Semnificatia si implicatiile apoptozei in studiul citogenetic al cancerului colorectal

Apoptoza, in prezent cunoscuta ca moarte celulara programata, este procesul prin care celulele, in mod sistematic isi inactiveaza, dezasambleaza si degradeaza propriile componente structurale si functionale pentru desavarsirea propriului lor deces. Fiind considerata prezenta spontana in tumori, poate fi reglata de produsii unor anumite protooncogene sau a unor gene tumoral supresoare ca p53 si bcl-2. Prin indepartarea celulelor care poseda alterari genetice, apoptoza este metoda eficienta de prevenire a transformarii maligne. Apoptoza anormala poate promova dezvoltarea cancerului atat prin permiterea acumularii de celule in diviziune, cat si prin blocarea indepartarii variantelor genetice cu potential malign ridicat. 1. Introducere Moartea celulara fiziologica este esentiala pentru dezvoltarea si functionarea sistemelor multicelulare. Celulele non-necesare, deteriorate si potential nocive trebuie inlaturate din microclimatul celular sanatos, pentru asigurarea homeostaziei structurale si functionale a tesutului. Exemple ale mortii celulare fiziologice au fost observate in aproape toate tipurile celulare pe parcursul dezvoltarii si maturarii. Pe parcursul dezvoltarii embrionare, modelarea celulara specifica si organogeneza sunt asigurate de un program spatiotemporal, definit genetic, de proliferare si moarte celulara. In tesuturile adulte, moartea celulara fiziologica apare in interiorul tesuturilor ciclic stimulate sau dependente hormonal, cum sunt endometrul, prostata si glanda mamara, dar si in turnoverul stady-state al multor alte tesuturi. Moartea selectiva a celulelor este fundamentala pentru dezvoltarea, reglarea si functionarea sistemului imun, incluzand eliminarea timocitelor autoreactive, selectia negativa a limfocitelor T si B si distrugerea celulelor realizata de limfocitele T citotoxice. Celulele care au suferit deteriorari genetice ireparabile sunt, de asemenea, detectate de procese endogene, probabil limitandu-se astfel diseminarea leziunilor genetice potential nocive. Limfocitele, care invadeaza tesuturi privilegiate din punct de vedere imunologic, sunt rapid eliminate, astfel protejandu-se regiunile sensibile de o deteriorare produsa printr-un raspuns inflamator (1). Conceptul unificator al tuturor acestor circumstante diverse este acela ca procesul de moarte celulara este mediat de un set comun de evenimente si se desfasoara pe cai biochimice similare, conducand la o dispunere stereotipa a modificarilor structurale. Aceasta moarte celulara este numita apoptoza. Apoptoza este un proces innascut, conservat din punct de vedere evolutiv, prin care celulele, in mod sistematic, isi inactiveaza, dezasambleaza si degradeaza propriile componente structurale si functionale pentru desavarsirea propriului lor deces. Acest proces poate fi activat intracelular printr-un program de dezvoltare definit fie genetic, fie extracelular, prin intermediul proteinelor endogene, citokinelor si hormonilor, ca si de componente xenobiotice, radiatii, stresul oxidativ si hipoxia. Abilitatea unei celule de a intra in apoptoza, ca raspuns la un semnal de moarte, depinde de statusul ei proliferativ, pozitia ciclului celular si de expresia controlata a genelor care promoveaza, inhiba si afecteaza programul de moarte. Reglarea stricta a acestor parametri modulatori ai mortii trebuie mentinuta, pentru asigurarea contextului fiziologic propice aparitiei apoptozei. Disfunctiile, care apar in oricare dintre punctele caii de moarte programata, pot duce la un proces apoptotic eronat, determinand astfel exprimarea unor conditii fiziopatologice. Importanta apoptozei deriva din natura ei activa si din potentialul ei de a controla sistemele biologice.

