2 Drojdie Arhitectura Celulara i Funcie

2.1 Caracteristici generale ale celulei de drojdie

Celulele de drojdie prezint o mare diversitate n ceea ce privete dimensiunea celulei, forma i culoarea. Chiar
i celulele individuale dintr-o anumit tulpin de drojdie a unei singure specii poate afia heterogenitate
morfologic i de culoare. Acest lucru se datoreaz n principal modificrilor condiiilor fizice i chimice din
mediul nconjurtor. ntre diferite specii de drojdie, dimensiunea celulei poate varia foarte mult. n cele ce
urmeaz ne vom concentra pe S. cerevisiae. Informaii mai detaliate i trimiteri la citologia drojdie pot fi gsite
n [Walker, 1998]. Celulele S. cerevisiae sunt n general de form elipsoidal avand ntre 5 pn la 10 m la
diametrul mare i 1 la 7 m la diametrul mic. Adic volumul de celule este 29 sau 55 microni

pentru un

haploid sau o celul diploid, respectiv, dimensiunea celulei crete odat cu vrsta. Constituenii
macromoleculari ai drojdiei cuprind: proteine, glicoproteine, polizaharide, polifosfai, lipide, i acizi nucleici
(Tabelul 2-1).
2.2 Metode citologice
Celulele de drojdie necolorate cu greu pot fi vizualizate prin microscopie optic. La 1000 de ori mrire, poate
fi posibila vaderea vacuolei drojdie i a corpilor de incluziune a citosolului. Prin microscopie cu contrast de
faz, mpreun cu tehnicile de colorare adecvate, mai multe structuri celulare pot fi distinse. Coloranii
Fluorochromic pot fi utilizati cu o microscopie fluorescenta pentru a evidenia caracteristicile interiorului
celulelor, precum i suprafaa celulei [Pringle et al., 1991].
Un instrument foarte convenabil pentru a localiza i chiar pentru a urmri micarea anumitor proteine in
interiorul celulelor de drojdie este utilizarea de "proteina verde fluorescent (GFP) de la meduze (Aequorea
victoria) ca o molecul de raportor, i mai multi derivai de GFP cu fluorescen spectrala mutata pe alte
lungimi de und. Fuziunile de gene ce prezinta interes cu gena GFP (N-sau C-terminal), permite de asemenea,
urmrirea destinului i a exprimarii proteinelor de fuziune urmate de microscopia fluorescenta [Niedenthal et
al, 1996;.A se vedea, de asemenea, capitolul 4].
Gama de funcii celulare vizualizate este cu mult crescut, atunci cnd anticorpii monospecifici produi
impotriva proteinelor structurale sunt cuplai la colorani fluoresceni, cum ar fi izotiocianatul de fluorescein
(FITC) sau Rodamin B.
Fluxul citometriei are mai multe aplicatii in studiile drojdiei. De exemplu, sortarea celulelor activate prin
fluorescen (FACS) poate monitoriza progresia ciclului celular de drojdie, atunci cnd pereii celulari sunt
etichetati cu Concanavalina A conjugat cu FITC i celule proteice cu izotiocianat tetrametil (TRITC). Aceste
etichete permit colectarea de informaii cantitative cu privire la proprietile de cretere ale celulelor
individuale de drojdie, in timpul progresului prin ciclul lor celular.
Ultrastructura i arhitectura macromoleculara a Organitului pot fi obinute numai cu ajutorul microscopiei
electronica, care, n procedurile de scanare este utila pentru studierea topologiei de celule, n timp ce sec iunile

ultrasubtiri sunt eseniale n microscopia electronic de transmisie pentru a vizualiza structura fin intracelular.
Microscopia cu for atomic poate fi aplicata la celulele neacoperite, nefixate de imagistica suprafe elor
celulare ale diferitelor tulpini de drojdii sau de celule n condiii de cretere diferite.
2,3 celulele organite mobile ale drojdiei si compartimentele ei
ntr-o celula de drojdie idealizata (Figura 2-2), urmtoarele caracteristici ultrastructurale se pot observa (Figura
2-3): peretele celular, periplasma, membrana plasmatica, invaginare, cicatricea mugurelui, citosol, nucleu,
mitochondrion, ER, reticul endoplasmatic; aparatul Golgi, vezicule secretorii, vacuole; peroxizom. n mod
evident, celulele de drojdie mprtesc cele mai multe dintre caracteristicile structurale i funcionale cu
eucariotele mai mari. Spre deosebire de celulele de mamifere, particularitile celulelor de drojdie sunt c ele
sunt nconjurate de un perete celular rigid i dezvolta cicatrici la natere n timpul diviziunii celulare; vacuola
corespunde lizozomilor n celulele mai mari. Tabelul 2-3 ofer o list de enzime de marcare care pot fi utilizate
pentru a identifica n mod specific aceste structuri.
Structurile subcelulare din celulele de drojdie pot fi izolate de protoplaste sau de celulele intacte prin ruperea
peretelui celular, nainte de centrifugarea diferenial.
2.3.1 Celula Invelitoare
Celul de drojdie invelitoare este o capsula protectoare, formata din trei constitueni majori (inauntru si afara):
membrana plasmatica, spaiul periplasmic, si peretele celular. n S. cerevisiae, celula invelitoare are circa 15%
din volumul total de celule i are un rol major n controlul proprietilelor osmotice i permeabile ale celulei.
Membrana plasmatica este de o grosime de aproximativ 7 nm, cu unele invaginari n citosol. Compozi ia
lipidica

cuprinde

principal

fosfatidilcolina

fosfatidiletanolamina,

cu

proporii

mici

de

phosphaditylinositol, fosfatidilserina sau phosphadityl-glycerole, precum i steroli, n principal, ergosterol i

zymosterol. Membrana de proteine a drojdiei include urmtoarele catagorii: (i) ancore citoschelet; (ii) enzime
pentru sinteza peretelui celular;
(iii) proteine pentru transducia semnalului de transmembranare; (iv) proteine pentru transportul substanei
dizolvate (permeases, canale, ATP); (v) facilitatori de transport, cum ar fi ABC (ATP caset de legare) proteine
implicate ntr-un transport multidrog.
Astfel, funciile principale ale membranei celulelor de drojdie este de a oferi permeabilitate selectiva, adic de
a controla ceea ce intr i ce iese din citosol. Cel mai important este rolul proteinelor membranare in reglarea
nutritiei drojdiei, cum ar fi absorbia de carbohidrai, compui cu azot sau ioni, i extrudarea moleculei
periculoase pentru celula. Alte aspecte importante sunt exo-i endocitoza de molecule de marf, reacii de stres,
i sporulare.
Periplasma drojdiei este (35-45 A), un subire perete celular, regiune asociat extern membranei plasmatice i
intern a peretelui celular. Aceasta conine n principal proteine secretate (manoproteine), care sunt n
imposibilitatea de a ptrunde n peretele celular, dar ndeplinesc funcii eseniale n substraturi hidralizatoare

care nu traverseaz membrana plasmatica: invertaza transform zaharoza n glucoz i fructoz, iar fosfataza
acid catalizeaz eliberarea de fosfat liber de la compuii organici.
2.3.2 peretele celular
Peretele unei celule de drojdie este o invelitoare remarcabil de groasa (100 pn la 200 nm) (Figurile 2-4 i 25), care conine aproximativ 15 pn la 25% din masa uscat a celulei. Majoritatea Constituenilor structurali ai
peretelui celular sunt polizaharidele (80-90%), n principal glucani i mannan-uri, cu un procent mic de chitin.
Glucanii (att -2, 6 i -glucani 1,3-glucani legati sunt reprezentati) asigur rezisten peretelui celular,
formnd o reea microfibrilara. Mannan-urile sunt prezentate ca un miez -1,6-legat cu -1,2 - -1,3 i
inlantuiri laterale. Chitina este un polimer de N-acetil glucozamina reprezentnd doar 2-4% din peretele celular
i localizat n principal n cicatricile mugurilor. Poate fi interesant de observat c unele cretereri de drojdie
filamentoase, cum ar fi Candida albicans, au un coninut mai ridicat de chitin, n timp ce chitina este absent
din multe alte specii de drojdie. Alte componente ale peretelui celular sunt cantiti variabile de proteine ,
lipide, i fosfat anorganic.
Dac celulele de drojdie sunt tratate cu enzime litice (de exemplu helicaza din sucurile digestive ale melcului;
Zymolase sau Lyticase din surse microbiene) n prezena stabilizatorilor osmotici, peretele celular este eliminat
ajutand formarea de spheroblasts, care pot fi vizualizati ca structuri globulare n microscop. Anterior formarea
Spheroblast-ilor era adesea folosita pentru a facilita izolarea componentelor subcelulare. Remarcabil,
spheroblasts menine potenialul de regenerare a peretelui celular (Figura 2-7).
Flocularea (agregare de celule asexuate) este un fenomen special de interes n fabricarea berii, deoarece
celulele cu tulpini de drojdie de bere au tendina de a agrega ntr-o msur diferit. Drojdiile de la fund,
utilizate n mod normal pentru fermentaii mai mari, au un grad mai mare de floculare (adic formarea de
flocoane macroscopice de adeziune celular) dect drojdiile de top, care sunt utilizate pentru a face tipuri
speciale de bere. Cel mai probabil, flocularea este o consecin a exprimrii difereniate a flocculinei, care
interacioneaz cu receptorii de manoz pe peretele celular al celulelor nvecinate.
2.3.3 Citosol i Cytoskeleton
Citoplasma drojdiei este un fluid coloidal acid ( pH = 5,25 ), care conine n principal ioni i compu i organici
cu mas molecular mic sau intermediara , i macromolecule solubile ( de exemplu proteine enzimatice ,
factori , glicogen ) . Enzimele citosolice de drojdie includ: ( i)calea glicolitica , ( ii)complexul sintazei de acid
gras , i ( iii ) unele enzime pentru biosinteza proteinelor . Reeaua cytoskeletal garanteaza stabilitatea interna a
celulei i furnizeaza organizare structural ce cuprinde microtubuli i microfilamente. Acestea sunt structuri
dinamice care ndeplinesc funcia lor prin asamblare regulata i des- asamblare de subuniti individuale de
proteine . Astfel , tubulinele i polimerizeaz monomeri ca heterodimeri pentru a da microtubuli , n timp
ce monomerii globulari de G Actin polimerizeaza n microfilamente dublu - catenare ale F - Actin .
Microtubulii i microfilamentele sunt de asemenea importante n mai multe procese dinamice care au loc n
timpul mitozei i meiozei , septarii , i mobilitatea organica

