-se doar c intervin unii fitohormoni dar i alte substane. Se pot cita cteva
modele de culturi in vitro, n care, variind componentele mediului de cultur i proporia
fitoregulatorilor de cretere s-au putut obine meristeme caulinare, radiculare sau chiar reproductive.
182

D. Stadiul de senescen
Stadiul de senescen urmeaz stadiului reproductiv la plantele anuale deoarece meristemele
sunt la sfritul vieii lor, fructificarea epuiznd rezervele, rdcinile nu mai hrnesc planta n mod
normal, schimburile de substane nutritive se reduce i plantele se pregtesc de iernare. La speciile
perene, aceast etap ncepe prin ncetinirea funciilor rdcinilor odat cu debilitarea ntregii plante,
ce devine mult mai sensibil la toate tipurile de atac. Nu este imposibil ca regulatorii cu rol inhibitor
s intervin cel puin la nceputul acestui stagiu fiziologic (acidul abscisic i etilena, alturi de alii).
Aceast scurt prezentare a proceselor fiziologice ce au loc de-a lungul vieii unei plante ne
permite nelegerea importanei interaciunilor ce regleaz morfogeneza plantelor. Astfel,
interaciunile pe distan scurt, predominant genetice, au loc la nivelul embrionilor i al meristemelor
vegetative i regenerative. Alt tip de interaciuni sunt interaciunile dintre organe ce permit plantelor
s recunoasc mediul nconjurtor i variaiile ce intervin la nivelul acestuia. Planta va putea s se
adapteze noilor condiii datorit schimbului de semnale sub forma fitohormonilor sintetizai n
anumite locusuri, circulnd n direcia unui punct int ce rspunde la acel stimul. n cursul deplasrii
lor fitohormonii sunt controlai de sistemele enzimatice existente n plante. Aceste interaciuni sunt de
aa natur nct de-a lungul unui ciclu de via al unei plante, echilibrul endogen dintre regulatorii de
cretere evolueaz continuu i reflect la un moment dat, nu doar starea prezent a mediului
nconjurtor al celulei, ci i ultimele evenimente petrecute cu acea celul. Datorit acestui fapt, la
recoltarea unui explant trebuie s se in seama de valoarea acestui echilibru, ce depinde de stadiul
fiziologic i de vrsta plantei donor, dar i de organul de pe care se prelev, precum i de mrimea i
natura fragmentului excizat.
2.2.2 Selecia explantelor n funcie de stadiul fiziologic i vrsta plantei mam
n funcie de stadiul fiziologic i vrsta plantei donor explantele pot reaciona diferit la
condiiile culturii in vitro. n general, plantele tinere sunt sursa cea mai potrivit de explante,
potenialul de adaptabilitate al explantelor la condiiile artificiale de via diminundu-se cu vrsta
plantei mam.
n cursul embriogenezei, embrionii pot fi excizai din ovul i inoculai pe mediul de cultur
dac se afl n stadiul globular, putnd reproduce un individ normal i complet. Aceast tehnic
prezint un interes sczut atunci cnd se are n vedere micropropagarea (potenialul genetic al
embrionilor este rareori cunoscut cu excepia cazului strict de autogamie). Pe de alt parte, aceast
tehnic permite studierea cerinelor speciale necesare unui embrion izolat. n unele cazuri, de
ncruciare interspecific sau intergeneric, cnd embrionii pot fi avortai sau mor imediat n ovul,
aceast tehnic permite creterea i dezvoltarea normal a acestor embrioni.
esuturile embrionare sunt uor regenerative, dar la unele specii doar din cotiledoane s-au
obinut rezultate notabile, ceea ce a permis specificarea cerinelor nutritive pentru cultura esuturilor
speciilor studiate. Acesta poate fi primul mod de abordare a culturilor in vitro iniiate din explante
btrne. n unele cazuri aceasta este singura cale cunoscut.
Dup germinarea n stadiul juvenil, esutul prelevat prezint un rspuns favorabil in vitro i
este sursa multor succese n domeniu. Odat cu naintarea n vrst a plantei donor, potenialul de
cultur in vitro a explantelor prelevate de la acesta se diminueaz. Acest fenomen este specific mai
ales plantelor perene, i n mod deosebit la arbori. La aceste specii, calitatea tehnic a lemnului nu este
msurabil, cu excepia arborilor aduli. n acest stadiu, totui, pentru multe specii, iniierea culturii
doar din butai nu mai este posibil, deoarece n stadiul tnr acetia au o capacitate rizogenic
ridicat.
Exist dou tehnici ce permit obinerea de puiei la speciile pomicole i arboricole:
-una ar fi utilizarea lstarilor tineri de la baza speciilor pomicole i arboricole. n acest caz
lstarii par a avea caracteristici juvenile i nrdcineaz mai repede (de exemplu la nuc i eucalipt).
La aceste specii esuturile de origine ale noilor lstari sunt genetic apropiate de stadiul juvenil,
probabil datorit faptului c se afl n apropierea rdcinilor;
183

-a doua tehnic este aplicat pentru multiplicarea speciilor pomicole i arboricole tropicale i a
coniferelor. Aceast tehnic permite rejuvenilizarea i obinerea de altoi. Un altoi prelevat dintr-un
arbore sau pom este altoit pe un portaltoi crescut din smn. Altoiul crete i este apoi nlturat fiind
ulterior altoit pe alt portaltoi. Dup mai multe altoiri altoiul ncepe s prezinte caracterele juvenile,
ceea ce-l face apoi apt pentru propagare prin butire.
La culturile in vitro, s-au observat fenomene similare la meristeme. Prima frunzuli ce se
formeaz are caractere juvenile (prima frunzuli a meristemului la vi de vie are caracteristici
similare celei dezvoltate din smn, de asemenea, i la orhidee meristemele dezvolt, n cultura in
vitro, protocorm identic cu cel obinut din smn). Rejuvenilizarea observat este deseori obinut
din prima subcultur, ns uneori sunt necesare mai multe subculturi pentru a obine aceste efect, n
funcie de specie.
ntoarcerea la stadiul juvenil poate fi datorat supresiei de informaii citoplasmatice sau
datorit diminurii considerabile a acestora determinnd astfel posibilitatea regenerrii de noi celule.
Mecanismele exacte ce determin aceste fenomen nu sunt nc pe deplin cunoscute. Se pare c
citochininele sunt implicate, cel puin parial, n acest proces, dar ele nu acioneaz singure.
Cultivarea organelor reproductive in vitro, se poate realiza cu succes atunci cnd plantele
donor sunt n stadiul reproductiv. Se pare c schimbrile ce apar n ritmul de funcionare al
meristemelor este favorabil i determin n esuturi un echilibru optim culturii in vitro.
Se pot obine culturi din esuturi prelevate de la plante aflate n stadiul de senescen, dar
rezultatele sunt n general slabe sau incomplete.
2.2.3 Selecia explantelor n funcie de vrsta explantului
Problemele legate de vrsta explantului apar la speciile perene n care se poate distinge un
stadiu activ i unul lent, latent, ntre care reaciile fiziologice sunt diferite. Astfel, primele
experimente, ce vizau cultivarea de meristeme la plantele lemnoase, au euat atunci cnd s-a ncercat
iniierea unei culturi de esuturi din meristeme prelevate de pe ramuri n vegetaie, dar au avut succes
atunci cnd s-a pornit de la meristeme prelevate din muguri dorminzi.
De-a lungul unui ciclu anual, echilibrul intern al plantelor se schimb. Primvara organele
cresc i analizele relev prezena regulatorilor de cretere de tipul auxinelor, giberelinelor i
citochininelor. Vara transportul fitohormonilor prin vasele conductoare se diminueaz, iar toamna se
sintetizeaz inhibitorii creterii. De aceea, nu e surprinztor faptul c explantele, prelevate de la
aceeai plant n perioade variate ale vegetaiei, vor da rspunsuri diferite chiar dac vor fi plasate pe
acelai tip de mediu.
De aceste considerente trebuie s se in seama atunci cnd se are n vedere micropropagarea
speciilor lemnoase. Unele explante au tendina de a nrdcina uor atunci cnd sunt prelevate n
anumite faze de vegetaie, n special dac sunt excizate n perioada de vegetaie, cnd concentraia de
auxin este maxim.
La speciile cunoscute deja ca recalcitrante la cultura in vitro, pentru realizarea rejuvenilizrii
se poate supune planta mam, pentru o perioad scurt, unui tratament cu temperaturi sczute, unui
regim de lumin particular sau unui tratament cu fitohormoni pentru modificarea echilibrului lor
intern n vederea stimulrii rizogenezei.

2.2.4 Selecia explantelor n funcie de amplasarea plantei donor


Dup determinarea stadiului i perioadei optime explantele pot fi prelevate. Dup tipul de
organizare a fragmentului ce urmeaz a fi cultivat in vitro se pot lua n considerare dou cazuri:
1.Explantele ce au o structur rudimentar sau organizat, cum e cazul mugurilor, apexurilor
caulinare, meristemelor i apexurilor florale, sunt cele mai utilizate pentru iniierea unei culturi de
esuturi, deoarece acestea sunt receptive i ridic cele mai puine probleme, genernd cu uurin, n
184

condiiile unui mediu de cultur adecvat, structuri organizate (de exemplu, organe). Dac mediul de
cultur nu este potrivit poate tulbura funciile explantului i conduce la dediferenierea celulelor,
genernd calus.
Utilizarea acestui tip de explante este similar unei microbutiri i este tehnica cel mai des
folosit atunci cnd se urmrete micropropagarea pe scar larg a unei specii.
Interesant de amintit este faptul c explantele posed un fel de memorie a tipului de cretere ce
l-au prezentat in vivo, acest fenomen fiind n special ntlnit la speciile lemnoase. La mai multe plante
la care corelaiile de cretere sunt puternice, explantele provenite din ramuri laterale au generat plante
cu rdcini, dar de tipul lianelor, sub forma unor plante culcate la pmnt i nu erecte. Unele cercetri
au evideniat faptul c aceast memorie aparine celui mai apropiat internod de lng meristem.
2.Explantele constituite din diferite tipuri de esuturi, cum ar fi fragmente de tulpin, frunze,
flori i fructe, crora, inoculate pe mediu de cultur, li se induce o reversie complet cu scopul de a
restaura capacitatea celulelor de a se divide i de a-i ctiga din nou capacitatea organogenic.
Pentru aceste explante, n funcie de specie, s-a dovedit c toate prile plantei sunt capabile s
urmeze procesul dediferenierii conducnd spre o nou organizare structural. Dar, n acest caz,
diferenele ntre specii sunt uriae. Unele specii, cum ar fi violetele de Parma, sunt capabile s
regenereze din toate prile plantei (peiol, limb, rdcini, petale, stamine, polen, ovule), alte specii
sunt mai recalcitrante, cum ar fi Actinidia sinensis, la care rezultate notabile au fost obinute doar din
fragmente de tulpin. Unele specii sunt total recalcitrante, nereuindu-se iniierea culturii de esuturi
din explantele amintite, iar la unele conifere s-a reuit obinerea de propaguli doar din cotiledoane.
n general, cele mai bune rezultate au fost obinute, la cele mai multe specii, din fragmente de
limb foliar i tulpini tinere.
2.2.5 Selecia explantelor n funcie de mrimea i natura acestora
Mrimea explantului ce urmeaz a fi cultivat prezint cea mai mare importan. Cu ct
explantul este mai mare cu att echilibrul endogenic al acestuia este mai determinant i mediul de
cultur va avea o influen limitat. n cazul explantelor de dimensiuni mici direcionarea acestuia n
sensul dorit se face mai uor, deoarece explantul este receptiv la substanele din mediul de cultur, i
anume la regulatorii de cretere existeni.
Explantele organizate cuprind n general un nod, un apex sau un mugure (solzii protectori sunt
nlturai), fiind o unitate suficient de complet pentru care mediul va favoriza creterea, sau n cazul
diferenierii axilare, va bloca creterea apical. Pentru meristemele ce trebuie s aib dimensiuni
foarte mici, exist o mrime minim ce conine domul meristematic cu dou primordii foliare. Sub
aceast mrime supravieuirea explantului este foarte dificil i pierderile sunt mari, peste aceast
dimensiune, rspunsul la cultura in vitro este mult mai bun , ns n detrimentul eliminrii virusurilor.
Dimensiunile explantelor variaz ntre 5 i 10 mm, ceea ce corespunde unei manipulri uoare
a materialului vegetal, sub aspectul excizrii sau prelevrii, fasonrii i inoculrii acestora. De
exemplu, prin cultivarea pe acelai mediu de cultur, a mai multe fragmente de peiol de Saintpaulia,
de 1,5; 3; 5 i 7 mm, s-a observat c doar fragmentele de peste 3 mm au generat plantule normale.
Fragmentele de 1,5 mm au generat dou tipuri de rezultate: unele explante s-au vetejit, iar altele au
format doar rdcini. Fr ndoial, n ultimul caz, auxinele prezente n mediu au jucat cel mai
important rol, pe cnd n cazul fragmentelor de dimensiuni mai mari au intrat n joc i fitohormonii
endogeni.
Se pot fasona explante din diferite tipuri de esuturi: epidermal, cortical, parenchim medular,
dar i rspunsurile vor varia. Cel mai regenerativ tip de esut este cel epidermal. esuturile corticale i
cambiale prezint de asemenea rezultate bune, dar rmn deseori n stadiul de calus. Parenchimul
medular este esutul cel mai puin regenerant, aceste esuturi cer o armonizare perfect ntre regulatorii
de cretere, un exemplu fiind dat de Skoog, care a folosit mduv de tutun pentru a determina rolul
echilibrului dintre auxine i citochinine.
Din esuturi epidermale de cteva straturi grosime a fost posibil orientarea regenerrii spre
stadiul caulogenic (lstari), rizogenic (rdcini), calusogenic sau reproductiv. Acest experiment
confirm ipoteza unei activiti crescute a fitohormonilor asupra explantelor de dimensiuni reduse.
185

Cel mai mic explant este constituit dintr-o singur celul, cum e cazul protoplatilor izolai
mecanic sau enzimatic. Protoplatii sunt capabili de a se divide i a reproduce plante, dar nun sunt
capabili de inducerea meristemelor florale.

2.3 RSPUNSUL EXPLANTELOR N CULTUR


Prima problem ce trebuie rezolvat, atunci cnd se iniiaz o cultur in vitro este meninerea
viabilitii (pe lng problema asepsiei) explantului. Deseori se poate observa, dup fasonarea
explantului, o brunificare a celulelor,mai ales a celor ce vin n contact direct cu mediul de cultur,
fenomen datorat oxidrii substanelor fenolice sintetizate n mediu, oxidare ce are efect toxic asupra
celulelor vegetale. Mai mult, celulele moarte pot diminua sau anula schimburile dintre explant i
mediul de cultur. Nu toate speciile prezint fenomenul de brunificare a explantelor, deoarece la
aceste specii problema este parial rezolvat prin imersia explantelor ntr-o soluie antioxidant
(soluie de acid ascorbic cu acid citric n proporie de 0,5 % respectiv 0,05%), imediat dup fasonarea
acestuia sau prin adiia n mediul de cultur a unor substane adsorbante sau detoxificante, cum ar fi
crbunele activ (1 pn la 4 g/l) sau polivinilpirolidon (5 pn la 10g/l).
Odat rezolvat aceast problem este necesar orientarea explantului, n funcie de natura sa,
n direcia dorit de operator.
2.3.1 Explante cu structur rudimentar
Explantele din aceast categorie pot fi cultivate prin dou metode.
Prima metod const n inducerea creterii apicale prin adiia n mediul de cultur a
fitohormonilor din clasa auxinelor i/sau a giberelinelor, foarte rar se pot aduga i citochinine,
ntotdeauna ntr-o doz foarte mic.
Dup iniierea pe acest tip de mediu se observ apariia unor formaiuni calusare la baza
explantelor. Este de dorit ca aceste explante s rmn de dimensiuni mici, deoarece dac acest calus
crete n dimensiune, ceea ce deseori se ntmpl, indic existena unui dezechilibru ntre substanele
minerale sau fitohormonii din mediul de cultur. Dup formarea calusului, ce are rol protector
(asemeni calusului format la o ran) se formeaz prima frunzuli, apoi prima rozet de frunze i mai
trziu are loc elongarea tulpinii (axului principal). Aceste etape morfogenice pot avea loc pe acelai
tip de mediu la unele specii ornamentale (crizanteme, garoafe) sau pe dou medii succesive, la speciile
lemnoase. Primul mediu va iniia creterea, putnd fi utilizat ulterior i pentru propagarea
fragmentelor cu un nod (microbutire). Al doilea mediu, mbogit cu auxine (cel mai frecvent,
acidul indolil acetic), servete ca mediu de nrdcinare (Actinidia, mr, numeroase specii lemnoase).
A doua metod const n blocarea creterii apexului caulinar favoriznd regenerarea i
dezvoltarea lstarilor laterali (axilari), caz n care mediul de cultur este adiionat cu citochinin (de la
1 la 10mg/l). Lstarii regenerai pot fi izolai i crescui pe mediu pentru cretere, fr hormoni sau cu
acid giberelic n concentraie mic. n unele cazuri este nevoie de al treilea mediu de cultur pentru
nrdcinarea lstarilor, mediu adiionat n general cu auxine.
Utilizarea acestui tip de explante este important deoarece asigur posibilitatea efecturii unui
numr foarte mare de subculturi i, din punct de vedere genetic, un minim de variabilitate.
2.3.2 Explante constituite din diferite tipuri de esut
Aceste explante sunt compuse din diferite celule asociate n esuturi fr o organizare
structural, putnd proveni din orice parte a sistemului vegetativ (tulpin, frunze, rdcini) sau
generativ (ax floral, sepale, petale, stamine, polen, ovul, fruct).
Celulele ce rspund la cultura in vitro trebuie s treac prin procesul de dedifereniere, adic sa
se ntoarc la stadiul de celule nedifereniate. Acest tip de reversie este mai uor de obinut la celulele
vegetale i mai greu la cele animale.
186

Observaiile asupra acestui tip de celule au evideniat cteva modificri ce intervin n procesul
dediferenierii: se reduce volumul vacuolar, dispar moleculele specializate, nucleul se mrete,
citoplasma devine mai dens. Dup realizarea acestor modificri celulele ncep s se divid, stadiu
denumit histogenez, uor de realizat prin adiia n mediul de cultur a auxinelor. n al doilea stadiu,
numit organogenez, citoplasma celular devine i mai dens, cu vacuole mici i nucleu voluminos.
Celulele pstreaz capacitatea de a se divide, dar celulele fiice vor fi capabile s se organizeze ntr-o
mas meristematic ce se va dezvolta ntr-un nou individ.
Observnd un explant n cultur se observ formarea, mai nti, a unei formaiuni calusare cu
rol protector. Celulele aflate n imediata apropiere a mediului sunt primele ce ncep s se divid i s
se dediferenieze.
Dac celulele ce vin n contact cu mediul brunific, nu se mai formeaz calus i deci tot
explantul moare. Celulele ce rspund la cultura in vitro au o poziie precis, de exemplu la Begonia
rex, celulele generatoare sunt cele subepidermale situate la baza periorilor glandulari. n general
celulele int, adic celulele ce rspund uor culturii pe mediu artificial, sunt cele epidermale, n
special cele provenite din tunic, dar pot avea i alte origini. Aceste celule se vor organiza ntr-un
meristem, care va dezvolta ulterior o plantul ntreag cu tulpini i rdcini, cum este cazul la Begonia
i Saintpaulia.
La alte specii, cum ar fi Pelargonium, se observ n primul stadiu formarea de calus
(calusogeneza), unde celulele regenerante se divid activ, i doar n al doilea stadiu, ce poate avea loc
pe acelai mediu de cultur sau pe alt mediu, se dezvolt meristemul ce va da natere noii plantule.
Cnd se formeaz meristemul prezint, n funcie de specie, acelai mod de a se dezvolta ca i
explantele organizate, doar c se cere un mediu mai complex pentru a asigura elementele nutritive
necesare dezvoltrii complete pn la stadiul de plantul.
Al doilea proces de organizare, mai puin frecvent, este acela n cursul cruia celulele se vor
comporta ca un ou fertilizat, urmnd etapele embriogenezei. Vom vorbi astfel de embrioni sau
embriogenez somatic. Acest fenomen, descris pentru prima dat la celule de morcov, a fost
descoperit la mai multe specii, att anuale ct i perene.
Ca o trstur general, inducerea embriogenezei depinde n cea mai mare msur de
compoziia mediului de cultur, dar i de genotipul de la care se prelev celulele generatoare. n multe
cazuri embriogeneza somatic, este precedat de formarea de calus, n acest caz izolarea celulelor nu
mai este un factor decisiv (Fig 9).
n cursul dezvoltrii se observ cum celulele se divid i embrionii ajung n stadiul globular,
apoi apare simetrie ntre forme i embrionul evolueaz spre stadiul cordiform i apoi ntr-un embrion
capabil s genereze o plantul (Fig 10).
Pentru celulele capabile s genereze embrioni somatici sunt suficiente dou medii de cultur.
Primul asigur formarea embrionilor, putnd servi i ca mediu de micropropagare, iar al doilea va
induce germinarea embrionilor.
Uneori sunt necesare mai multe subcultivri pe medii fr hormoni pentru a induce germinarea
embrionilor somatici i creterea plantulelor, n timpul acestor subcultivri are loc diluia
fitohormonilor la nivel celular permind astfel dezvoltarea normal a celulelor.

Fig. 9 Embrioni somatici de morcov regenerai din calus


187

Utilizarea explantelor difereniate este foarte avantajoas deoarece sursa de explante este
nelimitat i rata de multiplicare poate atinge valori considerabile. n funcie de rspuns, aceste
explante prezint unele dezavantaje la nivel genetic.
n primul rnd, celulele ce dau natere noilor plantule sunt somatice i exist probabilitatea ca
celule mutante s genereze embrioni din care s ia natere noi plante.

Fig.10 Embrioni somatici de citrice: a) n stadiul globular, b) n stadiul cordiform, c) genernd o


plantul
n al doilea rnd, cea mai mare rat de inducere a embriogenezei somatice are loc din calus,
caz n care, datorit ritmului intens de diviziune celular numeroase celule pot prezenta modificri la
nivel genetic (modificri cromozomale de tipul poliploidiei sau aneuploidiei, sau modificri
citoplasmatice). Aceast variabilitate poate fi suficient de mare i n unele cazuri a fost chiar folosit
pentru inducerea de mutani, prin stimularea formrii calusului pe medii adecvate fitohormonal i
chiar prin subculturi succesive ale calusului pentru creterea probabilitii mutaiilor. Dup
fragmentarea calusurilor i inocularea lor pe medii pentru regenerare, s-a observat c printre plantulele
neoformate unele prezentau modificri morfologice evidente mai ales citoplasmatice. n consecin,
de fiecare dat cnd propagarea unei specii necesit trecerea prin stadiul de calus se impune
verificarea calitii genetice a plantelor obinute.
Ca o concluzie a celor spuse mai sus, cercetrile asupra culturilor ce au pornit de la explante
difereniate au permis nelegerea modului de aciune al fitoregulatorilor de cretere, a cror echilibru
n mediul de cultur este determinant pentru orientarea celulelor s funcioneze ntr-un ritm ales de
operator, innd cont de echilibrul endogenic. Nu se tie nici n prezent care este modalitatea de a
determina exact concentraia i balana hormonal atunci cnd se apeleaz la fitoregulatori exogeni,
dar pe de alt parte, acetia din urm permit cercettorilor manipularea materialului biologic n sensul
dorit.
Aceste cercetri, ce sunt nc incomplete, sunt baza de la care s-a pornit n realizarea multor aplicaii
practice, unele dintre ele fiind acum parte din procesul de micropropagare ce a nceput s fie tot mai
mult folosit.

188

CAPITOLUL IV
4.1 CERINELE NUTRITIVE ALE ESUTURILOR VEGETALE
CULTIVATE N CONDIII ASEPTICE
4.1.1 Mediul de cultur
Explantele vegetale pentru a putea tri, dup desprinderea de planta donator, au nevoie de
condiii speciale de cultur, s fie protejate de agenii patogeni (asepsie total) i s aib ca surs de
hran o soluie nutritiv complex, format din ap, sruri minerale, substane organice i fitohormoni.
Pentru meninerea explantelor la suprafa i pentru ca acestea s nu fie asfixiate, mediul de cultur se
solidific cu un agent de solidificare. Soluia nutritiv complex lichid sau solid se numete mediu
de cultur sau substrat de cultur. Acest mediu de cultur trebuie sa fie steril i cu o compoziie
complex deoarece explantul nu are capacitate de a se hrni autotrof, el triete heterotrof pe baza
substanelor existente n mediu. n funcie de scopul urmrit, evoluia explantului poate fi dirijat prin
modificarea compoziiei mediului, obinndu-se calus sau regenerarea de noi plante prin stimularea
organogenezei.
Compoziia mediului de cultur este specific pentru fiecare specie, soi i faz de dezvoltare,
cerinele fiind diferite i n funcie de explantul folosit, momentul de prelevare i zona din care s-a
prelevat, chiar n cadrul aceluiai soi. n prezent se cunosc i se utilizeaz o serie de medii de cultur
ce poart numele celor care le-au creat: White, Murashige-Skoog, Nitsch, Gamborg, Heller (Tabelul
4.1).
Compoziia mediului s-a stabilit att prin tatonri repetate cu diferite substane, ct i prin
studii ale sevei brute i elaborate la diferite specii, studii privind absorbia i desorbia, schimbul ionic
care exist ntre plant i mediul nconjurtor. n prezent se cunosc destul de bine modificrile pe care
le sufer plantele cnd elementele chimice sunt n exces sau n deficit. Trebuie evitate pe ct posibil
aceste stri de stres pentru plante att la cultura n cmp, ct mai ales la culturile in vitro.
4.1.1.1 Compoziia chimic
A. Compuii anorganici i rolul lor
Apa
Apa reprezint componentul esenial al vieii, al materiei vii. Este utilizat n tot fluxul
tehnologic de producere a plantelor in vitro, de la splarea materialului vegetal i a vaselor de
cultur, pn la utilizarea ei ca solvent pentru celelalte componente i elemente de diluie pn la
concentraia dorit. Pierderea apei din esuturi provoac perturbri metabolice direct proporionale cu
cantitatea de ap pierdut. Stresul hidric este suportat de plante dac este de scurt durat i dac nu se
atinge nivelul de vetejire. n aceast ultim faz plantele sunt capabile de rehidratarea esuturilor puse
n condiii favorabile de umiditate, dac deficitul de ap se menine plantele mor.
La culturile in vitro exist momente cnd explantele pot s-i piard turgescena prin pierderea
apei, momente n care trebuie acordat atenia cuvenit, pentru asigurarea succesului culturii.
Sterilizarea materialului vegetal este o etap critic din acest punct de vedere, deoarece
soluiile utilizate sunt concentrate pentru distrugerea agenilor patogeni. Trebuie corelate foarte bine
timpul de sterilizare i concentraia soluiilor utilizate n funcie de starea de vegetaie a materialului
vegetal, pentru evitarea pierderii apei prin exosmoz. Prelevarea explantelor trebuie fcut repede,
altfel datorit dimensiunilor mici pierd repede apa prin transpiraie, prin rnile care sunt mari
comparativ cu mrimea lui. Manipulrile sub hot trebuie fcute destul de repede deoarece curentul de
aer deshidrateaz relativ uor explantele care stau descoperite.
Pe timpul creterii explantelor n camera de cretere, vasele trebuie s fie nchise pentru a evita
pierderea apei prin transpiraie, ce ar determina concentrarea mediului n elemente nutritive, ar
189

provoca crparea mediului i ca atare slaba cretere a culturilor. Pentru respectarea strict a
concentraiilor soluiilor stoc sau a mediului, apa trebuie distilat, deci eliberat de ionii minerali pe
care i conine. La splarea materialului vegetal dup sterilizare se folosete ap steril, sterilizare ce
se face n autoclav odat cu sterilizarea mediului sau separat.
Srurile anorganice
Substanele anorganice sunt introduse n mediu sub form de sruri. Cele mai utilizate sunt:
azotaii, fosfaii, clorurile i sulfaii de Ca, K, Mg, Mn, Al, Fe, Mo, Zn, Cu, Na, etc. Absorbia
elementelor din mediu se face sub form de ioni, utilizarea uneia sau alteia din sruri este n funcie de
cerinele fiecrei specii i de faza de vegetaie. n funcie de cantitatea de elemente ce se folosete n
mediu, elementele se mpart n:
-macroelemente - utilizate n concentraii de ordinul milimolilor C, O, H, N, K, Ca, P, S,
Mg;
-microelemente sau oligoelemente, utilizate n concentraii de micromoli.
Tabelul 4.1
Principalele medii de cultur utilizate n culturi
in vitro (dup Street, 1977)
Constitueni
Macroelemente
KCl
NaNO3
MgSO4 x 7H2O
NaH2PO4 x H2O
CaCl2 x 2H2O
CaCl2
KNO3
Na2SO4
(NH4)2SO4
NH4NO3
KH2PO4
Ca(NO3)2 x
4H2O
Microelemente
FeSO4 x 7H2O
Na2EDTA x
2H2O
MnSO4 x H2O
MnSO4 x 4H2O
KI
NiCl2 x 6H2O
CoCl2 x 6H2O
ZnSO4 x 7H2O
CuSO4 x 5H2O
H3BO3
FeCl3 x 6H2O
Na2MoO4 x
2H2O
AlCl3
Fe(SO4)3
Constitueni
organici
Inozitol
Acid Nicotinic
Piridoxin HCl
Tiamin HCl
Glicin
Acid folic
Biotin
Zaharoz

190

Heller

White

Nitsch

Murashige
Skoog

Gamborg

750
600
250
125
75
-

65
720
16,5
80
200
300

mg/l
185
166
950
720
68
-

370
440
1900
1650
170
-

250
150
150
2500
134
-

27,8
37,3

27,8
37,3

27,8
-

0,01
0,01
0,03
1,0
0,03
1,0
1,0
-

7,0
0,75
3,0
1,5
-

25
10,0
0,025
10,0
0,25

22,3
0,83
0,025
8,6
0,025
6,2
0,25

10,0
0,75
0,025
2,0
0,025
3,0
0,25

0,03
-

2,5

0,05
0,01
0,01
3,0
2%

100
5
0,5
0,5
2
0,5
0,05
2%

100
0,5
0,5
0,1
2,0
3%

100
1,0
1,0
10
2%

Diferenele ce exist ntre diferite reete de mediu, constau n raportul dintre diferii ioni. Rolul
fiziologic al fiecrui element depinde de forma chimic n care se gsete n mediu, de concentraia
lui, de natura explantului. n prezent se cunosc principalele reete utilizate pentru speciile cultivate
care se preteaz la cultura in vitro. Acolo unde nu s-a experimentat nc, trebuie fcute tatonri pentru
gsirea celei mai adecvate compoziii pentru mediu. Carenele pentru elementele minerale in vitro se
manifest dup 2-3 subculturi, deci trziu, cnd nu se mai poate face mare lucru pentru salvarea
culturii. De exemplu N are rol important n embriogeneza somatic, n funcie de forma lui nitric sau
amoniacal influeneaz vitrificarea. Carena de N duce la acumulri de antociani n vacuolele
celulelor, iar dac aceasta persist provoac dereglri n metabolismul glucidelor i proteinelor.
Potasiul influeneaz creterea esuturilor, carena determin o dezvoltare slab. mpreun cu
calciul, regleaz permeabilitatea membranelor celulare, a fluiditii protoplasmei, intervine n
schimbul ionic la nivelul membranelor.
Magneziul ntr n compoziia clorofilei, carena provocnd dereglri grave n structura
frunzei.
Microelementele exercit roluri metabolice i fiziologice diferite de cele ale macroelementelor.
Intr n compoziia multor combinaii organo-metalice complexe, cu valoare biologic ridicat de tipul
enzimelor, care controleaz ntreg procesul metabolic al plantelor.
B. Compuii organici
Sursele de carbon
Viaa in vitro este aproape n exclusivitate heterotrof, n special n primele faze ale existenei,
pn la formarea unui numr suficient de mare de frunze pe fiecare plantul sau lstar. Datorit acestei
nutriii heterotrofe mediul de cultur trebuie s conin un compus care s asigure carbonul organic
necesar n metabolism. Principalele surse de carbon sunt glucidele. Acestea sunt substanele cele mai
utilizate i mai accesibile plantelor ca surs energetic. Dozele pe litru sunt de cca. 2-3% n funcie de
faza de vegetaie i tipul de explant folosit. Dintre glucide zaharoza rspunde cel mai bine cerinelor
culturilor in vitro.
Aminoacizii
Sunt utilizai ca surse de azot amoniacal disponibil imediat pentru celule i esuturi, fa de
azotul organic care este mai greu accesibil. Se adaug n mediu sub form de compui simpli sau
compleci. Principalii aminoacizi utilizai sunt: glicina, asparagina, acidul aspargic, cisteina, alanina,
glutamina etc.
Vitaminele
Plantele spre deosebire de animale sunt capabile de sinteza vitaminelor, dar nu i esuturile
cultivate in vitro. S-a demonstrat experimental ca in vitro esuturile i plantulele rspund favorabil la
adaosul exogen de vitamine n cantiti mici. Majoritatea vitaminelor sunt termolabile, sunt distruse la
temperaturi ridicate, uneori cu ocazia autoclavrii, dar s-a observat c i substanele reziduale au rol
favorabil asupra culturii.
Principalele vitamine utilizate n mediile de cultur sunt:
-tiamina (vitamina B1, aneurina), se folosete n concentraii cuprinse ntre 0,1-10 mg/l;
stimuleaz creterea vegetativ, sporirea biomasei produs in vitro;
-piridoxina (vitamina B6), 0,1-1 mg/l; precursor a unor coenzime, cataliznd reacii de baza n
metabolismul aminoacizilor;
-riboflavina (vitamina B2), 0,1-1 mg/l, rezistent la temperaturi ridicate (280oC); inhibitor al
creterii rdcinilor, rol n metabolismul celular;
-acidul pantotenic (vitamina B5), este mai puin utilizat ca atare; pantotenatul de calciu se
folosete n concentraii cuprinse ntre 0,5-2,5 mg/l;
-cobalamina (vitamina B12), este mai rar folosit, stimuleaz sinteza nucleoproteidelor;
-acidul nicotinic (vitamina B3, niacina), 0,5-5 mg/l, rezistent la temperaturi ridicate (234237oC); rol n metabolismul intermediar;
191