Moartea celulara a fost considerata la inceput un proces haotic. Totusi, asa cum o celula isi poate echilibra metabolismul, penduland intre anabolic si catabolic, tot astfel un organism multicelular trebuie sa echilibreze ratele de proliferare celulara si de moarte celulara pentru mentinerea homeostaziei. De asemenea, un organism trebuie sa indeparteze celulele senescente, deteriorate sau anormale, care ar putea sa interfere cu buna functionare a unui organ sau s-ar putea transforma malign. Ca urmare, alterarile survenite in domeniul reglarii mortii celulare ar putea contribui la patogeneza bolilor degenerative si neoplazice. Desi moartea celulara fiziologica se cunoaste de decenii, interesul pentru aceasta problema a fost reactualizat in 1972, cand Kerr, Wyllie si Currie au descris in detaliu modificarile ultrastructurale, caracteristice celulelor muribunde, si au propus termenul de apoptoza pentru descrierea acestui proces. Ei au evidentiat faptul ca moartea celulara fiziologica nu este un proces randomic, ci are trasaturi morfologice distincte. De obicei, apoptoza afecteaza celule individuale si, odata initiata, se propaga rapid. Ingestia celulelor apoptotice de catre macrofage nu induce eliberarea enzimelor proteolitice sau a oxigenului singlet care este toxic. Fragmentarea celulelor are loc fara scurgerea continutului celular in sptiul extracelular, iar indepartarea celulelor apoptotice nu provoaca raspuns inflamator. Absenta inflamatiei reprezinta o trasatura cruciala, permitanduse astfel moartea celulei fara deteriorarea celulelor adiacente. 2. Genetica apoptozei Cu toate numeroasele progrese, care s-au realizat in cercetarea stiintifica, este foarte dificila identificarea moleculelor responsabile de apoptoza cu ajutorul demersurilor biochimice si moleculare in sistemele mamaliene. Din fericire, nematodul Caenorhabditis elegans reprezinta un model particular de studiu al reglarii genetice a apoptozei extrem de util. Pe parcursul dezvoltarii embrionare si larvare a nematodului, sunt eliminate 131 din 1 090 celule, in cadrul unui program foarte bine caracterizat, invariant din punct de vedere spatiotemporal. Astfel, s-a identificat un numar mare de mutatii, care afecteaza stadii specifice ale procesului apoptotic, iar genele au fost ordonate intr-o schema genetica . Aceste gene sunt implicate in decizia de a intra pe calea mortii, in executia acestei cai, in inglobarea celulelor muribunde si in degradarea resturilor celulare din cadrul inglobarii. Doua dintre aceste gene, ced-3 si ced-4 sunt necesare pentru toate formele de apoptoza din cadrul dezvoltarii si se considera a codifica efectorii finali ai caii apoptotice. O alta gena reglatoare cheie, ced-9, este necesara pentru supresia apoptozei in celulele programate sa supravietuiasca. Aceasta gena codifica o proteina omologa cu familia Bcl-2 din sistemul uman. Mai mult decat atat, expresia lui Bcl-2 poate inhiba apoptoza in nematode si poate chiar substitui partial pierderea functiei lui Ced-9, ceea ce indica faptul ca cel putin cateva componente ale caii apoptotice sunt conservate in evolutie. Mutatiile survenite in 6 gene afecteaza inglobarea corpilor apoptotici de catre celulele vecine non-profesionale. Proteinele intracelulare Ced-2, Ced-5 si Ced-10 semnalizeaza intr-o maniera comparabila cu omologii lor mamalieni Crkll, DOCK 180 si Rac, mediind reorganizarea si extensia citoscheletului celulei inglobatoare. Ced-7, omolog cu ABC-1se activeaza atat in celula muribunda cat si in cea inglobatoare, posibil in transportul transmembranar de lipide. Ced-1 este analog receptorilor scavenger din sistemul mamalian; Ced-7 si Ced-1 promoveaza, probabil, inglobarea interactionand cu proteina adaptoare de semnalizare Ced-6.