Citoplasma drojdie conine mai multe categorii de microorganisme , care pot fi difereniate de substructurile
organice :
(i) 80S ribozomi suspendati liberi (n contrast cu ER asociate i 60S ribozomi mitocondriali);
(II) particule lipidice, care ndeplinesc funcia de particule de depozitare sau pot servi in biosinteza membranei
de drojdie;
(III) Proteazele, multi-subuniti complexe implicate n proteoliza proteinelor programate i n alte aspecte ale
degradarii proteinelor sau ale transportului.
2.3.4 Nucleul i Elementele extracromozomiale
Nucleul de drojdie este un organit rotund - lobat, aproximativ 1,5 m n diametru . Nucleoplasma este separata
de citosol de o membran dubl care conine pori ntre 50 pn la 100 nm n diametru . De la distanta, SPBsurile sunt conectate la microtubuli citosolici. Aceste elemente structurale joac un rol important n timpul
diviziunii celulare , cytokinesis i formarea mugurilor . Spre deosebire de alte eucariote ,membrana nuclear n
drojdie nu se dizolv n timpul mitozei .
n nucleu exist o regiune densa corespunztoare nucleolului care dispare n timpul mitozei i se reformeaza n
timpul interfazei. Coninutul mare de nucleoplasma este reprezentata de AND-ul genomic care mpreun cu
histone si non- histone este organizat n cromatina. Cromozomii de drojdie se formeaz i se inmultesc n
timpul mitozei (sau meioz), dar se comport practic invizibil pentry tehnicile microscopice ( Figura 2-8) .
n plus fa de materialul genomic, nucleele de drojdie conin utilaje pentru replicarea ADN-ului, repararea
ADN-ului, transcriere i prelucrarea ARN mpreun cu substraturile necesare i factorii reglementori, i
produse(precursoare) rezultate., precum i o parte din protezomii drojdiei.
Mai mult dect att, multe elemente genetice non-cromozomiale pot fi prezente n nucleul drojdie [Wickner,
1995].
(i) 2 m ADN este o plasmid ADN meninuta circular stabil, care se reproduce exact o dat n timpul fazei S.
Aceste elemente pot fi prezente n numr mare de copii, i au fost utile n construc ia de vectori de donare n
tehnologia recombinanta a ADN-ului de drojdie. Nici o funcie nu a fost nc atribuita celor patru gene gsite
n AND-ul 2 m.
(ii) ARN dublu catenar i ADN liniar se gsesc n tulpini de drojdie ucigae. Ele traiesc in gene pentru toxine,
care vor fi periculoase pentru tulpinile non-ucigase.
(iii) Cele mai interesante elementele extracromozomiale sunt elementele Ty, singura clas de retrotransposons
gsite n drojdie.
2.3.5 Sistemul de secretor i vacuolele
La fel de comune pentru toate eucariotele, celulele de drojdie locuiesc ntr-un sistem de compartimente
nconjurate de o membran, care sunt concepute pentru traficul de proteine n i n afara celulei.
Reticulul endoplasmatic ( ER ) este locul de biosintez i modificare a proteinelor care urmeaz a fi exportate .
Dup sinteza polysom-urilor asociate ER-ului situate pe suprafaa membranei ER , proteinele precursoare sunt

translocate n lumenul ER. Din ER , proteinele sunt ndreptate de vezicule spre aparatul Golgi. Ulterior pot
avea loc in Golgi modificari ale proteinelor de catre catenele laterale carbohidrate, de exemplu mannosylation .
Transportul retrograd din Golgi la ER a fost stabilit ca un control al calitii pentru proteinele exportate.
Proteinele livrate de la Golgi sunt direcionate ctre diferite destinaii din interiorul celulei sau la exterior prin
diferite vezicule secretoare. Aceste destinaii includ : ( i)vacuolele , (ii )regiunea mugurului n timpul mitozei
orientate ctre transportul mediat de actin , (iii ) membrane plasmatica , ( iv )periplasma. n mod natural ,
doar cteva proteine sunt exportate n periplasm i la abunden sczut . Cu toate acestea , secvenele de
semnal care sunt prezente n aceste proteine au fost fuzionate pentru a recombine proteinele heterologe cu
valoare terapeutic , care sunt apoi secretate cu succes din celulele de drojdie .
Organetul cheie din drojdie implicat n traficul intracelular de proteine sunt vacuolele. Poate fi privit ca o
form de component integrant a sistemului intramembranous. Rolul principal al acestui compartimentLizozom cum este clivajul proteolitic nespecific proteinelor, care implic o varietate de enzime litice
intravacuolare: endopeptidaze, aminopeptidases i carboxipeptidaze.
Alte funcii fiziologice ale vacuolelor drojdiei includ: depozitarea de aminoacizi bazici, polifosfai i anumii
ioni metalici; homeostaza concentraiilor de ioni citoplasmatici; osmoregulation.
2.3.6 peroxisomele
Peroxisomele efectuiaza o varietate de functii metabolice in celule eucariote. n drojdie, peroxisomele (Figura
2-10) conin mai multe oxidaze care servesc n utilizarea oxidativa de surse specifice de carbon i azot.
Organitele se dezvolta din peroxisome mici prezente n celulele glucozei crescute ca rezultat al sintezei rapide
a enzimelor peroxisome, cum ar fi catalaza i oxidaza alcool-ului. Cele mai multe gene implicate n biogeneza
peroxizomilor (gene PEX) au fost caracterizate pn n prezent in S. cerevisiae. Cum mitocondriile de drojdie
duc lipsa de oxidare - peroxisomele sunt locul de degradare a acidului gras (Figura 2-11).
2.3.7 Mitocondriile
Celulele de drojdie conin mitocondrii care seamn structural cu aceste organite gsite n toate eucariotele.
Prin urmare, mitocondriile drojdiei au servit drept modele pentru a studia intens structura mitocondrial,
activitatea i biogeneza [Glick i Pon, 1995]. Cu toate acestea, mitocondriile drojdiei prezint o varietate de
caracteristici importante, care sunt absente de la omoloagele lor din organisme mai mari, n special celulele de
mamifere.
Caracteristicile structurale generale ale mitocondriilor (Figura 2-12) includ:
(i) o membran exterioar - care conine enzime implicate n metabolismul lipidic,
(ii) spaiul intermembranar
(iii) o membran interioar - care conine NADH i dehidrogenaze succinat, componentele lanului respirator
i sintaza ATP, i diferite proteine de transport membranare integrale,

(iv) matricea mitocondriala - care conine enzime de oxidare a acizilor grai, ciclul acidului citric, ADN-ul
mitocondrial mpreun cu transcripia mitocondriala i proteinele utilajelor de sinteza (inclusiv 60S ribozomii
mitocondriali i mitocondriale ARNt).
Mitocondriile drojdiei sunt structuri dinamice a cror dimensiune, form i numr poate varia foarte mult n
funcie de tulpina de specificitate, de faza ciclului celular, i condiiile de cretere, n care factori importani
sunt: presiunea parial a oxigenului, concentraia de glucoz, prezena substraturilor nefermentabile,
disponibilitatea de steroli i acizi grai , i a anumitor ioni metalici (Mg + +)
n condiii aerobe , mitocondriile drojdiei sunt implicate n sinteza ATP-ului cuplat la fosforilrile oxidative.
Activitile ciclului acidului citric i lanul respirator vor depinde n mare msur de speciile de drojdie i
expresia efectului Crabtree . n condiii anaerobe , mitocondriile par a fi dispensabile cel pu in pentru func ia
respiratorie . De fapt , aa-numita , mutanti mici, care nu dispun de mitocondriile funcionale sunt viabile
. Cu toate acestea, mitocondriile pot ndeplini i alte funcii n fiziologia celulei de drojdie , implicnd c
mitocondriile sunt relevante pentru metabolismul celular intact chiar i n condiii anaerobe :
- Sinteza i desaturarea acizilor grai i lipidelor,
- Biosinteza ergosterolului ,
- Reacii la stres i adaptarea la stres ,
- Enzime pentru sinteza anumitor aminoacizi i acizi dicarboxilici , pyrimididice i bazele purinice, porfirin
i pteridine ,
- Mobilizarea de glicogen ,
- Producia de arom " a componentelor.
Importana mitocondriilor drojdiei este cel mai bine ilustrat de faptul c aproximativ 8- 10% din genele de
drojdie nucleare sunt implicate n biogeneza acestor organite i meninerea funciilor lor . Marea majoritate a
acestor proteine sunt sintetizate de ribozomii din citosol i ajung sa fie importate n mitocondriile drojdie , care
au potenialul de a biosintetiza doar 12 proteine diferite ( subuniti cytocromoxidaze , citocromul b , cele ase
subuniti de NADH dehidrogenaza , factori de splicing ) pe lng mitocondrialul rRNAs ( 15S i 26S
subuniti ) i complementul ARNt a mitocondrialelor . Biogeneza mitocondriilor, care implic cooperativitate
genetic ntre genele nucleare i genomul mitocondrial , a fost studiat pe larg n S. cerevisiae , deoarece mai
multe tipuri de mutaii pot fi utilizate n acest model de organism .