-biotina (vitamina H), 0,1 mg/l; stimuleaz creterea esuturilor meristematice i proliferarea
celulelor;
-acidul folic, 0,01 mg/l; efect stimulator asupra creterii esuturilor la lumin; la ntuneric are
efect toxic;
-acidul para-aminobenzoic, 1 mg/l; stimuleaz biosinteza acidului pantotenic i a biotinei;
-acidul ascorbic (vitamina C), 1-100 mg/l, prin autoclavare se distruge n bun parte; este
activator general al metabolismului celular;
-vitamina E (tocoferolul), mrete sensibilitatea celulelor la auxine;
-inozitolul (mio-inozitolul, mezo-inozitolul, hexahidroxi-ciclohexan), 100-1000 mg/l; este
considerat att vitamin ct i glucid; stimuleaz diviziunea celular.
Fitoregulatorii
Fitohormonii, fitoregulatorii sau substanele regulatoare de cretere sunt substane organice
utilizate n cantiti mici cu rol de a stimula, inhiba sau controla procesele fiziologice de cretere i
dezvoltare. Exist fitohormoni endogeni, sintetizai de plante i fitohormoni exogeni sau de sintez.
esuturile in vitro nu sunt capabile s-i sintetizeze ntreaga cantitate de care au nevoie, fiind
necesar adugarea lor n mediul de cultur pentru a asigura o bun cretere a explantelor. Cei mai
folosii fitohormoni n culturile in vitro sunt auxinele, citochininele i giberelinele.
Auxinele sunt mult utilizate pentru reglarea proceselor de morfogenez alturi de
citochinine. Auxina natural descoperit este AIA (acidul indolil-acetic) care se produce i prin
sintez pe cale industrial. Cele mai folosite auxine de sintez sunt:
-IBA (acidul 3 indolil butiric); ANA (acidul naftilacetic); 2,4D (acidul 2,4 diclorfenoxiacetic);
ANOA (acidul beta naftoxiacetic).
Aciunea auxinelor este foarte complex datorit intreaciunii pe care o are cu alte substane
regulatoare i interveniei asupra unor procese fiziologice. Rolul auxinelor poate fi redat astfel:
-stimuleaz diviziunea celular;
- influeneaz alungirea celulelor prin mrirea plasticitii peretelui celular;
-modific permeabilitatea membranelor plasmatice pentru ap i ioni;
-rol important n dominana apical;
-inhib formarea embrionilor somatici n suspensiile celulare;
Auxinele sunt sintetizate n partea aerian a plantelor n muguri, frunze, fructele tinere i
bobocii florilor de unde circul n toat planta. Cel mai mult se folosesc ANA i 2,4D care sunt mai
stabile, nu se oxideaz n prezena luminii. 2,4D este mult utilizat pentru inducerea i creterea
calusului i pentru rizogenez. La calus asigur friabilitate mare uurnd separarea calusului pentru
cultura de suspensii celulare i n embriogeneza somatic.
Citochininele sunt substane ce se gsesc n cantiti relativ ridicate n fructe, semine, etc., iar
ca structur au la baz adenina i un nucleu purinic.
Prima citochinin izolat a fost chinetina, experimentat cu succes la culturile in vitro. La scurt
timp s-a sintetizat benzil aminopurina (BAP). n prezent se folosesc pentru culturile de esuturi patru
citochinine dintre care dou naturale (2 IP i zeatin) i doua de sintez (chinetina i BAP).
Efectul fiziologic al citochininelor const n:
-acioneaz asupra diviziunii celulare alturi de auxine;
-stimuleaz formarea mugurilor adventivi i din calus;
-stimuleaz formarea lstarilor laterali;
-stimuleaz sinteza proteic;
-inhib formarea rdcinilor.
Biosinteza citochininelor endogene are loc n rdcini i n embrioni, iar migrarea este
dependent de cea a glucidelor. Sunt substane termostabile suportnd uor autoclavarea.
Giberelinele sunt substane care acioneaz la nivelul ntregii plante i nu asupra celulei, cu rol
n stimularea creterii, nfloririi i fructificrii. Cea mai utilizat giberelin este acidul giberelic (GA3)
fiind i cea mai activ.
Aciunea fiziologic este urmtoarea:
-produce alungirea internodiilor tulpinilor;
192

-stimuleaz creterea frunzelor i rdcinilor.


Giberelinele sunt sintetizate n frunzele i fructele tinere, n mugurii activi, n embrioni i
vrful rdcinilor, circulnd n plante prin vasele liberiene. Pentru meristeme giberelina este
indispensabil n vederea alungirii lor. La alte tipuri de explante nu se recomand giberelina deoarece
inhib dediferenierea celular.
Etilena a fost recunoscut ca fitoregulator mult mai trziu i este utilizat puin n culturile in
vitro. Rolul fiziologic poate fi prezentat sintetic astfel:
-exercit un control asupra creterii permeabilitii membranelor;
-induce senescena esuturilor;
-are rol n transportul auxinei;
-se produce n cantiti mai mari n esuturile i celulele rnite;
-inhib extensia celular.
Acidul abscisic este implicat n procesele de laten a mugurilor i seminelor. Poate fi utilizat
pentru:
-inducerea latenei embrionilor somatici;
-inducerea latenei seminelor artificiale n vederea pstrrii lor o perioad mai lung;
-inhibarea creterii esuturilor i organelor pe timpul stocrii;
-are rol antagonist cu auxinele i giberelinele.
Agenii de solidificare
Substratul nutritiv utilizat la culturile in vitro este de obicei semisolid sau solid, utilizarea
mediului lichid fiind limitat doar la unele experiene i la cultura de suspensii celulare. Cel mai
utilizat agent de solidificare este agarul obinut din alge i are urmtoarele caracteristici:
-formeaz cu apa un gel care se topete la 100oC i se solidific la 45 oC, rmnnd solid n
condiii normale de cultur;
-nu este toxic pentru plante i nu este asimilat de plante;
-nu conine elemente minerale care s afecteze echilibrul dintre ioni n mediul de cultur, fa
de reeta de mediu folosit;
-nu reacioneaz cu constituenii mediului.
Cantitatea de agar utilizat la litru de mediu difer n funcie de consistena dorit, ntre 0,5-1%.
Cu rol similar n solidificarea mediului de cultur se mai folosesc:
-agaroza are un nalt grad de purificare i se folosete mai ales pentru cultura protoplatilor i
n prepararea gelului pentru electroforez;
-acidul alginic se folosete pentru cultura protoplatilor, suspensiilor celulare i pentru
ncapsularea embrionilor somatici n vederea obinerii seminelor artificiale;
-phytagelul (Gelrite) produce un gel limpede. Se folosete n concentraii de 1,5-2,0 % i se
gelifica la 27-31oC. Se utilizeaz mai ales la speciile care necesit un pH mai acid, asigurnd
solidificarea mediului i n aceste condiii.

C. Alte substane utilizate


Adenina are rol regulator n mediul de cultur, favorizeaz formarea mugurilor adventivi,
stimuleaz creterea i alungirea apexurilor ct i rata de multiplicare. Se pare c are o aciune
sinergic cu a citochininelor putnd fi un precursor al acestora. De regul se folosete sub form de
sulfat de adenin, n doz de 40-80 mg/l.
Compuii fenolici stimuleaz creterea calusului, favorizeaz nrdcinarea, creterea
lstarilor i a ratei de multiplicare. Are o aciune sinergic cu a auxinelor, n special cu AIA. Dup
unii autori are rol n prevenirea degradrii auxinelor. Dintre compuii fenolici cel mai utilizat este
fluoroglucinolul i procaina.
Floroglucinolul este mult utilizat n multiplicarea meristematic a pomilor i arborilor, se
gsete n seva brut, mai ales la mr.
193

Procaina are rol n multiplicarea i respiraia celulelor, stimuleaz creterea biomasei


explantelor, a coninutului n pigmeni, stimuleaz germinaia seminelor i creterea plantelor. Dozele
utilizate sunt cuprinse ntre 0,1-10 mg/l.
Substanele antioxidante se utilizeaz pentru prevenirea brunificrilor explantelor i a
mediului, n special, la speciile ce conin substane fenolice n cantiti mari, evitnd oxidarea lor. Se
folosesc fie ca soluii n care se ine materialul vegetal naintea prelevrii explantelor, fie se adaug n
mediul de cultur. Dintre substanele antioxidante, cele mai folosite sunt: acidul ascorbic (50-100
mg/l), acidul citric (150 mg/l), cisteina HCl (100 mg/l).
Polivinilpirolidona (PVP) este un poliamid utilizat pentru absorbia i blocarea fenolilor,
mpiedicnd astfel oxidarea lor cu brunificarea i moartea explantului. Se folosete n concentraii de
250-1000 mg/l.
Crbunele activ este un crbune vegetal, bine mrunit ce se adaug mediului, cu scopul de a
absorbi i bloca substanele toxice din mediu. Poate avea aciune i asupra fitohormonilor (auxine),
blocndu-le parial efectul, are aciune de inhibare a formrii calusului, stimuleaz embriogeneza,
favorizeaz formarea rdcinilor.
Uneori se mai pot folosi i alte substane cu rol de a mbuntii, de a completa compoziia
mediului, cum sunt: laptele de cocos, sucul de tomate, sucuri de fructe. Prezena acestora n mediul de
cultur este facultativ.
4.1.1.2 Caracteristicile fizice ale unui mediu de cultur
Metabolismul unui esut vegetal poate fi modificat integral n funcie de consistena mediului
de cultur. Rdcini de cicoare cultivate pe hrtie de filtru mbibat cu mediu lichid pot produce doar
lstari vegetativi, n timp ce cultivate pe mediu solidificat cu agar pot genera muguri florali. Alegerea
tipului de mediu de cultur, lichid sau solid, prezint o importan deosebit.
La mediul solid, concentraia de agar-agar, precum i calitatea acestuia au un efect distinct.
Masa calusului de cartof se dubleaz atunci cnd concentraia de agar-agar din mediu crete de la 0,8
la 1%, iar microbutaii de anghinare prezint fenomenul de hiperhidricitate pe mediu cu o concentraie
de agar-agar de 0,6% , ce dispare atunci cnd concentraia agarului crete la 1,1%.
Concentraia optim de agar variaz n funcie de tipul de organ cultivat, de calitatea agarului
folosit i de pH-ul mediului. n general, consistena mediului de cultur crete odat cu pH-ul acestuia.
Trecerea unor explante pe mediu lichid poate constitui o faz necesar n procesul de
micropropagare, ca n inducerii embriogenezei somatice la morcov din celule de calus n mediu lichid.
n cazul garoafelor, meristemele izolate sunt cultivate n mediu lichid cu agitare pentru a induce
lstrirea axilar multipl. Viteza de agitare a mediilor lichide este n general sczut atunci cnd se
cultiv organe (cca 1rpm) i ridicat n cazul culturii de suspensii celulare (cca 100 -150rpm).
Dac n alte tipuri de culturi nu se acord o mare importan schimbului de gaze, la culturile in
vitro schimbul de gaze cu exteriorul prezint o mare importan pentru inoculi. Schimburile de gaze se
realizeaz prin difuzie, diferenele de concentraie ntre gazele din interiorul containerelor i cele din
mediul ambiant exterior, precum i variaiile de temperatur influennd aceste schimburi.
Organogeneza indirect la morcov este stimulat de reducerea concentraiei de oxigen, pe cnd
nrdcinarea lstarilor a fost stimulat de creterea acesteia. Mai multe experimente au dovedit c
difuzia liber a oxigenului n esuturi a afectat semnificativ capacitatea organogenic a acestora. Alte
studii au demonstrat c intervenirea unei modificri n schimburile de gaze dintre esuturile cultivate
in vitro i mediu a indus apariia unor modificri n morfologia plantulelor. De aceea, este demn de
luat n considerare i tipul de vas de cultur folosit pentru culturile de celule i esuturi, precum i de
capacele utilizate: capace cu burete, parafilm, folie de aluminiu, etc.
Un alt factor important pentru mediul de cultur i implicit pentru plntuele regenerate in vitro
este pH-ul. n practic, ajustarea pH-ului se face la 5,5-5,8 n timpul preparrii mediului de cultur.
Totui, n dese cazuri pH-ul mediului scade n timpul autoclavrii sau chiar n timpul culturii ceea ce
poate avea efecte nedorite asupra materialului vegetal. Se tiu nc foarte puine despre efectele
acestor variaii ale pH-ului i despre cauzele determinante.
194

4.2 FACTORII FIZICI CARE INFLUENEAZ CULTURILE DE


ESUTURI
Principalii factori ai mediului nconjurtor sunt lumina i temperatura. Umiditatea relativ este
irelevant atta timp ct n interiorul vaselor de cultur aceasta atinge valori de aproximativ 100%.
4.2.1 Lumina
Cerinele fa de lumin pot fi divizate n mai muli parametri:
-intensitatea luminii pe unitatea de suprafa exprimat n W/m2 (unitatea lux nu ar mai trebui
folosit ca unitate de msur a intensitii luminoase, deoarece depinde de fiziologia ochiului uman,
ceea ce este total neadecvat necesitilor unei plante);
-durata iluminrii, exprimat n ore/zi;
-calitatea spectral a luminii primite de plante.
Pentru culturile de esuturi, fotosinteza nu este o activitate necesar atta timp ct energia este
furnizat sub forma carbohidrailor. Totui, unele cercetri au evideniat c fotosinteza nu este
eliminat n totalitate din culturile de esuturi vegetale, dar este considerabil redus probabil datorit
prezenei zaharurilor n mediu.
Numeroase studii au dovedit c lumina este indispensabil reglrii multor procese
morfogenetice.
A.Intensitatea luminoas
O intensitate luminoas foarte mare poate duce la pierderi importante n culturile in vitro.
Utilizarea unei intensiti luminoase de 50 W/m2 (aproximativ 10000luci) n camerele de cretere,
intensitate folosit n mod obinuit n fitotron, duce la ncetinirea creterii i scderea capacitii de
regenerare la multe specii vegetale. Intensitatea luminoas optim culturilor in vitro variaz ntre 5 i
25 W/m2 (1000-5000 luci) cele mai folosite valori fiind de 10 pn la 15 W/m2. deseori, n faza a
treia a micropropagrii, se urmrete creterea treptat a intensitii luminoase n vederea aclimatizrii
plantulelor la condiiile de lumin din fitotron.
B.Durata iluminrii
Nu exist multe date cu privire la influena fotoperiodismului asupra morfogenezei esuturilor
in vitro, aa cum exist dovezi clare ale influenei acestui parametru asupra plantelor donor, in vivo.
Se pare c n medie, calitatea luminii (intensitatea durata luminii) este important dezvoltrii
armonioase a plantulelor n condiii aseptice de cultur.
n practic, marea majoritate a camerelor de cretere au o durat a iluminrii de 16-18 ore/zi.
Cerinele fa de durata de iluminare, din camerele de cretere sunt diferite n funcie de natura
explantului, scopul urmrit dar i de specia la care se experimenteaz. Astfel, la gru, n cazul culturii
de antere, n vederea obinerii de produi androgenetici, s-a dovedit c, anterele cultivate n primele
ase sptmni la ntuneric, vor forma un procent mai ridicat de produi androgenetici. Dup aceast
perioad, culturile vor fi incubate n condiii normale de fotoperioad cu 16 ore lumin i 8 ore
ntuneric.
C.Calitatea luminii
Numeroase studii au evideniat c spectrul luminos influeneaz procesele fiziologice i
morfologice ale celulelor cultivate in vitro. Lumina albastr (cca 467nm) sau violet (cca 419nm)
induce formarea de lstari din calus de tutun, iar cea roie (cca 660nm) induce rizogeneza. Aceste
rezultatele asemntoare altora indic faptul c procesele morfogenetice par a fi reglate de pigmenii
fotoreceptori, cum ar fitocromul. n mod normal, lumina de zi conine radiaii n principal albastre,
195

iar lumina numit lumin alb conine radiaii roii, dar nu se cunosc cu exactitate curbele spectrale
de emisie ale acestora. n general, tuburile fluorescente albe aflate n comer sunt adecvate culturilor
de esuturi.
n ultimul timp au aprut n comer dou tipuri de tuburi fluorescente: tuburi cu lumin cald
i tuburi cu lumin rece, astfel c, o combinaie ntre cele dou tipuri de tuburi s-a dovedit a fi foarte
potrivit pentru culturile incubate n camerele de cretere.
4.2.2 Temperatura
n general, temperatura folosit n camerele de cretere este de 22-24oC. Aceste temperaturi
sunt la pragul critic, deoarece n interiorul vaselor de cultur temperatura poate fi cu 2 pn la 4oC mai
mare dect n camera de cretere. Practic, temperatura din camera de cretere trebuie s fie cu 2 oC
mai mic dect cea necesar speciei cultivate in vitro. Speciile provenite din climatul temperat sunt
obinuite la temperaturi mai sczute dect speciile tropicale, de aceea ar fi de dorit ca pentru speciile
din zonele temperate s se seteze temperatura n camera de cretere la
201 oC , iar pentru cele
o
tropicale la 251 C.
De asemenea, temperatura n camera de cretere va fi diferit i n funcie de scopul urmrit n
cultura in vitro. Astfel, la cartof, s-a observat c o temperatur de cca 19oC, influeneaz pozitiv
formarea minituberculilor, n timp ce la gru, cultura de antere necesit o temperatur de cca 27oC.
De aceea, se recomand ca fiecare unitate de cercetare s beneficieze de cel puin dou camere
de cretere, n care temperatura s poat fi reglat n funcie de necesitile explantelor i tipurilor de
culturi existente.
n natur, plantele sunt supuse unor fluctuaii de temperatur, iar reproducerea lor n camera de
cretere ar fi fr ndoial avantajoas. Totui, prea puine studii au fost fcute n aceste sens pentru a
putea trage o concluzie relevant.

196

CAPITOLUL VI
6.1 INIIEREA UNEI CULTURI IN VITRO
6.1.1 Aspecte generale privind condiiile aseptice de cultur
Prima condiie n realizarea cu succes a unei culturi de celule sau esuturi in vitro este asepsia.
Mediile de cultur sunt foarte favorabile dezvoltrii bacteriilor i ciupercilor, creterea crora este
mult mai rapid dect cea a celulelor vegetale i duce la inhibarea proceselor fiziologice ale esuturilor
cultivate. De aceea un laborator de culturi de esuturi este organizat i pstrat ntr-o asepsie strict
asemeni unei sli de operaie.
Principalele cauze ale apariiei infeciilor n culturile in vitro sunt:
1) Aerul care conine o cantitate mare de organisme patogene de tipul bacteriilor sau fungilor.
2) esuturile vegetale sunt acoperite la suprafa cu fungi i/sau bacterii. Cele mai infectate
organe sunt cele ce se dezvolt n pmnt (rdcini, bulbi, tuberculi). Bacteriile i ciupercile se
dezvolt i n interiorul esuturilor, n vasele conductoare libero-lemnoase sau n spaiile
intercelulare, caz n care este imposibil sterilizarea esuturilor, iar folosirea antibioticelor nu este
recomandat.
3) Corpul uman, care poart numeroase microorganisme pe piele sau n respiraie.
Metodele de eliminare ale acestor surse de infecie sunt:
a) Produsele chimice, care distrug microorganismele:
-hipoclorit de sodiu;
-hipoclorit de calciu;
-mercurobutol;
-clorid mercuric;
-produse bactericide i fungicide;
-etanol 70-80%.
b)Becuri de gaz pentru sterilizarea instrumentarului prin flambare.
c) Aerul cald: la 120oC timp de 20 minute (autoclav), cldur umed pentru sterilizarea
mediilor de cultur i a apei sau 180 oC timp de 2-3 ore, cldur uscat (etuv) pentru sterilizarea
sticlriei.
d) Razele ultraviolete, care distrug doar o parte din spori.
e) Sisteme de filtrare a aerului: se folosesc filtre speciale ce nu permit trecerea particulelor mai
mari de 0,22m. Filtrarea este realizat de un ventilator-extractor ce asigur o ventilaie constant cu o
vitez optim i are avantajul de a menine steril aerul din incinta hotei cu flux laminar. n momentul
de fa toate laboratoarele de culturi aseptice sunt prevzute cu hote cu flux laminar de aer steril.
6.1.2 Prepararea mediului de cultur
Datorit faptului c n prepararea unui mediu de cultur intervin mai muli factori este necesar
alctuirea unei liste de materiale nainte de a se trece la prepararea lui. Pe parcursul preparrii se vor
bifa, pe rnd, toate elementele msurate i introduse, inndu-se seama cu strictee de volumul final al
mediului.
Se vor nota cu atenie toate detaliile legate de proveniena substanelor chimice sau a soluiilor
stoc, erorile, coreciile, proveniena agarului, calitatea apei. n aparena sunt factori ce nu prezint o
mare importan, dar n realitate succesul unei culturi depinde ntr-o foarte mare msur de calitatea
mediului i implicit de factorii menionai mai sus.
Etapele preparrii unui mediu de cultur sunt:
1)Diluia srurilor minerale: macro- i microelemente, apoi ajustarea la volumul final.
2)Msurarea pH-ului, corectarea cu KOH 10N; n general pH-ul este de 5,5-5,8.
3)Adiia zaharurilor (sucrozei) urmat de adiia agarului, care se adaug n ploaie n timp ce
mediul este amestecat tot timpul.
197

4)Sterilizarea mediului de cultur la 120oC ntre 20-30 minute, n funcie de cantitatea de


mediu din recipient.
5)Adugarea vitaminelor i hormonilor (sterilizai prin filtrare) n mediu se face atunci cnd
temperatura mediului ajunge la 40-50 oC.
6)Repartizarea mediului n vasele de cultur sterile se face imediat dup adiia vitaminelor i
fitohormonilor.
Observaii
Mediile de cultur pot fi preparate n vase Erlenmeyer, dac se prepar cantiti mici (mai
puin de un litru), iar agarul este sterilizat odat cu mediul prin autoclavare n kukt. Pentru cantiti
mai mari de un litru se folosesc vase speciale, borcane cu capac termorezistent.
Dac mediul conine substane labile termic, substanele vor fi dizolvate separat, apoi
sterilizate prin filtrare i incorporate n mediul autoclavat n prealabil. Acest procedeu se execut n
hota cu flux laminar de aer steril.
Dac se folosesc vase de cultur din plastic achiziionate din comer sterilizate, adiia mediului
de cultur sterilizat se va face de asemenea n condiii sterile, la gura becului de gaz unde temperatura
este de aproximativ 40oC, dup ce gura vasului Erlenmeyer n care se afl mediul s-a trecut prin
flacr pentru flambare.
Ajustarea pH-ului se face de preferat cu pH metrul nainte de sterilizarea mediului. A se evita
hrtia de pH deoarece aceasta nu d rezultate precise i importana stabilirii unui pH corect se reflect
n succesul culturii in vitro. Agarul i zaharoza nu schimb pH-ul mediului, de aceea ajustarea
acestuia se face nainte de adiia celor dou componente.
Pentru a se evita infectarea soluiilor stoc este recomandabil folosirea unor recipiente
auxiliare, n care se va goli o cantitate aproximativ egal cu cea necesar preparrii mediului de
cultur, din care se va lua cu ajutorul pipetei cantitatea optim.
6.1.3 Izolarea i inocularea explantelor
Din punct de vedere teoretic, toate prile unei plante pot constitui explante pentru iniierea
unei culturi de esuturi, datorit totipotenei celulare, proprietate a celulei vegetale de a regenera n
mod normal un individ ntreg, identic cu planta donor.
Din punct de vedere al asepsiei, pot fi distinse dou tehnici obligatorii:
-stabilirea unei culturi aseptice din esuturi prelevate de la o plant ntreag cultivat n condiii
nesterile (prima etap a micropropagrii vegetale);
-meninerea asepsiei unei culturi deja iniiate prin transplantarea inoculilor n condiii aseptice
pe alte medii de cultur (etapele a doua i a treia n tehnica de micropropagare vegetativ).
Prima categorie prezint cele mai mari dificulti deoarece implic efectuarea unei sterilizri
corect a esuturilor ce urmeaz a fi introduse n condiii aseptice de cultur.
A.Sterilizarea esuturilor
Sterilizarea materialului vegetal nainte de iniierea unei culturi in vitro este dificil deoarece
gradul de infectare al esuturilor este variabil i pentru fiecare tip de manipulare trebuie utilizate
diferite substane chimice, n diferite concentraii cu durate diferite de timp pentru imersarea
esuturilor. n general, prile aeriene ale unei plante sunt mult mai puin infectate cu bacterii i fungi
dect cele subterane. Dificultatea sterilizrii const n necesitatea absolut de a distruge toate
microorganismele patogene folosind produse chimice, astfel nct s nu se distrug i celulele vegetale
(care sunt cel puin la fel de sensibile precum bacteriile sau fungii). De aceea, este absolut necesar
stabilirea unui timp optim de imersare a esuturilor n soluiile sterilizante.
Drept exemplu, pentru micropropagarea Saintpauliei tehnicile de sterilizare optime sunt:
-fasonarea peiolului n fragmente de aproximativ 1cm lungime;
-imersia fragmentelor de peiol n etanol 70% timp de 20 secunde;
-imersia n hipoclorit de calciu 4% timp de 12 minute, cu agitarea continu a vasului n care se
realizeaz imersia;
198

-efectuarea a trei cltiri succesive cu ap distilat steril pentru ndeprtarea agentului de


sterilizare.
Cel mai utilizat produs de sterilizare este hipocloritul de calciu Ca(OCl)2 deoarece nu
penetreaz esutul vegetal. Este totui un produs puin stabil n soluie apoas i trebuie preparat
imediat nainte de utilizare cantitatea dorit de hipoclorit este dizolvat n ap prin agitare continu
timp de aproximativ 10 minute, dup care, soluia format se filtreaz, iar filtratul se utilizeaz
imediat. Concentraiile standard folosite sunt de 4% i 8%, iar timpul de imersie variaz ntre 5 i 30
de minute.
Ali produi chimici ce pot fi folosii pentru sterilizarea materialului vegetal sunt:
Hipocloritul de sodiu, NaOCl - acest produs este comercializat n pungi de plastic cu titrul
colorimetric de 48o. Se folosesc concentraii ntre 5% i 20% v/v. Timpul necesar pentru realizarea
unei sterilizri optime la o diluie de 5% este de la 5 minute la 30 de minute. Acest produs penetreaz
esuturile putnd cauza leziuni la nivel celular ducnd la scderea capacitii regenerative a esuturilor
cultivate in vitro.
Biclorura mercuric (otrav puternic), HgCl2 este un sterilizant foarte eficient, folosit n
doze mici de ordinul 0,01% pn la 0,05%. Este dificil de nlturat deoarece are aderen crescut la
esuturi, necesitnd cltiri repetate, fiind recomandate cinci-ase cltiri comparativ cu trei n alte
cazuri.
Mercurobutol este de asemenea un sterilizant foarte bun i se poate gsi n farmacii. Conine
un detergent ce-i mrete puterea de penetrarea i eficiena, dar este foarte dificil de nlturat
necesitnd efectuarea a dou, trei cltiri cu alcool etilic de 70%.
Trebuie subliniat faptul c sterilizarea materialului biologic vegetal se realizeaz numai la
suprafa i dac accidental esuturile sunt infectate n interior nu este posibil sterilizarea lor.
n unele cazuri sterilizarea explantelor nu este necesar, cum ar cazul meristemelor bine
protejate de numeroase frunzulie rudimentare sau a anterelor protejate n spic.
B.Pregtirea echipamentului necesar sterilizrii i lucrului la hota cu flux laminar steril
nainte de realizarea sterilizrii materialului vegetal i nceperea operaiilor de fasonare i
inoculare pe mediu de cultur artificial a materialului vegetal, activiti ce se realizeaz n condiii
sterile, este necesar pregtirea hotei cu flux laminar de aer steril, locul unde se vor realiza etapele
precizate.
Sterilizarea hotei necesit parcurgerea mai multor etape:
- se terg, cu o bucat de vat nmuiat n alcool etilic de 70%, toate suprafeele orizontale i verticale
din interiorul hotei insistndu-se pe suprafaa de lucru;
- se pulverizeaz puin alcool pe filtrele de aer ale hotei;
- se pulverizeaz alcool n toate colurile i colioarele interiorului hotei;
- se pornete lampa UV, iar dup cinci minute se pornete i ventilaia.
n cazul hotelor cu flux de aer laminar (alctuit din lamele dispuse n straturi paralele) steril
este suficient, ca nainte de utilizare, s se tearg cu alcool etilic 70% toate suprafeele interioare, n
special suprafaa de lucru. La acest tip de hot, filtrul de aer nu trebuie pulverizat cu alcool sau alte
lichide deoarece este foarte fragil.
Pregtirea instrumentarului se face nainte de nceperea lucrului:
- se flambeaz instrumentele de metal la flacra becului de gaz, dup nmuierea n alcool 90%; este
recomandabil folosirea concomitent a cte trei buci din fiecare instrument;
- instrumentele se imerseaz n alcool etilic 70% n vase de sticl dac nu se folosete flambarea i n
alcool de 90-96% dac se dorete flambarea acestora;
- hrtia de filtru sau aluminiu folosit ca suport pentru fasonarea materialului biologic se sterilizeaz
prin autoclavare;
- vasele Petri sterilizate n prealabil n etuv la 180oC timp de 2-3ore se scot, din pachetele de hrtie
sau din cutiile de metal speciale n care au fost sterilizate, doar n hota sterilizat;
- mediul de cultur sterilizat se va turna n vase de sticl sau plastic sterilizate n prealabil doar la hot,
cnd aceasta este pornit;
199

- se pregtesc vasele de cultur cu sau fr mediu;


