FEA

TEHNICI DE ANALIZA A
PRODUSELOR ALIMENTARE

Prof.dr. Eugenia Eftimie Totu

TEHNICA ENZIMELOR CA INDICATORI AI CALITATII

ALIMENTELOR
Enzime ce degradeaza materiile prime alimentare:
- Polifenoloxidaza
- Clorofilaza
- Lipoxigenaza
- Lipaza
schimba culoarea si aroma (gust si miros)
- Esteraza
- Proteaze
-Enzime pectice
-Celulazele
modifica structura tesuturilor vegetale
-Hemicelulazele
-Tiaminaza
-Acid ascorbic oxidaza
- Oxidoreductaze

degradeaza vitamine si acizi grasi esentiali

indicatori

TEHNICA ENZIMELOR CA INDICATORI AI CALITATII

ALIMENTELOR
Enzime termostabile: peroxidaza, fosfataza alcalina
testare eficacitate a blansarii, pasteurizarii
produse f.b. blansate daca activitatea peroxidazei a ramas:
Mazare verde
6-6,3%
Fasole verde

0,7-3,2%

Conopida

2,9-8,2%

Varza de Bruxelles

7,5-11,5%

LIPOXIGENAZA
miros nedorit si culoare modificata legume verzi si porumb
Monitorizare: folosire benzi de hartie de filtru impregnate cu clorofila sol. care
se decoloreaza in prezenta de lipoxigenaza reziduala (1-2%)

POLIFENOLOXIDAZA culoarea bruna-neagra la piersici, caise, mere

TEHNICA CU BIOSENZORI
BIOSENZOR
o enzima

un anticorp
o bacterie

cuplat cu un traductor
Electrochimic

electrod

Masa
Cristale
piezoelectrice
Dispozitive de
unde acustice

Optic
optrod

Determinare compus specific

Termic
termistori

UREAZA imobilizata pe un electrod sensibil la cationi

-

electrodul sensibil raspunde la NH4+

comportament Nernstian intr-un domeniu de

concentratii ale analitului 10-4 10-1 M

folosit in laboratoare de analiza si control al calitatii

ELECTROZI ENZIMATICI
Substrat

Enzima/co-factor

Produsi

Glucoza

Glucoza oxidaza

Acid gluconic

Acid uric

Uricaza

Alantoina

Acid lactic

Lactaz oxidaza

Piruvat

Etanol

Alcool oxidaza

Acetaldehida

Esteri colecterolici

Colesterol esteraza Colestenona

+ colesterol oxidaza

Acid piruvic

Piruvat oxidaza,
Acid fosforic, FAD,
pirofosfat tiaminic,
Mg2+

Acetil posfat + CO2

Maltoza

Maltaza, Glucoza
oxidaza

Acid gluconic

SCHEME DE IMOBILIZARE ALE ENZIMELOR

ELECTROD
Enzima

Brate spatiale
(distantiere)

Enzima legata covalent de electrod

Membrana poroasa

SCHEME DE IMOBILIZARE ALE ENZIMELOR

Membrana poroasa

Enzima imobilizata
on beads

ELECTROD

Imobilizare covalenta sau

blocare (ENTRAPMENT)
de ex. Intr-un polimer
conductiv precum
polianilina sau polipirolul

CINETICA REACTIILOR ENZIMATICE

1. RASPUNSUL BIOSENZORULUI

EIS/Biosenzorul raspunde la specia de interes conform

ecuatiei lui NERNST
RT
0
Ei = Ei +
ln ai
zi F
Potentialul celulei = suma potentialelor din sistem

Ei = E + ELJ + EM
0
i

Toate potentialele mentionate depind de concentratia

analitului, astfel ca:
E = E 0 + 59,16 lg ai

ECUATIA NERNST
Emas = Const. S log [ax ]
unde: S = (RT / zx F) ln 10
Const. = contine termeni precum potentialul jonctiunii
lichide si potentialul electrodului intern de referinta.
T = 298,15 K ; panta ideala: 59,16 mV/ p[I] + ; 29.58mV / p[I]++
E = (RT/zF) ln(a/a) - ec. Nernst pentru dif. de potential transmembranar
- potential de membrana:
EM = r - s = EB(r) ED + EB(s)
EB(r) ; EB(s)

- potentiale Donnan

ED potential de difuzie
aprox. Henderson pentru potentialul jonctiunii lichide:

E D = s r

ECUATIA NICOLSKY EISENMANN

E = E0 + S log [ai + Kij aj
S = (RT / ziF) ln 10

zi/zj

]
Kij coeficient de selectivitate

Determinarea Kij
1. metoda solutiilor separate:
Ei = E0 + S log (a
(ai)
zi/zj)
Ej = E0 + S log (K
(Kij ajzi/

(j absent)
(i absent)

zi/zj ) 10 (E - E ) / S
Kij = (a
(ai/ajzi/
J I

2. metoda solutiilor mixte - determinare grafica

LIMITA DE DETECTIE
Definitia IUPAC
activitatea (concentratia) ionului primar,, i, la care potentialul deviaza
cu 18mV/zi de la extrapolarea portiunii liniare a graficului de
etalonare, unde zi este sarcina ionului de analizat.