5 genomul de Drojdie
5.1 Proiectul ordonarii genomului de drojdie
n 1989, sa decis initierea unui proiect de secveniere a drojdie n cadrul programelor de biotehnologie ale
UE. Bazat pe o abordare de reea, iniial, aproximativ 35 de laboratoare europene au devenit implicate n
aceast ntreprindere [Vassarotti & Goffeau, 1992]. Cromozomul III a fost primul cromozom finalizat n
1992 [Oliver et al.,1992]. n 1994, cromozomii XI i II au fost publicati de proiectul UE. La scurt timp, o
serie de alte laboratoare s-au alturat proiectului i au fost de accord cu o colaborare internaional care s
permit finalizarea ntreagii secvene a genomului de drojdie n 1995. n cele din urm, mai mult de 600 de
oameni de stiinta din Europa, America de Nord i Japonia au devenit implicati n acest efort [Levy, 1994].
Diagrama (Figura 5-1) enumer laboratoarele implicate n proiectul de colaborare din care a fost lansata
ntreaga secven, n aprilie 1996.
5.1.1 Clonarea i cartografierea Procedurii
Succesiunea cromozomului III a pornit de la o colecie de suprapuneri de plasmid sau clone fage lambda,
care au fost distribuite de ctre coordonatorul de ADN la laboratoarele de contractare . Cu toate acestea,
curnd a devenit evident c bibliotecile cosmide comandate au fost mult mai avantajoase pentru a ajuta
secventiere la scar larg. Mai multe dintre aceste libaries au fost construite [de exemplu Stucka &
Feldmann, 1994; Thierry et al, 1995; . .Riles et al, 1993] i folosite pentru restul cromozomilor de drojdie.
Avantajele evidente ale clonarii segmentelor de ADN n cosmide, care primesc n mod normal 35-45 kb de
ADN , au fost :( i) gene mai mari ar putea fi obinute pe o singur clon recombinanta, (ii ) mai multe gene
legate pot fi izolate mpreun cu regiunile lor ; intergenice ( iii ) mai puine colonii trebuie s fie men inute
i analizate pentru a izola o clon de interes ; ( iv ) clonele cosmid s-au dovedit a fi stabile timp de mul i
ani n condiii de depozitare normale . Nu in mod surprinzator, izolarea secveniala a clonelor cosmid
suprapuse ( exemplul prezentat n figura 5-2 ) a permis legtura fizic i caracterizarea larg de gene de la
diferite organisme .
Pentru a construi o bibliotec cu o acoperire ct mai complet si cu ct mai pu ine clone posibil, fragmente
ADN clonate trebuie distribuite aleatoriu pe ADN. n aceste condiii, numrul de clone (N) dintr-o
bibliotec reprezentnd fiecare segment genomic cu o anumit probabilitate (P) este N = ln (1-P) / ln (1-f)
unde f este lungimea inseriei exprimat ca fracie de mrimea genomului [Clarke & carbon, 1976].
5.1.2 Strategii de secventiere, secven de asamblare i de control al calitii
5.1.2.1 Strategii de secveniere
n reeaua european, clonele au fost distribuite la laboratoarele colaboratoare n conformitate cu un sistem
elaborat de ctre coordonatorii ADN. Fiecare laborator contractat a fost liber sa aplice strategii de
secveniere i propriile tehnici, cu condiia ca secvenele sa fie determinate n ntregime pe ambele catene
i sa fie obinute citiri clare. Dou abordri principale au fost folosite pentru prepararea de subclone pentru
secveniere: ( i) generarea de sublibraries prin utilizarea unor serii de enzime de restricie adecvate sau de

deleii ale subfragmentelor corespunztoare, formulate de exonucleaza III , (ii ) generarea de biblioteci
rapide formate din cosmide ntregi sau fragmente de subclona prin impartirea aleatoare a ADN-ului .
Secvenierea prin tehnica Sanger a fost facuta fie manual, etichetata cu [ 35S ] dATP fiind metoda preferata
de monitorizare, fie prin dispozitive automate, urmand diversele protocoale stabilite . Au fost folosite dou
tipuri de dispozitive de detectare on-line cu etichetarea fluorescent: Applied Biosystems ABI373A i
Pharmacia, ALF. Un laborator a folosit sistemul de exterminare directa a electroforezei de companie GATC
( Konstanz ). Proceduri similare au fost aplicate la succesiunea de cromozomi din afara reelei europene.
Laboratoarele americane s-au bazat n mare parte pe secventierea la scar larg de catre mainrii.
5.1.2.2 Secventierea Telomerelor
Cromozomi Telomerii ai drojdie au prezentat o anumit problem. Datorit substructuri lor repetate i lipsa
de locuri restrictive adecvate au putut fi clonai prin proceduri convenionale, cu doar cteva excepii.
Secvenele au fost apoi determinate de clone de plasmid specifice obinute prin " capcan clonarii
telomerilor", o strategie elegant dezvoltata de E. Louis la Oxford [Louis, 1994, Louis & Borts, 1995].
5.1.2.3 Secvena de asamblare i de control al calitii
n cadrul reelei europene, toate secvenele originale au fost depuse de ctre laboratoarele care colaboreaz
la Institutul Martinsried de Secvente a Proteinelor (MIPS), care a acionat ca un centru de informatic.
Secvenele au fost inute ntr-o bibliotec de date, asamblate n succesiuni ce creteau progresiv, i
actualizate n timpul desfurrii proiectului prin aplicarea criteriilor corespunztoare ntr-un numr de
controale de calitate, ncepnd cu cromozomul XI [Vassarotti et al., 1995]. n colaborare cu coordonatorii
ADN-ului secvenele cromozomiale finale au fost derivate.
5.1.3 Ordonarea Analizei
mpreun cu declaraiile de date oferite de ctre laboratoarele singure, i n cele din urm atunci cnd
secvenele complete au fost disponibile, datele au fost supuse unei analize prin diveri algoritmi .
Secvenele au fost interpretate utiliznd urmtoarele principii :
(i) Toate locurile de imbinare ale intronilor ce constau in modele special definite [ Kalegoropoulos , 1995 ;
Kleine & Feldmann , nepublicat ] au fost listate .
( ii) Orice ORF care conine cel puin 100 de codoni nvecinati ca sens i care nu sunt cuprinsi n ntregime
ntr- un ORF sau in vreo suvita de ADN a fost enumerat ( aceasta lista include si ORF-uri par ial
suprapuse ).
( iii ) Cele dou liste au fost fuzionate i toate perechile cu locuri de mbinare ale intronilor / puncte
ramur ce apar n interiorul unui ORF dar n orientare opus au fost luate n considerare.
( iv ) regiunile centromerelor i telomerilor, precum i genele ARNt i elementele Ty sau rm i e ale
acestora au fost cercetate n comparaie cu seturile de date caracterizate anterior de astfel de elemente
[ Kleine & Feldmann , nepublicate ] inclusiv nregistrrile bazei de date introduse ntr-o biblioteca de gene

ARNt i ARNt actualizat permanent [ Sprinzl et al . , 1996 ] , i prin aplicarea programului de scanare
ARNt [ Fishent & Burke , 1991 ] .
5.2 Genomul Drojdie: Viaa cu 6000 de gene
5.2.1 Proteomele Drojdiei: Cadrul citirii deschise i Functia Genelor
Termenul "Proteome" a fost inventat pentru a descrie un set complet de proteine sintetizate de o via
celulara [Wilkins i colab., 1996]. Odat cu finalizarea succesiunii genomului de drojdie, pentru prima
dat, a devenit posibil s se defineasc proteomul unei celule eucariote.
Dimensiunile majoritarelor cadre deschise citii ( ORF) din drojdie variaz ntre 100 i peste 4000 de codoni
. Mai puin de 1 % dintre ORF este estimata a fi mai mic de 100 codoni; cele mai mici peptide mature
care au fost caracterizate sunt cei doi feromoni de mperechere(respectiv 11 i 13 aminoacizi,).
Este de remarcat faptul c numrul de gene de drojdie pentru care funciile pot fi atribuite prin compara ii
cu intrrile de baze de date de la mai multe alte organisme , care s-a dezvoltat destul de exponen ial n
ultimii ani, nu a crescut substanial . O observaie similar a fost deja fcut , atunci cnd genomul complet
de procariote mici , cum ar fi Haemophilus influenzae ( 1,8 Mb ) [ Fleischman et al . , 1995 ] ,
Mycoplasma genitalium ( 0,6 Mb ) [ Fraser i colab . , 1995 ] , sau Archeon Methanococcus jannaschii
( 1,7 Mb ) [ . Bult et al , 1996 ] au fost determinate : o mare parte a genelor au avut omologii din alte
organisme . Prin urmare , probabil c, avem de a face cu un fenomen general deoarece se pare c multe
dintre funciile noi necesit doar o transcriere tranzitorie sau cu nivel sczut ntr-un organism, sau sunt n
primul rnd - ncrengturi specifice .
mpreun cu raportul ntreagii secvene genomice , o clasificare a genelor de drojdie a fost stabilit la MIPS
i a fost folosita ca baz pentru clasificarea genelor de la alte organisme . Unul dintre cele mai utile
inventare de proteine de drojdie a fost alcatuit n Baza de date a Proteinelor de Drojdie ( YPD ) [ Garrels et
al . , 1996 ] i sunt actualizate n mod regulat . (Cu toate acestea , n prezent aceast informa ie este
disponibila doar comercial ) .
5.2.2 Suprapunerea ORF , Pseudogene i Introni
Cteva cazuri au fost constatate acolo unde suprapuneri de ORF chiar exist ntr-adevr n drojdie i sunt
exprimate. Intr-un caz special, s-a mai artat c exprimarea celor doua ORF-uri are loc n diferite etape ale
creterii drojdiei. O ntrebare interesant a fost ct de multe pseudogene ar putea fi prezente n genomul
drojdiei. Din studii anterioare, s-a anticipat c acest numr n drojdie ar trebui s fie redus n compara ie cu
acela din genomul mamiferelor. n general, aceast ipotez pare s fie adevrata pentru cea mai mare parte
de cromozomi de drojdie, dar cromozom I s-a dovedit a fi o excepie de la aceast regul [ Bussey et al . ,
1995 ] .
Cromozomul I este cel mai mic cromozom nuclear eucariotic funcional care se intampla n mod natural
caracterizat pn acum. Centrala 165 kb seamn cu alti cromozomi ai drojdiei att n densitatea naltimii
cat i in distribuia de gene. n contrast, secvenele rmase flancand acest ADN ( cele dou capete ale