- se pregtesc dou borcane cu ap distilat steril, pentru cltirea materialului vegetal, sau a
instrumentarului n cazul cnd acesta este introdus doar n alcool, fr flambare.
C.Operaiunile ce se execut la hota cu flux de aer steril
Meninerea condiiilor aseptice se face urmnd cteva reguli stricte i necesare:
- nainte de a ncepe lucrul la hot, operatorul trebuie s-i spele minile cu spun (preferabil cu
mercurobutol sau alt substan sterilizant), s-i suflece mnecile halatului pn mai sus de coate,
s-i frece palmele, ncheieturile minilor i antebraele cu alcool 70% sau cu mercurobutol i s se
clteasc cu ap distilat steril;
- minile operatorului vor fi sterilizate cu alcool de 70%, de fiecare dat cnd vin n contact cu
materiale nesterile (pr, haine, etc);
- instrumentarul se schimb des, dup dou pn la maximum cinci explante, i se sterilizeaz prin
flambare sau imersie n alcool i cltire cu ap distilat steril;
- explantele se fasoneaz cu ajutorul unui bisturiu chirurgical cu lama foarte fin, mai ales cnd se
dorete obinerea unor explante de dimensiuni mici, cum e cazul meristemelor, sau extrase cu ajutorul
pensetelor cu vrf subire, n cazul anterelor, ovulelor, etc;
- explantele sunt inoculate pe mediu imediat pentru a se evita deshidratarea lor i intrarea n contact cu
germenii, viteza de lucru fiind un factor important n succesul culturilor in vitro;
- orice explant ce a czut pe masa de lucru sau a fost atins de altceva n afar de hrtia de lucru steril,
va fi eliminat;
- dopurile de vat nu vor fi lsate niciodat pe masa de lucru, iar capacele pot fi plasate cu gura n jos;
- gturile borcanelor, vaselor Erlenmeyer i sticlelor sunt sterilizate prin trecerea prin flacra becului
de gaz;
- odat cu terminarea lucrului, alcoolul rmas va fi pstrat n containere nchise, pentru siguran.
6.1.4 Meninerea culturilor
n general, culturile sunt plasate pe rafturi iluminate cu tuburi neon fluorescent alb cu o
intensitate de 12W/m2 (aproximativ 2500 luci) la o temperatur de 20-25o i un fotoperiodism de 16
ore lumin i 8 ore ntuneric.
Odat cu instalarea culturilor se va urmri apariia infeciilor, care se vd n general dup
cteva zile.
6.1.5 Infeciile i cauzele apariiei acestora
Apariia infeciilor n culturile in vitro are mai multe cauze. Dup simptomele manifestate
putem s ne dm seama dac infecia este cauzat de o ciuperc sau de o bacterie.
Dac este generat de o ciuperc, se va observa dezvoltarea unui miceliu cu o textur mat sau
pufoas, de cele mai multe ori de culoare alb sau gri. Penicillium genereaz un miceliu de culoare gri
mat, pe cnd Rhizopus nigricans, care se i multiplic foarte repede i care trebuie distrus prin
autoclavarea culturilor nainte de deschidere i splare, sau aruncare, formeaz miceliu de culoare
nchis cu aspectul unor fructificaii de culoare neagr.
Dac infeciile se datoreaz unei bacterii se va manifesta de forma unei paste lptoase n
interiorul mediului i pe suprafaa acestuia. Aceast past este uneori colorat roz sau galben.
Se va observa dac infecia a pornit de la zona de contact dintre esut i mediul de cultur, i
dac e aa se poate concluziona c sursa de infecie este nsui explantul. Dac infecia pornete din alt
punct al mediului de cultur, sursa poate fi aerul, sterilizarea ineficient a mediului sau din apa
condensat pe capacul recipientului de cultur. n unele cazuri, din fericire rare, sporii unor bacterii
pot rezista autoclavrii, de aceea este necesar cltirea sticlriei n clorur lichid. Atunci cnd se
observ dezvoltarea unui miceliu de Penicillinium se constat o capacitate de lucru slab a
operatorului. Manipularea necorespunztoare a materialului vegetal i aplicarea ineficient a tehnicilor
de cultur in vitro, genernd infecii ale culturilor se poate datora: vorbitului n timpul lucrului la hota
200

cu flux de aer laminar steril, sterilizarea necorespunztoare i insuficient a instrumentarului,


transportul microorganismelor de la explantele infectate la cele neinfectate.
Se poate ca, n cursul culturii, s nu se observe apariia unei infecii cu bacterii, caz n care
mediul de cultur folosit nu permite dezvoltarea acestora. Totui, culturile pot fi infectate i cea mai
sigur cale este subcultivarea lor pe mediu adiionat cu 2g/l pepton (un component obligatoriu n
mediile de cretere ale bacteriilor). Prin aceast metod se testeaz culturile i de elimin vasele de
cultur infectate, obinnd culturi de esuturi libere de bacterii.
6.1.6 Probleme tehnice minore ce pot cauza pierderi n culturile in vitro
Se poate ntmpla ca unele culturi s mearg foarte bine n anumite condiii, iar alteori, n
aceleai condiii s mearg prost sau deloc. Problema poate fi dat de condiiile de cultur, care sunt
rareori identice, condiiile climaterice din camera de cretere se pot schimba, s-a schimbat tipul
vasului de cultur sau calitatea sticlei acestuia. Un singur detaliu minor n aparen, poate schimba
ntreaga evoluie a culturii, de aceea atenia i meticulozitatea sunt caliti absolut necesare unui
operator in vitro.
n continuare se prezint cteva exemple concludente:
- creterea volumului vasului de cultur poate ncetini schimbul de gaze cu exteriorul ceea ce duce la
ncetinirea creterii inoculilor;
- utilizarea parafilmului ncetinete considerabil schimbul de gaze i poate modifica funcionarea
esuturilor;
- unele capace cptuite conin cleiuri toxice ce pot, prin evaporare sau prin dizolvare n apa
condensat, s otrveasc esuturile; de aceea, este recomandat ndeprtarea acestor cptueli nainte
de folosirea capacelor;
- condensul apei n vasele de cultur apare atunci cnd temperatura din exteriorul vasului este cu
cteva grade mai mic dect cea din interior, cauza putnd fi expunerea direct a culturilor la aerul
rece suflat de aparatele de climatizare.
6.1.7 Metode de iniiere a unor tipuri de culturi din diferite explante
6.1.7.1 Cultura de rdcini
Cultura de rdcini const n creterea pe medii aseptice a rdcinilor detaate. Tehnicile de
cultivare in vitro a rdcinilor au fost realizate nc n etapa de pionierat a cercetrilor efectuate n
aceast direcie. Astfel, White a dovedit c rdcini detaate de la plantule de tomate pot fi cultivate in
vitro timp nelimitat, prin subculturi repetate.
n general, se utilizeaz rdcina primar, embrionar, prelevat de la plantulele formate prin
germinarea seminelor n condiii aseptice. Principala problem care se ridic, n acest caz, este aceea
a realizrii unei perfecte sterilizri a seminelor. Smna sntoas, cu tegumentele ntregi, nelezate,
are esuturi embrionare neinfectate. Seminele pot fi dezinfectate folosind ageni puternici de
sterilizare ntruct prezena tegumentului protejeaz formaiunile embrionare de toxicitatea soluiei de
sterilizare. Astfel, un exemplu de realizare a sterilizrii, izolrii i cultivrii in vitro poate fi cel al unei
rdcini primare prelevate de la o plantul de mazre. Aproximativ 20 semine de mazre, cu
tegumentul ntreg, se introduc ntr-un vas Erlenmayer, n aproximativ 250 ml alcool etilic 70o; se agit
seminele, iar dup cca 10 secunde se decanteaz etanolul iar peste semine se adaug soluie de
hipoclorit de calciu 10%, timp de 20 minute, toate operaiunile efectundu-se n camera steril. Dup
cele 20 minute se decanteaz soluia de hipoclorit de calciu iar seminele se cltesc n trei reprize de
ap distilat steril. Dup cltire se ndeprteaz seminele devenite translucide, ca urmare a infiltrrii
apei sub tegument, iar seminele ntregi se inoculeaz, tot n condiii sterile, n vase Petri, n care a fost
repartizat un mediu de cultur MS (Murashige-Skoog) simplu constituit din soluia stoc de
macroelemente i agar 6,5%. Seminele se incubeaz la ntuneric, n condiii controlate, timp de 48
ore, dup care, cnd rdcinia plantulei atinge lungimea de aproximativ 20 mm, n condiii aseptice,
201

se detaeaz vrful rdciniei (cca 5-10 mm) i se inoculeaz tot n vase Petri, 1-2 explante/vas, pe un
mediu de cultur constituit din macroelemente i zaharoz, pH-ul fiind 5,8 (Reinert i Yeoman, 1982).
Se poate constata c mediul de cultur recomandat este unul simplu lipsit de microelemente,
vitamine sau hormoni. Se pot utiliza i medii mai complexe, clasice, iar ca surs de carbon organic
poate fi folosit glucoza n loc de zaharoz. Creterea rdcinilor in vitro are loc pe medii de cultur
lichide neagitate. Zilnic se poate urmri dezvoltarea radicelelor secundare, prin aplicarea sub cutia
Petri a unei hrtii milimetrice.
De obicei, dup 21 zile de cultur se constat o plafonare a creterii, moment n care se
recomand subcultivarea rdcinilor, prin excizarea apexului i transferarea lui pe mediu proaspt.
Subcultura se poate face i la interval de 7 zile. Dup aproximativ dou subculturi, este oportun
introducerea n mediul de cultur a tiaminei i a acidului nicotinic, n dozele normale, utilizate pentru
alte tipuri de explante.
Prin cultura de rdcini s-a putut cerceta efectul auxinelor asupra celulelor radiculare. Street
precizeaz c auxina stimuleaz att creterea n lungime a fragmentelor de rdcini de tomate ct i
diviziunea celulelor meristemului apical. Utiliznd culturi de rdcini, pe diferite tipuri de medii, ca i
compoziie i consisten, s-a putut stabili efectul diferiilor fitohormoni de cretere, al elementelor
chimice sau al unor substane organice, n formarea rdcinilor, n creterea lor, precum i urmrile
carenrii celulelor lor n anumite elemente. Prin extrapolarea acestor rezultate, s-a reuit mbogirea,
an de an, a cunotinelor privind funcionarea rdcinilor i rolul lor n metabolismul general.
De asemenea, din cultura de rdcini se poate obine uor calus, mai ales din cele principale
sau din cele ngroate secundar. Procesele de organogenez, la nivelul rdcinilor netransformate n
calus, se rezum la ramificarea acestora n radicele secundare. Geneza de mugurai i tulpinie are loc
la nivelul esutului calusal, provenit din rdcini, sau pe explante radiculare.
6.1.7.2 Cultura de meristeme
Meristemele sunt esuturi de tip formativ, cu celule tinere, ce-i menin, n tot cursul vieii
plantelor, capacitatea de a prolifera, respectiv proprietatea de a se divide, formnd mereu noi celule.
Meristemele sunt localizate n vrful ramificaiilor organelor (tulpini sau rdcini), fiind meristeme
apicale, de tip primar, cu rol n creterea n lungimea organelor; meristeme primare gsim i n
straturile profunde ale rdcinilor i tulpinilor. La organele ce sufer procese de modificare secundar
morfo-anatomic, ngrori, ntlnim meristeme secundare, respectiv cambiul i felogenul. De regul,
prin termenul de cultur de meristeme se nelege cultivarea in vitro a meristemelor apicale, caulinare.
Masivul de celule care alctuiete meristemul apical se apreciaz c msoar maximum 500
(Margara, 1982) sau altfel spus, cca 0,1 mm diametru i 0,25-0,30 mm lungime (Kartha, 1981). n
cazul n care se depete aceast dimensiune, vorbim despre o cultur de apex.
Celulele meristematice dein caracteristici structurale particulare, ce le confer capacitatea de a
se menine ntr-o continu stare de proliferare, cum ar fi:
-au pereii celulari subiri, celulozici, nemodificai secundar;
-sunt bogate n citoplasm, au mitocondrii numeroase, nucleul este mare, cu nucleoli bine
reliefai;
-vacuolele sunt mici i nu dein metabolii.
n raport cu celulele parenchimatice sau cu cele prozenchimatice, celulele meristematice sunt
mici, strns unite ntre ele, fr spaii intercelulare. Meristemele primare au celule de forma poligonal
iar meristemele secundare au form tabular. Celulele derivate din multiplicarea meristemelor
secundare au o dispoziie radial, respectiv toate celulele generate dintr-o celul meristematic mam
sunt dispuse liniar, perpendicular pe celula ce le-a dat natere.
Celulele meristemului apical, caulinar, sunt uniforme din punct de vedere anatomic, dar
arbitrar, la angiosperme, straturile de celule componente sunt submprite n tunica i corpusul.
La meristemul radicular pturile celulare prezint o structur diferit de aceea descris la
tulpin.

202

Forma, mrimea i conformaia meristemului apical, caulinar variaz mult la diferitele specii
dar, n mare, s-au delimitat trei tipuri principale structurale: meristemul criptogamelor vasculare,
meristemul la gimnosperme i meristemul de angiosperme.
Meristemul caulinar terminal este localizat n vrful ramurilor i de regul, este protejat n
mugur. El poate fi apical, axilar sau adventiv.
Mugurele este constituit dintr-un ax, n apexul cruia se afl meristemul. Prin diviziunea
continu a meristemului rezult celule care, pe msur ce se ndeprteaz de apex se difereniaz
funcional. Celulele externe ale masivului tisular (numit con de cretere sau vrf vegetativ) se pliaz,
iar protuberanele rezultate constituie primordiile. Cu timpul, primordiile se difereniaz n primordii
foliare sau florale. De regul, n primordiile florale se produce o cretere a intensitii ratei de
multiplicare celular, aceti muguri devin mai bombai, mai voluminoi. Celulele din zona central se
difereniaz n xilem, floem i esut parenchimatic. Centrifug, dinspre centru spre periferia mugurelui,
se ntlnesc primordii transformate fie n frunzulie, din ce n ce mai mari, fie n boboci, respectiv n
componente florale. Mugurii i bobocii au capacitate regenerativ ridicat, graie faptului c dein
esuturi tinere, slab difereniate i celule meristematice. Meristemele apicale posed o relativ
autonomie, fapt nc insuficient argumentat i dovedit experimental. n evoluia in vitro a explantelor
meristematice, un rol important l are stadiul de dezvoltare al primordiilor. Primordiile florale
recoltate n faze prea avansate de dezvoltare, cultivate in vitro, se transform n floare. Adeseori,
funcie de specie, la nivelul nveliurilor florale se poate induce neogeneza de formaiuni
meristematice adventive.
Cambiul i felogenul sunt meristeme prezente n organele ngroate secundar sau n cele
metamorfozate (rdcini tuberizate). De regul, cambiul constituie o principal zon regenerativ.
esuturile inoculate pe medii aseptice, de regul, difereniate morfofuncional, trebuie s se
dediferenieze, fenomen ce se petrece n etape succesive, pn la rentoarcerea lor la starea de
meristem primar, respectiv neoformarea de meristeme. Fenomenul de dedifereniere celular se
produce i spontan, de exemplu n cazul iniierii unor meristeme, sau al genezei de rdcini secundare
din celulele periciclului radicular.
Dediferenierea celulelor inoculate in vitro poate consta n formarea de calus, dedifereniere
primar, din care se poate ajunge la un stadiu de dedifereniere secundar, cnd o parte din celulele
calusului se transform n meristeme, generatoare de rdcini sau tulpini.
Dediferenierea celulelor inoculate in vitro constituie o condiie a formrii de promeristeme i
de iniiere a organogenezei.
n cultura de meristeme, meristemul este prelevat mpreun cu dou primordii foliare
subiacente acestuia.
Ball (1946) a fost primul care a obinut plantule din meristeme de Lupinus albus i
Tropaeolum majus, prin cultivarea lor in vitro. Aceste experimente au relevat potenialitatea
organogenetic a diferitelor pri ale apexului.
n prezent, o atenie deosebit se acord studiilor privind cunoaterea reaciei meristemului
cultivat in vitro, n raport cu condiia funcional a meristemului in situ, precum i a rolului
primordiilor. Este evident faptul c un meristem izolat, cultivat pe medii aseptice, i poate manifesta
totipotenialitatea sa real; n condiiile inoculrii lui mpreun cu primordiile, ori in situ, aceast
capacitate este mascat de corelaiile existente ca urmare a prezenei alturi de meristem i a celorlalte
esuturi. Dezvoltarea in vitro a meristemului solitar, sau a celui nsoit de primordii, este dependent
de fitohormonii de cretere prezeni n mediul de cultur. Se pare c primordiile, chiar n faza n care
frunzele sunt abia schiate, se pot transforma fie n frunze, fie n muguri floriferi. Experienele de
microchirurgie ale lui Wardlaw (1949), Steeves (1962), Haight i Koehnert (1969), precum i ale altor
autori, au permis stabilirea faptului c tinerele mucroane foliare se afl ntr-o stare nedeterminat nc
morfofuncional. Problema transformrilor morfologice i structurale, n cadrul proceselor de tranziie
care au loc n trecerea strii vegetative a meristemului n stare floral, precum i a celor legate de
reversia meristemelor iniial florale, n meristeme vegetative constituie punctul de plecare n
multiplicarea vegetativ in vitro, pornind de la explante constnd din boboci sau din nveliuri florale.
La conopid, n faza de preinflorescen, Margara (1982) se pot distinge trei categorii de meristeme:
vegetativ, de generare a inflorescenei i de formare a florilor.
203

Definitivarea direciei de evoluie a meristemului apical, din vegetativ n floral, depinde de o


serie de factori exogeni fotoperioad, temperatur sau endogeni specie, hormoni.
n condiiile cultivrii unor explante in vitro, celulele esuturilor inoculate pe medii aseptice
sufer un proces de dedifereniere i genereaz meristeme. Din aceste meristeme, prin redifereniere,
vor lua natere organe. Organogeneza constituie momentul de baz n asigurarea multiplicrii
vegetative.
De multe ori la nivelul calusului se pot identifica formaiuni meristematice, aflate ntr-un
stadiu tnr, nedifereniat funcional n meristem generator de rdcini, sau n meristem generator de
tulpini, fiind numite promeristeme. Tot legat de activitatea meristematic incipient, exist i un alt
termen, ntlnit n literatura de specialitate meristemoid (Torrey, 1966). Aceast noiune se refer la
formaiuni meristematice, abia schiate, cu direcie de dezvoltare nedeterminat, aparent identice din
punct de vedere morfologic.
Se tie c meristemul radicular al angiospermelor se deosebete funcional de cel al tulpinilor
nefiind interconvertibil, cu toate c axa caulinar i cea radicular, n evoluia filogenetic, au o
origine comun. Diferenierea funcional a meristemului se face, probabil, n stadiul de promeristem;
n cazul meristemoizilor pot fi deja identificate trei tipuri de meristeme ce evolueaz n: meristem
proliferativ, meristem generator de rdcini i meristem de tip caulogen. Dar nu se cunoate dac
aceti meristemoizi sunt identici sau prezint deja amprenta determinismului lor funcional, radicular
i caulinar.
Meristemele radiculare, funcie de originea lor se mpart n mai multe categorii:
-meristem apical situat n vrful rdcinilor;
-meristem lateral format pe rdcina principal;
-meristem adventiv provocat n a se forma la nivelul tulpinilor, frunzelor sau al altor organe,
care n mod natural nu sunt purttoare de rdcini. Inducerea formrii acestor meristeme radiculare
adventive constituie baza multiplicrii vegetative prin butai, marcote sau organe de rezerv;
-meristeme neoformate la nivelul calusului, ca o varietate de meristem adventiv.
Meristemele caulinare pot fi mprite astfel:
-meristeme apicale (terminale) derivate din muguraul embrionului;
-meristeme axilare aflate la axila frunzelor;
-meristeme adventive formate pe diverse organe;
-meristeme neoformate generate la nivelul calusurilor cultivate in vitro.
Formarea meristemelor i organogeneza sunt procese care se petrec treptat, sub control genetic
i hormonal. Factorii de mediu pot i ei stimula inducerea i viteza de desfurare a proceselor de
organogenez. Hormonii sau regulatorii de cretere de sintez constituie factori cu rol hotrtor n
direcionarea proceselor de difereniere a meristemelor, n meristeme radiculare sau caulinare.
Auxinele intervin n reglarea formrii meristemelor radiculare iar citochininele n neogeneza de
mugurai.
Explantele meristematice caulinare sunt frecvent folosite n tehnicile de multiplicare i de
micropropagare a o serie de specii de interes economic.
Astfel, se poate concluziona faptul c, la plantele superioare exist o diversitate de meristeme
clasificate, dup localizarea lor n plant. Meristemele mai pot fi clasificate i n alte dou categorii:
-meristeme histogene care produc obinuit numai esuturi;
-meristeme organogene care dau natere la esuturi ce formeaz organe;
Spre deosebire de meristemele radiculare, care sunt foarte simple ca structur i funciune,
meristemele caulinare sunt deosebit de complexe structural i funcional. Ele variaz ca aspect i
potenialitate, de la o specie la alta. Meristemele caulinare, terminale, constituie, n fapt, un
microbuta, ntruct vrful vegetativ al plantei, inoculat in vitro i formeaz un propriu sistem
radicular, n partea sa bazal. n consecin, acest tip de meristem este frecvent folosit n tehnicile de
multiplicare i de propagare accelerat a plantelor, pe medii aseptice.
Potenialitatea regenerativ a acestor meristeme este, de regul, extrem de mare. Ele se
adapteaz bine la condiiile in vitro, suport uor traumatismul provocat de explantare, relundu-i
activitatea n urma trecerii lor pe medii aseptice, genernd plante. Acest fapt presupune att creterea
axei mugurelui i a primordiilor sale, cu dezvoltarea frunzulielor, ct i neogeneza de rdcini. n
204

final, meristemul terminal, apical sau axial genereaz una sau mai multe plante, n funcie de balana
hormonal prezent n mediul de cultur. Meristemele terminale, caulinare ale plantelor lemnoase
ridic probleme speciale, ntruct ele aparin unor plante perene, multianuale, de talie mare, ceea ce
ngreuneaz o alimentare optim a lor cu ap, cu nutrieni i hormoni. Acest lucru constituie
impedimente fiziologice care, pe plan funcional, se traduc printr-o regresie a capacitii regenerative
a celulelor lor, soldat cu o scdere a totipotenialitii acestor meristeme.
Meristemul apical se formeaz n momentul organizrii embrionului i rmne activ n tot
cursul vieii plantei. Excepie fac plantele perene din zonele temperate, la care meristemul apical n
decursul sezonului de iarn se afl n stare de laten.
Prin intermediul culturii de meristeme apicale, terminale sau laterale, se poate realiza o
rapid multiplicare clonal a plantelor, ndeosebi a celor horticole i a unor specii silvice.
Prin cultivarea in vitro a meristemelor se obine o regenerare de plante identice din punct de
vedere genetic cu planta mam donatoare, fapt deosebit de important n horticultur, asigurndu-se
astfel o multiplicare clonal.
Un alt aspect, foarte important, care deriv din nmulirea meristematic a plantelor, este acela
al obinerii de material sditor sntos, n esuturile cruia este prevenit orice fel de atac fitopatogen.
Plantulele generate in vitro din meristeme, nsoite numai de prima pereche de primordii foliare, sunt
libere de viroze, deosebit de pgubitoare i imposibil de evitat i de combtut n condiiile nmulirii
vegetative a plantelor. Numai propagarea plantelor prin semine poate asigura, ntr-o oarecare msur,
eradicarea parial, temporar, a virozelor, tiut fiind faptul c, chiar i prin semine se transmit o serie
de viroze. Dar nenumrate plante horticole nu se pot nmulii prin semine sau, la unele soiuri,
multiplicarea prin semine este dificil (orhidee), ori seminele nu sunt fertile, ceea ce a fcut ca
nmulirea acestora pe cale vegetativ s constituie unica metod de multiplicare a lor. Pe de alt parte,
multiplicarea plantelor pe cale asexuat, prin metode de nmulire vegetativ clasic, a condus la
degenerarea descendenilor ca o consecin a perpeturii, an de an, a infeciilor virale. Astfel, o cultur
sntoas de garoafe (Rudelle, 1977), nmulite timp de cinci ani prin butire clasic, a prezentat o
rspndire n mas a virozelor, multe din ele, cauznd degenerri. Totodat, multiplicarea vegetativ,
prin metode tradiionale, are drept consecin i o perpetuare a unor mutaii somatice.
Virozele plantelor aduc mari daune culturilor, la cartofi i cpun, n floricultur i n
arboricultur, ntruct reduc vigurozitatea plantelor, scad potenialul productiv al acestora, producia
realizat este mediocr i produsele agricole au un grad naintat de depreciere a calitii lor. Butaii
obinui din plante virozate au o capacitate redus de nrdcinare i realizeaz un procent sczut de
prindere. Pe de alt parte, din cauza meninerii n cultur a unor plante virozate se creeaz pericolul
transmiterii virusurilor i la alte plante, prin vectorii biologici prezeni n cultur.
Primele ncercri de cultivare a extremitilor de tulpini i de rdcini sunt citate ca fiind
realizate nc din 1922, de ctre Kotte i de ctre Robbins, la mazre i porumb, dar fr mare succes.
Ulterior, n 1946, Ball a reuit s obin plante din apexuri meristematice la Lupinus albus i la
Trapaeolum majus. Pn n jurul anilor 1949-1950 cultura propriu-zis de meristeme nu era
cunoscut, abia ncepnd din anul 1949, prin lucrrile lui Wetmore i Morel s-au pus bazele
cercetrilor sistematice privind cunoaterea reaciei explantelor meristematice la condiii de cultur,
precum i cu privire la comportamentul in vitro al meristemelor diverselor specii, de diferite
dimensiuni, cultivate n condiii variate de mediu.
Dac meritul de a fi reuit regenerarea de plante din meristeme izolate revine lui Ball, n
schimb prioritatea n ceea ce privete obinerea de plante sntoase, devirozate, prin cultura in vitro a
meristemelor apicale, recoltate de la plante bolnave, revine lui Morel (1959-1960). Inspirat fiind de
rezultatele obinute ntre anii 1949-1950 de ctre Limasset i Cornuet, Morel a avut intuiia de a
cultiva in vitro meristeme apicale de aproximativ 75-100 m lime i 150-200 m nlime, cu 1-2
primordii foliare.
Experienele efectuate de Limasset i Cornuet au constat n urmrirea, prin analize serologice,
a gradului de rspndire i a evalurii intensitii virozrii organelor vegetative aeriene a plantelor la
diferite distane de apex. Ei au constatat o distribuie inegal a virusurilor n corpul plantelor i au
observat un gradient mai sczut de infecie viral, pe msura apropierii de vrful vegetativ, respectiv
de meristemul apical. Cea mai redus infecie viral a fost semnalat n sucul extras din frunzele aflate
205

nc n mugur. Pornind de la aceste fapte, Limasset i Cornuet au extirpat, aseptic o calot de esut
apical sau meristem i cteva primordii foliare i au depus-o pe o frunz tnr de tutun, lezat printro scarificare superficial. Dup trecerea unei perioade de incubaie s-a putut constata c frunzele de
tutun, pe care s-a amplasat exclusiv calota meristematic, au fost virozate n proporie de 60%, n timp
ce frunzele pe care s-au aplicat esuturi subiacente meristemului (primordii foliare mai ndeprtate de
meristem) s-a infectat n procent de 100%. Aceste experiene ia condus pe Limasset i Cornuet la
concluzia c n apexul caulinar migrarea i nmulirea virusurilor este oprit.
nc din 1952, Morel i Martin au intuit faptul c, pornind de la plante virozate, prin
explantarea i cultivarea in vitro a meristemului caulinar, apical, se poate obine o plant sntoas,
conservnd, n acelai timp, caracterele genetice ale plantei mam. Aceast ipotez a fost atestat de
ctre Morel i Martin prin experiene efectuate cu plante de dalie. Cultura de dalii a beneficiat prima
de eradicarea virozelor, prin procedeul imaginat i pus n practic de ctre Morel i Martin. Tulpinile
generate in vitro, neposednd rdcini, au fost transformate n minibutai. Acetia au dat natere la
plante libere de viroze. Au urmat apoi cartofii i orhideele. n 1957, Quak a remarcat c metoda lui
Morel i Martin este posibil de aplicat, cu aceleai rezultate, la garoafe. Din acel moment s-au demarat
cercetrile n scopul stabilirii unor metode intensive, industriale, de controlare i producere a unui
material sditor sntos, cu randament economic asigurat, avnd ca obiectiv obinerea de flori de
calitate superioar.
n acest mod a fost elaborat ipoteza imunitii poteniale a celulelor meristematice la atacul
viral. Dac prelevarea se face de la o plant neinfectat, sau care prezint o infecie viral slab, atunci
cresc i mai mult ansele de a preleva explante meristematice, lipsite de infecii virale.
Din pcate, plantele devirozate nu sunt imune la viroze. Ele se pot mbolnvi tot att de repede
ca i oricare alt plant. De regul, din plantele devirozate, aflate in vitro se asigur multiplicarea lor,
tot pe medii aseptice, prin minibutai, sau se induce formarea de colonii de propagule, sau se
constituie o plantaie mam, donatoare de meristeme ori chiar de butai, plantaie executat n condiii
speciale de protecie, nct plantele s fie ferite de atac zoopatogen.
Concomitent cu eradicarea virozelor, multiplicarea in vitro a plantelor, prin explante
meristematice, asigur i eliminarea din materialul sditor a fungilor i a bacteriilor. Astfel, la garoafe
s-a realizat eliberarea plantelor de infecii cu Fusarium roseum, iar la Pelargonium i Diffenbachia
eradicarea bacteriozelor sistemice (Walkey, 1979).
Cercetrile recente au dovedit ns, c nu toate meristemele sunt libere de infecii virale.
Invazia meristemelor cu virusuri este dependent de tipul meristemului, al virusului i de specia
plantei parazitate. Cu ct explantele meristematice sunt mai mici, cu att ansa prelevrii de celule
lipsite de virusuri este mai mare, dar cu ct inoculul meristematic este mai mare, cu att este mai
ridicat capacitatea lor regenerativ.
Nu toate virozele pot fi eradicate prin procedeele de nmulire meristematic (Martin, 1977).
De exemplu, la cartof, virusul X poate fi nlturat, prin nmulire meristematic, numai n procent de
1%. Unele virusuri pot exista chiar i n meristemele apicale (Hollings, 1962).
Termoterapia vine n ajutorul culturilor de meristeme pentru a completa metodele de
combatere a infeciilor virale, la plante. Termoterapia a fost elaborat de ctre Kunkel, n 1936.
Aceasta const n supunerea plantelor bolnave la temperaturi cuprinse ntre 35-39oC, timp de 2-4
sptmni. n cursul aplicrii termoterapiei virusurile nu se multiplic; ele rmn la nivelul celulelor
n care au fost surprinse n momentul declanrii tratamentului termoterapeutic.
Combinnd cultura de meristeme cu termoterapia se realizeaz, cu anse foarte mari de reuit,
eliminarea virusurilor din plantele generate in vitro. n consecin, mersitemele sunt prelevate de la
plante supuse, prealabil explantrii, tratamentului termoterapeutic. Dar, n aceast situaie, descrete
vitalitatea plantelor donatoare, concomitent cu scderea capacitii de supravieuire i de regenerare a
celulelor meristematice. Pe durata termoterapiei, apexul se alungete iar virusurile, nemultiplicnduse, rmn n celulele bazale ale conului vegetativ, ceea ce nlesnete prelevarea unor explante apicale
mai mari de pn la 1 mm, micornd pericolul recoltrii unor esuturi subiacente meristemului,
infectate cu germeni fitopatogeni. n consecin, explantele meristematice prelevate de la plante
supuse termoterapiei, fiind mai mari, capacitatea lor regenerativ i de cretere va fi mai ridicat, ceea
ce compenseaz epuizarea fiziologic, cauzat de termoterapie.
206