LD conditionata de:
Proprietatile electrodului
- solubilitatea materialului membranei in solutia de electrolit
Conditiile de determinare experimentala
- temperatura de lucru
- prezenta speciilor interferente

TIMPUL DE RASPUNS
Definitia IUPAC
Timpul scurs intre momentul in care un electrod ion-selectiv si un elecrod de
referinta (o celula electrochimica) sunt pusi in contact cu o solutie de electrolit
(sau la care este schimbata activitatea ionului primar in solutie) si primul
moment la care valoarea pantei potential / timp (E/
E/t) devine egal cu o
valoare limita selectata pe baza conditiilor experimentale si a preciziei
necesare.

In cazul determinarilor cu o precizie ridicata, valoarea limita este de 0,6 mV/min.

METODE

DE

CALIBRARE A EIS / BIOSENZORILOR

I. Metode Simple de Imersare

A. Metoda Clasica
Calibrarile preliminare ale EIS se efectueaza in solutii avand 10-610-1 mol/L.
Pentru solutii cu tarie ionica ridicata nu este necesara agitarea.
Este rapida elimina un electrod nefunctional.
Se aplica in special pentru electrozii cu un timp de raspuns lent.

B. Tehnica Adaosului Standard

Elimina dificultatile ce apar ca urmare a diferentelor intre matricea probei si

cea a solutiei etalon.
Un volum cunoscut de proba se adauga unui standard, sau invers,
inregistrandu-se modificarea corespunzatoare a diferentei de potential.
Aplicarea sa implica cunoasterea raspunsului Nernstian al electrodului.

II. Metode de Curgere

Esential este ca viteza de curgere sa fie reproductibila

pompa peristaltica

Membrana in contact
permanent cu solutia

La supraf.membranei
se formeaza un starat
de difuzie = timp de
raspuns rapid

Avantaje

E. Referinta plasat in flux dupa EIS,

orice compus eliminat din E.Ref. nu
interfera cu EIS

Realizare simpla a
analizelor
automatizate
(on-line)

Diametrul
interior
tub
Lungimea
tubulaturii

Vechimea
tubulaturii

Timp de
raspuns

A. Metoda curgere continua conventionala

Utilizata in analizaoarele chimice folosind un flux de aer purtator.
B. Tehnica de curgere nesegmentata (Flow Injection Analysis FIA)
Se introduce un volum exact intr-un flux purtator nesegmentat in
sistem nu sunt bule de aer, fiind astfel posibila o viteza ridicata de
analiza (100 300 h-1) si un timp de raspuns imbunatatit.

Flux de curgere
pulsant

Existenta bulelor de
aer

Necesara eliminarea
bulelor de aer din solutie

METODA DILUTIEI LA VOLUM CONSTANT (CVD)

1976- Horvai si colab.
Metoda des utilizata
Metoda simpla, in care se determina concentratia, c, a unui ion, i,
a carui solutie curge prin celula CVD in timpul, t, intr-un volum constant,
sub agitare

c = c0 e

W t
Vr

unde :
c0 = concentratia initiala a solutiei
W = viteza de curgere a solutiei de diluare
t = timpul de la inceperea dilutiei
Vr = volumul vasului de dilutie

TEHNICA CU BIOSENZORI
Electrozi enzimatici
Imunosenzori

Determinare de contaminanti

Termistori enzimatici

Carbohidrati

Fluorina

Peptide

Penicilina

Aminoacizi
Parametri ai prospetimii pestelui

Vitamina C
Etanolul
Lactatul

Electrodul XANTINOXIDAZA
det. IMP inozin monofosfat
rap. Xantina/hipoxantina
Amine biogene
Bisenzor glutamat-oxidaza
L-glutamat
L-lactat

TEHNICI IMUNOCHIMICE
- Se bazeaza pe reactia dintre un anticorp si un antigen specific
- Kit-uri pentru decelarea micotoxinelor, pesticidelor, subst. toxice din
alimente (solanina), proteine (gluten, alergeni, enterotoxine
stafilococice sau ale patogenilor Salmonella si Listeria)
autentificare de specie
- ANTICORPI Monoclonali = MAb
decelare falsificare
modificare proteine la procesare
termica
K-cazeina din lapte se foloseste ca antigen pt reactia cu anticorpul MAb
in analiza prod.lactate si det proteinelor din soia in lapte.
Anticorpii MAb indirect in testele ELISA (Enzyme Linked
Immunosorbent Assays)
- pentru identificarea ovalbuminei denaturate termic;
- decelarea alftoxinei B1 in porumb si arahide prajite

Imagini ale unor micro-mecanisme acoperite cu compusi activi

www.nanowerk.com

TEHNICI BAZATE PE ADN

In functie de mecanismul implicat:
- Tehnici bazate pe PCR = Polymerase Chain Reaction
- Tehnici bazate pe secventierea ADN-ului
- Tehnici bazate pe hibridizarea ADN-ului

- ETAPE
- Incubarea probei cu hexadeciltrimetilbromura de amoniu
(DTAB) + extractie cu cloroform + precipitare ADN in izopropanol
- tratare cu proteinaza K + dodecil sulfat amoniu (SDS) + rasina
cu silice pentru purificarea ADN-ului eliberat.