cromozomului ) au o densitate mult mai mica de gene, n mare parte nu sunt transcrise , nu con in gene
eseniale pentru creterea vegetativ , i conin patru pseudogene aparente i o secven redundant 15 kb .
Aceste regiuni terminale repetitive constau intr-o repetare telomerica, flancata de AND-ul care este n
strns legtur cu FLO1 , o gen de drojdie implicata n floculare de celule i care codific o serina.
Pseudogenele sunt legate de gene de drojdie cunoscute, dar aucodoni interni de oprire. Grij extrem a fost
luat n astfel de cazuri pentru a reconfirma secvenele din regiunile amintite de laboratoarele
independente.
Numai o mic parte a genelor de drojdie, n jur de 4% din total, sunt prezise (sau deja demonstrate
experimental) ca vor fi ntrerupte de introni. Pn n prezent doar dou cazuri au fost ntlnite n care doi
introni sunt prezenti:, locus-ul MAT pe cromozomul III i o gena proteica ribozoma, RPL6A, pe
cromozomul VII. n acesta din urm, al doilea intron codific un ARN mic. In general, intronul dintr-o
anumit gen este situat la extrema captului 5 'al fiecarei gene, uneori chiar precede regiunea de
codificare. Populaia predominant de gene care conin introni este recrutata de cele care codific
proteinele ribozomale. Semnificaia funcional a intronilor nu este deloc clara, i n ciuda numrului mic
de gene de drojdie ce conin introni, continua sa se dezvolte i sa menina un mecanism deosebit de
sofisticat si complex pentru despicare.
5.2.3 Membrana Proteinelor , Proteine mitocondriale
Algoritmul ALOM [ Klein et al . , 1985 ] poate fi aplicat pentru a prezice deschiderea membranei putative .
O prim estimare pentru cromozomul III a artat c aproximativ 38% din genele "reale" poate codifica
pentru proteine transmembranare care conin ntre 1 i 14 membrane potenial transversabile[ Goffeau et
al . ,1993a ]. O figur la fel de mare ( 142 ORF din 410 ), a fost gasita pentru cromozomiul II [ Feldmann i
colab. , 1994 ] . Datele ordonate sistematic, obinute de la alti cromozomi ai drojdiei, sugereaz c acest
lucru pare s se aplice, ca regul general, la drojdie [ Goffeau et al , 1993b ; . . Nelissen et al , 1995 ] .
Chiar dac algoritmul poate da o estimare destul de mare, este posibil ca o treime din proteinele de drojdie
sa trebuiasca s fie considerate ca fiind asociate cu structuri de membran .
Examinarea ORF pentru apariia secvenelor de semnal int a mitocondriilor putative este dificil datorit
caracterului complex al acestor semnturi [ Hartl et al . , 1989 ] acest lucru ar putea fi realizat numai prin
inspecie vizuala. Din moment ce nu toate proteinele care particip la biogeneza mitocondriilor sunt
importate prin anumite secvene semnal , numrul exact de proteine implicate in mentinerea functiei
mitocondriale, in drojdia de bere rmne necunoscut n prezent . O estimare aproximativ 8-10 % este c
unele proteine de drojdie pot fi implicate n biogeneza mitocondriilor .
5.2.4 Alte entiti genetice
Pe lng genele care codific proteinele, informaii detaliate fost obinut despre organizarea genele pentru
ARNt si alte RNAs mici, de Retrotranspozoni a drojdiei (elemente Ty denumite) , precum si secvene
telomerice i centromerice . Genele pentru ribozomele RNAs sunt grupate n aproximativ 100 de copii pe

braul drept al cromozomului al-XII-lea , n timp ce, cele mai multe copii ale genelor tARN sunt gsite
mprtiate n ntreagul genom.
5.2.4.1 Genele Drojdie ribozomal
Genele ribozomale ARN sunt situate n cromozomul XII al drojdiei, unde formeaz o matrice de
aproximativ 100 de uniti de transcripie aranjate tandem, fiecare cuprinznd secvenele de 28S , 5.8S i
18S ARNr . Numrul de uniti poate varia uor ntre tulpini ( Figura 5-8 ) .
5.2.4.2.2 Familii tARN , Redundana Genelor tARN , i variante de Gene tARN
Efectuand analiza de ansamblu a genomului de S. cerevisiae S288C folosind ajutor computerizat ar putea
fi identificate cele 274 de gene ARNt nucleare intacte, codificate i o gena ARNt de pe cromozomul
suplimentar XIV ntrerupt de un element de Ty1 aproape de captul 5 '
Dupa mai multe criterii , cele 274 de gene tARN de drojdie pot fi considerate gene active i grupate n 42
de familii ( Tabelul 5-1 ) de specificitate codon distincta. Cele dou isoacceptoare de metionin sunt
atribuite familiilor distincte, in calitate de iniiator tRNAMeti i de elongator tRNAMet3, se disting n mod
clar , att prin structura cat i prin funcie. n majoritatea cazurilor, copiile unice a unei familii impart
secvente identice
in partea structural a ARNt-ului. Cu toate acestea, unele familii, pot s cuprind copii ale genei cu
secvene puin variate care dau natere la perechi alternative de baze din tulpini sau nucleotide alternative
la locurile unice de ARNt . De asemenea , variaii ale secvenelor de introni pot fi observate ntre diferiti
membrii a unei familie. n total, variante de secvene ( inclusiv variantele intron ), exist n 11 familii de
gene tARN. Secvenele de gene tRNASer3 reprezint cazuri speciale : n dou dintre ele , primul C lipse te
n bucla anticodon ( n mod normal, citirea 5'CTGCTAA3 " ) . n cazul n care aceast "pierdere" nu este
pur i simplu din cauza erorilor de secventiere, tARN rezultat ar trebui s fie o variant real, care are doar
ase nucleotide n bucla anticodon . Genele pentru nonsens sau supresoare tRNAs missense pot fi incluse
n familiile lor "mam", deoarece ele rezulta din mutatii special, din copii de gene individuale ale acestei
familii .
Mai mult dect att, n tulpina S288C nu au fost detectate gene pentru trei ( variant) tRNAs-uri,
structurile primare din care au fost raportate n literatura de specialitate : tRNAHis1 , tRNASer1 i
tRNAThr1b . Dou explicaii sunt oferite : (i ) aceste ARNt sunt codificate de genele suplimentare care pot
fi prezente n alte tulpini de drojdie, ( ii ) acestea (i poate altele ) variante de structuri ARNt sunt generate
de editarea ARN . Prima posibilitate este susinut de faptul c ARN-ul " solubil " din diferitele tulpini au
servit drept materie prim n purificarea ARNt-ului specific pentru secveniere . Mai mult dect att, au
existat numeroase indicii din profilele tARN-ului n diferite tulpini de drojdie ( inclusiv tulpinile haploide
sau diploide , cu diferite tipuri de imperechere ), c numrul i amplasarea anumitor isoacceptors a fost
variabil . A doua presupunere este dificil de dovedit n prezent. Potrivit cunostintelor noastre, editarea
ARN-ului nuclear a drojdiei de bere nu a fost raportata pn acum .

5.2.4.2.3 Introni i Procesare de precursori tRNAs

Secvene care intervin n genele eucariote tARN au fost descrise pentru prima data de tRNATyr-ul drojdiei
[ Goodman et colab . , 1977 ] . Cu disponibilitatea secvenelor suplimentare, reguli pentru localizarea
intronilor n cadrul secvenelor de codificare au fost stabilite, iar mecanismul de despicare a intronilor n
drojdie a fost elucidat , iar componentele implicate n acest proces au fost caracterizate .
Surprinzator , intronii sunt gsiti n doar 10 familii nucleare de gene tARN ( Tabelul 5-1 ), dar oricare
membru dintr-o anumit familie poate purta un intron . In general, intronii pentru o anumits specie tARN
sunt identici sau demonstreza o secven similara foarte ridicata. Cu toate acestea, in cateva cazuri, intronii
au lungimea variabil ( + / - o nucleotid ), precum i n succesiune .
Asa cum a fost studiat n anumite supresoare tRNAs , unele activit i de modificare par s necesite
coninuturi de introni tRNAs in calitate de substraturi . n special, intronii pot fi obligai s introduc
modificri anticodon la prima de baz n timpul prelucrarii a anumitor pre- tRNAs-uri astfel nct ARNturile mature sunt capabile sa citeasca codoni selectati. Cu toate acestea, aceast cerin a fost demonstrat c
nu este universala, precum i modificrile la alte poziii n secvena ARNt nu necesit precursoare tRNAs
ca substraturi, dei multe dintre modificri au loc n mod normal la nivelul precursorilor .
O observaie interesant a fost c intronii pot fi amestecati ntre genele omoloage ARNt [ Olson i colab . ,
1981 ] . Putine informaii sunt disponibile despre modul n care secvene ce intervin ar putea afecta nivelul
expresiei genice ARNt.
5.2.4.2.4 Multiplicitatea ARNt i Capacitatea Codon n drojdie
Studiile anterioare au aratat ca drojdia de bere , ca i alte organisme , are isoacceptoare nucleare codate
pentru majoritatea dintre cei 20 de aminoacizi , de preferin, pentru a satisface degenerarea codului
genetic . A devenit evident c " wobbling " n interaciunile : codon-anticodon permite reducerea numrului
de tRNAs-uri necesare pentru a ine cont de ntreaga capacitate de decodare a unui organism [ Crick ,
1966 ] i c "finetuning-urile ", interaciunilelor codoni- anticodonilor sunt mediate prin modificri de baz
anticodon foarte precise n special tRNAs-uri . Regulile wobble particulare pentru poziia a treia a perechii
codon - anticodon propuse pentru S. cerevisiae a dus la predicia a aproximativ 46 de ARNt-uri diferite
[ Guthrie & Abelson , 1982 ] .
5.2.4.2.6 Redundana genelor ARNt i selecia Codon n drojdie
Studiile la nceputul anilor 1980 au artat deja o corelaie puternic ntre abundena tRNAs-urilor drojdiei
i apariia codoniilor respectivi n genele proteinelor : gene care au fost cunoscute ca fiind puternic
exprimate

s-au dovedit a fi mai mult prtinitoare dect gene cu un nivel mai sczut de exprimare