Kassanis (1950) a dovedit c unul din virusurile cartofului, localizat n frunze, poate fi
inactivat la nivelul tuberculilor, prin aplicarea termoterapiei. Dar tot Kassanis a precizat c la tomate
exist virusuri a cror activitate este suprimat abia la 80 oC. acesta a fost unul dintre motivele care i-a
determinat pe cercettori s prelungeasc durata termoterapiei, de la cteva zile la cteva luni i s
ridice temperatura de la 35 la 40oC (Quak, 1977).
Hakkaart i Quak (1964), experimentnd cu meristeme excizate de la crizanteme, de pn la 1
mm lungime cu 2-3 primordii foliare, au constatat c prelungirea duratei de termoterapie de la 10-20
zile la 30 zile a dus la sporirea procentului de plante devirozate, de la 9 la 90% dar prelungirea
tratamentului termoterapeutic peste aceast durat de timp (pn la 50-60 zile)nu a condus la
depirea procentului de plante devirozate.
n unele cazuri, se poate realiza distrugerea virusului din vrful meristematic i n decursul
cultivrii esuturilor in vitro. Astfel, Hollings i Stone (1964), au reuit aceast performan la garoafe,
iar Walkey i colab. (1969) la cire. Aceast eradicare endogen a virozei, n interiorul celulelor
cultivate pe medii aseptice, poate fi un rezultat al unui proces metabolic dereglat, ca o consecin a
traumatizrii celulelor excizate. Cu ct a fost mai mic fragmentul de esut excizat, cu att
traumatismul a fost mai puternic i efectul endogen, distructiv, exercitat asupra virusului, a fost mai
mare (Walkey, 1980). De regul ns, este imposibil s regenerm anumite specii de plante din
fragmente att de mici de esuturi; ori n alte condiii, nu poate fi realizat o traum de o aa amploare
nct s se produc o disturbare a metabolismului virusurilor din celulele explantate, soldat cu
suprimarea atacului viral.
Explicaiile privind modul n care celulele meristematice rezist infeciilor nclin spre
justificri de ordin molecular. Una din ipoteze susine c exist o competitivitate ntre celula gazd i
parazit, n ceea ce privete utilizarea unor enzime implicate n procese de restituie; alt ipotez,
susine c celula meristematic utilizeaz ARN viral, sau c substanele generate n urma traumatizrii
celulelor ar suprima virusurile prezente n celule.
n anul 1978, Walkey, a reuit obinerea de plante sntoase i prin cultivarea in vitro a
esutului gametofitic femel, respectiv ovare sau esut nucelar, sau a meristemului floral.
Trebuie subliniat i marele merit pe care Morel l-a avut n intuirea importanei deosebite a
descoperiri posibilitii de a obine plante sntoase din plante bolnave, precum i a direciilor
aplicative pe care le-a deschis aceast tehnic, efectuat n condiii aseptice. Cele mai mari realizri
le-a avut Morel n multiplicarea in vitro la orhidee. Astfel, n anul 1963, Morel comunica primele
rezultate cu privire la cultivarea in vitro a meristemului apical de orhidee. Acestea se refereau la faptul
c meristemele de orhidee, cultivate pe medii aseptice, genereaz un glomerul de 1-2 mm, de culoare
verde, numit protocorm. Prin ruperea i cultivarea in vitro a fragmentelor va rezulta o mas
globuloas, un glomerul de cca 3-4 mm slab difereniat histologic, constituit dintr-un parechim, cu
celule mari, srace n citoplasm i cu vacuole ntinse. n partea central a glomerulului se disting
cteva fascicule vasculare. Fragmentnd periodic aceast mas i cultivnd-o in vitro s-a putut
remarca o foarte mare capacitate de multiplicare vegetativ a celulelor detaate. n anul 1978,
Murashige afirma c, dintr-un meristem de orhidee, n decursul unui an, prin fragmentri i
subcultivri repetate ale protocormilor, se pot obine cca 4 milioane de noi plante de orhidee.
Protocormul produs in vitro este asemntor cu protocormul de germinaie, rezultat din embrionii
seminelor.
n 1959, Martin a intuit posibilitatea crerii unei bnci cu explante, n care s fie conservat
materialul biologic meristematic sntos. Prin aceast tehnic, astzi, materialul vegetal generat in
vitro este uor conservat, esuturile deinnd nealterat, ntreaga lor capacitate regenerativ.
Valoarea mare a culturii de meristeme const deci n:
-asigurarea uniformitii genetice a materialului sditor, generat in vitro;
-eliminarea agenilor fito sau zoopatogeni;
-creterea la maximum a coeficientului de multiplicare, n cel mai scurt timp, a unui exemplar
vegetal;
-obinerea unui material sditor juvenilizat, imposibil de realizat prin metode tradiionale de
nmulire vegetativ;
207

-conservarea prin temperaturi sczute a inoculilor meristematici, pentru o lung perioad de


timp, ntr-o anumit faz de dezvoltare, pentru a avea un stoc permanent, ce s asigure, oricnd,
necesarul de material sditor solicitat pe pia;
-conservarea germoplasmei n bnci de gene.
n extinderea rapid a acestor practici, n regim industrial a predominat factorul economic
rezultat, n primul rnd, din aspectele fitosanitare, respectiv din obinerea unor culturi viguroase,
sntoase. Astfel, cartoful, plat extrem de important att n hrana omului i pentru industrializare
dar i n hrana animalelor, a beneficiat primul de extinderea metodelor de redresare a vigurozitii
culturilor prin eradicarea virozelor, cultivnd in vitro meristemele caulinare. Cartoful este atacat de
nenumrate virusuri care, de cele mai multe ori, pot fi prezente concomitent n esuturi, ceea ce
epuizeaz planta i scade, considerabil recolta. Pierderile sunt cifrate la 15-25%. Din nefericire, nu
toate tipurile de virusuri pot fi n egal msur combtute. Astfel, la cartof, dintre toate virusurile
prezente foarte des n cultur (A, Y, M, S, X) virusul A este mai uor de ndeprtat, comparativ cu
virusul X. Multiplicarea in vitro prin meristeme a luat o mare amploare i la garoafe. Astfel, n Frana,
cifra de afaceri realizat, n categoria florilor tiate, prin vnzarea garoafelor, ocup locul doi iar
exportul horticol francez este reprezentat n proporie de 80% de garoafe, 90% dintre acestea
provenind din mutaii de culoare, practicate la tipul american de garoaf creat de William Sim, n
1939. Multiplicarea acestui cultivar s-a fcut n miliarde de exemplare. Conservarea calitilor sale
genetice se datoreaz metodei de multiplicare prin cultura in vitro a meristemelor caulinare, apicale.
Infeciile virale afecteaz nu numai calitatea florilor, ci reduce foarte mult i capacitatea de
nrdcinare a butailor. n laboratoarele unei singure uniti se produc anual, in vitro, cca 10 000 de
garoafe. nmulirea meristematic a permis vindecarea garoafelor i de boli vasculare, respectiv
eradicarea atacului de Phialophora cinerescens, Fusarium oxysporum, i a bacteriozelor Pseudomonas
caryophylli i Pectobacterium parthenii. De o mare importan este cultura orhideelor, obinerea de
material sditor devirozat la garoafe, cpun, crizanteme, la pomi fructiferi, la arbori i arbuti.
Dar cultivarea in vitro a meristemelor nu nseamn urmrirea, ca scop n sine, numai
eradicarea bolilor ci pur i simplu, multiplicarea unor clone, respectiv genotipuri valoroase. Aceast
metod este cu att mai important cu ct se pleac de la un material iniial devirozat.
Se practic diferite metode de multiplicare in vitro prin intermediul meristemului de tip
caulinar i anume:
-unele procedee vizeaz cultivarea exclusiv a celulelor conului meristematic, fr primordii
foliare, pentru studierea proceselor regenerative, n dependen de dimensiunea redus a explantelor i
de consecinele traumatismelor provocate;
-altele privesc obinerea de material sditor devirozat, explantele constnd din meristeme
recoltate mpreun cu prima pereche de primordii foliare, lungimea explantelor fiind de pn la 500
m, respectiv 0,25-0,7 mm;
-altele au n vedere obinerea unui numr foarte mare de plantule, n timp scurt utiliznd
explante mai mari de 1-5 mm sau impulsionnd diferenierea de meristeme axilare i de muguri
adventivi pe apexul iniial.
n oricare din cazuri trebuie s avem n vedere selectarea, cu mare atenie i pricepere, a
plantelor mam, donatoare de explante. Este de dorit ca ele s fie sntoase i s se afle ntr-o perioad
de cretere activ. Latena organelor uneori ridic probleme speciale i implic aplicarea unor
tratamente termice sau hormonale, pentru a stimula emergena meristemelor. Alegerea explantelor,
sterilizarea organelor, tipul de mediu de cultur folosit, regimul din camerele de cretere influeneaz
supravieuirea explantelor. Restabilirea proceselor biologice, de diviziune i de regenerare precum i
sensul desfurrii histo i organogenezei, diferenierea de plante, dezvoltarea lor i apoi capacitatea
adaptativ a acestora la mediul normal sunt influenate att de factori endogeni, ct mai ales de cei
exogeni, n special de balana hormonal i de regimul de lumin, respectiv de temperatur.
De regul meristemele caulinare, terminale, apicale, dovedesc cea mai rapid cretere. Cu toate
acestea i meristemele laterale, prelevate din mugurii axilari, pot fi folosite n culturile de meristeme.
La crizanteme din 5000 de vrfuri meristematice, 32% din mugurii apicali, terminali, au crescut,
genernd plante mature, n timp ce numai 18% din mugurii laterali au format noi plante.
208

Mrimea explantelor se stabilete n funcie de specie i de scopul urmrit. Cnd se are n


vedere obinerea de plante libere de viroze la garoafe, explantul nu trebuie s depeasc 0,5 mm dar
nici s fie mai mic de 0,2 mm, deoarece, n acest caz, este dificil nrdcinarea plantulelor generate
din meristeme. n cazul n care s-a aplicat corect termoterapia explantul poate fi mai mare, de pn la
1 mm. n camerele de cretere intensitatea luminii se recomand s fie de 2400-2600 luci, n regim de
fotoperioad cu 16 ore lumin i 8 ore ntuneric. n alte cazuri, lumina trebuie intensificat la 35004000 luci, iar la conifere se poate ajunge chiar la o intensitate de peste 10 000 luci. Temperatura
trebuie s fie stabilizat ntre 22-25oC. Uneori exist indicaii stricte cu privire la regimul termic i de
iluminare, cerute de un anumit tip de cultur, potrivit unei anumite specii sau corespunztor unei
anumite etape de dezvoltare a inoculilor.
n literatura de specialitate sunt recomandri i cu privire la sezonul cel mai potrivit pentru
prelevarea i inocularea unui anumit tip de meristem. Astfel, se specific c meristemele de garoafe
supravieuiesc, n proporie mai mare, dac sunt recoltate primvara sau toamna devreme; meristemele
recoltate iarna nrdcineaz mai uor iar cele recoltate vara dau cel mai ridicat procent de plantule
libere de viroze (Van Os, 1964). La cartof, meristemele recoltate primvara sau vara, de timpuriu,
nrdcineaz mult mai repede n raport cu cele care sunt prelevate i inoculate la finele anului.
n ceea ce privete substratul de cultur, de cele mai multe ori, se utilizeaz medii de cultur
solide. La cartof, garoafe i la alte specii se pot folosi i mediile lichide. PH-ul mediului de cultur
poate constitui un factor limitativ al creterii i dezvoltrii meristemului cultivat in vitro. Astfel, de
regul, pH-ul de 5,5-5,8 este indicat ca fiind optim; dup autoclavare, pH-ul scade, iar n decurs de o
sptmn de la cultivarea esuturilor, pH-ul descrete pn aproape de 5,4. Un pH iniial sczut
inhib formarea rdcinilor.
n compoziia mediilor de cultur sunt incluse macro i microelemente, FeEDTA, vitamine,
aminoacizi i o surs de carbon organic, reprezentat, de regul de zaharoz n concentraie de 2-3%.
Natura hormonilor i concentraia acestora variaz de la o specie la alta, n funcie de scopul urmrit.
Astfel, pentru nrdcinare se folosesc cu precdere ANA i AIA, care ns folosite timp ndelungat
pot duce la inhibarea creterii rdcinilor. n acest caz, se recomand subcultivarea explantelor pe
medii lipsite de auxine. Citochininele stimuleaz creterea meristemelor, mai ales n cazul n care ele
se fal n laten, precum i formarea de nenumrai mugurai. Concentraia fitohormonilor de cretere
variaz n diferitele faze de evoluie ale meristemelor.
Plantele complet formate prezentnd rdcini i tulpini vor fi scoase din condiiile in vitro,
fiind trecute n condiiile mediului septic. Ele vor fi transferate n ghivece mici, n amestec de perlit cu
pmnt. Se poate realiza transferul lstrailor n mediul septic,chiar nenrdcinai, aceast
operaiune putnd determina nrdcinarea lor. Buys (1969) recomand transferarea timpurie n sol a
plantelor de garoafe neoformate in vitro, ntruct rdciniele generate in vitro sunt n mic msur
folositoare n sol, iar prelungirea duratei de meninere a plntuelor n flacoanele de cultur, ridic
nejustificat costul materialului plantat rezultat. Atunci cnd plantele sunt suficient de mari, se va testa
serologic, eventuala prezen a virusurilor i gradul de infecie.
Metodele de testare a virozelor i natura acestora variaz de la o specie la alta. n 1977, Clark
i Adams au pus la punct un procedeu ELISA de identificare a prezenei virusurilor, iar n 1973,
Derrick, a preparat un ser septic pentru electronomicroscopie, metode de mare sensibilitate n
determinrile de virusologie vegetal. Pentru a uura exactitatea investigaiilor este de dorit s se fac
o analiz a infeciilor la nivelul plantelor donatoare de meristeme, precum i n cultura, sau culturile
apropiate. Dup stabilirea unei culturi lipsite de germeni este absolut indispensabil ca plantele s fie
meninute n condiii speciale fie c ele sunt prezervate n condiii de temperaturi sczute, n
recipientele lor de cultur, pe medii aseptice, fie c sunt cultivate n teren, ntr-un perimetru ferit de
infecii, metodele fiind menite s realizeze evitarea unei reinfectri a plantelor.
Metodele criobiologice de prezervare a materialului obinut in vitro sunt economice i
indispensabile pentru conservarea, pe termen lung, a germoplasmei precum i a unei cantiti limitate
de material iniial, devirozat. Crioconservarea poate fi realizat la temperaturi extrem de sczute. n
aceste condiii se asigur reducerea tuturor funciilor metabolice. Primele ncercri de crioconservare
au fost fcute de ctre Seiberg n anul 1976, la garoafe. Ulterior s-a reuit i conservarea altor tipuri de
inoculi: calus, celule sau protoplati. Tehnicile de crioconservare presupun utilizarea unor substane
209

crioprotectoare, cu rol n prevenirea daunelor cauzate de nghearea brusc a celulelor, respectiv


formarea cristalelor de ghea. Cele mai folosite substane crioprotectoare sunt dimetilsulfoxidul
(DMSO) i glicerolul (Kartha, 1981, citat de Cachi, 1984). Meristemul este esutul cel mai potrivit
pentru a fi conservat la temepraturi sczute, graie alctuirii particulare a celulelor lui. Astfel, el i
poate pstra ntreaga capacitate regenerativ, ntruct n momentul repunerii lui n condiii optime de
mediu, celulele i reiau activitatea metabolic i fiziologic normal. Meristemul se preteaz cel mai
bine conservrii prin crioconservare, celulele lui fiind srace n vacuole i avnd o citoplasm dens.
Pentru executarea operaiunilor de congelare, ndeosebi pentru coborrea gradat a
temperaturii, exist dispozitive speciale. O metod accesibil preconizeaz introducerea flacoanelor cu
inoculi ntr-o baie de alcool, mediu n care se produce descreterea gradat a temperaturii.
n anul 1980, Dale i colab. Au pus la punct o metod de stocare la temperaturi sczute a unor
graminee sau a unor plante legumicole, constnd n conservarea ndelungat a plantelor, generate in
vitro, prin meninerea lor la temperaturi de 2-4oC, n regim de 8 ore lumin pe zi si o intensitate de
300 luci. Cultura poate fi meninut astfel 10-11 luni, dup care se recomand ca aceasta s fie
transferat pe mediu proaspt.
O alt problem deosebit de biologie se ridic n cazul plantelor generate in vitro. Plantele
provenite att din meristeme ct i din explante de alt natur, prezint un grad de juvenilitate similar
plantelor dezvoltate din embrionii seminelor. Astfel, materialul de plantat, generat in vitro, este
superior celui obinut prin metodele tradiionale: butire, marcotaj, altoire.
Juvenilitatea plantelor generate in vitro poate fi constatat morfologic, de exemplu la
plantulele de cpun, difereniate din meristeme. La cpun, frunzele tinere sunt ntregi, n timp ce
frunzele plantelor btrne sunt trifoliate. Generarea de frunzulie ntregi sisteaz la inoculi n
momentul n care se depete faza de morfogenez, constnd n proliferarea a noi muguri axilari, prin
repicri repetate i cultivarea inoculilor pe mediu cu citochinin.
Un caz particular este acela al rentineririi unor organe de pe care urmeaz s fie prelevate
meristeme apicale. Un exemplu l constituie plantele lemnoase, multianuale. Explantele sau butaii
prelevai de la astfel de plante i pierd capacitatea de nrdcinare. La aceste plante se practic
diferite metode de rentinerire a materialului biologic prin butiri sau microbutiri in vitro, altoiri de
apexuri de plante adulte pe tinere plantule.
Sfecla constituie un alt exemplu de plant a crei esuturi adulte prezint o foarte sczut
capacitate organogenetic. De aceea se recomand inducerea formrii de meristem prin repicri
succesive.
O problem deosebit o constituie aceea a meninerii meristemului vegetativ, inoculat pe medii
aseptice, ntr-o stare primar, ntruct n cazul n care se inoculeaz un meristem vegetativ, prelevat de
pe o tulpin florifer, exist pericolul ca anumii factori de mediu s induc formarea florilor sau
invers, s grbim, prin reglarea fotoperioadei i a altor factori de mediu, transformarea unui mugur
vegetativ, n mugure florifer. Reglarea fotoperioadei i sporirea cantitii de zaharoz din mediu la
40-50 g/l sunt factori care par s determine transformarea apexului vegetativ n florifer.
La numeroase plante, detaarea meristemelor florale i cultivarea lor in vitro imprim
esuturilor capacitatea de a redeveni meristeme vegetative, genernd mugurai. Adeseori, se formeaz
muguri axilari sau adventivi acolo unde altfel, normal ar trebui s se formeze boboci. Inocularea in
vitro, pe medii, cu sau fr fitohormoni, a unor fragmente desprinse din inflorescene tinere conduce la
formarea a numeroi muguri. La conopid, prelevarea unui mic explant din apexul preinflorescenei i
cultivarea lui pe mediu lichid, cu o auxin (AIA), provoac reveria esuturilor din florifere n
vegetative. Astfel, poate fi nmulit planta pe cale vegetativ (Crisp i colab., 1974, citat de
Cachi,1984).
Originea comun a meristemului vegetativ i a celui florifer face ca transformarea, n direcia
diferenierii morfologice i funcionale s fie posibil, ntr-o anumit faz de dezvoltare a plantelor
sau a organelor. Reuita este dependent de vrsta esutului, de specie i de condiiile de mediu.
Ambele tipuri de meristeme, dirijate corect, pot servi la multiplicarea in vitro a unor plante.

210

6.1.7.3 Cultura de calus


Calusul este o formaiune particular constituit dintr-o mas nedeterminat de celule deinnd
o structur histologic uniform. De regul, cnd este tnr, posed celule nedifereniate, care se divid
activ. Un anumit tip de calus se produce i n mod natural, fie la nivelul zonelor traumatizate, avnd
rol n cicatrizarea rnilor, fie se formeaz la baza butailor plantai pentru nrdcinare, constituind
zona de genez a rdcinilor adventive. n funcie de obiectivul urmrit, obinerea de calus poate
constitui un scop n sine, alteori apariia i dezvoltarea lui poate fi un dezavantaj. Inducerea formrii
de calus ct mai friabil constituie scopul principal atunci cnd se urmrete iniierea unei culturi de
celule, iar din acestea a unei culturi de protoplati. Instabilitatea genetic a celulelor sale i
poliploidizarea facil a lor, n anumite condiii de cultur, fac din calus si din cea de celule, un
material biologic valoros asupra cruia agenii mutageni i factorii stresani pot opera modificri,
selectndu-se linii cu caliti speciale. Multiplicarea clonal, via calus nu este posibil tocmai din
cauza facilei poliploidizri a celulelor sale. Pe aceast cale se practic ns nmulirea regenerativ,
rapid a unei specii, fr a avea sigurana conservrii genotipului. La unele specii: morcov, tutun,
crizanteme din calus se pot obine uor plante. La specii ierboase (bumbac)sau la plante lemnoase
(stejar), geneza de plante din calus este extrem de dificil.
Atunci cnd se urmrete multiplicarea clonal rapid, formarea de calus n poriunea bazal a
explantului sau transformarea ntregului inocul ntr-o mas de calus constituie un fenomen care
perturb dirijarea proceselor de morfogenez. Astfel, administrarea unei balane hormonale
neechilibrate, face ca la baza explantului s se genereze calus, cauznd dezvoltarea preponderent a
rdcinilor, n defavoarea diferenierii mugurailor sau invers, se formeaz unul sau mai muli
mugurai, iar pentru inducerea rizogenezei fiecare mugura trebuie detaat i subcultivat pe un mediu
cu sau fr auxin. Aceast metod se practic cu succes, atunci cnd se procedeaz la multiplicarea in
vitro a unor specii ornamentale (Saintpaulia i Gerbera), constnd n desprinderea de propaguli, de pe
un esut calusal comun de dimensiuni minime generat din inoculul iniial, situat n poriunea bazal a
coloniei de propaguli.
Creterea calusului este considerat ca fiind nedefinit, ntruct el poate fi nmulit i cultivat
la nesfrit, atunci cnd, periodic, se procedeaz la repicarea, respectiv la fragmentarea lui. Fiecare
fragment este apoi subcultivat pe un mediu proaspt. Calusul crescut la 25oC se recomand a fi repicat
la un interval de 4-6 sptmni, n dependen de natura esuturilor din care a provenit i de condiiile
n care a fost cultivat. Numai prin subcultivri repetate poate fi conservat vitalitatea celulelor sale.
Dac calusul nu este subcultivat n timp util, se produce o mbtrnire a celulelor sale, masa tisular
i schimb culoarea, din glbui, galben-verzui ori verde, devenind cenuie sau galben-brun; uneori
culoarea calusului devine roiatic sau viinie, datorit formrii i acumulrii de antociani n sucul
vacuolar. Proveniena calusului i natura inoculului iniial influeneaz sinteza antocianilor. Street
(1973) precizeaz c trecerea calusului n suspensie celular duce la scderea substanial a cantitii
de antociani. De altfel, s-a constatat c anaerobioza inhib formarea antocianilor (Gautheret, 1959,
citat de Cachi, 1984). n general, prezena luminii i natura acesteia intensific acumularea n celule
a antocianilor. Antocianii sunt sintetizai ns i la ntuneric. Astfel Eriksson (1967) iradiind o cultur
de celule de Haplopappus cu raze UV, a izolat o linie celular cu un coninut foarte ridicat de
antociani. Fitohormonii de cretere i natura acestora influeneaz i ei sinteza antocianilor. Astfel,
auxina inhib, iar citochininele stimuleaz formarea antocianilor (Street, 1977; Kalinin, 1981).
Temperatura sczut, carena de azot i coninutul ridicat al mediului de cultur n glucide stimuleaz
sinteza de antociani. Se pare c zaharoza intervine prin presiunea osmotic pe care o creeaz, ntruct
i un coninut ridicat de NaCl stimuleaz formarea acestor pigmeni.
La plantele dicotiledonate calusul este indus cu mai mult uurin, dect la gimnosperme sau
la monocotiledonate.
Pe msur ce calusul depete un numr de zile de cultur, n profunzime se difereniaz
centri vasculari, ori noduli organoformatori. n morfo i organogeneza calusului un rol determinant l
au mediul de cultur i condiiile de cultur, natura esuturilor din care a provenit calusul i vrsta
acestora.
211

Formarea, creterea i aspectul calusului sunt dependente de natura i concentraia


fitohormonilor de cretere, prezeni n mediile de cultur. De regul, concentraiile ridicate de auxin
conduc la formarea de calus. Cele mai eficiente auxine n inducerea de calus s-au dovedit a fi acidul
2,4 diclorfenoxiacetic (2,4D) i acidul 2,4,5 triclorfenoxiacetic (2,4,5 T), folosite n concentraii
cuprinse ntre 1-10 mg/l.
n general, calusul poate fi generat cu uurin din material vegetal de provenien diferit,
chiar i din esuturi cu structur definitiv. Astfel, prin inocularea de liber secundar, muguri,
meristeme, internodii, fragmente de frunze, pe mediu bogat n 2,4D, se ajunge uor la formarea de
calus.
Celulele esutului calusal pot fi mai compacte, legate ntre ele, sau pot fi mai laxe, formnd un
calus friabil, grunjos, separabil n fragmente granulate, de mrimi diferite, mai greu dezagregabile, sau
spumos, ce se separ n formaiuni tisulare fine, adecvat pentru iniierea unei culturi de celule.
Consistena i friabilitatea esutului calusal depind de specie, de natura organelor din care au fost
detaate explantele generatoare de calus, de tipul fitohormonilor de cretere prezeni n substratul de
cultur i uneori de condiiile de cultur. Capacitatea organogen sau embriogen a esutului calusal
este dependent att de factorii endogeni i exogeni, de numrul repicajelor fcute, de condiiile de
cultur i de vrsta calusului. Se cunosc cazuri de calusuri care subcultivate periodic, chiar i dup
cinci ani, i menin o potenialitate ridicat de a regenera plante (la tutun). Calusul provenit din
plantele monocotiledonate (cereale) are o capacitate regenerativ sczut, evaluat la cteva sptmni
(Conger, 1981).
Dintr-un inocul iniial se obine calus de tip primar, ce conine un numr de aproximativ 50
000 celule. Dup cca ase sptmni, calusul primar este suficient de bine dezvoltat pentru a putea fi
subcultivat pe un mediu nou. Calusul transferat pe mediu proaspt, se numete calus secundar.
Calusul obinut poate fi de tip regenerativ care totdeauna d natere la noi plante i un calus de
tip neregenerativ ce prezint, de regul, o cretere luxuriant, din el difereniindu-se rdcini, i uneori
mugurai, dar niciodat plante (Nabors, 1982). Aceste dou tipuri de calus au mai fost denumite
calusuri embriogene i neembriogene. Calusul embriogen este dens, translucid sau opac de culoare
alb-lptoas, spre galben, ori galben-verde. Citologic se remarc zone compacte, cu celule
nedifereniate, ce pot genera embrioni sau embrioizi, din care ulterior se vor forma plante complet
formate. Calusul neembriogen este constituit dintr-o mas cristalin, transparent, de culoare alb,
brunie sau verde. Acest tip de calus prezint o consisten mai lax, fiind mai friabil, desfcndu-se
uor n pachete de celule. Regiunile friabile prezint celule mari, mult vacuolizate. Aceste regiuni
genereaz rdcini i mai rar mugurai dar niciodat plante. Nabors a fost primul care a dovedit c cea
mai ridicat capacitate regenerativ, meninut timp ndelungat o prezint calusul embriogen, denumit
de tip regenerativ. Tot Nabors a observat c acest calus regenerativ tinde s devin neregenerativ;
dup producerea acestei reversibiliti procesul este definitiv, ntruct cele dou forme sau tipuri de
calusuri, diferite funcional, nu sunt interconvertibile. De altfel, cele dou tipuri de calusuri necesit
fitohormoni diferii, n doze variate, att pentru impulsionarea i susinerea creterii ct i pentru
difereniere. De regul, calusul neregenerativ crete abundent, n timp ce calusul regenerativ are o
cretere mult mai lent, chiar i pe medii potrivite scopului meninerii unei creteri susinute a
acestuia. Pentru a prentmpina dezvoltarea neomogen a calusului se urmrete obinerea unui calus
regenerativ omogen sau cel puin predominant ca mas, ntr-o populaie de celule calusale. Nabors a
remarcat i faptul c ceea ce la un anumit moment, ntr-un anumit stadiu de dezvoltare a calusului,
pare s fie esut de tip neregenerativ, poate genera, n continuare, regiuni regenerative, ce pot fi izolate
i subcultivate (Cachi, 1984).
Frecvent, cele mai bune medii de cultur, adecvate creterii optime a esutului calusal, nu
constituie medii corespunztoare producerii calusului de tip regenerativ. n general, mediul LinsmaierSkoog (1965) sau cele de compoziie similar, respectiv srace n azot cu pH-ul 5,5 sunt de preferat.
La cereale se recomand adugarea n mediu a acidului 2,4,5 triclorfenoxiacetic, avnd efect pozitiv n
susinerea creterii calusului. Acest mediu ns nu este cel mai potrivit pentru inducerea i meninerea
proceselor regenerative.
n general, calusul care provine din rdcini de plantule de cereale posed mai multe regiuni cu
calus de tip regenerativ, n raport cu calusul derivat din embrioni imaturi. Dar i la calusul bogat n
212

zone regenerative acestea reprezint numai cca 1-10% din totalul masei calusale. Dac regiunile cu
calus de tip regenerativ sunt subcultivate pe medii care s impulsioneze i s susin procesele
regenerative, celulele lui vor da n final natere la plante.
Calusul de tip regenerativ poate fi obinut i din calusul secundar, prin meninerea calusului
regenerativ pe mediu potrivit creterii acestuia i nefavorabil obinerii de plante, intervenindu-se
periodic, prin subcultivri de ntreinere. Pe alt cale se pot identifica i izola insulele de calus
regenerativ, pe msur ce ele apar pe calusul de tip neregenerativ, realizndu-se transferarea lor pe un
mediu de cretere adecvat.
n decursul timpului s-a constatat c se obine mai mult calus din inoculii cultivai la ntuneric
dect din cei crescui la lumin. Regiunile cu calus regenerativ sunt mai greu depistabile pe calusurile
crescute la ntuneric. Procentul de formare al calusului regenerativ crete ns la calusul crescut n
condiii de ntuneric. La gru, calusul trebuie transferat la interval de cinci sptmni, pe mediu
potrivit induciei diferenierii de plante. La calusul de gru, regenerarea se realizeaz pe un mediu
lipsit de fitohormoni de cretere; astfel din calusul de tip regenerativ, n cca 2-5 sptmni dup
transferarea pe mediu adecvat proceselor regenerative, are loc formarea de plante. Pe un astfel de
mediu, calusul de tip regenerativ nu va mai crete. Dac calusul este mixt, componenta neregenerativ
continu s creasc mult; concomitent, ns, din poriunile de calus de tip regenerativ, n cultur se
difereniaz i plante. Dup dou subcultivri ale calusului de tip regenerativ, pe mediu lipsit de
fitohormoni de cretere, potrivit inducerii neoformrii de plante, se recomand transferarea calusului
rmas, pe un mediu coninnd auxin, pentru a favoriza continuarea creterii acestuia.
Plantele obinute sunt detaate de calus i sunt plasate n vase deschise, coninnd perlit, care
va fi udat cu ap de la robinet, urmnd ca dup 1-2 sptmni, plantele bine nrdcinate, s fie
transferate n ghivece cu pmnt n amestec cu perlit.
Calusul poate fi folosit i n obinerea unei culturi de celule, cultivndu-l pe medii lichide,
obinnd-se astfel suspensiile celulare folosite n diferite scopuri.
n vederea obinerii de calus se parcurg urmtoarele etape:
-alegerea materialului vegetal, din care se va executa prelevarea explantelor. Calusul poate fi
obinut din explante provenite din diverse surse: semine, embrioni, rdcini, esut de rezerv, frunze,
ramuri, antere, ovare;
-prepararea mediilor de cultur i alegerea tipului de mediu se vor face n funcie de scopul
propus. Atunci cnd scopul este doar obinerea de calus se poate utiliza un mediu de cultur oarecare,
coninnd substane anorganice (macro i microelemente) i substane organice (surs de carbon
organic, vitamine, aminoacizi i fitohormoni), iar solidificarea mediului se realizeaz cu agar;
-sterilizarea recipientelor i a mediilor de cultur;
-pregtirea materialului vegetal n vederea dimensionrii explantelor. Se realizeaz curirea
organelor i dezinfectarea lor, folosind diverse procedee n funcie de tipul de explant utilizat;
-dimensionarea explantelor este diferit n funcie de specia la care se lucreaz i de tipul de
organ folosit ca surs de explante;
-inocularea explantelor se realizeaz n condiii aseptice, la hota cu flux de aer steril, fie pe
mediu solid fie pe mediu lichid cnd ns este necesar agitarea n vederea aerrii culturii;
-incubarea inoculilor se face fie la ntuneric, fie la lumin, de regul la temperatura de 25oC;
-observarea proceselor de formare a calusului i urmrirea creterii acestuia se face periodic, la
diverse intervale de timp;
-subcultivarea periodic se realizeaz prin fragmentarea calusului i inocularea fragmentelor
pe medii proaspete. Subcultivarea se efectueaz la cca 4-6 sptmni, fiind obligatorie pentru
meninerea viabilitii calusului. Este important inerea unei evidene stricte a numrului de
subcultivri suportate de ctre fiecare fragment de esut calusal;
-urmrirea proceselor de organogenez sau de embriogenez funcie de condiiile n care a fost
cultivat calusul, de provenien i de vrsta acestuia.
esutul calusal are o utilizare variat. El constituie unul din materialele biologice asupra cruia
se pot aplica diferii ageni selectivi, n scopul obinerii de linii rezistente, pentru selecionarea de
plante care s fie tolerante la prezena n mediul lor de via a unui anumit factor de stres. Nabors
(1982) a reuit s obin calus i apoi plante rezistente la concentraii ridicate de NaCl, substan
213

introdus n concentraii crescnde n mediul de cultur. Astfel, a raportat obinerea de plante de