3. Mutageneza colorectala si raspunsul celular apoptotic Transformarea carcinogenetica a adenoamelor polipozice colorectale debuteaza cu mutatii in nucleii celulelor epiteliale colorectale. Dieta umana contine un numar mare de mutagene si de substante, care se matabolizeaza in mutagene. Cea mai mare parte a acestor mutagene sunt toxice chimice sintetizate de plante, ca raspuns imediat la agresiunea produsa de bacterii, fungi, insecte sau alte microorganisme. Prezenta acestor componente toxice este atat de evidenta, incat mucoasa colonica poseda mecanisme detoxificante protectoare si eficiente. Metabolizarea precarcinogenilor este foarte complexa si poate implica urmatoarele evenimente: absorbtia intestinala, metabolizarea hepatica, secretia biliara, oxidarea colonica. In studiul transformarii carcinogenetice a polipilor colorectali s-a folosit experimental dimetilhidrazina (DMH). Dupa absorbtia intestinala la nivelul colonului, acest precarcinogen este oxidat si hidrolizat la nivelul ficatului, generand un compus mai putin stabil: metilazoximetanol (MAM). Raspunsul final al cascadei de evenimente biochimice il reprezinta alterarea procesului de metilare al ADN. Dupa expunerea la acest agent alkilant carcinogenetic, gazda tinde sa repare ADN alterat sau, in ultima instanta, celulele raspund la lezarea ADN, prin intrarea in programul de moarte celulara programata(apoptoza). Dwan, Meier si Blackman au evidentiat diferente genetice in inductia cancerului colorectal sub influenta DMH la animalele dre experienta; acesti cercetatori au observat ca nu toate speciile de sobolani dezvolta tumori intestinale ca raspuns la DMH; speciile rezistente la carcinogeneza colorectala dezvolta leucemie ca raspuns la acest procarcinogen. Dupa administrarea de DMH, epiteliul colonic dezvolta tumori, chiar daca este transplantat pe intestin subtire, situatie care nu este valabila pentru dezvoltarea adenomatoasa pe insule de intestin subtire transplantate pe colon. Administrarea unei singure doze de carcinogen alkilant (DMH) este suficienta pentru a produce la animalul de experienta adenom si carcinom colorectal dupa o perioada de latenta de cca 4 luni. Mutatiile caracteristice G-A, detectate in genele K-ras, in proportie de 66%, debuteaza in a 15-a saptamana de tratament cu carcinogen, procesul final de tumorigeneza fiind incheiat dupa alte 24 de saptamani. Mutatiile G-A produse de DMH la animalele de experienta cuprind intregul genom. Cand o mutatie se soldeaza cu inactivarea unei gene vitale pentru supravietuirea celulara, celula este imediat eliminata. Inactivarea mutationala a zonei reglatoare a genei K-ras la codonii 12,13 si 61 apare doar intr-o singura celula a colonului dupa expunerea carcinogenetica, deoarece aceste celule vor expanda clonal, vor invada celulele invecinate si vor crea un numar mare de progeni. Acest model experimental probeaza natura secventiala a leziunilor genetice si demonstreaza ca mutatiile initiale si specifice carcinogenezei colorectale umane sunt determinate de carcinogeni chimici.

4. Semnificatia apoptozei in cancer si in terapia cancerului

Dereglarea procesului apoptotic, care are ca rezultat o moarte celulara excesiva, insuficienta sau prematura, constituie fundamentul initierii si progresiei multor maladii umane. Se presupune ca o exacerbare a apoptozei celulelor neuronale ar putea contribui la progresia si severitatea mai multor dereglari neurodegenerative, care includ maladia Alzheimer, scleroza laterala amiotrofica, atrofia musculara spinala, maladia Parkinson, maladiile neuromotorii si chiar atacul cerebral. Apoptoza excesiva la nivelul celulelor T circulante este corelata cu sindromul imunodeficientei severe si SIDA, in vreme ce manifestarea insuficienta a acestui proces constituie mecanismul de declansare al anumitor boli autoimune si limfoproliferative. Inhibarea procesului apoptotic prin pierderea mutatiilor functionale in genele activatoare ale mortii sau castigarea unor mutatii functionale in genele supresoare de moarte este incriminata in transformarea neoplazica. Virusurile si au dezvoltat mecanisme, care manipuleaza calea apoptotica, pentru a-si asigura perpetuarea propriei supravietuiri, inhiband apoptoza celulelor infectate, pentru a permite replicarea virala, si activand apoptoza mecanismelor celulare de aparare ale gazdei. Tinand cont de aceste realitati, manipularea cailor apoptotice prin