UNIVERSITATEA DIN BUCURETI

FACULTATEA DE BIOLOGIE

STUDII DE TAXONOMIE MOLECULAR ASUPRA

UNOR DROJDII POTENIAL PATOGENECANDIDA ALBICANS

CONDUCTOR TIINIFIC
Prof. Univ. Dr. Tesio Clin
DOCTORAND
Rusu Elena

Bucureti
2009

REZUMAT
Candida albicans este un microorganism care face parte din microbiota normal a tractului
gastrointestinal, a cavitaii orale i a zonei genitale. n anumite condiii favorizante, aceasta specie
poate deveni patogen ducnd la apariia candidozelor. Candidozele sunt cele mai intlnite infecii
cauzate de fungi, reprezentnd aproximativ jumatate din totalul infeciilor micotice. Prezena
speciei Candida albicans este cauza major a candidozelor invasive i este cel mai frecvent
patogen izolat din sngele pacienilor care au suferit tratamente postoperatorii. Candida albicans
este un fung dimorf care are capacitatea de a adopta un spectru de morfologii: blastospori,
pseudohife, tubi de germinaie i hife. Ea se poate reproduce prin nmugurire, sub form de celule
de drojdie (blastospori sau blastoconidia). Producerea de tubi germinativi rezult din conversia la
faza filamentoasa hifal, numit i forma de miceliu.
Patogenitatea tulpinilor de Candida albicans depinde de complexitatea unor factori de
virulen. Acetia includ dimorfismul celular, variabilitatea antigenic, adeziunea la esuturile
gazdei, caracterul hidrofob al suprafeei celulare precum i producerea de enzime extracelulare.
Datorit necesitii de combatere a infeciilor cauzate de fungi, studiul substanelor
antifungice este n plin dezvoltare. Cele mai importante clase de compui antifungici sunt
polienele (amfotericina B, nistatin), compuii azolici (imidazoli i triazoli), echinocandine
(caspofungin, micafungin) i 5-fluorocitozina.
n ultimii ani au fost identificai o serie de metabolii ai acidului arahidonic (prostaglandine) la
un numr de specii de drojdii (S. cerevisiae). De asemenea s-au realizat cercetri n ceea ce
privete producerea eicosanoidelor de ctre fungii patogeni. Eicosanoidele sunt compui care
rezult n urma metabolizrii acidului arahidonic. Ele cuprind patru grupuri mari: prostaglandine,
prostacicline, tromboxani i leucotriene. Drojdiile patogene C. albicans i Cryptococcus
neoformans sintetizeaz eicosanoide (atat prostaglandine cat i leucotriene). Traterea acestor specii
de drojdii cu inhibitori ai COX (ciclooxigenaza este principala enzim implicat n metabolizarea
acidului arahidonic) s-a dovedit a fi toxic in vitro, sugerand implicarea produilor metabolismului
acidului arahidonic n creterea i dezvoltarea lor. La specia C. albicans s-a constatat c atat
prostaglandinele (PG) exogene cat i cele endogene au un rol important n amplificarea procesului
de formare a tubilor germinativi.
Principalele obiective ale prezentei lucrri de doctorat au fost:
2

1. Izolarea i caracterizarea unor tulpinilor de Candida albicans prin metode clasice

(fiziologice i biochimice)
2. Caracterizarea tulpinilor izolate prin metode moleculare
3.

Testarea sensibilitii tulpinilor izolate la medicamente antifungice (ketoconazol) i

determinarea efectului pe care l au unele medicamente antiinflamatoare nesteroidiene
asupra creterii i dezvoltrii tulpinilor de Candida analizate precum i modificri la nivel
ultrastructural induse de prezena acestor medicamente.