Triticum, Orisa i Pennisetum tolerante la concentraii ridicate de NaCl (0,6-0,9%), precum i la
Avena la care pragul de suportabilitate a fost ridicat la 0,03%. La gru, cel mai bun calus, care
rspunde pozitiv la astfel de tratamente este acela obinut din rdcinia embrionar, dezvoltat n
condiiile germinrii cariopselor pe medii aseptice.
Atunci cnd se urmrete cultivarea in vitro a embrionilor imaturi, boabele de gru se
sterilizeaz, dup care, la microscop, se detaeaz embrionii, evitndu-se lezarea acestora i
inoculndu-i pe mediu de cultur.
Mediul de cultur recomandat pentru gru (cariopse sau embrioni imaturi) este LinsmaierSkoog, coninnd macro i microelemente, vitamine, surs de carbon (zaharoz), fitohormoni (2,4D
sau 2,4,5 T) i agar.
Agenii selectivi la care dorim s obinem toleran pot fi introdui fie n mediul de cultur,
preparat pentru inducerea formrii de calus, fie se adaug n substratul de cultur destinat repicrii
calusului. n cazul n care se utilizeaz ca material biologic de iniiere a culturii de calus, o varietate n
mod natural mai rezistent la aciunea duntoare a agentului selectiv n cauz, se realizeaz o
reducere a timpului de obinere a unei linii rezistente, cu caracterele dobndite stabilizate,
transmisibile descendenilor. S-a constatat c stabilitatea caracterelor dobndite este dependent de
durata n care s-a petrecut imprimarea acestor caractere, respectiv durata de timp n care s-a operat
selecia. Pentru a fi atins o stabil toleran, chiar i n condiiile absenei ndelungate din mediu a
agentului selectiv, sunt necesare cel puin ase luni de clire i selecie, prin subcultivri repetate.
Menionm c i n situaia unor experimente de acest gen este prezent fenomenul de manifestare a
diferenierii capacitii regenerative a calusului, n calus de tip regenerativ i neregenerativ. Numai din
calusul de tip regenerativ se poate induce formarea de noi plante; calusul de tip neregenerativ este
inutilizabil n acest gen de experimente.
Calusul poate fi utilizat i ca instrument de cercetare n diferite experimente de fiziologie, n
studierea problemelor de morfogenez, n urmrirea unor modificri ultrastructurale, n analize de
ordin biochimic, sub aciunea unor anumii factori, administrai exogen sau n dependen de natura
inoculilor din care a provenit calusul.
n concluzie, calusul poate fi utilizat ca monitor al reaciei celulei vegetale la o serie de
substane sau condiii de cultur, permind efectuarea unor experimente de fiziologie privind:
creterea, reacia la pesticide, noxe, ioni grei, respiraia, morfo i organogeneza, testarea viabilitii
celulare, a biogenezei unor produi primari sau secundari de metabolism.
6.1.7.4 Cultura de embrioni i endosperm
Cultura de embrioni sau de segmente embrionare se practic n diferite scopuri, att pentru
cercetri de fiziologie a seminei ct i n experiene de hibridri intersoiuri, interspecii i intergenuri.
nc din 1904, Hanning a demonstrat posibilitatea cultivrii pe medii aseptice a embrionilor de
Raphanus i Cachlearia pe soluii minerale cu adaos de zaharoz, obinnd plantule transferabile n
sol.
Metodele de cultivare a embrionilor pe medii aseptice au fost perfecionate continuu. Van
Qverbeek i colab. (1941) au definitivat un procedeu care le-a sugerat lui Lee (1955) i Morel (1956)
s efectueze experiene de multiplicare in vitro folosind ca material iniial embrioni extrai din
semine coapte. Seminele au fost sterilizate, dup care au fost mbibate n ap, 12-24 ore, i apoi, n
condiii aseptice a fost izolat embrionul.
Embrionii pot fi cultivai in vitro, ca atare sau se opereaz detari de fragmente embrionare,
sau sunt cultivai n scopul obinerii de calus, care este utilizat ulterior n alte experimente. Exist i
practici constnd n grefarea de embrioni pe endospermul aparinnd altor specii sau genuri, operaie
denumit hibridare in vitro.
Problemele ridicate de cultura embrionilor sunt, asemenea celorlalte tipuri de explante,
complexe. Un rol deosebit revine momentului n care se execut explantarea embrionului, respectiv
timpul scurs dup fecundare, din clipa formrii zigotului i pn la inocularea lui in vitro, perioad
care exprim vrsta embrionului n zile. Ovulul fertilizat adpostete zigotul care, dup formare,
214

ncepe s se divid i se hrnete din rezervele endospermului. n aceast faz celulele embrionului
sunt heterotrofe; pentru creterea i dezvoltarea lor ele au nevoie de: glucide, aminoacizi, vitamine i
hormoni. n aceast etap explantarea embrionului i inocularea lui pe medii aseptice creeaz
probleme deosebite pentru realizarea cadrului fiziologic optim, adecvat continurii proceselor de
cretere i de dezvoltare.
De regul, la dicotiledonate, embrionul este apt pentru cultivare pe medii aseptice n momentul
n care sunt formate cotiledoanele, respectiv cnd ncepe diferenierea intern a celulelor embrionului.
stadiul critic de transformare endogen a structurii embrionare variaz de la specie la specie i uneori
este dependent de condiiile meteorologice. n unele cazuri, cnd este important izolarea timpurie a
embrionului de sub aciunea plantei mam, poate fi realizat o cretere corespunztoare a acestuia
numai dac embrionul este izolat mpreun cu nucela sau cu esutul nutritiv, sau dac se detaeaz
ovulul n ntregime realizndu-se astfel inocularea lui pe medii aseptice, corespunztoare ca i
compoziie.
Prin cultura in vitro de embrioni se poate prentmpina avortarea sau dezvoltarea anormal a
embrionilor ca urmare a instalrii unei incompatibiliti ntre embrion i esutul nutritiv, aa cum este
cazul hibrizilor sexuali intervarieti interspecii i intergenuri, sau al formrii de hibrizi sterili.
Spre deosebire de cultura de embrioni imaturi, care ridic mari probleme, cultura de embrioni
maturi este mult mai uor de realizat.
Embrionii maturi necesit un mediu de cultur simplu, care are n compoziia sa sruri
minerale i o component glucidic. Adugarea la mediul de baz a vitaminelor (acidul nicotinic,
acidul ascorbic, piridoxin) impulsioneaz creterea esuturilor, iar adugarea fitohormonilor de
cretere are drept scop urmrirea evoluiei embrionilor n prezena acestora, pentru a asigura
stimularea creterii unui anumit organ sau pentru inducerea formrii de calus. n mediile aseptice
destinate culturii embrionilor imaturi, adesea se recomand adiionarea unor extracte naturale:
hidrolizat de casein, lapte din nuc de cocos, suc din fructe de tomate sau extract de endosperm.
n general, dezvoltarea embrionilor in vitro se petrece natural, cu condiia ca ei s fie
explantai n acea faz de formare care s le permit, n continuare parcurgerea evoluiei fireti a
proceselor de ontogenez i s se respecte integritatea lor morfoanatomic; cu ct stadiul n care au
fost prelevai a fost mai timpuriu cu att i factorii de care depinde dezvoltarea lor sunt mai compleci
i greu de reprodus. n timp ce plantulele provenite din embrionii maturi au o dezvoltare similar cu
cei dezvoltai n condiii naturale, sau prezint chiar un uor avans n cretere plantulele dezvoltate din
embrionii imaturi sunt plpnde, iar n sol dovedesc o cretere mai lent i sunt mai firave. Cultura de
embrioni imaturi, recoltai foarte tineri, uneori conduce la obinerea de plantule malformate, chiar
dac mediile de cultur au o compoziie adecvat dezvoltrii acestora.
n unele cazuri, dup polenizarea interspecific sau intergeneric, dezvoltarea embrionilor a
fost extrem de lent, ceea ce a fcut ca explantarea embrionilor i cultivarea lor in vitro, s fie
imposibil. Taira i Larter (1978) au tratat ovulele fertilizate cu acid E-amino-n-caproic, facilitnd
astfel, creterea embrionilor hibrizi, realizai ntre gru i secar, depind barierele fiziologice care
mpiedicau creterea acestora. Deci, pretratamentul florilor femele cu anumii regulatori de cretere,
dup polenizare, impulsioneaz creterea embrionilor pn la faza n care ei pot fi extrai i cultivai,
cu succes, pe medii aseptice.
Prin cultura de embrioni s-a reuit obinerea de plante mature din hibrizi de trifoi 2n x 4n,
mbinndu-se caracterul de perenitate cu cel al calitii furajului realizat (Evans, 1962). Rezultate bune
s-au obinut i n regenerarea de plante din embrionii altor specii furajere, obinndu-se hibrizi
interspecifici de Melilotus, Lotus, Phaseolus, i Medicago.
Tot prin cultura de embrioni s-a reuit obinerea de plante la specii ale cror semine nu
germineaz (banane) sau a celor care se nmulesc greu prin semine (specii forestiere). n unele cazuri
scoaterea embrionilor din starea de laten, prin cultivarea lor pe medii aseptice a constituit o metod
eficient n scurtarea ciclului de dezvoltare a plantelor.
De asemenea, embrionii pot s serveasc i ca esuturi de plecare n multiplicarea i
propagarea rapid a unor plante (la specii ornamentale) atunci cnd acest lucru este dificil de realizat
prin utilizarea altor tipuri de explante.
215

O atenie deosebit trebuie acordat aspectelor teoretice i practice pe care le ridic problemele
de embriologie experimental la gimnosperme. Cea mai veche cultur de embrioni la gimnosperme
este citat ca fiind efectuat de ctre Schmidt n anul 1924, cnd a cultivat pe un mediu organic
embrioni de Pinus sylvestris. Mai trziu, n 1936 Rue a reuit cultivarea in vitro a embrionilor
provenii de la cteva specii: Pinus resinosa, Picea canadensis, Tsuga canadensis i Pseudotsuga
menziensii i a demonstrat, totodat, c embrionul imatur de gimnosperme (de 2-4 mm) poate fi
cultivat pe medii aseptice, pn la stadiul de plantul. Experimentele ulterioare au reliefat faptul c
embrionii de gimnosperme pot fi crescui in vitro, n lipsa megagametofitului (Cachi, 1984).
La cultura de embrioni, presiunea osmotic, sau sursa de carbon organic, joac un rol
important n evoluia acestora, atunci cnd embrionii sunt excizai i sunt cultivai in vitro. De
exemplu, embrionii de Pinus strobus, pe mediu Murashige-Skoog, cun un coninut de 3-6% zaharoz
i hormoni, vor genera plantule, n timp ce pe un mediu cu numai 1-2% zaharoz, se constat o
serioas limitare a dezvoltrii primordiilor radiculare.
Prin cultivarea in vitro a embrionilor de Taxaus embryo s-a reuit scoaterea acestora din starea
de laten, odat cu detaarea i desprinderea lor de sub aciunea megagametofitului.
Cultura de endosperm constituie un excelent instrument pentru studierea problemelor de
morfogenez i se refer la cultura endospermului de tip secundar, derivnd din diviziunea nucleului
secundar al sacului embrionar, avnd celule triploide, gimnospermele avnd un endosperm de tip
primar. Ambele tipuri de endosperm dein un rol important n alimentarea i susinerea creterii
embrionilor. La plantele dicotiledonate, de regul endospermul este consumat n primele faze ale
dezvoltrii embrionului, rolul de depozitare a rezervelor nutritive revenind cotiledoanelor.
Primele experimente constnd n proliferarea endospermului imatur de porumb au fost
efectuate nc din anul 1933 de ctre Lampe i Mills. La Rue, n anul 1947, a realizat creterea
nelimitat a endospermului de porumb. Cercetrile menionate au deschis calea unor experimente prin
care s-a dovedit c acest esut iniial are o capacitate ridicat de proliferare, formeaz uor rdcinie,
mugurai i chiar plantule. n aceast direcie, Straus i La Rue n 1954, au obinut rezultate excelente
cultivnd endosperm de porumb, la 12 zile de la polenizare. Cele mai bune varieti, potrivite pentru
acest scop sunt cele de porumb zaharat. Endospermul de porumb, la 8 zile dup polenizare, nu crete
pe medii aseptice. Deci, pentru reuita iniierii culturii este important stadiul n care se afl
diferenierea celulelor embrionului.
Endospermul matur, doar la cteva specii sau varieti, corespunde scopului inducerii formrii
de calus i anume: Zea mays, Lolium, Santalum, Ricinus, Coffea arabica, Croton, Petroselinum
hortense. Dintre acestea numai la unele specii se manifest procese de organogenez. Endospermul de
porumb, de ricin, precum i la alte specii, genereaz o mas de calus n continu cretere, fr
organogenez, n timp ce la nivelul valusului de Petroselinum se observ embriogeneza.
Cultura de embrioni ofer un important instrument n cercetrile de embriologie i n
embriogeneza experimental, constituind un sistem de tip monitorial n redarea fazelor de cretere ale
diferitelor pri componente ale embrionilor. Aceste etape pot fi studiate n dependen de natura
substratului de cultur, de vrsta embrionului, n funcie de condiiile de mediu, oferind importante
informaii privind interferena diferitelor etape metabolice cu regulatorii de cretere, procesele de
depozitare ale substanelor de rezerv n esuturi, cu factorii care pot intervenii, pozitiv sau negativ, n
formarea i creterea embrionilor.
6.1.7.5 Cultura de ovare, ovule i de esut nucelar
n hibridare poate exista, adeseori, o incompatibilitate ntre partenerii sexuali. De aceea prin
utilizarea metodelor culturilor in vitro se poate, uneori, facilita fie accesul polenului la ovul, fie
acceptarea de ctre ovule a autopolenizrii ori a polenizrii ncruciate, nvingndu-se astfel barierele
de autoincompatibilitate, a celor de incompatibilitate la ncruciri, operaiunile fiind fcute n scopul
obinerii de semine viabile.
Incompatibilitatea dintre ovule i polen este provocat de ctre diferite cauze, de ordin
endogen i anume: o prim selecie a polenului se face la nivelul stigmatului. Aceasta poate prezenta o
216

conformaie morfologic necorespunztoare, mpiedicnd angrenarea ornamentaiilor exinei polenului


pe vilozitile stigmatului; pe de alt parte, natura umed sau uscat a suprafeei stigmatului poate
constitui un impediment n reinerea polenului pe stigmat i n crearea mediului optim; substanele
secretate de ctre celulele epiteliale ale stigmatului pot stimula sau inhiba, germinarea polenului
precum i creterea tubului polinic.
n unele cazuri exist o autoincompatibilitate natural, generat de faptul c plantele care
trebuie ncruciate prezint diferene morfologice constnd n mrimea polenului, amplasarea
anterelor n floare etc. Alteori, maturitatea organelor sexuale se face n momente diferite, caz n care
se impune ca, n prealabil, polenul s fie recoltat i s fie conservat, pentru o anumit perioad de
timp.
Experimentele de polenizare i fecundare artificial in vitro trebuie precedate de o cunoatere a
bilogiei florilor cu care se dorete efectuarea experienelor, att n ceea ce privete morfologia, etapele
de morfogenez ct i a compatibilitii i a incompatibilitii, a antezei i a factorilor care pot
intervenii favorabil sau pot inhiba fiecare din fazele respective. Pe de alt parte trebuie fcute testri
prealabile cu privire la mediile de cultur adecvate meninerii microsporilor la un potenial biologic i
ntr-o stare optim de viabilitate, pentru asigurarea creterii tubului polinic, pentru meninerea
viabilitii prilor componente ale pistilului.
Polenizarea i fecundarea artificial in vitro se poate face, deci, la nivelul stigmatului unui
pistil cultivat pe mediu aseptic, ori prin punerea n contact a polenului, respectiv a tuburilor polinice,
cu ovarele sau cu ovulele excizate.
Aplicarea polenului pe stigmatul pistilelor, cultivate pe medii aseptice, se practic n cazul
speciilor compatibile sexual, cnd nu exist impedimente morfofiziologice, privind fixarea i
germinarea polenului la nivelul stigmatului. Prin aceast metod s-a reuit autopolenizarea la
Antirrhinum majus (Usha, 1965), n schimb la Petunia violacea, specie autocincompatibil s-a
constatat c autopolenizarea in vitro a fost urmat de o cretere a pistilului dar dup un timp acesta s-a
brunificat (Shivanna, 1965, citat de Cachi, 1984).
Deseori, ns, polenizarea i fecundarea in vitro a ovulelor au euat, n condiiile utilizrii
tehnicilor constnd n folosirea, ca partener femel, a pistilului,motiv pentru care s-a trecut la
reproducerea acelorai ncruciri, dar opernd cu ovare sau ovule.
Meritul primei culturi de ovare i revine lui La Rue (1942), care a reuit cultivarea in vitro a
ovarelor de Lycopersicon pimpinellifolium, neobinnd, ns n final semine viabile. n aceast
perioad, Nitsch (1949-1951) a cultivat in vitro ovare de Lycopersicon esculentum, Cucumis angeria,
Phaseolus vulgaris i Nicotiana tabacum. Mediile de cultur au fost complexe i au coninut ca
fitohormoni: acidul 2,4 diclorfenoxiacetic i acidul 2,4,5 triclorfenoxiacetic. Ovarele au fost recoltate
fie nainte de polenizare fie dup ce polenizarea s-a petrecut n mod natural. In vitro ele au crescut, dar
n final nu au format semine.
Prin tehnicile de cultur in vitro a ovarelor au fost obinui hibrizi din ncruciarea hibrizilor
diploizi de Brassica chinensis i autotetraploidul Brassica pekinensis (Inomata, 1968). Hibrizii
triploizi au prezentat caracterele intermediare ntre cei doi prini.
La Oryza sativa i la Haworthia turgida, Majumdar a obinut, n anul 1970, plantule din ovare
nepolenizate, cultivate pe medii aseptice.
Mitra (1972) a reuit obinerea de embrioizi din pereii ovarelor nepolenizate de Citrus
aurantifolia i Citrus sinensis, cultivate in vitro. n general cultura de ovare servete la inducerea
artificial a poliembrioniei, la seminele care, normal, sunt monoembrionare.
Exist numeroase cercetri care atest rolul deosebit pe care l joac prile florale n
dezvoltarea fructului. Astfel, Maheshwari i Lal (1961, citai de Cachi, 1984) experimentnd cu flori
excizate, cultivate in vitro, au constatat la Iberis amara formarea unor fructe normale, numai dac, n
condiiile inoculrii lor la o zi dup polenizare, acestea prezentau caliciu. Lipsa caliciului poate fi
suplinit prin adugarea n mediul de cultur a unui surplus de zahr. n cazul n care florile au fost
excizate i inocularea s-a fcut la opt zile dup polenizare, lipsa caliciului nu a mai fost resimit.
Cultivarea pe medii aseptice a ovulelor a permis stabilirea unui contact direct ntre polen i
ovule, ceea ce a facilitat accesibilitatea tubului polinic pn la sacul embrionar. n acest mod, s-a
217

realizat actul de fecundare ntre indivizii ndeprtai filogenetic, nlturndu-se barierele


incompatibilitilor genetice i obinerea, n final, de semine viabile.
nc din anul 1932, White a ncercat s cultive ovule de Antirrihinum, dar a obinut calus,
generat din integumentele ovulului. Apoi, La Rue cultivnd in vitro ovule de Erythronium
americanum, observat o cretere a acestora fr ca s obin maturizarea lor.
n anumite cazuri, de exemplu la ovulele de Ribes rubrum, n condiiile cultivrii in vitro a
acestora, s-a observat apariia fenomenelor de poliembrionie. Embrionii izolai au continuat s
prolifereze numeroi ali embrioni (Zatyko, 1975).
S-a constatat c esutul placentar exercit un efect pozitiv asupra creterii ovulelor cultivate in
vitro, favoriznd formarea i maturarea seminelor. Se presupune c esutul placentar cedeaz ovulelor
anumite substane stimulatoare. Substanele respective nu prezint o specificitate, ntruct ovule
fertilizate, provenind de la diferite specii sau genuri, au fost grefate, cu rezultate favorabile, pe
placent de Capsicum. n condiiile cultivrii acestora in vitro, ovulele s-au maturizat i au format
semine viabile.
Pot fi cultivate in vitro att ovule fertilizate ct i ovule nefertilizate. Ovulele pot fi recoltate ca
fiind fertilizate n condiiile naturale sau pot fi fertilizate prin polenizarea lor, cultivate fiind pe un
mediu aseptic.
Exist perspective mari n ceea ce privete realizarea prin culturi in vitro a unor polenizri
ncruciate, interspecifice i intergenerice care n condiiile obinuite, n natur duc fie la incapacitatea
embrionului format n a-i menine viabilitatea, fie smna rezultat se dovedete inapt n a suporta
dezvoltarea embrionului.
n literatur se citeaz hibridul realizat ntre Lolium perene i Festuca rubra, utilizndu-se
ovule detaate din floare, la cinci zile de la polenizare. Plantele rezultate au fost asemntoare cu
Festuca rubra.
nvingerea barierelor morfo-fiziologice creeaz posibilitatea realizrii de hibrizi interspecifici
care, n viitor, pot prezenta un interes economic major i care n mod natural nu pot fi obinui prin
hibridare sexuat.
S-au reuit realizarea de experimente privind cultivarea pe medii aseptice a nucelei. Pornind de
la acest tip de esut, in vitro se poate induce poliembrionia. Astfel, n 1976, Mullins i Srinivasan au
provocat formarea de embrioizi la nivelul ovulelor de Vitis vinifera Cabernet Sauvignon, specie n
mod normal monoembrionar. Din ovulele nefertilizate s-a format un calus nucelar, din celulele cruia
s-au difereniat embrioizi, ceva mai mari dect embrionii zigotici. Plantulele rezultate au fost viabile.
La fertilizarea ovulelor poate fi folosit fie polen proaspt, recoltat n perioada iniierii culturilor
de ovule, ovare sau de pistile, fie polen conservat, mai ales n cazul urmririi realizrii de polenizri
interspecifice sau intergenerice. n ambele cazuri este necesar ca prealabil inoculrii, polenul s fie
testat n ceea ce privete capacitatea germinativ, creterea tubului polinic i s se studieze comparativ
eficiena ctorva reete de medii de cultur, n vederea asigurrii unei creteri optime a tubului polinic,
respectiv conservarea i susinerea ntregului potenial biologic al celulei generative i a celei
vegetative.
n cazul n care polenizarea se face la nivelul stigmatului, este necesar s se aproximeze dac
tubul polinic are o lungime corespunztoare pentru a fi asigurat accesibilitatea lui la ovule; n caz
contrar se renun la cultura de pistile i ovulele vor fi excizate i cultivate ca atare. n acest mod, va fi
facilitat fecundarea i se prentmpin epuizarea celulei generative, n decursul parcurgerii traseului
de la stigmat, pn la sacul embrionar (Cachi, 1984).
Cultivarea in vitro a pistilelor, ovarelor, ovulelor i a altor pri florale, precum i a
ansamblelor de componente florale a permis completarea cunotinelor actuale privind funcionarea
organelor respective i privind biologia fecundrii, a formrii embrionului, a seminei i a fructului.
Aceste cunotine servesc la obinerea de noi succese n nvingerea barierelor incompatibilitilor
existente n hibridarea sexuat, fapt deosebit de important, ntruct prin nmulirea sexuat se poate
rennoi continuu, potenialul biologic al plantelor, mbogindu-se zestrea ereditar, cu caracterele
motenite de la doi prini, posednd acumulri genetice diferite.

218

6.1.7.6 Cultura de celule


Poate fi definit ca o cretere a celulelor libere sau a unor mici agregate celulare pe un mediu
de cultur lichid. n funcie de momentul n care se face aprecierea acestui aspect, gradul de agregare
al celulelor poate fi mai mic sau mai mare, fiind mai redus n momentul iniierii culturii i mult mai
accentuat n perioada optim de cretere. Agregatele celulare pot fi datorate unei ineficiente
dezmembrri a celulelor inoculate, a separrii i individualizrii pariale a acestora. De asemenea ele
pot fi i rezultatul unor repetate diviziuni celulare, fr separarea celulelor, iar n astfel de cazuri
frecvena agregatelor crete pe msura atingerii perioadei maxime de diviziune celular. Ulterior dei
frecvena diviziunilor scade, mrirea agregatelor celulare se datoreaz creterii n volum a celulelor.
Cea mai perfect cultur de celule nu este alctuit numai din celule libere. Pentru a reduce
numrul de agregate se practica filtrarea culturii. Agregatele care persist i dup filtrare vor deine
maximum 4-10 celule, uniforme din punct de vedere genetic (Street, 1976).
Gradul de dispersare a celulelor, ntr-o suspensie celular, depinde de durata creterii celulelor
n cultur, originea acestora, compoziia mediului i condiiile de cultur (Street, 1977). Mediul de
cultur optim, de cultivare la celulele de gimnosperme difer de mediul de folosit pentru cultivarea
celulelor la plantele monocotiledonate, dar i fa de mediul folosite la dicotiledonate. Unul din
constituenii mediului de cultur de care depinde meninerea celulelor n suspensie sunt fitohormonii
de cretere care pot influena cultura celulelor in vitro prin natura lor i concentraia folosit. Astfel un
coninut ridicat de auxin determin creterea numrului de celule n suspensie, iar reducerea
coninutului n acest fitohormon, descrete capacitatea celulelor de a se separa (Torrey i Reinert,
1962). De asemenea s-a constatat c procesele de agregare celular sunt influenate i de prezena n
mediul de cultur a etilenei dar i de creterea concentraiei n glucide.
O cultur celular ideal trebuie s fie omogen din punct de vedere morfologic i biochimic.
Numai o cultur de celule individualizate, obinute prin clonarea unei singure celule, meninut n
condiii care s pstreze stabilitatea nuclear, constituie un material biologic valoros pentru
operaiunile de mutagenez, n izolarea de linii celulare, n selectarea de mutani, de un anumit tip.
Culturile de celule de lung durat manifest o diversitate genetic n cadrul populaiei de celule
(Cachi, 1984).
Pentru meninerea celulelor ntr-o stare activ de diviziune i astfel creterea gradului de
agregare, suspensiile celulare trebuie subcultivate la intervale scurte de timp.
Din momentul iniierii unei culturi celulare i pn n momentul practicrii unei subculturi se
parcurge un interval de timp care se numete ciclu de cretere a culturii. n decursul acestui ciclu se
produc schimbri n ceea ce privete viteza de diviziune i de cretere a celulelor. Se distinge o faz
incipient de cretere a vitezei de multiplicare celular, urmat de o perioad de plafonare a frecvenei
diviziunilor, dup care, fr o subcultivare a celulelor, apare un declin, finalizat cu oprirea
diviziunilor. Celulele cultivate ntr-un volum finit de mediu nutritiv constituie celule izolate sau
agregate celulare cuprinse n acelai flacon de cultur. n aceste condiii creterea nceteaz atunci
cnd nutrienii de baz din mediu s-au redus sau au fost epuizai. Exist i sisteme nchise de cultur
care asigur remprosptarea continu a mediului consumat; celulele sunt separate mecanic din mediul
eliberat din vasul de cultur aciune care asigur funcionarea sistemului i recoltarea biomasei
produse. n acest sistem se realizeaz un echilibru ntre cantitatea de mediu introdus n sistem i
mediul evacuat.
Durata meninerii n condiii de viabilitate a unei culturi, fr a se produce modificri, depinde
de specie, de condiiile de cultur, de epuizarea din mediu a constituenilor, care pot limita diviziunea
i creterea, de pH.
Dea asemenea oxigenul i glucidele din mediu pot influena creterea, astfel c o reducere a
celor dou componente determin reducerea sau chiar stoparea creterii celulelor. Subcultivarea
celulelor nainte de finalizarea perioadei exponeniale de cretere a celulelor permite obinerea unor
populaii de celule mai stabile.
Prin ncorporarea n mediul de cultur a unor concentraii reduse de enzime se poate realiza
separarea celulelor, ntruct enzimele, n diluii adecvate, nu influeneaz negativ rata de cretere,
219

permind obinerea de suspensii celulare cu celule mai uniforme din punct de vedere morfologic i
metabolic.
Rata de cretere a numrului de celule n decursul ciclului de cretere a culturii se modific din
momentul iniierii culturii, pn la oprirea diviziunilor. O prim faz, imediat dup inoculare, const
ntr-o ntrziere a declanrii proceselor de multiplicare i de cretere, dar n urmtoarele 10 zile
numrul de celule per unitatea de volum crete exponenial, urmnd apoi faza de staionare i apoi
faza de declin. Faza exponenial de cretere se caracterizeaz ca o perioad finit de timp, n care rata
de cretere a biomasei, raportat la unitatea concentraiei de biomas este constant. Faza de cretere
exponenial este extins n condiiile n care cultura este iniiat cu o densitate redus a celulelor per
unitatea de volum (Cachi, 1984).
Pentru a menine culturile ntr-o faz de cretere exponenial trebuie prevenit situaia
limitrii nutrienilor din mediu ca o consecin a epuizrii acestora. n acest sens se impune
subcultivarea frecvent a celulelor. Eriksson a subcultivat cultura de Haplopappus gracilis i la un
interval de 48 ore. La o cultur de Acer pseudoplatanus, Dorre i colab. (1971) au realizat subculturile
la un interval de 7 zile, obinnd o densitate iniial de 2 x 105 celule/ml.
Pentru culturile de celule se pot folosi urmtoarele tipuri de dispozitive:
-fermentatoare de cca 1 l sau chiar mai mari, utilizate i n cultura cu volum de mediu limitat,
stabilit iniial;
-chemostate pentru cultura continu, deschis;
-fitostate chemostat pentru reglarea culturii semicontinue aparate n care rata de cretere i
densitatea celular sunt meninute constante, prin fixarea unei rate de introducere a factorilor nutritivi
i hormonali;
-turbiostate sistem deschis de cultur continu, n care mediul proaspt se adaug n
momentul creterii turbiditii culturii i a eliberrii, prin splare i eliminare a excedentului de celule.
O cultur de celule poate fi obinut pe mai multe ci. Cea mai folosit metod const n
realizarea n mediul de cultur lichid a unei suspensii utiliznd ca material iniial calus, pentru ca s se
realizeze o dispersare a celulelor i a agregatelor ce alctuiesc masa de calus, condiie ce poate fi
ndeplinit prin efectuarea unor subculturi repetate de calus, pe medii cu balan hormonal adecvat
scopului respectiv. Cel mai folosit fitohormon este acidul 2,4 diclorfenoxiacetic, n diferite
concentraii. n cazul n care gradul de dispersie al calusului este redus, chiar i n condiiile agitrii
mediilor de cultur lichide, se vor efectua subculturi prin recoltarea supernatantului i diluarea
agregatelor celulare mici n mediu de cultur proaspt.
De asemenea, n acelai scop, se poate practica recoltarea fragmentelor de calus din mediul
lichid i recultivarea lor, din nou pe mediu solid, astfel c, coloniile de celule formate vor avea un
procent mult mai ridicat de dispersie atunci cnd se reiniiaz suspensia celular (Street, 1976).
O alt metod const n omogenizarea organelor plantulelor prin triturare moderat, n
omogenizator de sticl i apoi inocularea pe mediu lichid a suspensiei ce celule rezultate.
n acelai scop se pot utiliza protoplati obinui prin digestie enzimatic.
Cultura de suspensii celulare se menine prin inocularea unei cantiti de mediu, dintr-o cultur
deja existent, avnd o densitate cunoscut de celule, dilund-o cu mediu proaspt. Densitatea
celulelor n subcultur nu trebuie s depeasc iniial 0,5-2,5 x 105 celule/ml. n decurs de 15-25 zile
densitatea va crete pn la cca 4 x 106 celule/ml (Street, citat de Cachi, 1984).
Cultura de celule prezint foarte multe avantaje. Exist specii care constituie modele n ceea ce
privete reacia la condiiile create i la care procesele de citodifereniere, de organogenez i
embriogenez pot fi controlate i dirijate n sensul dorit (morcov, tutun). Astfel, cultura de celule
prezint avantaje deosebite n efectuarea unor studii la nivel celular, privind aspecte ale creterii,
citodiferenierii, ale metabolismului celular. De asemenea cultura de celule, fiind constituit ntr-o
populaie omogen de celule se poate folosi n vederea inducerii variabilitii genetice i seleciei de
mutani, prin expunerea culturii la aciunea unor anumii ageni fizici sau chimici.
Unul din marile obiective urmrite prin culturile de celule l constituie acela al selectrii de
mutante biochimice, cum ar fi mutante rezistente la antibiotice, erbicide, metale grele, sruri, etc. Prin
astfel de experimente au fost create linii celulare mutante, iar modificrile genetice operate la nivel
celular pot fi regsite n plantele regenerate pornind de la celula care a suferit un proces de mutaie.
220