[ Ikemura , 1982; Bennetzen i Hall , 1982 ] . Aceste constatri au fost confirmate intr-un studiu usor de
inteles care a investigat corelarea dintre redundana genei tARN i selecia translationala in drojdie
utiliznd un eantion de 1756 de secvene proteice distinct codificate: o co-adaptare semnificativ mai

puternic ntre alegerea codonului i numrul de copii a genei tARN a fost observat n gene extrem de
exprimate [ Percudani i colab . , 1997 ] .
Cuantificri exacte ale tuturor componentelor individuale ale populaiei ARNt-urilor nu sunt disponibile. O
estimare a coninutului celular de 21 din 24 serii de tRNAs-uri, dateaz din 1982 [ Ikemura , 1982 ] i nu
include nici unul dintre ARNt-urile rare . ntr-un studiu recent, Percudani et al . [ 1997 ] a constatat c
numrul de copii de gene pentru speciile individuale de tARN-uri se coreleaz bine cu coninutul
intracelular msurat anterior a celor 21 de specii ARNt . Aceasta , mpreun cu constatarea c exist o
legtur strns ntre redundana genei ARNt i compoziia global de aminoacizi a proteinelor drojdiei
indic c nivelurile intracelulare de ARNt n celulele de drojdie ce cresc normal, sunt determinate n
principal de numrul de copii a genei.
Cu toate acestea , variaia coninutului de tARN in drojdia de bere , la rate de cretere diferite, nu a fost
studiat n detaliu cum a fost fcut , de exemplu , n E. coli [ Dong et al . , 1996 ] . Numai pentru anumite
ARNt-uri de drojdie , cum ar fi isoacceptors serin , abundena relativ a fost gsita variind n celule care
creteau la viteze diferite [ Heyman i colab . , 1994 ] . Studiile in vitro au sugerat c att TFIIIB70 i
TFIIIC joac un rol n coordonarea transcrierii nivelului polimerazei III cu rata de cre tere a celulelor
[ Sethy i colab . , 1995 ] .
De asemenea, trebuie remarcat faptul c s-au observat variaii n numrul de copii de gene majore ARNt n
diferite tulpini de drojdie, dar par a fi tolerate . Aceste constatari sugereaza faptul ca trebuie sa existe
mecanisme mai complicate care permit coninutului tARN-urilor s fie adaptate prin reglementarea copiilor
expresiei unice a genei tARN. Cu toate acestea, problema cu privire la modul in care expresia genelor
individuale ARNt este reglementat in vivo este nc o problem datorit redundanei genele ARNt .
5.2.4.2.7 Organizarea genomica a genelor ARNt ale drojdiee i aspecte evolutive
37 din cele 42 de familii de drojdie tARN sunt reprezentate de mai multe copii ale genei mpr tiate de-a
lungul genomului. Aliniamente ale secvenelor genei ARNt-uri isoacceptoare codificate arat c copiile
individuale au o particularitate in comun cu genele care codific proteinele: n majoritatea cazurilor,
puine , dac nu chiar aproape deloc, omologia nu este vzut n regiunile adiacente dintre membrii diferii
ai unei familii, si de asemenea nu este vzut nici ntre membrii din diferite familii de gene . Poate doar,
unele de 10 sau cam asa ceva perechi de baze sunt conservate n cadrul regiunilor imediat urmatoare a
diferiilor membrii ai unei familii de gene ARNt. Exist cteva excepii n care similitudini mai extinse n
regiunile adiacente sunt vzute ( de exemplu , pentru cele dou gene tRNAIle1 , i pentru dou copii de
gene ale tRNAPro1 pe Cromozomii XII i respectiv XIII), sugernd c dispersia acestor exemplare de gene
care s-au format prin duplicare a avut loc numai recent .
n ceea ce privete bazele transcrierii genei tARN, care este reglementata de secvene promotorii interne,
secvena divergenei n regiunile adiacente nu este att de surprinztoare .

Cu toate acestea , avnd n vedere faptul c factorul de transcriere TFIIIB se leaga de secvente care preced
partea structural a genelor tARN , " ajustarea " expresiei genelor tARN ar trebui s depind de caracterul
acestor secvene [ de exemplu , Kassavetis i colab . , 1990 ] .
n timp ce ntreinerea multiplicitatii genei tARN este uor de explicat prin conversia genei interlocus
[ Amstutz i colab. , 1985 ] , ntrebri cu privire la stabilirea mecanismului ce sta la baza multiplicitatii
genelor tARN rmn n mare parte nerezolvate . Un proces mediat de transcriere invers pare plauzibil:
conservarea de introni nu nltura aceast ipotez deoarece despicarea este un pas mai trziu n maturarea
tARN i precursorii ARNt pot fi considerati substraturi pentru retrotranscriptie [ Olson , 1991 ] .
Alte mecanisme de dispersie, cum ar fi evenimentele mediate de retrotransportori, au fost propuse pentru a
fi implicate n amplificarea genei ARNt [ Warmington et al . , 1987 ] , dar cuno tin ele noastre actuale
privind organizarea dintre genele ARNt de drojdie confer aceast posibilitate improbabila .
Compararea ntregilor secvene de cromozomi releva apariia aa-numitelor regiuni omologii Cluster
( CHRs ), n care genele omoloage sunt aranjate n aceeai ordine , cu aceea i orientare transcrip ional
relativ , pe doi sau mai multi cromozomi. Wolfe i Shields (1997 ) au definit 55 de astfel de blocuri i au
sugerat un model destul de convingtor care explic omologiile extinse vzute n drojdia de astzi facute de
( allo - sau auto) - tetraploidizarea dintre dou tulpini vechi de S. cerevisiae , urmate de translocari
reciproce i stergeri de 85 % din genele duplicate .
Este evident ca cele mai mari CHRs-uri mprtesc o serie de " perechi " de gene tARN, att n aceea i
locaie relativ cat i in orientare . Modelele observate implica faptul c aceste gene particulare ARNt au
fost copiate mpreun cu proteinele ce se ocupau de codificarea genelor vecine . Presupunnd c genele
ARNt sunt o achiziie veche ce a evoluat, i lund n considerare faptul c regiunile de flancare ale acestor
perechi de gene tARN s-au despartit complet, constatarile nostra sunt intru-totul de acord cu ideea ca
CHRs-urile au fost generate de suprapunerile genelor vechi. Cu toate acestea, avnd n vedere faptul c o
mare varietate de exemplare de gene duplicate, codificari de gene precum i gene tARN , se gsesc
mprtiate de-a lungul mai multor locatii in genomul drojdie, sunt necesare postulari de mecanisme
suplimentare de amplificare a genei i de dispersie . n special pentru genele tARN , dintre care majoritatea
( 232/274 ) se afl n afara CHRs-irilor , ar trebui s invoce dou tipuri diferite de mecanisme prin care sa
fie generate duplicri : ( i) co - evoluia de mari segmente cromozomiale care conin att codarea
proteinelor cat i genele ARNt ; ( ii ) introducerea " duplicarii" copiilor de gene ARNt de la locurile
singulare din alti cromozomi , un proces care ar fi putut deveni operativ dup speciaie/ specificatie .
5.2.4.3 Drojdie Ty Elemente
Cinci tipuri diferite de elemente Ty care prezint omologie substanial la retrovirusuri i retrotranspozonii
de plante i animale sunt prezente n genomul de drojdie: Ty1, Ty2, i Ty4 aparin clasei "COPIA" a
retrotransposonilor, n timp ce Ty3 este un membru al familiei "igan" [revizuire, Sandmeyer, 1992].

S288C conine 32 Ty1 i 13 Ty2 elemente complete, n timp ce Ty4 este prezent la doar trei locaii i Ty3
are loc n dou exemplare. Ty5, gsit n cromozomul III, a aprut ca o noua clasa de transpozoni n drojdii.
5.2.5 Genomul: Arhitectur i Organizaia
5.2.5.1 Densitatea Genelor i Amenajarea de gene care codific proteine
Din numrul de gene i dimensiunea total a genomului drojdiei se ajunge la o densitate a genei de
aproximativ 2 kb pe cadru de citire deschis. Acesta a stabilit c densitatea genelor n toti cromozomii
drojdiei este destul de asemntoare . Cu excepia ORF-urilor contribuite de elementele Ty , ORF-urile
ocup o medie de 70 % din secvenele . Acest lucru las doar un spaiu limitat pentru regiunile intergenice
care pot fi gndite s poarte elemente de reglementare majore, implicate n ntre inerea cromozomilor,
replicarea i transcrierea ADN-ul.
Natura compacta a genomului S.cerevisiae se poate observa n comparaie cu sistemele eucariote mai
complex. De exemplu, genomul elegans C. conine o poteniala gena ce codific proteinele numai la 5-6 kb
[ Hodgkin i colab . , 1994 ] . n genomul uman , densitatea genelor fusese estimata a fi de numai o singur
gen n 30 kb [ Olson , 1993 ] , dup ce proiectul de ordine este disponibil , aceast figura este o gena in
aproximativ 100 kb .
Diferena dintre cele dou gene de drojdie pare a se datora faptului c , n drojdia de fisiune cca 40 % din
gene conin introni , n timp ce numai o fraciune mic (mai puin de 5 % )din genele care codific proteine
din S. cerevisiae sunt prezise ( sau deja demonstrate experimental ) ca vor fi ntrerupte de introni[ Dujon ,
1996 ] .
n ceea ce privete transcrierea genelor care codific proteine, o varietate de elemente au fost identificate si
caracterizate , care sunt operative n iniierea transcrierii , de reglementare i terminare . Nu toate genele de
drojdie sunt precedate de o caset TATA canonic , i rmne nc deschis ce tip de secven e AT - bogate
sau alte elemente pot aciona ca niste locuri de iniiere in transcriptie.
In unele cazuri , secvenele terminale au fost definite , dar nici un consens general secven ele pot fi
deduse ., De asemenea, elemente de reglementare negative ( secvene de reprimare din amonte ; URS ), s-a
dovedit ca controleaza exprimarea unor gene . Cu toate acestea , n doar cteva cazuri , idei precise privind
interaciunea intima dintre diferitele componente de reglementare care mediaz expresia genelor au nceput
s evolueze .
Cunoaterea ntreagii secvene a genomului combinata cu puternice instrumente genetice disponibile
pentru
drojdie ar trebui s ncurajeze, acum, cercetarea de-a lungul acestor linii .
n general , ORF-urile par a fi mai degrab distribuite n mod egal ntre cele dou componente ale
cromozomilor singuri . In unii cromozomi ( ex. I , II , VIII ) , exist un mic exces de capacitate de
codificare pe una dintre catene ,a carei semnificaie nu este cunoscut .