Studiul prezent a debutat cu procesul de izolare i purificare a unor tulpini de drojdii din
diferite produse patologice cum ar fi secreie vaginal, exudat faringian, sput, secreie
traheal, sediment urinar de la persoane cu diferite afeciuni (vulvovaginit, persoane care
urmeaz un tratament imunosopresor datorit unui transplant de organe, purttori ai virusului
HIV). n urma procesului de izolare i purificare a tulpinilor de drojdii s-a constatat c a fost
obinut un set de 47 de tulpini de drojdii. n cadrul acestei teze de doctorat au fost luate n
lucru doar 8 dintre acestea (C1, C2, C3, C4, C6, C8, C10 i C11). Odat cu aceste 8 tulpini de
testat au mai fost introduse n studiu i alte tulpini martor: C. albicans ATCC 10231, C.
krusei CMGB 94, C. parapsilosis CBS 604 i Yarrowia lipolytica.
Pentru identificarea convenional a tulpinilor studiate s-au utilizat teste care au vizat
aspecte legate de morfologia coloniilor i a celulelor precum i de proprietile biochimice ale
acestor microorganisme. n urma examinrii caracterelor de cultur i a caracteristicilor
microscopice am constatat c 7 tulpini, respectiv C1, C2, C3, C4, C8, C10 i C11 prezentau
aspecte similare cu ale tulpinii de referi C. albicans ATCC 10231 iar tulpina C6 prezenta
caractere similare cu tulpina de referin C. krusei CMGB 94. Testul de filamentaie
difereniaz speciile genului Candida de alte drojdii patogene, precum i ntre speciile acestui
gen, C. albicans fiind singura de drojdie cu semnificaie clinic care are capacitatea de a
produce tubi germinativi. Rezultatele acestui test au artat c doar 7 tulpini dintre cele
studiate aveau capacitatea de a filamenta. Pentru o mai bun identificare am realizat i testul
de degradare a ureei precum i kiturile comerciale API 20C aux i CHROMagar CANDIDA.
n urma efecturii acestor teste tulpinile C1, C2, C3, C4, C8, C10 i C11 prezentau aspecte
similare cu ale tulpinii de referi C. albicans ATCC 10231 iar tulpina C6 prezenta caractere
similare cu tulpina de referin C. krusei CMGB 94.

Dup ncadrarea tulpinilor analizate prin metode convenionale acestea au fost supuse unor
metode moleculare de analiz taxonomic n vederea stabilirii cat mai riguroase a identitii
acestora. Testele moleculare au vizat: izolarea i purificarea ADN nuclear, amplificarea genei
pentru ARNr 5,8S i obinerea profilelor de restricie a ampliconului genei pentru ARNr 5,8S. n
urma analizelor electroforetice i spectrofotometrice ADN cromozomal izolat s-a observat c
extractele obinute se gsesc ntr-o concentratie optim utilizrii lor n analizele moleculare
ulterioare i nu prezentau contaminare proteic. Tehnica ARDRA este una dintre tehnicile
moleculare utilizat din ce n ce mai frecvent n identificarea microorganismelor. Experimentele
noaste au vizat compararea pattern-ului ARDRA la tulpinile luate n studiu cu tulpinile de referin
C. albicans ATCC 10231, C. krusei CMGB 94 i C. parapsilosis CBS 604. Dup obinerea
ampliconilor prin tehnica PCR acetia au fost supui digestiei (n reacii separate) cu
endonucleazele de restricie MspI, CfoI, i Dde I. Din analiza gelurilor de restricie i compararea
fragmentelor obinute au putut fi determinate pattern-urile de restricie ale celor 8 tulpini de drojdii
i dimensiunea fragmentelor de restricie.
n urma realizrii testelor de identificare prin metode convenionale i moleculare tulpinile C1,
C2, C3, C4, C8, C10 i C11 au fost ncardate n specia C. albicans iar tulpina C6 n specia C.
krusei.
Dup identificarea tulpinilor de drojdii luate n studiu i ncadrarea acestora n genul Candida
speciile albicans i krusei am realizat mai departe testarea sensibilitii la unele clase de substane
antifungice (imodazoli- ketoconazol). n cazul determinrii concentraiei minime inhibitorii,
tulpinile ncadrate n specia Candida albicans prezent valori care se nscriu n intervalul 0,160,47 g/ml. Tulpina C6 a fost considerat tulpin rezistent la ketoconazol din cauza faptului c
valoarea concentraiei minime inhibitorii este de 2 g/ml.
Avand n vedere cercetrile legate de influena eicosanoidelor asupra spciei C. albicans am
efectuat studii referitoare la efectele unor medicamente antiinflamatoare nesteroidiene (aspirina i
diclofenac de sodiu) asupra tulpilor analizate de noi. Studiile realizate au avut n vedere modul n
care influeneaz aspirina i diclofenacul dimorfismul celular al specieie C. albicans i viabilitatea
celular. Testul de filamentaie s-a realizat pe linie celular HeLa pentru c anterior s-a constatat o
cretere a sintezei PGE2 a celulelor HeLa infectate cu C. albicans. n plus, modelul linie celular
HeLa/ C. albicans este asemntor cu vulvovaginitele produse de aceast specie de drojdie cu
potenial patogen. Procesul de formare a tubilor germinativi i capacitatea de aderen la linia