Selectarea liniei celulare se poate face uor prin etalarea suspensiei pe medii de cultur solide,
recoltarea efectundu-se n perioada creterii exponeniale (Cachi, 1984).
Capacitatea regenerativ depinde de gradul de agregare al celulelor, viabilitatea acestora,
vrsta culturii, compoziia substratului i de condiiile de cultur.
ntruct experienele de ameliorare i genetic din cmp sunt costisitoare, necesitnd mult
for de munc i suprafa mare de teren, prin tehnicile de culturi in vitro aceste experimente se
simplific, reducndu-se activitatea, n prima faz, doar n laborator, astfel c se reduc att suprafeele
de lucru ct i timpul necesar obinerii rezultatelor dorite. n plus materialul biologic valoros obinut,
prin cultura de celule se poate pstra timp ndelungat prin crioconservare, n azot lichid.
O problem deosebit este aceea a obinerii de culturi de celule fotoautotrofe. Celulele
cultivate pe medii aseptice dei au clorofil nu pot supravieui n lipsa zahrului din mediul de cultur.
n ncercrile fcute pe medii aseptice s-a constatat c succesul cultivrii esuturilor i celulelor
clorofiliene autotrofe a fost minim, nregistrndu-se o rat sczut a creterii acestora. Vigurozitatea
slab a celulelor crescute n astfel de condiii a fost explicat printr-o activitate fotosintetic sczut,
datorat unor deficiene de cultur, care mpiedic dezvoltarea cloroplastelor i a fotosintezei. Yamada
i colab.(1978) s-au ocupat de aceast problem i au ajuns la concluzia c n realizarea culturilor de
celule fotoautotrofe trebuie s se aib n vedere selectarea de celule care produc mult clorofil.
Lumina puternic stimuleaz sintetizarea clorofilei, dar numai la o concentraie sczut de zaharoz.
Prezena n mediul de cultur a unor concentraii ridicate de zaharoz inhib sinteza clorofilei.
Culturile de celule au implicaii practice deosebite n industria aa zis de tip fermentativ, dup
modelul biotehnologiilor care folosesc microorganismele n scopuri industriale. i n culturile de
celule s-a asimilat i adoptat termenul de fermentatoare pentru recipientele n care se cultiv celule. La
plantele superioare, spre deosebire de microorganisme, produii secundari de metabolism sunt
depozitai n vacuole, nefiind excretai n mediul de cultur. La suspensiile celulare, derivnd din
plantele superioare, durata de fermentaie este de cca 10 ori mai mare dect la culturile de tip
microbian.
Un aspect particular l constituie capacitatea celulelor cultivate in vitro de a transforma
precursori sau anumii compui prezeni n mediul de cultur. Biotransformarea poate fi utilizat
pentru diferite tipuri de reacii: hidroxilare, dehidrogenare, hidrogenare, glicozidare, adiia de carbon,
ruperea lanului de carbon.
Culturile n mediu lichid prezint avantajul unui contact mai bun al celulelor cu nutrienii, se
asigur un schimb de gaze optimizat, se evit neajunsurile provocate de o eventual orientare polar
neadecvat, precum i depozitarea i concentrarea n jurul celulelor a produilor de metabolism,
eliminai n mediu.
6.1.7.7 Cultura altor tipuri de explante
Teoretic, oricare parte a plantei poate fi folosit ca explant pentru iniierea culturilor in vitro.
Inducerea neoformrii de esuturi este dependent de specie, de natura organului, de mrimea
explantului, natura esuturilor prezente n explant, sezonul n care s-a recoltat organul, modul de
sterilizare, compoziia mediului de cultur, orientarea lor pe mediu precum i balana hormonal
folosit n mediul de cultur.
De regul, n afar de meristemele apicale, la nivelul nodurilor, al frunzelor, al
inflorescenelor, cotiledoanelor i mai rar, n poriunea internodal a tulpinilor se constat existena
unei capaciti regenerative, a crei intensitate depinde de specie, de vrsta organului din acre se
preleveaz esuturile, mrimea explantului, orientarea lui pe mediu de cultur, de compoziia mediului
sau de condiiile din camera de cretere.
ntr-un experiment efectuat de Lazr i Cachi (1980-1982), cu explante de crizantem de
natur diferit, cultivate pe mediu de baz cu adaos de AIA (2 mg/l) i BA (2mg/l) s-a constatat c, n
afar de meristeme, alte tipuri de explante folosite de la peduncul floral, peiol, inflorescena,
minibutai frecvent au generat calus. La nivelul calusului s-a observat inducerea proceselor de
organogenez, pe suprafaa superioar, formare de mugurai iar pe cea inferioar, generarea de
rdcinie. Din meristemele apicale, dup dou luni de cultivare pe medii aseptice s-au format plante,
221

complet conformate. Din meristemele axilare, diferenierea plantelor s-a fcut mai lent. Plantele
formate din meristeme au avut o conformaie proporionat i s-au adaptat bine la viaa mediului
septic. Explantele nodale i cele constnd din teaca frunzelor, au generat, pe un explant, un numr
variabil de mugurai. Dintre acetia unul pn la trei s-au dezvoltat, ceilali rmnnd n diferite faze
de cretere. separai i subcultivai pe medii proaspete au format rdcinie i s-au dezvoltat normal.
Inoculii constnd din explante de form cilindric (ex. internod), au prezentat o pregnant polaritate
morfogenetic, chiar dac explantul a fost acoperit de calus.
Procesul de organogenez a fost i mai sczut la fragmentul desprins din mijlocul peiolului
frunzelor. n general, inoculii constnd din internod i mai ales cei dimensionai din peiol au generat
mult mai mult calus dect cei de form i mrime similar, obinui din peduncul floral.
Explantele dimensionate din poriunea limbului foliar, n care nervura principal a frunzei era
bine reprezentat, au generat o cantitate mai redus de calus, n schimb au dat natere la mugurai, din
care s-au format plante (Lazr i Cachi, 1982). n general, lstraii formai la nivelul calusurilor au
un aspect diferit de acela al tulpinielor formate din meristeme, ceea ce atest c din celulele calusului
se pot diferenia plantule cu o conformaie particular, diferit de aceea a plantelor din care au
provenit, nefiind asigurat, pe aceast cale nmulirea clonal.
Concluzia final a constat n aceea c regenerarea i diferenierea rapid a noi plante s-a
realizat din inoculii meristematici. Lstarii pot fi transformai n minibutai i prin aceasta se ridic
coeficientul de multiplicare a clonei respective.
Se poate deci concluziona c, n funcie de specia la care se dorete experimentare, dar innd cont i
de scopul urmrit, natura explantului este diferit, iar rezultatul preconizat a se obine este influenat
de o serie de factori, de la compoziia mediului de cultur, natura fitohormonilor de cretere i
concentraia acestora, pn la vrsta organului donor sau condiiile din camerele de cretere. Exist,
aadar, o gam variat de posibiliti de inducere a unei culturi in vitro, astfel c se pot depista
pentru fiecare specie de cultur, ornamental sau forestier, sursele de explante cele mai potrivite n
vederea realizrii unor astfel de experiene. Iar acolo unde literatura nu ofer posibiliti de inducere a
culturilor de celule, experiena cercettorului poate permite depistarea prin tatonri a celor mai bune
metode n vederea realizrii obiectivelor n acest domeniu.

222

CAPITOLUL VIII
8.1 TEHNOLOGII DE CULTUR IN VITRO
Tehnicile de cultur in vitro a explantelor reprezint o cale optim de cercetare a fiziologiei
plantelor. Aplicaiile practice ale acestor tehnici au fost repede apreciate de vreme ce plantulele
obinute n vase de cultur pot fi aclimatizate pe un substrat normal n condiii naturale de via.
Cronologic, cultura de meristeme a stat la originea primelor aplicaii, deoarece scopul acestor
culturi a fost, n principal, obinerea de plante libere de virusuri. Dup primele succese ce au confirmat
semnificaia metodei, s-au dezvoltat rapid tehnicile de micropropagare pentru a asigura o producie
rapid de plante libere de virusuri.
Acestor dou tehnici, care sunt acum utilizate frecvent n horticultur, le mai pot fi adugate
altele trei, ce nc aparin domeniului cercetare, obinerea plantelor haploide, izolarea i cultura de
protoplati i cultura de calus i suspensii celulare cu scopul producerii de compui medicinali
aromatici. Ultima tehnic vizeaz obinerea de substane farmaceutice direct din culturi de celule
vegetale, fr o cultivare n cmp.
8.1.1 Cultura de meristeme
Meristemele sunt esuturi de tip formativ cu celule tinere ce-i menin pe tot parcursul vieii
plantelor capacitatea de se divide, formnd mereu noi celule. Meristemele sunt localizate n vrful
ramificaiilor organelor tulpini sau rdcini fiind meristeme apicale cu rol n creterea n lungime a
acestora. Importana culturii de meristeme const n principal n utilizarea lor n vederea obinerii de
plante libere de viroze, aceasta fiind i principala aplicaie practic a acestui tip de culturi.
Pentru cultura de meristeme cu scopul devirozrii plantelor se folosesc ndeosebi meristemele
din vrful de cretere al tulpinilor, i anume din mugurii floriferi sau foliari, iar la cartof din ochii de
pe tubercul tocmai pornii n vegetaie.
Mugurele este constituit dintr-un ax principal n apexul cruia se afl meristemul, iar prin
diviziunea continu a meristemului se formeaz primordiile foliare (Fig.17). Formarea meristemelor i
mai apoi organogeneza, adic formarea organelor plantei, sunt procese ce au loc sub influena
fitohormonilor, de aceea meristemele excizate sunt plasate pe medii cu o balan hormonal adecvat.
Observaiile ce au condus la dezvoltarea culturii de meristeme au fost fcute de White, care a
notat c rdcini de tomate infectate cu virus, genereaz n unele cazuri rdcini fr virus. Studii mai
amnunite au fost fcute de Limaset i Cornuet (1949), care au observat c din plante de tutun
infectate cu virus, explantele prelevate prezentau o infecie de intensitate sczut, sau explantele de
dimensiuni mici erau chiar libere de virusuri.
Aceste cercetri au demonstrat c intensitatea infeciei crete dinspre prile juvenile ale
plantei spre cele mature (de exemplu: frunzele aflate n apropierea mugurilor apicali conin cu pn la
150 de ori mai puin virus dect cele aflate la mijlocul plantei).

a zona apical axial; b zona lateral;


c primordii foliare; d meristeme axilare;
e meristem medular; f - procambiu

Fig. 17 Reprezentarea schematic a unui meristem caulinar


(dup Badea i colab., 2001)
223

Aceste cercetri au permis emiterea teoriei conform creia multiplicarea virusurilor a fost
limitat la nivelul sub-meristematic, meristemul fiind liber de virusuri. Morel i Martin au fost primii
care au reuit s regenereze noi plantule din meristeme inoculate pe medii artificiale. Plantele
regenerate au fcut parte din genul Dahlia i erau infectate cu virusul ptrii inelare i virusul
mozaicului. Meristemele cultivate au generat lstari tineri dintre care unii s-au dovedit a fi liberi de
virusuri. Acest prim succes a fost urmat de altele i a deschis calea utilizrii acestei tehnici de cultur
in vitro n horticultur.
Motivul pentru care meristemele sunt libere de virusuri nu este elucidat n ntregime
presupunndu-se c datorit ritmului alert de multiplicare a celulelor la acest nivel genereaz o
anumit imunitate sau poate c n lupta pentru metabolii dat ntre celule i virusuri primele au mai
mult succes. A doua presupunere este verificat prin rezultatele obinute n urma aplicrii
termoterapiei, deoarece temperaturile ridicate avantajeaz multiplicarea celulelor vegetale i reduce
viteza de multiplicare a virusurilor. De fapt, studiile au artat c n unele cazuri de infecie cu anumite
virusuri rezultate notabile s-au obinut doar dup combinarea celor dou metode: cultura de meristeme
cu termoterapia.
Aceast tehnic este aplicat doar la speciile ce permit nmulirea vegetativ i favorizeaz
diseminarea virusurilor. La speciile ce se nmulesc generativ, riscul transmiterii prin intermediul
seminei este foarte limitat, de aceea regenerarea prin cultura de meristem este puin interesant.
Dup alegerea plantei donor se trece la prelevarea vrfurilor de cretere din care, n condiii
sterile, va fi izolat meristemul. n funcie de vrful de cretere se va proceda la sterilizarea materialului
vegetal nainte de izolarea meristemelor. De exemplu, colii tuberculilor sau vrfurile de cretere ale
Saintpaulia sau Gerbera, trebuie sterilizate nainte de prelevarea meristemelor, pe cnd mugurii de
vi de vie, vrfurile vegetative ale garoafelor, crizantemelor sau anghinrii nu necesit sterilizare,
doar schimbarea instrumentarului, cu unul sterilizat, dup fiecare operaiune. Explantele se sterilizeaz
conform metodologiei prezentate anterior i pstrate pn la fasonare i inoculare n ultima ap
distilat steril destinat cltirii. Excizia poate fi fcut la hota cu flux de aer steril sau mai simplu pe
o mas dezinfectat n prealabil. Un binocular este indispensabil efecturii acestor operaiuni,
magnitudinea optim putnd fi de 20 sau 40x. Frunzele tinere sunt nlturate de pe explant prin tiere,
urmnd ca foliolele rudimentare s fie nlturate prin smulgere, iar meristemul izolat cu ajutorul unui
vrf de ac de sering sau cu un bisturiu cu vrf foarte fin. Instrumentarul se schimb foarte des, dup
fiecare operaiune, i se nlocuiete cu unul sterilizat prin flambare. Cnd meristemul este vizibil
(domul meristematic cu o pereche de primordii foliare constituie n general meristemul primar i are o
culoare galben-verzuie transparent) se nltur cu foarte mare grij i ultimele foliole i prin patru
seciuni perpendiculare se izoleaz meristemul. Ultima seciune transversal izoleaz meristemul,
tierea trebuie fcut imediat sub inelul central. Meristemul (0,2-0,3 mm) este preluat pe o lam, ac de
sering sau bisturiu cu lamela foarte fin i inoculat la suprafaa mediului de cultur solid.
Toate operaiunile prezentate anterior trebuie fcute ntr-un timp ct mai scurt pentru a evita
deshidratarea i pentru a limita riscurile contaminrii.
n ce privete substratul nutritiv utilizat, n general, acesta trebuie s fie suficient de bogat n
elemente minerale, n special n potasiu, concentraia cruia trebuie s fie mare ntr-un mediu destinat
micropropagrii. Din acest punct de vedere mediul Murashige-Skoog este optim.
Coninutul n zaharuri trebuie s fie ntre 2 i 6%, n funcie de specie. Mai sunt necesare i
alte componente de tipul microelementelor, vitaminelor i cheailor de fier, n concentraii variabile.
Mediul de cultur artificial este solidificat, n general, cu agar (6 pn la 10mg/l), dar poate fi
i lichid, caz n care schimburile dintre mediu i explant sunt mai bune cu condiia asigurrii unei
aerri optime (pentru a se evita asfixierea explantelor), deci a unei agitaii corespunztoare.
Regulatorii de cretere sunt determinani n realizarea cu succes a unei culturi de meristeme. n
general, auxinele sunt indispensabile multiplicrii celulare. Uneori se adaug i citochinine n
concentraii foarte mici, n special sub form de urme. Deseori sunt necesare i giberelinele pentru
determinarea alungirii axului principal, meristemele aparinnd grupului de explante de tip organizat.
Vasele optime culturii de meristeme sunt cutiile Petri, deoarece volumul de aer de deasupra
meristemelor trebuie s fie mic pentru a evita deshidratarea acestora.
224

Dup inocularea meristemelor, vasele de cultur sunt plasate n camerele de cretere la o


intensitate luminoas de 1000 pn la 3000 de luci, la un fotoperiodism de 16 ore lumin i 8 ore
ntuneric i la temperaturi de 22-25oC.
n aceste condiii, dac mediul este favorabil, se va observa formarea unor lstari care vor
nrdcina sau nu, n funcie de specie. Dac plntuele sunt complet formate, cum e cazul
crizantemelor, garoafelor, violetelor de Parma sau anghinrii, se poate trece la aclimatizarea lor sau pe
mediu de multiplicare, n cazul n care se dorete obinerea unui numr mare de plante. Dac
plntuele nu nrdcineaz, cum e cazul speciilor Actinia, Gerbera i trandafir, lstarii regenerai se
subcultiv pe mediu pentru nrdcinare, ce va conine doar elementele minerale necesare fr
fitohormoni sau cu adiie de auxine.
Din numrul total de meristeme inoculate se pierd mai multe sau mai puine din mai multe
cauze.
Prima cauz ar fi de ordin tehnic, procedeul de izolare al meristemelor este dificil i delicat,
rezultnd contaminri cu bacterii sau fungi (n medie de aproximativ 5%). Mai mult, un numr
nsemnat de meristeme se deshidrateaz, iar la cele de dimensiuni foarte mici s-ar putea la seciunea
final s se treac prin inelul central al domului meristematic i astfel s se determine decesul
acestuia.
A doua cauz poate fi de natur fiziologic, condiiile n care au crescut plantele donor
prezentnd o importan deosebit. La speciile ierboase, se ntlnesc deseori urmtoarele fenomene:
cnd meristemul este prelevat de pe axa principal de cretere, rata de regenerare este de 80-90%. n
contrast, aceast rat poate descrete pn la 5-10% atunci cnd meristemele sunt prelevate din axele
secundare cu creteri lente.
La speciile lemnoase aceast metod este dificil de aplicat deoarece meristemele prelevate de
pe ramuri aflate n faza de vegetaie se brunific n contact cu mediul i mor. n acest caz, prelevarea
meristemelor se face din muguri dorminzi.
A treia cauz ar putea fi de ordin biologic, pe de o parte, dup cum se tie, unele virusuri ajung
i n domul meristematic, pe cnd unele sunt uor de nlturat prin cultura de meristeme, iar pe de alt
parte, la unele specii se poate ntlni prezena bacteriilor pn n cele mai profunde straturi celulare
(marea majoritate nepatogene) ce se vor dezvolta ulterior n mediu infectnd cultura. De exemplu,
Hydrangea i Pelargonium gzduiesc multe bacterii ceea ce duce la creterea ratei infeciilor in vitro
(aproape de 99% uneori la Hydrangea). Aceast caracteristic este observat i la speciile acaule (fr
tulpin aparent., vine din franuzescul acaule, n greac a fr, kaulos tulpin), la care
meristemele sunt situate la nivelul solului.
Cauzele enumerate mai sus determin eliminarea a numeroase vase cu infecii sau cu
meristeme deshidratate, sau dac nu au aprut nici infecii i s-au dezvoltat lstari trebuie verificat
prezena virusurilor la nivelul esuturilor.
n cazul acestei tehnici, nu este att de important procentul de plante regenerate ct numrul de
plante libere de virusuri obinute, ce vor constitui materialul biologic donor pentru regenerarea unui
lot liber de virusuri.
Cultura de meristeme permite obinerea de plante sntoase i viguroase, la care trebuie ns
verificat cu rigurozitate dac s-au eliminat virusurile din esuturi. Aceste controale se fac prin
indexarea plantelor susceptibile de infecii cu virusuri, la care se calculeaz n general trei indici. Dac
aceti indici sunt negativi, planta se consider liber de virusuri i poate trece pe mediile pentru
micropropagare. Aceste tehnici nu ne permit s afirmm c plantele sunt n totalitate libere de
virusuri, existnd ntotdeauna un oarecare risc. n afara indexrii se pot efectua teste imunologice sau
serologice, ce permit testarea plantelor pentru virusurile cunoscute.
Controalele sanitare ofer informaii asupra prezenei sau absenei virusurilor, dar nu indic
calitatea genetic a plantelor. Oricnd pot aprea mutaii, chiar dac din acest tip de explante
modificrile genetice sunt foarte rare. De aceea, nainte de a distribui plantele obinute prin cultura de
meristeme, la beneficiari, este recomandabil a se verifica dac sunt identice din punct de vedere
genetic cu planta donor.
Punerea la punct a acestei tehnici a indus o dezvoltare considerabil culturilor in vitro i a
permis descoperirea unei bariere pentru rspndirea virusurilor printre speciile de importan
225

propagate vegetativ. De asemenea, aceast metod permite rejuvenilizarea unei specii, ducnd la
obinerea de descendeni viguroi.
Se presupune c fenomenul de rejuvenilizare este datorat tipului de explant (civa milimetri
de esut) care n urma exciziei pierde o parte din memoria citoplasmatic construit de-a lungul
existenei esuturilor parentale.
Trebuie subliniat faptul c dei aceast tehnic permite eliminarea virusurilor din esuturi i obinerea
de plante sntoase, plantele obinute nu sunt imune, rmnnd susceptibile la atacul bolilor i
duntorilor ca i prinii donor. De aceea, este recomandabil s se evite recontaminarea materialului
vegetal obinut, i dac nu este posibil s se rennoiasc cu regularitate materialul semincer.

CAPITOLUL XI
11.1 MICROPROPAGAREA PLANTELOR
11.1.1 Consideraii generale
Spre deosebire de metodele de nmulire clasic, generativ i vegetativ, micropropagarea
plantelor prezint o serie de avantaje, care au impus-o n faa primelor. Aceste avantaje ar putea fi
urmtoarele:
-nmulirea in vitro este mult mai rapid dect cea in vivo, astfel c ntr-un an dintr-un explant
se pot obine peste un milion de exemplare;
-multe specii care nu pot fi nmulite in vivo sau care se nmulesc greu, pot fi nmulite in vitro
n urma parcurgerii unui proces de juvenilizare;
-creterea plantelor nmulite in vitro este mai puternic, fapt datorat juvenilizrii i
devirozrii. Astfel, Cameron i colab. (1986) au observat la cpun, c creterea mai puternic a
explantelor obinute in vitro se datoreaz modificrilor survenite n schimburile gazoase ale acestora;
-este posibil obinerea i nmulirea plantelor libere de virusuri cu toate avantajele care decurg
de aici;
-plantele cultivate in vitro pot fi transportate n condiii de siguran fitosanitar desvrite,
putnd fi schimbate, exportate sau importate;
-pentru iniierea unei culturi in vitro este nevoie de o cantitate redus de material biologic.
Pentru amelioratori acest lucru este foarte important nct se poate realiza o selecie drastic a
materialului biologic i n plus se pot nmulii indivizi deosebii obinui prin hibridri sau mutante
aprute;
-se realizeaz importante economii de teren, spaiu, energie i combustibil;
-ofer posibilitatea controlului total al factorilor de mediu, fapt ce duce la creterea
productivitii i eficienei culturilor i la nlturarea periodicitii produciei determinat de efectul
sezonier. Se poate, de asemenea, planifica producia de plante obinute in vitro n funcie de
necesitile concrete ale pieei;
-nmulirea in vitro permite obinerea plantelor pe rdcini proprii, nlturnd altoirea cu toate
dezavantajele pe care le presupune;
-materialul produs in vitro poate s fie conservat prin diferite metode i folosit n momentul n
care este cerut;
Pentru ameliorarea plantelor, micropropagarea ofer avantaje suplimentare:
-se scurteaz timpul necesar producerii i lansrii unui soi;
-se pot obine i nmulii clone homozigote care s fie folosite pentru obinerea hibrizilor F1;
-prin utilizarea agenilor mutageni n diferite faze i tipuri de culturi in vitro se pot obine i
seleciona mutante valoroase. Procedeul este folosit mai ales la cultura de calus i la regenerarea de
lstari adventivi din mezofil;
-prin cultura explantelor in vitro n condiii extreme se poate realiza selecia la factorii de stres
a genotipurilor noi (ex. selecia la aluminiu);
226

-manipulrile genetice de tipul hibridrilor somatice nu se pot concepe fr folosirea culturilor


de celule i protoplati in vitro;
-anumite plante necesit nmulire vegetativ exclusiv; haploizi, mutante sterile, liniile
mascule sterile folosite la hibridri, aneuploizi, sau heterozigoi deosebii;
-materialul genetic valoros poate fi conservat n bnci de gene sub form de explante in vitro.
Folosirea micropropagrii este limitat, n unele cazuri, de anumite dezavantaje pe care aceasta
le prezint:
-n anumite situaii, stabilitatea genetic a materialului nmulit in vitro este redus;
-plantele nmulite in vitro prezint, uneori, defecte caracteristice i dup ce sunt trecute in
vivo: juvenilitate accentuat manifestat prin frunze necaracteristice, prezena spinilor, lstrire
adventiv, fructificare ntrziat, vigoare exagerat, pierderea caracterului dominant;
-uneori, nrdcinarea explantelor nmulite in vitro este greoaie sau imposibil. De regul,
rdcinile formate in vitro au o funcionalitate redus ele fiind nlocuite de alte rdcini n faza de
aclimatizare;
-aclimatizarea plantelor obinute in vitro este, la unele specii, foarte dificil datorit unor
modificri morfo-anatomice i fiziologice care apar pe durata cultivrii in vitro. Pentru realizarea
aclimatizrii trebuie construite structuri speciale sere, solarii, dotate cu dispozitive de control al
factorilor de mediu;
-clonarea exagerat favorizeaz creterea riscurilor de distrugere n mas a unor clone de ctre
rase virulente de boli i duntori aprute ulterior. Pentru evitarea acestor situaii se va recurge la
varianta nmulirii i plantrii multiclonale;
-capacitatea regenerativ a explantelor poate s se reduc sau s se piard prin subculturi
repetate;
-n anumite situaii, sterilizarea total a materialului iniial este dificil sau imposibil de
realizat;
-micronmulirea in vitro presupune existena unor structuri specializate i a unei fore de
munc specializate.
11.1.2 Fazele multiplicrii in vitro
11.1.2.1 Pregtirea materialului biologic
Prima faz a micropropagrii este o etap important mai ales pentru speciile lemnoase care
trebuie s treac printr-o faz de juvenilizare. Aceasta se poate realiza prin:
-tieri repetate, puternice, fiind stimulate astfel creterile noi;
-prin butire;
-prin altoiri repetate sau microaltoire.
Materialul biologic juvenil se poate obine prin germinarea seminelor sau smburilor atunci
cnd este posibil.
n acelai timp, faza de pregtire presupune cultivarea plantelor destinate prelevrii de
explante, n spaii nchise pentru prevenirea sau reducerea contaminrilor sau pentru efectuarea unor
tratamente fitosanitare eficiente.
11.1.2.2 Iniierea i stabilizarea
Faza de iniiere i stabilizare a culturilor in vitro presupune, sterilizarea materialului biologic,
izolarea explantelor i inocularea acestora pe un mediu de iniiere. Mediile de iniiere sunt, n general,
variante ale mediilor obinuite, recomandate pentru specia respectiv, avnd ns concentraia de
sruri redus la jumtate. Frecvent se folosesc reete de medii lipsite de fitohormoni.
n aceast faz este important realizarea culturii aseptice i nceperea creterii explantelor.
Pentru depistarea infeciilor latente sunt necesare teste suplimentare pe medii bogate n zaharuri,
peptone, etc.
227

11.1.2.3 Multiplicarea
Faza de multiplicare se ntinde pe mai multe subculturi cu o durat de 3-4 sptmni. n
aceast faz scopul principal este creterea ratei de multiplicare n condiiile meninerii stabilitii
genetice a materialului biologic.
Aceasta se poate realiza, n general, prin creterea cantitii de citochinine din mediu sau prin
realizarea unei balane hormonale favorabile citochininelor.
Numrul de subculturi trebuie s fie limitat, n funcie de specie, i orice prelungire a fazei
respective necesit verificri suplimentare a stabilitii genetice a materialului.
11.1.2.4 nrdcinarea
Faza de nrdcinare sau de pregtire a materialului pentru trecerea in vivo este o faz
important care const n reducerea lstririi axilare, stimularea alungirii lstarilor, inducerea formrii
rdcinilor sau chiar formarea rdcinilor.
Frecvent, n aceast faz se folosesc medii de cultur adiionate cu crbune vegetal, lipsite de
hormoni sau cu concentraii ridicate de auxine. O alt variant const n cultivarea pe un mediu cu o
concentraie ridicat de auxine, o anumit perioad, urmat de cultivarea pe un mediu fr hormoni.
Foarte multe laboratoare opteaz ns pentru realizarea nrdcinrii concomitent cu aclimatizarea
pentru a evita astfel pierderile de timp i reactivi.
11.1.2.5 Aclimatizarea
Este etapa cea mai dificil dintr-un protocol de micropropagare. Lstarii nrdcinai sau cu
primordii de rdcini sunt trecui n amestecuri de pmnt i apoi meninui ntr-un spaiu caracterizat
prin umiditate relativ ridicat i temperatur controlat.
nainte de a fi folosit pentru plantare materialul sditor, att cel de pomi fructiferi i vi-devie, ct i cel de arbori trebuie s petreac cteva luni n cmp (pepiniere) pentru cretere i fortificare.
11.1.3 Cultura de meristeme i apexuri
Meristemele caulinare sunt folosite n mod normal pentru a fi cultivate pe medii aseptice in
vitro.
Datorit totipotenei de care dau dovad meristemele caulinare, ele vor fi capabile s genereze
n final plante ntregi.
n general, se folosesc pentru iniierea de culturi meristematice, meristemele terminale i cele
axilare (laterale). Acestea sunt capabile s genereze in vitro plntue care sunt folosite apoi pentru
nmulirea rapid.
Primele ncercri de cultivare a meristemelor caulinare i radiculare in vitro au fost fcute n
1922 de ctre Kotte la mazre i de ctre Robbins la porumb. Abia n 1946, Ball a reuit s obin
plante din apexuri meristematice de Lupinus albus i Tropaeollum majus. Ulterior, Wetmore i Morel,
citai de Cachia-Cosma (1984), au studiat comportarea meristemelor provenite de la diferite specii, n
diferite condiii de cultur.
Epoca optim pentru prelevarea meristemelor variaz de la caz la caz. De regul se evit
perioadele de laten a organelor, cnd activitatea meristematic este redus.
La garoafe, cel mai mare procent de supravieuire l-au avut meristemele recoltate primvara
sau toamna devreme, pe cnd cele recoltate iarna au nrdcinat mai uor, iar cele recoltate vara au
prezentat cel mai ridicat grad de devirozare.
La cartof, meristemele recoltate primvara i vara formeaz plante care nrdcineaz mai bine
dect cele recoltate n a doua parte a anului.
Prelevarea meristemelor se face dup sterilizarea prealabil a materialului vegetal.
228

La speciile lemnoase care prezint meristeme protejate de catafilele mugurilor, sterilizarea


poate s se fac la concentraii mai ridicate ale agenilor sterilizani.
Ulterior, prelevarea meristemelor se face la hot sub o lup binocular. Se nltur treptat
catafilele i primordiile frunzelor cu ajutorul bisturiului i a unor ace spatulate pn se ajunge la
domul meristematic. Excizarea acestuia se face prin una sau dou tieturi urmrind detaarea unei
cantiti ct mai reduse din esutul aflat dedesubt.
Pentru uurarea lucrului, la mugurii vegetativi provenii de la speciile lemnoase nainte de
dezvelirea domului meristematic, sub lup, se poate recurge la eliminarea prin patru tieturi paralele
cu marginile mugurilor a aproximativ 50% din volumul acestora. Tierea se va face antrennd i
scoara adiacent de pe ramur i nlturnd astfel i eventualele riscuri de infecie.
Dup detaare, meristemul este aezat uor de pe lama bisturiului pe mediul de cultur. Se
poate practica, cu ajutorul vrfului bisturiului, o uoar incizie n masa mediului n care se va aeza
meristemul.
Mediul de cultur folosit este, de regul, mediul solid, putndu-se ns folosi i medii lichide,
meristemele aezndu-se n acest caz, pe puni de hrtie de filtru.
Frecvent se recomand reducerea coninutului de macroelemente la jumtate (Standardi,
1982), iar pH-ul mediului variaz ntre 5,5 5,8.
Concentraiile de hormoni sunt reduse 0,1-0,5 m/l, auxinele i citochininele fiind indicate
pentru stimularea diviziunii celulare, iar giberelinele pentru stimularea alungirii lstarilor.
Intensitatea luminoas variaz de la caz la caz, n general recomandndu-se 2400-2600 luci,
cu o fotoperioad de 16 ore lumin i 8 ore ntuneric. La unele specii incubarea meristemelor la
ntuneric timp de cteva zile (2-6) are ca efect reducerea brunificrilor (Stnic i colab., 1992).
Exist situaii cnd intensitatea luminoas trebuie s ating valori cuprinse ntre 3000-4000
luci sau chiar de 10000 luci la conifere. Uneori, se recomand suplimentarea luminii fluorescente ,
cu lumin roie.
Temperatura optim este de 22-25oC, dar la unele specii (via-de vie) incubarea meristemelor
la temperaturi mai ridicate poate avea un efect mai drastic n eradicarea virusurilor.
Dup nceperea formrii lstarilor din meristeme se trece la nmulirea acestora, folosind cel
mai adecvat procedeu n funcie de specie.
Astfel, se poate realiza minibutirea lstarului prin secionarea lui n fragmente uninodale sau
stimularea lstririi axilare i izolarea lstarilor formai.
Avantajele folosirii meristemelor sunt multiple:
-posibilitatea nmulirii clonale a materialului biologic valoros;
-eliminarea bolilor i duntorilor periculoi;
-obinerea unui material juvenilizat cu capacitate mare de multiplicare;
-conservarea la temperaturi sczute a inoculior valoroi pn n momentul folosirii;
-posibilitatea realizrii bncilor de gene.
11.1.4 Cultura de apexuri
Pe lng folosirea meristemelor , iniierea culturilor in vitro se poate realiza prin folosirea unor
apexuri de lstari. Vrful de cretere al lstarului, nsoit de 1-2 frunze n formare, este detaat dup o
prealabil sterilizare i inoculat pe mediul de cultur. Cel mai bun moment pentru inoculare este
perioada de cretere intens a lstarilor.
Lstarii pot proveni de la plante cultivate n cmp sau n ser. n aceste cazuri ns gradul de
infectare a materialului este ridicat.
O soluie mult mai practic este obinerea lstarilor n laborator prin punerea la forare a unor
ramuri anuale. n acest scop, ramurile se fasoneaz n butai de 10-15 cm, se parafineaz la vrf i
eventual se dezinfecteaz prin mbiere ntr-o soluie de fungicide. Se pun apoi n vase cu ap la
temperatur ridicat, n camera de cretere, urmnd ca n 10-14 zile mugurii s se deschid i s
formeze lstarii care vor fi folosii pentru prelevarea apexurilor.

