Secventierea

Tipuri de secventiere

Calea
enzimatica

Calea
chimica

Calea Enzimatica
( Sanger)
(1-5)
Separarea AND-ului;

Denaturarea AND-ului cu scopul obtinerii matricei

monocatenare.

Se produce hibridizarea oligo-nucleotidului cu lungimea de

17-20 unitati, complementar cu secventa interesata.

Solutia cu primeri se imparte in 4 eprubete in care

afta cele 4 tipuri de dNTP.

Unul din dNTP-uri este marcat cu izotopul radioactiv

( didezoxionucleotid ddNTP ).

se

Calea Enzimatica
( Sanger)
(5-10)

Scopul la ddNTP este sa opreasca procesul de replicare in

anumit segment .

Ca

rezultat primim 4 secvente unicale de ADN .

Se adauga formamid pentru ruperea lantului nucleotidic .

Amestecul obtinut se supune electroforezei in gel

(eng. PAGE) (Polyacrylamide Gel Electrophoresis).

Se efectueaza analiza radiografica care permite citirea lantul

nucleotidic secventitiat al segmentului de ADN .

Varianta moderna
(Sanger )
ddNTP se semneaza cu 4 tipuri diferite de
marcheri florescenti si realizeaza PCR intr-o
singura eprubeta .
Urmeaza PAGE , unde in anumite zone se
actioneaza cu laser , marcheri florescenti se
excita si detectorul analizeaza care
nucleotid in momentul dat migreaza.

Calea chimica (MaxamGilbert)

Fragmentul de ADN analizat se marceaza cu
32P fie 3* sau 5* si se imparte in 4 alicote .
Se aplica formamid si alte sb. chimice ,care
distrug lantul nucleotidic in urmatoarele
fragmente: ( C, C+T , G, G+A).
Se realizeaza PAGE si pe o imagine
radiografica se analizeaza lanturi unicale de
nucleotide.

Scopul

Determinarea

succesiunii
nucleotidelor dintr-un
anumit segment al
moleculei de ADN .

Limitele
E nevoie de primeri sintetici .
Fragmente obtinune sunt max : 100 perechi
de nucleotide cu tehnici vechi si pina la
1000 cu tehnici noi .
Cunoasterea exacta a genei pentru alegerea
primerilor
Informatia despre forma normala a genei