Compoziia de baz medie a AND-ului de drojdie este de 38,4 % ( G + C ) . Cum era de a teptat ,proteina
regiunilor de codificare are un coninut GC mai mare , n medie ( 40,2 % ) dect n regiunile non- codare
( 35,1 %) . In ferestrele glisante, regiunile de codificare pot fi discriminate din regiunile intergenice ,
deoarece " tranziiile " din coninutul GC sunt destul de agere la frontierele lor . O distribu ie aproape
simetric a frecvenelor dinucleotidice se poate observa peste ntregul cromozom, n timp ce compoziia de
baz a ORF-ului prezint un exces semnificativ de perechi omopurine pe catena de codificare . n mod
normal, regiunile de codificare sunt n mod egal distribuite ntre cele dou componente . Mrimea medie a
ORF-ului este de 1450 bp . Dimensiunile medii a inter-regiunilor ORF variaz ntre 630 i 945 pb pentru
diferiti cromozomi , sunt 618 pb , n medie, pentru " promotori divergenti " ( 36,2% GC ) i 326 pb pentru
" terminatori convergenti " ( 29,3 % GC ) , n timp ce " combina iile promotor - terminator " ( 34,2 % GC)
sunt n medie,517 pb n lungime.
5.2.5.2 Compoziia de baz i Densitatea Genelor
Compoziia medie de baz a fost gsita a fi simetrica de-a lungul ntregului cromozom ( simetria fiind i
mai evident in frecvenele dinucleotidice ) , dar acest lucru reflect doar un numr aproape egal de ORFuri codificate pe fiecare fir de ADN a celor mai multi cromozomi ai drojdie , compozi ia de baza a ORFurilor arata un exces semnificativ de perechi omopurine pe suvita codificare [ Dujon et al . , 1994 ] .
Variaii regionale a compoziiei de baz cu amplitudini similare s-au observat mai nti de-a lungul
cromozomului III [ Sharp & Lloyd , 1993 ] , cu vrfuri majore GC - bogate n mijlocul fiecarui bra .
Rezultatele cromozomului XI au confirmat aceast constatare, dar din cauza dimensiunilor sale mai mari ,
a dezvaluit o periodicitate aproape regulata a coninutului GC , cu o succesiune de segmente GC - GC bogate i srace . O observaie si mai interesanta a fost c periodicitatea compoziional coreleaz cu
densitatea genelor locale , ajungnd la mai mult de 85 % n regiunile bogate n GC , urmate de segmente
gene cu densitatea comparabil mai mic ( 50-55 % ) , n regiunile ATrich [ Dujon et al . , 1994 ] .
5.2.5.3 Elementele funcionale ale cromozomilor de drojdie
5.2.5.3.1 centromeri
Centromerii sunt locurile de formare a kinetoforilor i locul de ataament cromozomal al axelor mitotice i
meiotice [ Lechner i Ortiz , 1996 ] . Din toate secvenele de ADN centromeric cromozomii drojdiei
mprtesc o structur comun , care se extinde doar peste aproximativ 200 pb , contrar centromerilor
mult mai mari n S. pombe sau celule de mamifere , n cazul n care se ocup aproximativ 200 kb .
5.2.5.3.3 Telomeres
Organizarea telomerilor drojdiei a devenit clara din lucrarea lui E. Louis i a colaboratorilor su n
combinatie cu secvenele cromozomiale .
n schema din figura 5-16 , terminatiile primilor trei cromozomi ce erau s fie finalizate sunt comparate .
Secvene repetitive cu similitudine ridicata la nivel de nucleotide sunt indicate de ctre triunghiurile

lumplute . ORF-urile sunt reprezentate prin sgei . Secvenele telomerice consens sunt afiate n negru ,
infrastructura lor [ Louis & Borts , 1995 ] este indicat n inserie ( nu trase la scar ) .
Toti cromozomii drojdiei mprtesc caracteristici telomerice i structuri subtelomerice.
Comparaiile dintre terminalele cromozomilor a artat c , n plus fa de repetrile subtelomerice comune,
ele au similitudini extinse n regiunile subtelomerice : redundana genetica este regula de la capetele de
cromozomi ai drojdie . Regiunilor " duplicat " conin copii ale genelor cu funcii cunoscute sau previzibile ,
precum i mai multe produse ORF care prezint asemnare mai mare , dar funciile lor rmn neclare
deoarece nici-un omolog dintr-o funcie cunoscut nu a fost gsit n bazele de date .
Din cauza structurii lor "deschise " , telomerii trebuie s fie stabilizati i replicati de ctre un Sistemul
telomeric specializat . Telomerii drojdiei sunt formati din produsele genelor a trei gene EST ( EST1 ,
EST2 , EST3 ) , prin care Est2p acioneaz ca subunitate catalaytica , si o component RNA ( TLC1 ) care
este folosita ca o matrice n sinteza ADN-ului telomeric . In plus , replicarea telomerilor este dependenta
de:
( i)complexul TRF1 , constnd din Ku70 ( HDF1 ) i Ku80 ( HDF2 ), proteine i interacioneaz cu
Cdc13p , care este , de asemenea, crucial pentru suvitele reparatoare ale AND-ului dublu non- omolog si
protejeaza telomerii fa de nucleaze i recombinaze ,
( ii ) un numr de proteine RAD ( RAD50 , RAD51 , RAD52 ) ,
( iii ) Sgs1p , o helicaz , prevenind din recombinarea de letirious ntre secvenele telomerice ,
( iv ) i un numr de alte proteine .
n celulele telomere, telomerii progreseaza incet ( n aproximativ 60 de generaii ) si conduc la o scurtare a
telomerilor si a senescentei crescute .
Zakian ( 1996) a discutat extrapolarea informaiilor despre AND-ul telomeric al drojdie la mbtrnirea
celulele umane. Datele de la S.cerevisiae , de asemenea, sugereaza ca abilitatea de a mentine lungimea
telomerilor poate fi critica pentru starea tumoroasa a celulelor de mamifere . Activitatea telomerilor este
modificat n cele mai multe tipuri de cancer .
5.2.5.4 Repetri complexe i simple
n general, genomul de drojdie este extrem de srac n secvene repetate. Constelaia unica de secvene
repetitive la cele dou capete ale cromozomului I a fost deja subliniata. Aproximativ 30 kb din fiecare
regiune subtelomerica transporta gene similare ( dar neeseniale ) i o repetare de 15 kb. Aceste
caracteristici sunt n concordan cu ideea c aceste regiuni terminale reprezint echivalentul drojdiei cu
heterochromatina i apariia acestui tip de ADN sugereaz c prezena sa d acestui cromozom lungimea
critic necesar pentru stabilitatea i funcionarea corect . Regiunea 30 kb poate fi ndeprtat din fiecare
capt, fr a afecta creterea vegetativ , dei stabilitatea cromozomului este redusa considerabil . Cel mai
probabil, aceste regiuni repetate care au fost observate ca contribuie la dimensiunea polimorfisma a
cromozomului I [ Bussey i colab . , 1995]. Pe lng elementele Ty, ADNr-urile de pe cromozomul XII

sunt cele care contribuie cel mai mult la caracterul repetitiv . Un grup de aproximativ 15 repetiii n tandem
( 2 KB fiecare ) coninnd gena CUP1 i care contribuie la variaia polimorf se gaseste pe cromozomul
VIII [ Johnston et al . , 1994 ] .
Exista intinderi repetate de oligonucleotide scurte. Acestea includ tractele polilor ( A ) sau polilor (T),
alternnd tracturile polilor ( AT ) sau polilor ( TG ), i repetri lungi directe sau inversate . Chiar si
intinderile scurte a secvenei se repeta simplu ( TG1 - 3 ) n , n mod normal " etanarea " capetelor
cromozomiale, au fost uneori ntlnita in interiorul unor cromozomi . Acest tip de repetiii interne sunt,
probabil, relicve a unor evenimente din timpul ruperii i vindecarii de cromozomi .
Prin aplicarea programului Pythia [ Milosavljevic & Jurka , 1993 ] pentru a cuta repet simplu , am
detectate cel puin 12 seturi de trinucleotide repetate n mod regulat de-a lungul cromozomului II ,
reprezentnd codoni repetati pentru anumiti aminoacizi, formnd astfel ntinderi homopeptide . n unele
cazuri, au rezultat modele de aminoacizi chiar mai complexe ( Tabelul 5-3 ) . Un studiu sistematic privind
distribuia i variabilitatea repetarilor trinucleotidei in genomul drojdiei a fost efectuat [ Richard & Dujon ,
1997 ] .
Repetri perfecte i imperfecte , de la patru la 130 de tripleti au fost recunoscute i repartizarile unor
combinatii triplet diferite s-a dovedit ca difera ntre ORF i regiunile intergenice . Examinarea diverselor
tulpini de laborator evideniaz o variaie de mrime polimorfa pentru toate repetri perfecte, comparativ
cu o
lipsa de variaie pentru cele imperfecte . Aceste constatari sunt deosebit de interesante n ceea ce prive te
faptul c mai multe boli genetice umane sunt cauzate de expansiune trinucleotidelor. Sistemul de drojdie
poate oferi acum o abordare experimental pentru a studia mecanismele de expansiune a lor .
5.2.5.5 Comparatie intre hrile fizice i genetice
Harta genetic de S. cerevisiae [ Mortimer i colab . , 1992 ] a avut o valoare considerabil pentru biologi
molecule de drojdie nainte ca hrile fizice sa devena disponibile .
Pe lng extinderea local sau contracia hrii genetice, i faptul c frecvena global a recombinarii
meiotice creste cu scurtarea dimensiunii cromozomului, ordinea genelor poziionate pe cromozomii de
cartografiere genetic i fizic sunt extrem de acord. Astfel, compararea hrii fizice i genetice arat c
cele mai multe dintre legturi au fost stabilite pentru a da ordinea corecta a genelor , dar ca, n multe
cazuri, distanele relative derivate din cartografierea genetica sunt imprecise .
Evident imprecizia hrilor genetice se poate datora faptului c diferite tulpini de drojdie au fost utilizate n
stabilirea legturilor. Este chiar posibil ca unele tulpini folosite n experimentele de cartografiere genetica
arat inversiuni sau transferuri care apoi ar putea contribui la discrepane dintre hrile fizice i cele
genetice. In mod clar, acurateea cartografierii genetice va depinde de abordrile experimentale utilizate.
Cu toate acestea, un fenomen mai rspndit, care poate duce la imprecizie hrilor genetice sunt
polimorfismele tensometrice cauzate de secvenele repetitive extinse sau genele subtelomerice duplicate