celular este mult diminuat n prezena diclofenacului de sodiu. Cel mai mare efect de inhibiie a
formrii tubilor germinativi s-a nregistrat n prezena diclofenacului de sodiu 0,1mM (3,2-12,5%).
Marea majoritate a celulelor de Candida albicans nu au dezvoltat tubi germinativi i nici
pseudohife, rmnnd sub form de celule de drojdie. Prezena aspirinei 0,1 mM n mediul de
cultur a dus la prezena tubilor de germinaie cu valori cuprinse ntre 45-86% (valorile depinzand
de tulpina testat). Cea mai mare parte a celulelor de Candida albicans au dezvoltat tubi
germinativi i pseudohife n prezena aspirinei. Inhibiia procesului de filamentaie n prezena
aspirinei a fost mai sczut comparativ cu diclofenacul de sodiu. Diclofenacul de sodiu are o
specificitate mai crescut de inhibiie a izoenzimei COX-2 comparativ cu izoenzima COX-1.
Avnd n vedere efectul inhibitor mai ridicat al diclofenacului asupra procesului de formare a
tubilor de germinaie fa de aspirin, putem spune c procesul de morfogenez la specia Candida
albicans este influenat de activitatea enzimatic a izoenzimei COX-2.
Testele care au vizat viabilitatea celular a celor 8 tulpini studiate de noi s-au efectuat prin
doua metode: metoda diluiilor seriale i metoda microdiluiilor. Prin metoda diluiilor seriale
viabilitatea celular n prezena diclofenacului de sodiu 1 mM n mediul de cultur YPG lichid a
avut valori sczute cuprinse ntre 0,36 i 18,67% iar n prezena aspirinei 1 mM viabilitatea
celular a nregistrat valori ntre 4,45 i 63% (valorile depind de tulpina testat).
Determinarea viabilitii celulare n microplci a confirmat rezultatele obinute prin metoda
diluiilor seriale. Concentraia diclofenacului de sodiu 3,6 g/ml la care s-a lucrat reprezint
valoarea concentraiei plasmatice care se nregistreaz dup administrarea unei doze de 50 mg
diclofenac de sodiu. n cadrul acestui test cu excepia aspirinei tulpinile studiate de noi au fost
supuse i la tratament cu piroxicam i ketoconazol (la o concentraie egala cu valoarea MIC) n
reacii separate. Valorile densitilor optice s-au citit la 24 i respectiv 48 de ore. La toate tulpinile
analizate cea mai sczut valoarea a viabilitii celulare a fost obinut n urma tratamentului cu
diclofenac de sodiu (40-55% pentru tulpinile ncadrate n specia C. albicans i 59% pentru tulpina
ncadrat n specia C. krusei). Tratamentul cu aspirin a dus la o viabilitate celular cu valori
cuprinse ntre 60 i 80% iar prezena piroxicamului a dus la scderea viabilitii celulare pan la
52-80%.
Cercetri efectuate de diferii autori, care au avut n vedere substanele medicamentoase utilizate
n alte scopuri dect n infeciile fungice, au remarcat o serie de modificri la nivel ultrastructural
n cazul drojdiei cu potenial patogen Candida albicans. Noi am efectuat un studiu de microscopie