229

n tabelele 11.1 i 11.2 sunt prezentate cteva din realizrile obinute prin cultura de meristeme
i apexuri la plantele horticole lemnoase, pomi i arbuti fructiferi, arbori i arbuti ornamentali. Sunt
indicate att mediile de cultur folosite, ct i rezultatul cercetrilor.
11.1.5 Cultura de fragmente uninodale
Metoda const n secionarea lstarilor crescui in vitro n poriuni uninodale urmat de
cultivarea acestora pe un nou mediu de cultur.
Din mugurii axilari vor lua natere noi lstari care dup o anumit perioad de timp vor fi
secionai din nou.
Primele experiene privind cultura de fragmente uninodale, obinerea de lstari i nrdcinarea
acestora au fost efectuate de Galston (1947, 1948) i Gorter (1965) la asparagus.

230

Tabelul 11.1
Denumirea
speciei
Ananas
comosus

Castanea
sativa
Citrus sp.
Cocos
nucifera

Rezultat

Culturi de meristeme i apexuri la pomii i arbutii fructiferi


(dup Stnic, 1999)
Mediu de cultur pH
Zaharoz
Agar
Fitohormoni
(g/l)
(g/l)
(mg/l)

Lstari axilari

MS (1962)

Lstar unic
Lstar unic

MS (1962)
Rodriquez (1982 b)
K(h)
Rodriquez (1982 b)
K(h)
Vieitez i Vieitez
(1980 b)
Bouzid (1975) A

lstari
Proliferare
lstari
Lstari axilari
i adventivi
Rizogenez
Lstari
devirozai

Fragaria
Proliferare
lstari
Lstari

30

5,5

30
30

5,5

30

5,5

30

5,8

30

68,4

6,5

30 glucoz

20

1 ANA;
1 KIN
1-2 ANA;
12% CM
2,5 AIA;
0,1 KIN
10% CM

DSouza (1982) BM

Autori

1,8 ANA;
2 AIB; 2 KIN
25% CM
1 AIB

Matheus i Rangan
(1979)
Zepeda i Sagawa (1981)
Rodriquez (1982 c)

0,06 AIB;
1 BAP
0,1 BAP

Rodriquez (1982 c)

Mullin i colab.
(1974) B
White (1954) - sruri

5,75,8

Adams (1972)
Boxus (1974 a)

5,2
5,6

30
22 glucoz

1 AIB; 0,1 BAP


1 BAP

Mullin i colab.
(1974)

4,5

30 glucoz

1 AIA

Vieitez i Vieitez (1980


b)
Bouzid (1975)
DSouza (1982)
Mullin i colab. (1974)
Miller i Belkengren
(1963)
Adams (1972)
Boxus (1974)
Mullin i Schlegel
(1976)

231

Tabelul 11.1 (continuare)


Denumirea
speciei
Malus x
domestica
Musa
cavendishii
Musa textilis
Prunus
cerasifera
Rubus idaeus
Rubus sp.
Vaccinium sp.

232

Rezultat
Proliferare
lstari
Proliferare
lstari
Calus
Lstari axilari
i adventivi
Proliferare
lstari axilari
Cretere lstari
Lstari axilari
Proliferare
lstari
Lstari axilari

Culturi de meristeme i apexuri la pomii i arbutii fructiferi


(dup Stnic, 1999)
Mediu de cultur pH
Zaharoz
Agar
Fitohormoni
(g/l)
(g/l)
(mg/l)

Autori

MS (1962)

5,3

20

1,1 BAP

Lane (1979)

Jones i colab.
(1977)
MS (1962)

5,2

30

Snir i Erez (1980)

30

6,5

1 AIB; 1 BAP;
0,1 GA3
0,3 AIA; 1 KIN;

Mante i Tapper
(1983)
LS (1965)

5,7

30

5-8

2 BAP

Mante i Tapper (1983)

5,8

30

0,5 BAP

Norton i Norton (1986)

Donnelly (1982)

5,7

30

Skirvin i Chu
(1978)
Goldy i Lyrene
(1984)
Smagula i Lyrene
(1984)

5,8

30

10

0,1 ANA; 2 BAP

Donnelly i colab.
(1982)
Skirvin i Chu (1978)

5,7

30

10 2IP;

Goldy i Lyrene (1984)

5,7

30

5 2IP

Smagula i Lyrene
(1984)

Ma i colb. (1978)

Tabelul 11.2
Denumirea
speciei

Hedera helix

Lavandula
augustifolia
Pinus
sylvestris
Syringa
vulgaris
Weigela
florida

Rezultat
nrdcinare
(sub lumin
puternic)
nrdcinare
(sub lumin
slab)
Lstari
Calus
nmugurire
Dezvoltare
lstari
4 lstari/expl.

Culturi de meristeme i apexuri la arbori i arbuti ornamentali


(dup Stnic, 1999)
Mediu de cultur pH
Zaharoz
Agar
Fitohormoni
(g/l)
(g/l)
(mg/l)
Hackett (1970)

5,8

20

Hackett (1970)

5,8

20

Polito i Alliata
(1981)
Kharta (1974)

5,6

20

5,5

Bornman i Janson
(1980)
Wetmore (1954)

5,65,8

MS (1962)

Autori

5-10 ANA sau


10 AIA + 5,5
catechol
10 AIA + 5,5
catecho

Hackett (1970)

0,5 ANA; 2 BAP

Polito i Alliata (1981)

20

Quazi (1980)

50,5

6-7

1 ANA; 4 BAP;
10% CM
2,2 BAP; 1-2 2IP

20

10

15% CM

30

6,5

2,25 BAP

Hackett (1970)

Bornman i Janson
(1980)
Wetmore (1954)
Calvert i Stephens
(1986)

233

Pentru realizarea acestei tehnici se pot folosi ca explante iniiale meristeme, vrfuri de lstari
(apexuri), muguri aflai la subsioara bracteelor la unele tipuri de inflorescene, precum i alte organe
capabile s genereze lstari in vitro.
De regul, n mediul de cultur, nu se adaug citochinine care s anuleze efectul dominanei
apicale. Se urmrete de fapt, alungirea lstarilor pentru a obine un numr ct mai mare de noduri.
Iniierea culturii este foarte important. n vederea stabilizrii trebuie realizat juvenilizarea
materialului iniial.
La speciile lemnoase un alt aspect important l reprezint necesitatea ntreruperii dormansului
mugurilor dup inoculare. Acest lucru este posibil prin tratamente cu temperaturi sczute (0-5 oC),
mrirea duratei perioadei de iluminare (16 h), asociat cu temperaturi sczute, urmat apoi de
creterea temperaturii.
Uneori se recomand creterea concentraiei de citochinine i gibereline.
La speciile erbacee, dormansul se poate ntrerupe prin etiolarea materialului.
Rata multiplicrii este direct proporional cu viteza de cretere a lstarilor, respectiv cu
numrul de frunze care se formeaz.
De regul, lstarii formai din apexuri cresc i se alungesc mai rapid dect cei formai din
muguri axilari. De aceea, ei sunt trecui n vase de cultur separate.
Folosirea mediului de cultur n dublu strat (solid i lichid) a avut ca efect accentuarea vitezei
de cretere a lstarilor de gutui BA-29 (Stnic F. i colab., 1996).
De asemenea, folosirea apei structurate, i a unor glico-steroizi naturali (Ecostim) a stimulat
creterea lstarilor de mr (Svulescu Anca i Stnic F., 1996).
La liliac (Syringa vulgaris), stimularea creterii lstarilor este posibil prin folosirea zeatinei
sau a 2IP (Pierik i colab., 1986).
La Araucaria cunninghammii (Mott, 1981), la realizarea regenerrii, pot fi folosii numai
lstari ortotropi. La cafea, n schimb are loc o transformare a lstarilor plagiotropi n ortotropi (Pierik,
1987).
Metoda de fa se folosete cu succes la foarte multe specii (vi-de-vie, pr, trandafir, ieder,
salcie pletoas), (tabelele 11.3 i 11.4).
Dup mai multe cicluri de multiplicare este necesar inducerea nrdcinrii lstarilor obinui.
Acest lucru este realizabil prin folosirea unor tratamente cu auxine combinate sau nu cu incubarea la
ntuneric.
n faza de alungire a rdcinilor, concentraia de auxine trebuie redus.
11.1.6 Cultura de lstari axilari
Aceast metod presupune, spre deosebire de cultura de fragmente uninodale, stimularea
creterii lstarilor axilari prin creterea concentraiei de citochinine, fr stimularea alungirii lstarului
mam.
Creterea concentraiei de citochinine are ca efect eliminarea dominanei apicale a mugurelui.
Acest lucru este posibil i prin eliminarea apexului lstarului iniial.
Principiile acestei metode sunt cunoscute nc din 1925. Ea a fost aplicat pentru prima dat de
ctre Hackett i Anderson (1967) la garoafe, de ctre Adams (1972) i Boxus (1973, 1974) la cpun
i de Pierik (1973, 1974, 1975) i Murashige (1974) la gerbera. Dup descoperirea chinetinei,
eliminarea dominanei apicale a fost posibil prin folosirea acesteia, iar ulterior prin utilizarea altor
citochinine.
Frecvent, aceast metod de micropropagare este folosit n tandem cu cultura de fragmente
uninodale. Astfel, n prima etap dintr-un explant uninodal se obine un lstar, apoi acest lstar este
trecut pe un mediu cu un coninut ridicat n citochinine i este stimulat formarea lstarilor axilari.
Cultura de lstari axilari are o serie de avantaje:
-este simpl;
-rata de multiplicare este relativ ridicat;
-stabilitatea genetic este asigurat;
234

-este unica metod de multiplicare in vitro eficient la plantele care cresc n rozet (ex:
cpun).
Necesarul de citochinine este diferit n funcie de specie. La multe specii s-a observat scderea
necesarului de citochinine odat cu creterea numrului de subculturi datorit acumulrii acestora dar,
mai ales datorit juvenilizrii lstarilor.
Concentraia citochininelor trebuie corelat i cu stadiul de dezvoltare al materialului biologic.
Astfel, materialul juvenil necesit o cantitate mai redus de citochinine n mediul de cultur dect cel
provenit de la plante adulte (Sequoia sempervirens, David, 1982).
Frecvent se recomand s se foloseasc medii cu concentraii sczute de auxine i concentraii
ridicate de citochinine. Raportul citochinine:auxine cel mai recomandat este de 10:1.
Felul citochininelor folosite este i el important. Cele mai multe specii reacioneaz bine la
utilizarea BAP (benzil aminopurin) i mai puin bine la chinetin sau 2-iP.
Tidiazuronul i compuii de substituie ai piridil-fenil-ureei stimuleaz, uneori, mai mult
lstrirea axilar dect citochininele (Read i colab., 1986).
n multe situaii se recomand distrugerea mugurelui apical i asocierea acestei msuri cu
aplicarea citochininelor. Pentru creterea eficienei metodei, citochininele trebuie aplicate dup ce
lstarul s-a alungit.
Creterea concentraiei de citochinine aduce, uneori, formarea calusului, ceea ce trebuie evitat
pentru a reduce probabilitatea apariiei variabilitii somaclonale.
La unele specii (Ananas), formarea lstarilor este uneori stimulat de folosirea mediului de
cultur lichid.
De regul, capacitatea de proliferare scade odat cu creterea numrului de subculturi, acest
fenomen fiind frecvent nsoit i de formarea calusului.
Astfel, la cpun, de exemplu, depirea unui numr de 12 subculturi a avut ca efect apariia
unor modificri fiziologice majore.
Metoda lstririi axilare poate fi folosit att pentru plantele care cresc n rozet ct i pentru
plantele care formeaz lstari normali.
Mrirea concentraiei de citochinine din mediul de cultur, n vederea stimulrii lstririi
axilare, poate avea ca efect apariia fenomenului de tuf, fenomen care poate continua i dup
subcultivarea explantelor pe medii lipsite de citochinine n vederea alungirii sau nrdcinrii.
n prezent, metoda este mult folosit la micropropagarea materialului sditor pomicol, n multe
ri fiind generalizat (Italia, Frana, Anglia).
n tabelele 11.5 i 11.6 sunt prezentate cteva din cercetrile efectuate n micropropagarea prin
lstrire axilar la plantele horticole lemnoase.
11.1.7 Organogeneza adventiv
Organele i esuturile cultivate in vitro n anumite condiii au capacitatea de a diferenia centri
meristematici care ulterior dau natere la lstari sau rdcini, iar uneori la structuri de tip embrioid.
Formarea adventiv a lstarilor i rdcinilor poart denumirea de organogenez. Aceasta
poate fi de dou feluri: direct sau indirect, dup cum organele respective se formeaz direct din
explantele inoculate sau se trece printr-o faz intermediar de calus.
n general, factorii care influeneaz pozitiv organogeneza i formarea lstarilor adventivi sunt
numeroi:
-plantele juvenile au o capacitate organogenetic ridicat; la gimnosperme regenerarea de
lstari adventivi este posibil doar folosind embrioni, puiei tineri sau pri ale acestora (David, 1982);
-zaharurile stimuleaz organogeneza direct cu formarea de lstari;
-giberelinele i acidul abscisic inhib organogeneza;
-lumina stimuleaz, n general, procesul de organogenez.
Exist i o serie de specii care necesit o perioad de ntuneric.

235

Tabelul 11.3
Denumirea
speciei
Acer negundo
Betula
verrucosa
Paulownia
tomentosa
Quercus
robur

Rezultat
Calus
Calus
Muguri axilari
Lstari
Lstari

Salix
babylonica
Salix
madsudana

Lstari
Lstari
adventivi i
axilari
Lstari axilari

Tilia cordata
Vinca minor

236

Proliferare
lstari

Cultura de fragmente uninodale la arbori i arbuti ornamentali


(dup Stnic, 1999)
Mediu de cultur pH
Zaharoz
Agar
Fitohormoni
(g/l)
(g/l)
(mg/l)
MS
(1962)
Chalupa
(1981)
Ben-Jaacov i Dax
(1981)
Chalupa (1984)
BTM sau WPM
Morel i Martin
(1955)
Daguin i Letouze
(1986)
Whitehed i Giles

5,6

5,8

Chalupa
(1984) WPM
Stapfer i Heuser
(1985)

5,65,8

20

3 ANA;
15%CM
0,05 AIB;
0,6 BAP
0,1 ANA;
1 BAP
0,2-1 BAP

30

30

6,5

20

15
Glucoz
15
Glucoz
20

6,5

0,01 ANA;
0,05 BAP

20

30

0,2-1 BAP;
0,1 ANA sau
AIB
0,018-0,18 ANA
14,4 BAP

Autori
Radojevic i colab.
(1980)
Chalupa
(1981)
Burger i colab.
(1985)
Chalupa
(1981)
Daguin i Letouze
(1986)
Daguin i Letouze
(1986)
Bhojwani
(1980)
Chalupa
(1981)
Stapfer i Heuser
(1985)

Tabelul 11.4
Denumirea
speciei

Rezultat

Actinidia
deliciosa
Armeniaca
vulgaris
Castanea
mollissima

Lstari
nrdcinai
70% lstari

Castanea
sativa
Citrus sp.
Corylus
avellana
Juglans
hindisii x J.
regia
Juglans regia
Olea europea

Proliferare
lstari axilari
Proliferare
lstari axilari
Proliferare
lstari
Proliferare
lstari
Embriogenez
direct
Multiplicare
lstari
Lstari
Proliferare
lstari

Cultura de fragmente uninodale la pomi i arbuti fructiferi


(dup Stnic, 1999)
Mediu de cultur pH
Zaharoz
Agar
Fitohormoni
(g/l)
(g/l)
(mg/l)
Harada
(1975)
Lloyd i McCown
(1981) WPM
Yang
(1986)
San Jose
(1984)
Heinz i Mee
(1969)
LS
(1965)
Cheng
(1975) Basal
Driver i Kuniykuhi
(1984) DKW
Chalupa
(1981)
Rugini i Fontanazza
(1981)

Autori

5,5

20

5,2

20

0,1 ANA;
40 Ad;
2 2IP

5,5

20

6,5

0,1 BAP

30

0,1 BAP

5,5

30

1 BAP

5,7

30

10

5,5

30

1 BAP;
100 AdS;
0,1-1 AIB

5,5

30

2
gelrite

0,001 AIB;
1 BAP;

Harada
(1975)
Snir
(1984)
Yang i colab.
(1986)
San Jose i colab.
(1984)
Vieitez i Vieitez
(1980 b)
Navarro i colab.
(1975)
Perez i colab.
(1986)
Driver i Kuniykuhi
(1984)

30

30

0,15 ANA;
0,1 BAP;
0,5 AIB;
0,5 GA3;

Chalupa
(1981)
Rugini i Fontanazza
(1981)

5,8

237

Tabelul 11.4 (continuare)


Denumirea
speciei

Rezultat

Pyrus
communis

Lstar unic
Lstar unic

Rubus idaeus
Theobroma
cacao
Vaccinium
corymbosum
Vaccinium sp.

238

Proliferare
lstari axilari
Lstari axilari
1-2 lstari/expl.
Lstari axilari

Cultura de fragmente uninodale la pomi i arbuti fructiferi


(dup Stnic, 1999)
Mediu de cultur pH
Zaharoz
Agar
Fitohormoni
(g/l)
(g/l)
(mg/l)
MS
(1962)
Snir
(1981)

5,8

30

0,45 BAP

5,0

20

6,5

Passey i Jones
(1983)
Cohen i Elliot
(1979)
Lloyd i McCown
(1981) WPM
Smagula i Lyrene
(1984) WPM

5,2

30

0,22 2,4 D
1 BAP;
0,1 GA3
0,2 BAP

5,7

30

5 2IP

5,2

30

5 2IP

5,7

30

5 2IP

Autori
Shen i Mullins
(1984)
Snir
(1981)
Passey i Jones
(1983)
Cohen i Elliot
(1979)
Wolfe i colab.
(1983, 1986)
Smagula i Lyrene
(1984)

Tabelul 11.5
Denumirea
speciei

Rezultat
Plantule

Cultura de lstari axilari la pomi i arbuti fructiferi


(dup Stnic, 1999)
Mediu de cultur pH
Zaharoz
Agar
Fitohormoni
(g/l)
(g/l)
(mg/l)

Ananas
comosus

Plantule
Lstari multipli

Lakshni Sita
(1974)
MS (1962)
MS (1962)

Castanea
sativa

Cretere lstari
Proliferare
lstari
Lstar unic

0,5 x MS (1962)
Vieitez i Vieitez
(1980)
MS (1962)

Proliferare
lstari
Cretere lstari
i rdcini
Dezvoltare
lstari
8 lstari/
explant
Lstar unic

LS (1965)

5,2

30

Jones i Vine
(1968)
Jones i Vine
(1968)
LS (1965)

5,65,8
5,65,8
5,2

40
Glucoz
40
Glucoz
29,9

Heinz i Mee
(1979)
Anderson
(1978, 1980)

5,8

40

1 AIB, 0,2 BAP,


1 GA3
0,1 AIB, 0,99
BAP, 0,48 GA3
5 BAP

5,7

30

0,1 AIB, 4 BAP

Ficus carica

Glossularia
redinata
Malus x
domestica
Mussa sp.
Rubus idaeus

Proliferare
lstari

5,8-6

20

30
30

6,5
-

5,5

30
30

5,8

30

1 ANA
1,8 ANA, 2 AIB,
2 KIN
25%CM
1-2 BAP
0,18 ANA, 0,1
BAP, 0,03 GA3
0,5 BAP, 0,1
AIB, 0,1 GA3

Autori
Lakshni Sita
(1974)
Mapes (1973)
Matheus i Rangan
(1979)
Zepeda i Sagawa (1981)
Vieitez i Vieitez
(1980)
Muriithi
(1982)
Pontikis i Melas
(1986)
Jones i Vine
(1968)
Jones i Vine
(1968)
Van Nieuwkirk i colab.
(1986)
Cronauer i Krikorian
(1984)
Anderson
(1979)

239

Tabelul 11.6
Cultura de lstari axilari la arbori i arbuti ornamentali
(dup Stnic, 1999)
Mediu de cultur pH
Zaharoz
Agar
Fitohormoni
(g/l)
(g/l)
(mg/l)

Denumirea
speciei

Rezultat

Clematis sp.
Cotoneaster
dammeri
Crataegus
rachzacantha
Fraxinus
americana
Hydrangea
macrophylla

Lstari multipli
Lstari multipli

LS (1965)
LS (1965)

5,8

30
30

6
7

10 BAP
1 BAP

Lstari multipli

LS (1965)

5,8

30

1 BAP

Lstari multipli

5,2

20

Lichid

5-10 BAP

5,5

20

5,75,8
5,5

20

2
gelrite
7

1,8 BAP

Proliferare
lstari
Plantule

Lloyd i McCown
(1981)
Gamborg
(1968)
Miller i Murashige
(1976)
Kartha (1974)

20

2 2,4D, 4 BAP,
10%CM

Proliferare
lstari

Rumary i Thrope
(1974)

5,9

30

Lavandula
augustifolia
Picea glauca

240

6 lstari/explant

1 BAP

Autori
Kratz i Langhans (1978)
Norton i Boe
(1982)
Norton i Boe
(1982)
Heiman i Preece
(1983)
Bailey i colab.
(1986)
Stoltz (1984)
Quazi (1980)
Rumary i Thrope
(1984)

Rezultatele obinute de Standardi A, Ferradini Nicoleta, Stnic F. (1996), au dovedit


importana ntunericului n faza de inducie pentru stimularea organogenezei adventive din limb foliar
la portaltoiul de mr M-27:
-poziia explantului este de asemenea foarte important; n cazul limbului foliar, la majoritatea
speciilor, acesta trebuie aezat cu partea inferioar pe mediu. Uneori se recomand crestarea
nervurilor frunzei nainte de inoculare;
-fitohormonii influeneaz organogeneza n mod diferit; exist specii care nu necesit aport
suplimentar de auxine sau citochinine n mediu pentru declanarea organogenezei chiar dac aceste
substane stimuleaz apoi acest proces;
-marea majoritate a speciilor formeaz lstari adventivi n prezena citochininelor n timp ce
auxinele inhib procesul. Uneori acest lucru este posibil i atunci cnd este vorba de explante de tipul
peiolului, rdcinilor sau internodurilor (Stnic F., 1995);
-cea mai folosit citochinin este BAP, iar pentru gimnosperme este singura recomandat.
Celelalte citochinine sunt mai puin utilizate;
-concentraii ridicate de citochinine (n special BAP) poate determina dereglarea procesului de
organogenez. Se recomand n aceast situaie alternarea culturii pe dou medii cu concentraii
diferite;
-zeatina a avut un rol important n procesele de organogenez la kiwi pornind de la diferite
tipuri de explante (Stnic F. i colab., 1995, 1998). De asemenea TDZ (tidiazuronul) i 2 iP (2
izopenteniladenina) au determinat efecte spectaculoase de stimulare a lstririi adventive;
-adenina sulfat poate stimula organogeneza adventiv la ulm (Jacquiot, 1951). n combinaie
cu citochininele, adenina sulfat a stimulat formarea lstarilor adventivi (Skoog i Miller, 1975; Nitsch
i colab., 1969);
-acidul abscisic inhib formarea lstarilor adventivi la marea majoritate a speciilor;
-substanele antiauxinice, cele care inhib transportul auxinelor au ca efect stimularea
organogenezei adventive;
-vitaminele stimuleaz formarea lstarilor adventivi la ulm (Jacquiot, 1951);
-infectarea materialului iniial cu Agrobacterium tumefaciens rasa C58, a stimulat
organogeneza adventiv la plop (Steffen i colab., 1986). Efectul s-a datorat i juvenilizrii
materialului iniial datorit aciunii bacteriei.
n tabelele 11.7 i 11.8 sunt prezentate cteva din rezultatele obinute n organogeneza
adventiv la pomi, arbuti fructiferi, arbori i arbuti ornamentali.

241

Tabelul 11.7
Denumirea
speciei
Actinidia
deliciosa

Amygdalus
communis

Ananas
comosus
Armeniaca
vulgaris
Castanea
sativa
Cerasus
avium

242

Explant

Organogeneza adventiv de lstari la pomi i arbuti fructiferi


(dup Stnic, 1999)
Mediu de cultur pH
Zaharoz
Agar
Fitohormoni
(g/l)
(g/l)
(mg/l)

Fragmente
rdcini
Fragmente
lstari
Fragmente
lstari
Lstari
Lstari

20

1 Z, 40 Ad

Harada (1975)

30

6,5

1Z

5,7

22,5

Hisajima (1982)
Hisajima (1982)

5,5
5,5

30
30

6
6

Lstari

MS (1962)

5,8

30

Calus

Matheus i Rangan
(1981)
0,5 x MS (1962)

30

6,5

0,023 AIB, 2
BAP, 60 AdS
0,0225 BAP
0,0225 BAP,
0,005 AIB
0,1 ANA, 0,7
BAP
5%CM

Kwei i colab.
(1980)
Monette (1986)

Monette (1986)

30

0,5-1 AIB

20

6,5

30

0,1 AIB, 2 BAP

San Jose (1984)

30

0,1 AIB, 1 BAP,


0,1 GA3

Seirlis i colab.
(1979)

Lstari
Fragmente
lstari
Epicotil
Fragmente
lstari

Harada (1975)

5,5

Autori

MS (1962)

Skirvin (1980)

5,7

San Jose (1984)


Jones (1977)

5,2

Hisajima (1982)
Hisajima (1982)
Ruginii i Verma
(1982,1983)
Matheus i Rangan
(1981)
Zepeda i Sagawa
(1981)
Skirvin (1980)

Tabelul 11.7 (continuare)


Denumirea
speciei
Cerasus
vulgaris

Citrus sp.