TEHNICI BAZATE PE ADN METODA PCR CONEVTIONALA

A
B

Secventa cunoscuta de ADN

este amplificata cu 2 initiatori:
- Unul actioneaza la capatul
5al secventei A, care este
apoi extins cu Taq polimeraza
cu capatul 3 al initatorului

- Al 2-lea initiator actioneaza

la capatul 3 al secventei
lantului pe care il extinde cu
capatul 5 al initiatorului

http://www.universe-review.ca/DNAsequencing

Metoda PCR se aplica pt conc.

mai mari de 102CFU/g de specii:
- Brochothrix din probe de carne
- Patogene:
-

Shigella sonei
S. flexneri
S. hoydii
S. dysenteriae
Salmonella paratyphi
Aeromonas Hydrophila
Staphylococcus aureus
Clostridium perfringens

Permite detectia falsificarii si

autentificarea materiilor prime si a
produselor.
www.serc.carleton.edu

Avantaje: simplitate, specificitate,

sensibilitate, timp relativ scurt de
procesare, cost scazut.

Se folosesc:
- secvente de ADN de min.200 bp in
lungime pt a fi detectati pe gel de
agaroza;
-1,5-2,0 cicluri logaritmice.

Tehnici derivate din PCR:

-Tehnica SCAR = Simple Characterized Amplified Region
- Tehnica ARMS = Amplification Refractory Mutation System
- Tehnica SSR = Simple Sequence Repet
- Tehnica DMAD = Direct Amplification of Minisatellite Region DNA
-Tehnica DAF = DNA-Amplification Finger Printing
- Tehnica ISSR = Inter Simple Sequence Repeat
- Tehnica AP-PCR = Arbitrary Prime PCR
- Tehnica QC-PCR = Quantitative Competitive - PCR

www. oceanexplorer.noaa.gov

TEHNICI BAZATE PE ADN

Metoda PCR in timp real (REAL TIME PCR)
Detectarea tintei PCR-amplificare ADN ampliconi
Se aplica mai multe cicluri de amplificare (5-6 cicluri)
Se foloseste o secventa scurta de ADN (50-60 bp)
Se foloseste 10-20 L proba
Se masoara un semnal de fluorescenta indus de radiatii UV, a carui
intensitate este proportionala cu cant. de ADN obtinuta
Se foloseste pentru:

Det. specii de cereale

Diferentierea graului dur de cel comun
Det. falsificarii cerealelor
Det. de alergeni in condimente

www. genengnews.com

ALTE TEHNICI BAZATE PE ADN

-

Tehnica ADN-RAPD = Random Amplified Polymorphic DNA

- Initiatorul are 10 nucleotide pentru a recunoaste secventa tinta
- se foloseste la identificarea clonelor identice din bacterii patogene implicate in
toxiinfectii alimentare

- Metoda AFLP = Amplified Fragment Lenght Polymorphism

- implica restrictia initiala a ADN-ului genomic + lergarea unor adaptori
complementari in locurile restrictionate + amplificarea selectiva a PCR
- ampliconii finali sunt denaturati termic si separati prin electroforeza pe
gel folosind gel de poliacrilamida 10% denaturat cu uree si formamida.

-Tehnica RFL-PCR = Restriction Fragment Polymorphism

- permite diferentierea speciilor prin analiza produselor de scindare a ADN-ului
cu o nucleaza de restrictie (endonucleaza)
- ampliconii sunt scindati si fragmentele sunt
supuse electroforezei pe gel de agaroza
cu vizualizarea benzilor de ADN.

-Tehnica PCR-SSCP = Single Strand Polymorphism PCR

- implica amplificarea PCR a unei secvente dintr-o gena (mitocondriala) +
denaturare + electroforeza unui singur lant ssADN, pe gel de poliacrilamida
nedenaturat + vizualizarea unui nr. limitat de benzi ADN de pe gel.
www.scielo.br

METODE DE AUTENTIFICARE - EVALUARE

Analiza microscopica
- se foloseste in cazul mierii de albine:
- se det. granulele de polen si amidon
- decelarea falsificarii mierii cu diferite probe de origine vegetala
Analiza microscopica electronica cu scanare (SEM)
- evidentiaza structura diferitelor tesuturi utilizate la falsificarea
produselor alimentare
Metoda HPLC aplicata pentru determinari de:
-Flavonoide si acizi organici din diferite sucuri de fructe
- Pigmenti fenolici din ceai, fructe si sucuri de fructe
- Izomerii pirolinei si aminoacizii din vin
- Pigmentii antocianici din vin, sucuri de fructe, gemuri
- Analiza constituentilor produselor alimentare
- Decelarea falsurilor din produsele alimentare

www.foodsafetynews.com