electronic pentru a analiza posibilele modificri ultrastructurale ale celulelor speciei C. albicans
n urma tratamentului cu diclofenac de sodiu la diferite concentraii. n literatura de specialitate nu
am gsit date referitoare la analize efectuate la nivel ultrastructural n ceea ce privete aciunea
diclofenacului de sodiu asupra speciei Candida albicans. Imaginile electronomicroscopice obinute
prin analiza celulelor de C. albicans relev o structur tipic celulelor de drojdii. Se evideniaz
mitocondrii, nucleu, corpi citoplasmatici electronodeni (probabil granule de glicogen) n interiorul
unei citoplasme electronodense. Tratamentul cu diclofenac 1 mM i 2 mM a determinat modificri
ultrastructurale a celulelor de drojdie, exprimate prin liza accentuat a coninutului citoplasmatic
care confer aspectul unei structuri rarefiate cauzat de degradarea vacuolei. Devin evidente
cutri ale plasmalemei i dezorganizri ale acesteia; se observ de asemenea numeroase granule de
glicogen, ntrunind caracteristicile unor celule senescente sau necrotice. Apar modificari la nivel
ultrastructural care const n: liza accentuat a continutului citoplasmatic, cutri ale plasmalemei i
dezorganizarea acesteia (are loc desprinderea plasmalemei), citoplasma complet dispersat n
fragmente mai mici, celulele au aspect senescent i necrotic. Aceste modificri ultrastructurale
induse de prezena dicofenacului de sodiu pot avea un efect de sensibilizare a celulei de drojdie la
tratamentul antifungic specific, n special la tulpinile care dezvolt rezisten la medicamentele cu
activitate antifungic.
Un aspect important al drojdiilor cu potenial patogen este legat de capacitatea de reglare
a tranziiilor morfologice prin valorile densitilor celulare. Dimorfismul speciei Candida albicans
este asociat cu patogenitatea acesteia. Acest aspect este legat de rolul pe care l are fiecare tip de
morfologie n timpul infeciei. Celulele de drojdie sunt implicate de obicei n infecia iniial i n
diseminarea prin sistemul vascular. Celulele hifale sunt forme invazive care penetreaz esuturile
gazdei. Tranziiile morfologice sunt nsoite de modificri ale antigenelor de suprafa ale celulei
patogene ceea ce face ca microorganismul s reueasc s evite rspunsul sistemului imunitar.
Corelarea dimorfismului cu patogenitatea arat c interferena n modificrile morfologice pot
constitui o metod pentru controlul patogenitii. Metodele de manipulare a dimorfismului speciei
C. albicans pot fora acest specie patogen oportunist s existe doar ntr-o singur form care nu
are implicaii patologice asupra gazdei purttoare.
Rezultatele obinute de noi arat c utilizarea diclofenacului de sodiu i a aspirinei reduc
viabilitatea celulelor speciilor genului Candida i inhib dezvoltarea formelor hifale la specia
Candida albicans. Prostaglandinele fungice ndeplinesc un rol important n reglarea proceselor

implicate n morfogeneza, dezvoltarea i supravieuirea celulelor speciilor genului Candida.

Inhibiia biosintezei prostaglandinelor fungice prin blocarea izoenzimelor COX are ca efect
dezvoltarea celulelor speciei Candida albicans doar sub forma de blastospori (drojdie), form care
nu prezint implicaii patologice asupra organismului uman. Utilizarea medicamentelor
antiinflamatoare nesteroidiene (diclofenac de sodiu, aspirina i piroxicam) n tratamentul infeciilor
cu specii ale genului Candida poate avea ca efect o scdere a densitii celulare, mbunatatind
astfel rezultatele tratamentului antifungic specific. Studiile ulterioare de microscopie electronic
efectuate asupra speciei C. albicans au evideniat pentru prima dat efectul diclofenacului de
sodiu la nivel ultrastructural.