dup cum sa menionat mai sus, i n special de elementele Ty . n total, experiena acumulat de la
proiectul genomului de drojdie arat c hrile genetice furnizeaza informaii valoroase , dar ca
cartografierile fizice independente i determinarea secvenelor complete este necesar pentru a delimita n
mod clar toate genele de-a lungul cromozomilor . n acelai timp, diferenele constatate ntre diferite tulpini
de drojdie demonstreaz necesitatea de a utiliza o tulpina speciala ca un sistem de referin.
5.2.5.6 Organizarea Genomumui i Aspecte evolutive
5.2.5.6.1 Redundana genetic n drojdie
ntruct o estimare a similaritatii secvenei ( att la nivel de aminoacizi i nucleotide ) este acum posibil ,
ea rmne inca dificil de corelat fizic complet la redundana funcional , deoarece chiar i funciile genei
de drojdie au fost definite cu precizie ntr-o msur limitat . nelegerea adevratei naturi a redundantei va
ajuta la elucidarea rolului biologic a fiecarei gena de drojdie.
In multe cazuri, secvenele duplicate sunt limitate la aproape ntreaga regiune de codificare a acestor gene
i nu se extind n regiunile intergenice . Astfel, produsele genei corespunztoare mprtesc similaritatea
ridicat n termeni de secven de aminoacizi sau , uneori sunt chiar identice i , prin urmare , pot fi
funcionali excesivi . Cu toate acestea, dup cum indic diferenele de secven din cadrul regiunile
promotor , expresia genelor ar trebui s varieze n funcie de natura elementelor de reglementare sau alte
constrngeri ( de reglementare ) . Acest lucru a fost demonstrat experimental n numeroase exemple
( Tabelul 5-4 ) .
Se poate foarte bine ca o copie a genei sa fie foarte exprimata in timp ce o alta este exprimata umil.
Deschiderea sau oprirea expresiei a unei copii special din cadrul unei familii de gene poate depinde de
starea difereniat celulei ( cum ar fi tipul de mperechere , spori, etc ) . Studiile biochimice , de asemenea,
au relevat faptul c , n cazuri speciale proteinele " redundante " se pot substitui reciproc , astfel fiind
lamurit faptul c o mare parte din perturbrile genelor singure din drojdia de bere nu afecteaz creterea
sau provoca fenotipuri " anormale " . Acest lucru nu implic, totui , c aceste gene redundante erau
dispensabile prioritar . Mai degrab au aprut prin necesitatea de a ajuta celule de drojdie sa se adapteze la
anumite condiii de mediu . Aceste noiuni sunt de importan practic in efectuarea i interpretarea
experimentelor de ntrerupere a genei .
5.2.5.6.1.1 Genele dublate n regiunile subtelomerice
Exemple clasice de gene redundante n regiunile subtelomerice sunt drojdiile MEL , Suc , MGL i Genele
MAL , care au fost menionate anterior . De fapt, tulpinile de drojdie difer de prezen a sau absen a
seturilor speciale ale acestor gene . De exemplu , trei gene mapate pe cromozomul II, tulpinile de tip
slbatic , MEL1 , SUC3 , i MGL2 , sunt absente de la tulpina S288C . O compara ie la nivel molecular a
S288C cu tulpina de drojdie de bere C836 a artat n mod clar c genele SUC sunt prezente pe
cromozomul II din ultima tulpinia . n ceea ce privete genele implicate n metabolismul carbohidrailor,
prezena multiplelor copii ale genei pot fi atribuite presiunii selective indus de domesticire uman , a a

cum se pare c acestea sunt n mare parte dispensabile n tulpinile de laborator ( cum ar fi S288C ) care nu
mai sunt utilizate n procesele de fermentaie . Procesele de recombinare non- omoloage pot fi responsabile
pentru dublarea acestora i a altor gene care locuiesc n regiunile subtelomerice [ de exemplu, Michels i
colab . , 1992 ] , care reflect structura dinamic a telomeriilor drojdiei n general [ Dershowitz & Newlon ,
1993 ] . Am menionat deja faptul c regiunile subtelomerice a multor cromozomi ai drojdiei impart
segmente foarte conservate, n unele cazuri pn la 30 kb , care transporta genele duplicate ale cror funcii
sunt n mare msur necunoscute .
5.2.5.6.1.2 Genele de dublare interne ctre Cromozomii
In plus , exist o mare varietate de gene interne cromozomilor care par s fi aprut din dublari , a a cum e
sugerat de analizele cromozomilor individuali. nainte ca secvenele complete a cromozomilor sa devina
disponibile , o mare varietate de gene au fost cunoscute s apar n dou sau mai multe copii identice sau
aproape identice localizate la diferiti cromozomi , cum ar fi genele histone , genele ribozomale de proteine
, genele pentru transportatorii ATP / ADP , pentru enzimele caii glycolytic , pentru zahr i transportori de
aminoacizi , i pentru multe alte proteine . Numeroase exemple pot fi acum adugate , atunci cnd
cromozomii finalizate sunt cutati pentru similitudini la nucleotide , precum i la nivelul proteinelor .
Acestea includ familiile dispersate cu gene nrudite , dar non- identice mprtiate individual peste muli
cromozomi . Cea mai mare astfel de familie cuprinde 23 de gene PAU care specific a a-numitele
seripauperine [ Viswanathan et al. , 1994 ] , un set de proteine serin- saraci aproape identice cu funcie
necunoscut . Genele PAU locuiesc n regiunile sub- telomerice . Familii de gene cluster sunt mai pu in
frecvente , dar o mare familie de acest tip se produce pe cromozomul I unde ase gene nrudite codifica un
set de proteine membranare cu funcie necunoscut [ Viswanathan et al . , 1994 ] . Alti 10 membrii ai
aceastei familii au loc pe cinci cromozomi suplimentari , uneii sunt grupati , altii sunt mprtiati individual
, nc altii sunt situati n regiunile sub- telomerice .
5.2.5.6.1.3 Genele dublate n Clustere
Remarcabil , gene duplicate au fost , de asemenea, gsite n clustere . Exist cel pu in trei exemple de acest
gen n cromozomul II [ Feldmann i colab. , 1994 ] . Un alt caz este un grup de trei gene hexoz
transportate pe cromozomul VIII [ Johnston et al . , 1994 ] , care par a fi rezultatul unei duplicari de gen
mai recenta. Mai degrab cazuri unice ale dublri de gene sunt reprezentate de o mare familie de gene
grupate ( tandem ) de proteinele cu membrana pe cromozomul I , i un grup mare de pe cromozomul VIII
lng CUP1 . Gena de codificare, metalotioneina de cupru CUP1, este coninut ntr-o repetare de 2 kb,
care include , de asemenea, un ORF cu functie necunoscuta . Regiunea repetat a fost estimat sa se
deschida la un interval de 30 kb de tulpina S288C , care ar putea cuprinde 15 repetari , dar numrul de
repetri variaz printre tulpinile de drojdie .
5.2.5.6.1.4 Regiunile omoloage Cluster ( CHRs )

Un fenomen cu att mai surprinztor a devenit evident , atunci cnd secvenele de cromozomi completi au
fost comparate ntre ele , dezvluind c exist mari segmente cromozomiale n care genele omoloage sunt
aranjate n aceeai ordine , cu aceeai orientri transcripionale relative , pe doi sau mai multi cromozomi .
Apariia unor astfel de regiuni omoloage Cluster ( CHRs ) este acum manifestata intr-o mare parte a
genomului de drojdie i ar putea reprezenta pentru unele 30-40 % din redundana total [ Goffeau et al ,
1995; . Heumann & Mewes , 1996 ] . Pentru a analiza msura i modelul redundanei genomului de drojdie
, o structur de date puternica ,HPT , a fost dezvoltata la MIPS , permitand o compara ie toate - contra toate a blocurilor de dimensiuni fixe ale nuclotidelor rezultate care pot fi vizualizate prin o interfa grafic
care arat similariti att la nucleotide cat i la nivelul de proteine . Figura 5-18 prezint un exemplu din
aceast analiz.
Cromozomi II i IV mprtesc cel mai lung CHR , care cuprinde o pereche de regiuni pericentrice de 170
i respectiv , 120 kb , care mprtesc 18 perechi de gene omoloage . Genomul a continuat s evolueze de
cand aceast dublare veche a avut loc : a avut loc introducerea sau eliminarea de gene , elemente Ty i
intronii au fost pierdute i acumulate ntre cele dou seturi de secvene . In total, cel puin 10 CHR-uri
( comune cu cromozomi II , V , VIII , XII , XIII i ) pot fi recunoscute pe cromozomul IV .
Remarcabil , ntreagul cromozom XIV poate fi mprit n mai multe segmente care sunt gsite duplicate pe
alti cromozomi .
O examinare mai atent a celor mai mari apte CHR-uri a artat c acestea sunt compuse din "unit i "
(scurte) fiecare coninand una sau dou gene omoloage de codificare de proteine adiacente unei gena ARNt
. Acest lucru ar putea sugera c astfel de uniti au fost asamblate nainte duplicarii ntregilor blocuri. S-ar
putea chiar sa se aibe n vedere posibilitatea ca astfel de uniti sa fi contribuit la suprapuneri de-a lungul
evoluiei . Mai izbitor, este faptul ca exist un astfel de exemplu de susinere a unui astfel de regim.
Cromozomul XIV poarta doua copii ale genei tRNAIle2 n legtur cu dou gene care codific proteina
extrem de conservate , cu domiciliul n dou segmente inversate de 4.2 kb, segmente separate cu24 kb de
secvena non- repetitive . In termeni de evolutie , acesta dublare , trebuie s fi avut loc recent , deoarece
aceste segmente impart o secven identical de 99 %. Din moment ce o mare parte din al XIV-lea
cromozom , inclusiv una dintre copiile genei tRNAIle2 este duplicata pe cromozomul IX [ Philippsen et
al . , 1997 ] , am verificat dac regiunea adiacenta acestei gene ARNt pe cromozomul IX a fost
asemntoare regiunii de 4,3 kb de pe cromozomul XIV . Acest lucru nu a fost sugerat, ca aceasta copie a
genei tRNAIle2 a fost amplificata n mod independent.
Dup cum sa menionat deja , Wolfe i Shields [ 1997 ] au definit 55 de blocuri de suprapunerile gene de
cluster i au sugerat un model destul de convingtor care explic omologiile extinse vzute n drojdia de
astzi prin( allo sau auto ) - tetraploidizare ntre dou tulpini vechi de S. cerevisiae , urmate de
translocatii reciproce i stergeri de gene duplicate in proportii de 85 %. Acest punct de vedere a fost