Corylus
avellana
Diospyros
kaki
Fragaria
Glossularia
redinata
Juglans regia

Explant
Fragmente
lstari
Lstari
Fragmente
rdcini
Fragmente
lstari (5 cm)
Calus
Calus
Calus
Fragmente
lstari
Fragmente
lstari
Lstari
Semine

Organogeneza adventiv de lstari la pomi i arbuti fructiferi


(dup Stnic, 1999)
Mediu de cultur pH
Zaharoz
Agar
Fitohormoni
(g/l)
(g/l)
(mg/l)
Skirvin
(1980)
Skirvin i Chu
(1978)
Hoagland i Snyder
(1933)
Kitto i Young
(1981)
Radojevic
(1975)
Radojevic
(1975)
Yokoyama i
Takeuchi (1976)
MS (1962)
MS (1962)

5,7

20

6,5

5,7

30

6,5

30 -40

10

5 BAP, 80 AdS

20

8-10

1 KIN, 2 Ad

20

8-10

5,65,8
5,6

30

30

5,5

30

30

30

1 KIN, 2 Ad,
1GA3
1 ANA, 0,1-1
KIN
0,2-1 AIB, 1,1
BAP, 1 GA3
0,1 AIB, 0,49
BAP
0,1-0,3 ANA,
0,1-0,6 BAP
9 BAP

5,65,8

Chalupa (1981)
0,5 x Rodriguez
(1982)

5,5

0,1 ANA, 2 BAP

Autori
Skirvin i colab.
(1980)
Skirvin i colab.
(1981)
Murashige i colab.
(1972)
Kitto i Young
(1981)
Radojevic
(1975)
Radojevic
(1975)
Yokoyama i Takeuchi
(1976)
Anderson i colab.
(1982)
Walender (1985)
Chalupa (1981)
Rodriguez
(1982)

243

Tabelul 11.7 (continuare)


Denumirea
speciei

Malus x
domestica

Morus alba
Musa
acuminata

244

Explant
Fragmente
lstari
Cotiledon
Calus
Calus din
cotiledon
Calus din
embrion
Lstari

Organogeneza adventiv de lstari la pomi i arbuti fructiferi


(dup Stnic, 1999)
Mediu de cultur pH Zaharoz
Agar
Fitohormoni
(g/l)
(g/l)
(mg/l)
Jones (1977)

5,2

30

Jones (1977)

5,2

30

Lstari

LS (1965)

5,2

29,9

0,1 AIB, 1 BAP,0,1


GA3
1 ANA, 0,3 BAP
1 BAP
4 ANA, 2 KIN, 1
GA3, 15%CM
2 ANA, 2 BAP,
15%CM
1 AIB, 1 BAP, 0,1
GA3
0,1 AIB, 0,48 GA3

Kartha (1974)
Kartha (1974)
White (1943)

5,8
5,8

30
30
20

8
8
6,5

20

6,5

Muguri
dorminzi/lstar
Fragmente
lstari
Fragmente
lstari
Muguri
Lstari

Zimmerman
(1984)
Lakshmi-Sita
(1976)
Lakshmi-Sita
(1976)
MS (1962)
Krikorian i Cronauer
(1984)

20

0,01 AIB, 0,09 BAP

5,6

30

1 BAP

5,6

30

10 BAP

5,6
5,8

30
40

8
-

10 BAP
4,95 BAP, 10%CM

White (1943)

Autori
Jones (1977)
Liu i colab. (1983)
Liu i colab. (1983)
Mehra i Sachdeva
(1979)
Mehra i Sachdeva
(1979)
Snir i Erez
(1980)
Van Nieuwkirk
i colab.(1986)
Zimmerman
(1984)
Oka i Ohyama
(1981)
Oka i Ohyama
(1981)
Oka i Ohyama (1981)
Krikorian i Cronauer
(1985)

Tabelul 11.7 (continuare)


Organogeneza adventiv de lstari la pomi i arbuti fructiferi
(dup Stnic, 1999)
Mediu de cultur pH Zaharoz
Agar
Fitohormoni
(g/l)
(g/l)
(mg/l)

Denumirea
speciei

Explant

Musa
cavendishii

Calus

MS (1962)

Lstari

Heinz i Mee (1979)

Lstari

Musa spp.
Musa textilis
Persica
vulgaris
Phoenix
dactylifera

30

6,5

0,3 AIA, 1 KIN

5,8

40

5 BAP

Mante i Tepper
(1983)
Miller (1982)
Skirvin i Chu (1978)
LS (1965)

5,7

30

5-8

5,7
5,7

20
30
30

8
6,5
8

0,1 AIB, 3-5 BAP,


160 AdS
0,1 ANA, 2 BAP
0,1 ANA, 2 BAP
0,1 2,4D sau ANA, 3
2-Ip, 40 AdS

Thompson i Gordon
(1977)
Tisserat (1984)

30

30

0,5 x MS (1962)

5,65,8
5,65,8
5,8

Lstari

MS (1962)

5,8

4 BAP

5-8 mm lstari

MS (1962)

30

4 BAP

Lstari
Lstari
Fragmente
lstari
Calus
Fragmente
lstari
Semine

Pistacia vera

10 2,4D

Autori
Ma i colab.
(1978)
Cronauer i Krikorian
(1984)
Mante i Tepper
(1983)
Miller (1982)
Skirvin i Chu (1978)
Tisserat i colab.
(1979)
Tisserat i colab.
(1982)
Tisserat i colab.
(1984)
Barghchi i Alderson
(1983)
Barghchi i Alderson
(1983)
Barghchi i Alderson
(1985)

245

Tabelul 11.7 (continuare)


Denumirea
speciei
Prunus
domestica
Prunus
insititia
Pyrus
communis

Ribes nigrum

Explant

Organogeneza adventiv de lstari la pomi i arbuti fructiferi


(dup Stnic, 1999)
Mediu de cultur pH Zaharoz
Agar
Fitohormoni
(g/l)
(g/l)
(mg/l)

Fragmente
lstari
Fragmente
lstari
Fragmente
lstari
Fragmente
lstari
Fragmente
lstari
Fragmente
lstari
Fragmente
lstari
Fragmente
lstari
Lstari
Lstari

Pietropaolo i Reisch
(1984)
Skirvin (1980)

5,8

30

1,1 BAP

5,7

20

6,5

Nu sunt menionai

Pietropaolo i Reisch
(1984)
Skirvin (1980)

Jones (1977)

5,2

30

Lane (1979)

5,2

30

0,1 AIB, 1 BAP, 0,1


GA3
1,13 BAP

Jones i Hopgood
(1979)
Lane (1979)

MS (1962)

5,8

30

LS (1965)

5,75,8
5,7

30

1,36-2,25 BAP, 1,1 Z;


1,02 2-iP
2 BAP

Shen i Mullins
(1984)
Singha (1982)

20

1,35 BAP

5,65,8
5,7
5

40
Glucoz
30
20

Flegmann i
Wainwright (1981)
Jones i Vine (1968)

6,5
Gelrite

Donnely (1980)
Snir (1981)

Lstari cu
noduri

Welander
(1985)

5,2

30

0,1 AIB; 1 BAP


0,22 2,4D; 1 BAP; 0,1
GA3
1 BAP

MS (1962)
Jones i Vine (1968)
Donnely (1980)
Snir (1981)

Rubus idaeus

246

Autori

Welander
(1985)

Tabelul 11.8
Denumirea
speciei

Explant

Acer rubrum x
Acer saccharum

Fragmente
lstari
Calus
Calus

Betula pendula

Betula verucosa
Biota orientalis
(thuja)
Chaenomeles
japonica
Crataegus
rachyacantha
Fraxinus
americana

Frunze
Fragmente
lstari
Calus
Hipocotil
Fragmente
lstari
Fragmente
lstari
Fragmente
lstari

Organogeneza adventiv de lstari la arbori i arbuti ornamentali


(dup Stnic, 1999)
Mediu de cultur pH Zaharoz
Agar
Fitohormoni
(g/l)
(g/l)
(mg/l)

Autori

MS (1962)

5,7

30

10

0,1-0,5 Thidiazuron

Kerns i Meyer (1985)

Simola (1985)
Srivastava i
Steinhauer (1981)
Srivastava (1985)
Srivastava (1985)

5,6
5,8

20
40

6
6

5-10 Z; 0,1-0,2 ANA


2 AIA; 6 KIN; 40 Ad

5,8
5,8

30
30

6,5
6,5

Simola (1985)
Srivastava i
Steinhauer (1981)
Srivastava (1985)
Srivastava (1985)

30

Thomas i Tranvan
(1982)
LS (1965)

5,4

30

2 AIA; 5 Z; 2 GA3
0,5 ANA; 5 2 iP; 30
Ad
0,05 AIB; 0,2 BAP;
20 AdS
0,1 AIB; 1,1 BAP

5,8

30

2,5 BAP

LS (1965)

5,8

30

0,1-1 BAP

Lloyd i McCown
(1981)

5,2

20

0,5 1 BAP

Chalupa (1981)

Chalupa (1981)
Thomas i Tranvan
(1982)
Norton i Boe
(1982)
Norton i Norton
(1986)
Heiman i Preece
(1983)

247

11.1.8 Embriogeneza somatic


Embriogeneza somatic a fost realizat pentru prima dat, n anul 1958, de Reinert i Steward,
la morcov, din calus i suspensie de celule. Tot ei au realizat o paralel ntre formarea embrionilor
zigotici i a celor somatici, fapt uurat de folosirea laptelui de cocos n mediul de cultur.
Thomas i colab. (1979) au reuit inducerea de embrioni somatici la elin, o alt reprezentant
a familiei Umbeliferae.
n formarea embrionilor somatici se disting mai multe etape:
-dediferenierea celulelor difereniate i nceperea diviziunii;
-formarea celulelor parenchimatice, nceperea diviziunii i creterea coninutului de citoplasm
sub influena auxinelor. Astfel are loc transformarea celulelor parenchimatice n celule embriogene.
Acestea sunt mici, cu coninut dens de citoplasm, vacuol mic, nuclei mari cu nucleoli mari i un
coninut ridicat de grunciori de amidon. Au activitate metabolic intens i de asemenea o sintez a
ARN-ului;
-formarea embrionilor din celule embriogene n absena auxinelor n mediu.
Formarea embrionilor somatici se poate face n interiorul calusului, sau la exteriorul acestuia.
Embrionii somatici se mai pot forma n esutul nucelar i hipocotil, sau pe organe florale, antere,
grunciori de polen, endosperm, embrioni zigotici. Embrionii somatici se formeaz dintr-o singur
celul care se divide i formeaz o structur embrioid.
S-a reuit inducerea embriogenezei somatice la 132 specii din 81 de genuri, aparinnd
familiilor: Ranunculaceae, Rutaceae, Solanaceae, Umbeliferae, Gramineae (Tisserat i colab., 1979,
citai de Pierik, 1987).
11.1.8.1 Embriogeneza somatic direct
Embriogeneza somatic direct const n formarea embrionilor somatici sau a esuturilor
embrionare direct din explantul inoculat iniial. Embrionii somatici se pot forma din celule somatice,
din celule nucelare la specii aparinnd genului Citrus, din celule epidermice i hipocotil de morcov
sau Brassica napus.
n vederea inducerii i studierii embriogenezei somatice cel mai frecvent se recurge la culturi
de embrioni zigotici imaturi. esutul acestora are un pronunat caracter embriogenic. Momentul optim
pentru izolarea i inocularea embrionilor zigotici in vitro este la aproximativ 14 zile de la polenizare.
Ca substrat nutritiv se folosesc medii de cultur care conin cantiti variabile de auxine, n
special ANA i 2,4D.
Dup sterilizare se face excizarea embrionului imatur i inocularea lui pe mediu. Dup
aproximativ o sptmn, la o parte dintre explante ncep s se diferenieze embrioni somatici n
diferite stadii de dezvoltare. Fazele de evoluie ale embrionilor somatici sunt: globular, cordiform,
de torpil i cotiledonar. Se poate observa dezvoltarea asincron a embrionilor, ceea ce poate
determina suprapunerea diferitelor faze ale evoluiei.
11.1.8.2 Embriogeneza somatic indirect
Tehnica de micropropagare care const n formarea embrionilor somatici din calus se numete
embriogenez somatic indirect. Dup obinerea i multiplicarea calusului acesta este trecut pe un
mediu de inducere i formare a embrionilor somatici.
Capacitatea de regenerare din calus depinde de specie, tipul de explant utilizat iniial, vrsta
explantului sau numrul de subculturi.
Inducerea embriogenezei somatice este condiionat de un numr nsemnat de factori:
-concentraia ridicat de auxine (mai ales 2,4 D), determin inducerea embrionilor somatici;
-acidul abscisic stimuleaz formarea embrionilor somatici n culturile de calus sau n
suspensiile celulare;
-giberelinele i etilena inhib inducerea formrii embrionilor somatici;
248

-probabilitatea formrii embrionilor somatici crete la esuturile juvenile. La speciile genului


Citrus embrionii se formeaz numai n nucel;
-azotul redus sub form de ioni de amoniu, potasiul i concentraia ridicat de sruri
stimuleaz formarea celulelor embriogene n masa calusului; n acelai timp, ionii de calciu
influeneaz negativ acest proces;
-lumina este un factor stimulator al embriogenezei somatice, existnd ns i specii care
reacioneaz mai bine la ntuneric;
-temperatura ridicat, este un alt factor care stimuleaz formarea embrionilor somatici; la
cultura de antere, n vederea inducerii embrionilor somatici, este necesar, la nceput, un oc cu
temperaturi sczute;
-prezena n mediul de cultur a zaharozei (2-3%) i a laptelui de cocos are un efect pozitiv
asupra inducerii embrionilor somatici.
Ca urmare a capacitii mai reduse de a forma embrioni somatici, la speciile horticole
lemnoase, aceast tehnic de micropropagare este folosit mai puin (tabelele 11.9 i 11.10).
La speciile de conifere se studiaz posibilitatea extinderii acestei metode pentru nmulirea
rapid, pornind de la embrioni zigotici i trecnd prin faza de calus embriogen. Rata de multiplicare
este ridicat i rezultatele obinute pn n prezent sunt ncurajatoare (Palada Nicolau Magdalena,
1994).

249

Tabelul 11.9
Denumirea
speciei
Actinidia
deliciosa
Mangifera
indica

Pheonix
dactylifera

Embriogeneza somatic la pomi i arbuti fructiferi (dup Stnic, 1999)


Explant
Mediu de cultur pH Zaharoz
Agar
Fitohormoni
(g/l)
(g/l)
(mg/l)
Fragmente de
rdcini
Semine
imature
Fructe
imature
Fragmente de
lstari
Muguri
laterali
Calus

0,1-1 2,4D; 40Ad

Autori

Harada (1975)

5,5

20

Harada (1975)

Litz (1984)

5,7

30

Litz (1984)

5,7

60

1 2,4D

Litz (1984)

LS (1965)

5,7

30

Tisserat (1979)

Thompson i Gordon
(1977)
Tisserat (1984)

5,65,8
5,65,8

30

10 2,4D; 3 2iP; 40
AdS
10 2,4D; 3 2iP

30

Litz (1984)

Tisserat (1982)
Tisserat (1984)

Tabelul 11.10
Denumirea
speciei
Hedera helix
Ilex aquifolium
Larix decidua

Embriogeneza somatic la arbori i arbuti ornamentali (dup Stnic, 1999)


Explant
Mediu de cultur pH Zaharoz
Agar
Fitohormoni
(g/l)
(g/l)
(mg/l)
Calus
Embrioni
Calus
Calus

Picea abies
Quercus rubra

250

Embrioni
maturi
Internod

Banks (1979)
LS (1965)
Nagmani i Bogna
(1985)
Von Arnold i Erikson
(1981)
Von Arnold i Erikson
(1981)
MS (1962)

Autori

5,7
5,6
5,8

30
40
20

5
10
8

1 ANA; 0,5 BAP


2 BAP

Banks (1979)
Hu i Sussex (1972)
Nagmani i Bogna (1985)

5,8

34,2

2,2 2,4D; 1,1 BAP

Hakman i colab., (1985)

10

3
gelrite
6,5

2,21 2,4D; 1,13


BAP
5 ANA; 0,1 BAP

Von Arnold i Hakman


(1986)
Seckinger i colab. (1979)

30

11.1.9 Poliembrionia nucelar


O serie de specii din genul Citrus formeaz n mod natural, n aceeai smn, pe
lng embrionul zigotic i unul sau mai muli embrioni somatici. Aceti embrioni iau natere
din celule somatice diploide ale esutului nucelar. esutul nucelar este un esut juvenil
caracterizat printr-o mare capacitate de regenerare. Prin cultivarea esutului nucelar in vitro i
inducerea formrii calusului s-au obinut un numr mare de embrioni9 somatici la genul
Citrus (Rangaswamy, 1981).
Formarea embrionilor somatici prin embriogenez direct sau indirect a fost posibil
prin cultivarea in vitro a unor ovule fecundate sau nefecundate de Citrus (Litz i colab.,
1985).
Embriogeneza somatic din esut nucelar este prezent la mango (Mangifera indica) i
la alte specii pomicole tropicale. La fel ca n cazul citricelor, speciile cu tendine de
poliembrionie in vivo au o capacitate ridicat de regenerare a embrionilor somatici in vitro.
Utilizarea poliembrioniei nucelare prezint o serie de avantaje: permite nmulirea n
mas a speciilor monoembrionare; procesele de embriogenez somatic sunt nsoite i de
devirozarea materialului vegetal obinut; n paralel, se pot induce mutaii i se pot seleciona
mutantele utile; se realizeaz juvenilizarea materialului obinut. n toate cazurile, folosirea
pentru nmulire a embrionilor somatici care conserv caracteristicile genetice ale plantelor
mam, deschide mari perspective n domeniul seminelor artificiale (Standardi, 1998).
11.1.10 Embriocultura
Cultura embrionilor zigotici a aprut ca necesitate pentru rezolvarea unor probleme
aprute n procesul ameliorrii plantelor horticole.
n pomicultur, apare posibil cultivarea pe medii aseptice a unor embrioni imaturi
care provin prin ncruciri de la soiuri extratimpurii i timpurii de smburoase. n mod
natural, aceti embrioni nu ajung la maturitate datorit unor dereglri fiziologice care apar n
procesul de cretere a seminei i fructului. n mod similar, n cazul unor hibridri
interspecifice are loc avortarea embrionilor naintea ajungerii lor la maturitate (Stnic F.,
Dumitracu Monica, Ion Ligia, 1977).
La via-de-vie nu este posibil obinerea unor descendeni hibrizi atunci cnd se
folosete ca genitor matern un soi apiren i n acest caz, embrionul avortnd timpuriu. Situaii
oarecum similare se ntlnesc i la realizarea unor combinaii hibride sau ncruciri ntre
soiuri, specii sau genuri incompatibile.
Prin extragerea embrionului abia format cu o poriune de esut nucelar, sau prin
cultivarea ovulului fecundat se reuete s se depeasc barierele incompatibilitii.
Un alt caz particular este reprezentat de cultivarea embrionilor maturi. Metoda se
folosete pentru scurtarea procesului de ameliorare prin eliminarea perioadelor de repaus
relativ al seminelor.
De asemenea, n cazul unor combinaii hibride valoroase se face nmulirea
materialului genetic nainte de realizarea seleciei in vitro, sau materialul hibrid este supus
unor procese de stres, nainte de a fi aclimatizat i trecut n cmp.
Momentul nceperii culturii variaz de la specie la specie n funcie de scopul urmrit.
Astfel, la cire, la 28-35 zile de la nflorire, la viin, la 29-41 zile i la piersic la 81-97 zile.
Un alt indiciu folosit este reprezentat de mrimea cotiledoanelor la piersic, momentul
optim fiind cnd acestea ating 4-5 mm n diametru.
La cire se mai recomand iniierea culturii n momentul ntririi smburelui, dup
aceea viabilitatea embrionilor scznd pn la momentul intrrii n prg. Stabilizarea

251

culturilor de embrioni este relativ uoar datorit faptului c smburii sau seminele protejate
de endocarp sau tegumente pot fi sterilizate la concentraii ridicate.
Compoziia mediului de cultur este cu att mai complex cu ct embrionii se afl
ntr-un stadiu de dezvoltare mai timpuriu.
Dup inoculare, embrionii se las la ntuneric timp de 30-60 zile la temperatura
camerei pentru germinare, dup care sunt trecui la lumin.
11.1.11 Microaltoirea in vitro
Const n altoirea n condiii aseptice a unui apex meristematic pe un portaltoi obinut
din semine sau din minibutai.
Portaltoii folosii trebuie s ndeplineasc urmtoarele condiii:
-s posede semine cu o bun capacitate germinativ pe mediile de cultur;
-minibutaul s aib esuturi elastice i turgescente;
-minipuietul s posede cambiu activ, uor depistabil;
-esuturile s fie rezistente la oxidare;
-s posede un aparat radicular bine format, capabil s creasc n mediul de cultur.
Portaltoiul poate fi obinut din semine. n acest sens seminele sunt scoase din starea
de laten fie prin tratamente cu fitohormoni (citochinine i gibereline), sau prin tratamente cu
temperaturi sczute. Se nltur apoi endocarpul, iar apoi se determin viabilitatea seminelor
prin imersie timp de cteva ore, a unor probe de semine ntr-o soluie de clorur de 2,3,5
trifenil-tetrazoliu, 1%. Viabilitatea seminelor este evideniat prin culoarea esuturilor
seminelor n culoare rou intens.
Materialul este apoi sterilizat prin imersie n alcool 70% cca 1 min., urmat de imersia
n hipoclorit de sodiu 7% timp de 20 minute, iar n final se cltesc seminele n cinci reprize
cu ap distilat steril.
Germinarea seminelor se face pe mediu Murashige-Skoog solidificat cu 7 g/l agar.
Incubarea se face la 22-24oC, la ntuneric.
Portaltoii se pot obine i din minibutai, care, sub form de fragmente uninodale se
preleveaz de pe plante libere de viroze.
Pregtirea altoiului. Altoiul const dintr-un apex meristematic provenit fie din lstari
crescui in vitro, fie de la lstari sau ramuri in vivo.
Altoirea propriu-zis se face prin nlturarea cotiledoanelor de la portaltoii obinui din
semine care apoi sunt secionai transversal. Se secioneaz de asemenea, transversal
portaltoii vegetativi. Apexul meristematic, de dimensiuni foarte reduse se detaeaz i se
aeaz pe zona cambial a portaltoiului secionat.
Planta altoit se trece apoi ntr-un vas steril, pe mediu lichid pentru a asigura o atmosfer
saturat n umiditate. Aclimatizarea se realizeaz cnd minialtoiul atinge 1,5-2,5 cm lungime,
prin transplantarea plantei altoite n condiii normale (Stnic, 1999).

252

CAPITOLUL XIV
14.1 TRANSFERUL PLANTELOR DE PE MEDIUL DE CULTUR
N SOL ACLIMATIZAREA
O plant provenit din cultura in vitro difer din multe puncte de vedere de una
provenita din mediul in vivo (Fossard, 1977; Grout si Aston, 1978; Grout si Debergh, 1982;
Sutter, 1985) prin urmtoarele aspecte:
1. La plantele crescute n condiii in vitro stratul de cear (cuticular) de la suprafaa
frunzelor i tulpinilor este foarte slab dezvoltat deoarece umiditatea relativ ntr-un vas de
cultura este de 90-100%, iar plantele nu au avut nevoie s se protejeze mpotriva deshidratrii.
Acest fapt are repercusiuni nefaste pentru plantulele transferate direct in vivo, care vor suferi
pierderea unei cantiti mari de apa din esuturi, deoarece umiditatea aerului in vivo este mult
sczut comparativ celei in vitro. Frunzele unei plante regenerate in vitro sunt moi, subiri i
prezint o activitate fotosintetic mult redus, deoarece i pot procura carbonul necesar din
mediul de cultur i anume din zaharurile din mediul de cultur, astfel c, atunci cnd o
plantul regenerat in vitro va fi trecut in vivo va trebui s se readapteze la o activitate
fotosintetic intens. De asemenea, frunzele plantelor provenite din cultura in vitro prezint,
pe lng un numr sczut de celule palisadice, necesare pentru captarea eficient a luminii, i
multe spaii aerifere n mezofil. Stomatele lor nu funcioneaz normal, iar trecerea plantelor
de la mediul in vitro la cel in vivo constituie sursa cea mai important de stres hidric. n
culturile de celule conexiunile vasculare, dintre lstari i rdcinue, sunt slab dezvoltate, ceea
ce duce de asemenea la o slab circulaie a apei dintr-o parte a plantei n alta. Plantele in vitro
au o hrnire heterotrof, pe cnd cele in vivo au o hrnire autotrof, acest fapt constituind un
alt factor de stres pentru plntuele transferate n sol. Ele trebuie s-i dezvolte activitatea
fotosintetic pentru a-i putea procura carbonul necesar.
Din cele de mai sus se poate concluziona c aclimatizarea plantulelor trebuie s fie un
proces lent, care s permit trecerea treptat a plantelor de la condiiile in vitro la cele in vivo,
ceea ce presupune adaptarea la o umiditate relativ sczut, la dezvoltarea mecanismelor de
nchidere i deschidere a stomatelor, la accelerarea procesului fotosintetic. Wardle i colab.
(1983) au demonstrat c scderea umiditii aerului in vitro la Brassica oleracea Botrytis a
dus la formarea unei pelicule de cear mai groas pe stratul cuticular, ceea ce a condus la o
evaporare cuticular mult sczut i la creterea procentului de plante aclimatizate.
Aclimatizarea poate fi fcut prin generarea unei umiditi crescute n mediul in vivo
unde vor fi transferate plantulele provenite din mediul in vitro, prin utilizarea unor aparate
speciale, generatoare de cea, i prin meninerea unei luminoziti i temperaturi relativ
constante i sczute. O alt metod de aclimatizare prevede lsarea vaselor de cultur
deschise, ntr-un mediu steril, pentru a permite aclimatizarea treptat a plantulelor la condiiile
exterioare. De asemenea, mai este posibil folosirea unor substane antiperspirante, care sunt
pulverizate pe frunzele plantulelor transferate n sol, reducnd astfel procesul de evaporare al
apei din esuturi (Sutter i Hutzel, 1985), dei aceast metod poate avea i efecte adverse.
2. Rdcinile plantelor provenite din cultura in vitro sunt mai vulnerabile i nu
funcioneaz foarte bine in vivo, prezentnd foarte puini sau deloc periori absorbani. Aceste
rdcini vor muri n scurt timp fiind nlocuite de altele generate direct n sol. Dezvoltarea
periorilor absorbani in vitro poate fi determinat prin meninerea culturilor, pentru o
perioad de timp, pe mediu lichid. Sistemul radicular slab dezvoltat determin o supravieuire
slab a unei plante n condiiile de mediu natural, in vivo, mai ales n condiiile unei
transpiraii intense. Pentru o plant provenit din cultura in vitro este vital pierderea unei
cantiti ct mai mici de ap din esuturi.

253

3. Plantele care n condiiile mediului lor natural de via triesc n simbioz cu fungi
(micorize) sau bacterii (ex: Leguminosae:Rhizobium) simt lipsa acestei simbioze atunci cnd
sunt transferate n condiii in vitro, dar mai ales dac sunt din nou transferate in vivo. Mai
multe studii au artat c inocularea unor plante in vitro mpreun cu microorganismul
simbiont a determinat o cretere i dezvoltare mai bun a explantelor i o supravieuire
crescut atunci cnd s-a procedat la aclimatizarea acestora.
Dhawan i colab. (1986) au demonstrat c adiia de Rhizobium n timpul aclimatizrii
plantelor de Leucaena a dus la formarea nodulilor la peste 80% dintre plantulele care au
supravieuit transplantrii n sol, iar supravieuirea acestora a avut o rat cu 90% mai mare
fa de cele care nu au nodulat. Morandi i colab. (1979) au raportat c plantele produse in
vitro de Rubus idaeus au crescut mult mai bine dac au fost inoculate cu cteva
microorganisme din specia Glanus mycorrhiza. De asemenea, Struller i colab. (1984) au
raportat c micorizele joac un rol important n micropropagarea plantulelor de plop;
inocularea explantelor mpreun cu micorize din specia Paxillus involutus a determinat o
cretere cu 75% a plantelor comparativ cu cele inoculate fr micorize.
Atunci cnd se iau n considerare problemele asociate cu sistemele radiculare nefuncionale trebuie avut n vedere urmtoarele msuri speciale:
-permiterea formrii rdcinilor in vitro, ce vor putea ulterior fie s se dezvolte n rdcini
subterane proprii, fie mcar s asigure supravieuirea plantulei pn la formarea unor rdcini
subterane proprii;
-permiterea dezvoltrii in vitro a rdcinilor, atunci cnd e posibil, prin meninerea culturilor,
o perioad de timp, cu rdcinile n mediul lichid, acestea fiind apoi capabile s preia toate
funciile unei rdcini normale, atunci cnd va fi transferat n sol;
-transferarea ntregii faze de nrdcinare n mediu in vivo. nrdcinarea n sol nu este
realizabil la toate speciile de cultur, dar poate fi stimulat prin nmuierea bazei lstarilor n
soluie de auxin. Totui pentru multe specii faza de nrdcinare este bine s aib loc in vitro
mai ales pentru speciile care nu nrdcineaz uor nici n condiii normale de cultur, cu ar fi
speciile ierboase.
Atunci cnd se recurge la aclimatizarea unor plntue obinute prin tehnicile de
regenerare in vitro, trebuie s se in seama de urmtoarele:
1.Pentru a evita infeciile cu fungi sau bacterii:
-agarul de pe rdcinuele explantelor (ce conine zaharuri) trebuie ndeprtat prin splarea
acestora cu ap cldu;
-solul sau substratul solid, n care vor fi trecute plntuele regenerate in vitro, trebuie s fie
sterilizat prin meninerea la temperaturi ridicate (n etuv la 180oC pentru 3 ore) sau prin
iradiere cu radiaii gama.
2.Asigurarea unor condiii ct mai sigure de via, prin executarea tratamentelor de
combatere a insectelor, bacteriilor, fungilor, melcilor (limax), determin o rat mai mare de
supravieuire a plantelor transferate in vivo, care sunt destul de sensibile.
3.Pentru a se evita rnirea rdcinuelor se recomand folosirea, pentru nceput, a unui
sol uor.
4.Pentru a mbunti aclimatizarea plantulelor la condiiile in vivo, nrdcinarea este
bine a avea loc pe medii de cultur srace n sruri minerale (MS concentrat la jumtate sau
KNOP).
5.Uneori este necesar un tratament cu temperaturi sczute (4-8 sptmni la 5oC) in
vitro sau imediat dup transferul in vivo, pentru a scoate plantulele din perioada de laten.
Acest procedeu este necesar mai ales plantelor cu bulbi, arbutilor i plantelor lemnoase, dar
i cerealelor care necesit o perioad de vernalizare pentru a putea produce semine.

254

6.Plantele care formeaz protocorm (cormofitele) sau bulbi, trebuie transferate n sol
n aceast form (protocorm, bulbi), ceea ce va crete ansele de aclimatizare i supravieuire
ale acestora.
7.Transferarea lstarilor generai in vitro pe un mediu fr zaharuri i mbogirea
mediului nconjurtor cu CO2 poate duce la o aclimatizare mai uoar a plantelor (Langford i
Wainwright, 1986).
Mai jos sunt prezentate pe scurt ultimele descoperiri n domeniu:
1.n unitile comerciale, transferul plantelor pentru aclimatizare se face direct n
straturi acoperite cu folie de plastic, ceea ce ajut la meninerea umiditii (uneori se folosesc
i pulverizatoare de ap n acest scop), iar luminozitatea i temperatura trebuie s fie relativ
sczute.
2.Lstarii obinui in vitro la unele specii (Gerbera i Rhododendron) sunt transferai
direct pe un substrat artificial, care va permite nrdcinarea acestora. Laboratoarele Twyford
au confecionat un tip de ldie de plastic prevzute cu 400 de orificii, care vor fi umplute cu
substrat pentru nrdcinare. Acestea vor permite scurgerea surplusului de apa i susinerea
optim a lstarilor. nrdcinarea lstarilor n ldiele perforate va avea loc ntr-o ncpere
semisteril, climatizat, n care umiditatea aerului este meninut ridicat. Imediat ce
nrdcinarea este suficient i lstarii ncep s creasc, butaii sunt transferai din ldiele
perforate direct n ser.
Speciile lemnoase sunt n prezent nrdcinate mai mult in vivo dect in vitro,
deoarece astfel se economisete mai mult timp i bani. La specii ca Rhododendron, Kalmia,
Amelanchier, Betula, Vaccinium, Syringa vulgaris (Zimmerman, 1985) i n general la toate
speciile lemnoase, care sunt propagate comercial, se aplic acest tip de nrdcinare.
3.Compania Milcop din Frana a produs un substrat artificial pentru nrdcinare, pe
baz de polypropilen, autoclavabil, stabil biologic, inert chimic, permind o aerare bun.
Acest substrat este disponibil sub form de fulgi, fiind potrivit pentru nrdcinarea in vitro.
Pentru o nrdcinare direct, in vivo, exist blocuri (cuburi) mici, din acelai material, n care
lstarii pot fi plasai cu uurin.
Pe baza celor prezentate mai sus, se poate presupune c, n viitorul apropiat, vor
aprea pe pia tot mai multe tipuri de substraturi artificiale, ce vor face aclimatizarea
plantulelor mult mai eficient i mai uoar, dect a fost n trecut. Trecerea direct a butailor
in vivo este important, pentru c va duce la eliminarea fazei de nrdcinare in vitro, care este
relativ costisitoare i necesit o perioada de timp suplimentar, ceea ce crete perioada dintre
doua generaii de plantule, fapt nedorit de companiile comerciale productoare de material
semincer. Astfel micropropagarea va deveni o tehnic uzual i mai la ndemn, necesitnd
doar camere de cretere special amenajate pentru aclimatizarea i nrdcinarea butailor
direct pe substraturile artificiale.

255