confirmat prin compararea genomului Ashbya gossypii a genei S. cerevisiae [ Dietrich et al . , 2004 ] i a
unei analize noi a duplicarilor din S. cerevisiae [ Woodfit & Wolfe , 2005 ] .
5.2.5.6.1.5 Redundana i Organizaia Genelor
Cu toate acestea, ne putem imagina dou moduri in care se poate sa fi aprut suprapunerile. n primul
rnd , unele dintre genele duplicate ar putea reprezenta genele prelucrate care au fost inserate n genomul
relativ recent , o vedere care este n concordan cu conservarea secvenei numai n regiunile de codificare .
Cu toate acestea, toate aceste cazuri par s fi creat prin integrarea intregului AND complementar , pentru c
nici unul nu pare s fie pseudo gene , iar acest lucru este neateptat n acest model . In plus , o parte din
perechile de gene omoloage includ introni n ambele gene , ceea ce sugereaz c cel puin aceste gene nu
au fost dublate de acest mecanism .
n al doilea rnd , gruparea de gene duplicate i apariia de zone similitudine extinse ne oblig s luam n
considerare ideea c regiunile genomice ntregi au fost dublate . Mai multe dintre acestea evenimente
duplicatoare par a fi vechi [ Wolfe & Shields , 1997 ] , pentru c secvena de AND a deviat n mod clar n
afara regiunilor de codificare , n plus , astfel de grupuri par sa imparta chiar i un numr de genele ARNt,
ambele n acelai loc i orientare . Cu toate acestea , suprapunerile pot aprea n orice moment in timpul
evoluiei [ Richard i Dujon , 1998 ] .
Oricare ar fi termenele i mecanismele de suprapunere relativ , aceste evenimente urmate de mutaii care
afecteaz proprietile funcionale da o ans de a duce la mbuntirea sanatatii mediului . Pe de alt parte
,densitatea mare de gene in drojdie indic o tendin puternic de a menine un genom compact , Prin
urmare, mecanismele de compensare trebuie s existe pentru a elimina copiile genelor nefuncionale sau de
prisos .
O problem interesant strns legata de evoluie este originea modelului de organizare a genelor care s-a
manifestat pn n prezent. Am putea , de exemplu , gsi orice criteriu , fie structural sau func ional n
natura , care sa guverneze aranjamentul regional al unor gene speciale ? Cu alte cuvinte , este acolo de-a
lungul cromozomilor drojdie o " grupare ordonata " de gene sau ne-a rmas o succesiune aleatorie din
majoritatea genelor ? n prezent , nu avem multe indicii pentru a rspunde la aceste ntrebri . Cu toate
acestea , in ceea ce privete unele gene, avem indicii supra unei anumite locaii sau grup de gene , i cteva
exemple au fost deja menionate mai sus . n mai multe cazuri, gene extrem de exprimate sunt gsite
asociate cu Elementele ARS , astfel nct s-ar putea specula c replicarea i transcrierea eficient sunt
strns cuplate . n cromozomul XI , se pare c genele foarte exprimate apar n " clustere " n regiuni
preferate [ Dujon , pers . Commun . ] . In mod clar ,MAL i loci SUC , si locusul GAL reprezint exemple ,
n care genele legate funcional implicate ntr-o anumit cale metabolic sunt strns asociate ntre ele .
5.2.5.6.1.6 Variaia Sequence Printre tulpini de drojdie
ntrebarea: n ce msur tulpinile de drojdie difer n ceea ce privete coninutul lor genetic implicit a fost
deja atinsa. Am discutat o serie de caracteristici care contribuie la formarea polimorfismelor n diferite

tulpini de drojdie : ( i) numr variabil de copii de gene de la familii de gene repetate ; ( ii ) modele
individuale cauzate de prezena sau absena anumitor elemente Ty ; ( iii ) plasticitate cromozomului se
termina . n toate aceste cazuri, polimorfismul de asemenea, devine manifestat prin lungimi diferite intre
cromozomii corespunztri. n plus, excizii sau inversiuni speciale ale regiunilor genei au fost observate
pentru a da natere la polimorfisme . Ruperea cromozomului a fost gsita n drojdia de bere , care rezult n
karyotipul ce se abat de la imaginea de "normal" . Cu toate acestea, variaiile secvenei n regiunile de
codare de gene individuale par a fi rare , n msura n care putem spune in urma compara iilor secven elor
omoloage obinute din diferite tulpini .
5.2.6 Familiile Genelor Drojdiei
5.2.7 Compararea genomului de drojdie cu alti genomi
Disponibilitatea secventei completa a genomului de drojdie nu numai c a permis introspecia n
organizarea i evoluia genomul n drojdiea de bere , dar se extinde catalogul de gene noi detectate n acest
organism [ Stucka , 1992 ] . Multe dintre acestea pot avea o valoare deosebit numai pentru biologii
molecule de drojdie , dar de interes general pot fi acelea care sunt omoloage cu genele care ndeplinesc
funcii difereniate n organisme multicelulare sau care ar putea fi relevante pentru malignitate . De i rolul
acestor gene trebuie nc s fie clarificat , drojdia , n unele cazuri, a servit ca un sistem experimental util
in identificarea funciei lor . Pe de alt parte, bogia de informaii care urmeaz s fie a teptata cere n
mod clar ca noile rute sa fie explorate pentru a investiga functiile genelor noi .
5.2.7.1 Conexiunea om- drojdie
Prin compararea catalogului de secvene umane disponibile n bazele de date cu ORF-uri asupra
cromozomilor drojdiei realizate la nivelul aminoacizilor se estimeaz c peste 30 % din genele de drojdie
de bere au omologi printre genele umane . Cum era de ateptat , cele mai multe dintre genele cu funcia
cunoscut, clasificata n acest fel reprezint funcii de baz n ambele organisme. Mai multe asemnri devin
evidente , cnd EST-uri sunt incluse n analiz . Fr ndoial, protagonistele cele mai convingtoare
printre aceste omoloage sunt genele drojdiei care poart similitudini substaniale cu " genele bolii "
umane .
Studii comparative de-a lungul acestor linii au fost publicate [ Basset et al . , 1996 ] i sunt actualizate n
mod regulat .
5.2.7.2 Alte organisme model
nainte de a elibera secvena complet a genomului de drojdie , dou genomuri bacteriene complete au fost
publicate , cele de H. influencae i M. genitalium [ Fleischman et al , 1995; . . Fraser et al , 1995 ]; un alt
genomului procariot , cea Methanococcus jannaschii , a fost lansat n acelai an [ Bult et colab . , 1996 ] .
Intre timp , secvenele unor multitudine de genoame bacteriene i genoame archeal , precum si genoamele
mai multor eucariote inclusiv Schizosaccharomyces pombe , Caenorhabditis elegans , Drosophila
melanogaster , Arabidopsis thaliana , i Homo sapiens sunt disponibile .

Fr ndoial, informaiile acumulate de la aceste proiecte ofer o baz important pentru afla mai multe
despre msura n care diferite procese sunt conservate ntre organisme n diferite linii [ Miklos i Rubin ,
1996] .
O caracteristic remarcabil printre genele de specii diferite a devenit evidenta destul de devreme n timpul
diferitelor proiecte de secventiere . Cnd gene intregi au fost supuse la cutri similaritate asistate
computerizate ntre cadrele de citire deschise , s-a constatat c toate mprtesc un procent ridicat de gene
orthologous ( Figura 5-19 ) i c redundanta genetica intraspecifica a fost de aproximativ 30 % la minim ,
dar ar putea deveni la fel de mare ca 60 % , de exemplu, n C. elegans ( Figura 5-20 ) .
5.3 genomul Drojdie mitocondriale
De la descoperirea lui Ephrussi n 1949 a citoplasmaticelor ereditare a mutan ilor Petite ", cu deficit
respirator, Saccharomyces cerevisiae au fost n centrul geneticii mitocondriale. Genele mitocondriale i
structura lor mozaic intronic au fost identificate pentru prima dat n S. cerevisiae i primele gene
mitocondriale esalonate au fost de la acest organism .
Genomul mitocondrial copiat multiplu de la S. cerevisiae este caracterizat de o densitate sczut a genei i
coninut ridicat de A + T . Compoziia sa de baz este foarte eterogen , n timp ce con inutul de G+ C al
genelor este aproximativ 30 % , distanierele intergenice sunt compuse din cvasi - pure ntinderi A + T ale
mai multor sute de perechi de baza , ntrerupte de peste 150 ( G+ C) clustere bogate , variind de 10-80 pb
n lungime . Aceste trsturi explic de ce oamenii de stiinta au structurat genele i neglijat regiunea
intergenic.
Secvena complet a genomului mitocondrial de drojdie a fost determinat de Foury i colab. [1998].
Genomul ( figura 5-21 ) conine genele pentru subunitile citocrom c al oxidazei I , II i III ( cox1 , COX2
i cox3 ) , ATP subunitile sintaz 6 , 8 i 9 ( atp6 , atp8 i atp9 ) , apocytochrome b ( cytb ) , o proteina
ribozomala ( var1 ) i mai multe cadre de citire deschise legate de intronul ( ORF) . COX1 i genele cytb
conin mai multi introni , dintre care unele sunt traduse , independent sau n cadru cu exoni lor n amonte,
n plus , genomul mitocondrial conine originele replicilor ( ORI) elemente de replicare i codificare 21S i
15S ARN ribozomal , 24 tRNAs care pot recunoaste toti codonii , i ARN-ul 9S componenta de RNaz P.
Toate genele sunt transcrise din aceeai catena , cu excepia tRNAthr1 . Aproximativ 10 000 de nucleotide
sunt secvene noi , compuse n esen de + lungi T ntrerupte de mai multe grupuri de G+ C genele atp6 ,
atp9 , COX2 , cox3 i tARN apar ca mici insule G+ C - mbogite n mijloc de regiuni cluster bogat in A +
T i P C. Celelalte vrfuri de densitate mare G + C corespunde Clusterelor G+ C , l imea lor fiind n
funcie de numrul acestora situate aproape una de alta .