interventie farmacologica sau genetica promite noi oportunitati terapeutice pentru o serie de maladii. Circumstantele aparitiei apoptozei se impart in 2 mari categorii. Apoptoza apare in tesuturile normale, unde raspunde de deletia celulelor, si este de asemenea observata in contexte patologice specifice. Cel putin intr-o parte din situatiile din categoria a doua, poate fi sustinut teoretic faptul ca vine in sprijinul unei semnificatii biologice. Supravietuirea celulelor in curs de distrugere ar putea fi nociva gazdei. In contrast, necroza este totdeauna patologica, fiind consecinta lezarii majore a celulei si nu ii poate fi atribuita nici o functie homeostatica. Celulele raspund la leziune, daca pot, prin apoptoza. Daca un medicament induce apoptoza intr-un limfocit, de obicei furnizeaza mai multe date despre celula decat despre medicament, deci astfel de experimente trebuie interpretate cu precautie. Implicatiile acestui proces in terapie sunt evidente: un medicament care inhiba apoptoza poate fi folosit in prevenirea pierderii celulei, acordand timp altor forme de terapie sa inlature infectia. In cancer, dimpotriva, va avea valoare terapeutica o cale de stimulare a apoptozei in celulele maligne. Modul de obtinere al acestui efect cu specificitate adecvata reprezinta o provocare, la fel ca in cazul agentilor chemoterapeutici uzuali. Desigur, celulele T citotoxice, una din cele mai stralucite inventii ale naturii, stiu cum sa ucida specific. O alta potentiala terapie este reprezentata de anticorpii declansatori ai apoptozei, dar foarte importante sunt si imunotoxinele, care ascund liganzi, care induc apoptoza. Concomitent cu explorarea potentialului terapeutic al apoptozei este necesara descoperirea mecanismelor si moleculelor implicate. Evolutiei i-au trebuit milioane de ani pentru dezvoltarea unui sistem desavarsit, capabil sa elimine celulele nedorite; noua ne revine dificila sarcina de a descoperi cum sa inducem organismului comutarea procesului pe on sau off, la comanda. Legaturile intercelulare caracteristice formelor superioare de viata nu ar fi posibile, fara un mecanism de indepartare individuala a celulelor, care nu mai sunt necesare sau care nu mai functioneaza normal. Reglarea defectiva a mortii celulare programate ar putea juca un rol in etiologia cancerului, SIDA, bolilor autoimune si bolilor degenerative ale sistemului nervos central. Manipularea farmacologica a apoptozei ofera noi posibilitati de profilaxie si tratament acestor maladii.

TRANSFORMAREA MALIGNA Deoarece o celula trebuie sa sufere o serie de modificari moleculare pentru a atinge fenotipul malign si deoarece aceste schimbari sunt deseori induse de agenti sau tratamente, care - in timp - altereaza celula, orice element care activeaza supravietuirea celulelor deteriorate promoveaza carcinogeneza. In majoritatea cazurilor, celulele canceroase sunt diferite de celulele normale din punct de vedere morfologic. Variatiile legate de marimea si forma celulelor si a nucleilor lor corespund pleomorfismului celulelor tumorale. Nucleul este deseori marit, cu densitati inegale (hiper- sau hipocromatism), o membrana nucleara neregulata, angulara, nucleoli proeminenti, singulari sau multipli. Exista o crestere a raportului nucleo-citoplasmatic. Se observa si celule bizare, cu nuclei polilobati sau multipli si celule gigantice. Aceste modificari reprezinta semnele citologice ale malignitatii. Exista si exceptii, in anumite varietati de cancer, celulele tumorale avand un aspect morfologic foarte apropiat de celulele normale; ca urmare, diagnosticul de malignitate este dificil de hotarat si, in astfel de situatii, se apeleaza la alte criterii, in particular arhitecturale. Majoritatea cancerelor se caracterizeaza printr-un numar mare de celule in diviziune. Aceste mitoze sunt uneori anormale.Indicele mitotic, definit prin numarul de mitoze pe unitatea de microscop are o valoare data, contribuind la evaluarea prognostica a tumorilor. In realitate, cancerele nu poseda un indice mitotic ridicat, ca cel care se poate observa in patologia nontumorala. Totusi, in anumite tipuri de cancer, diagnosticul de malignitate se bazeaza pe indicele mitotic. APOPTOZA SI CANCERUL Oncologii au fost traditional preocupati in principal de proliferarea celulara, cu toate acestea, in ultimul timp, atentia lor se indreapta, cu un interes din ce in ce mai mare, spre studiul apoptozei. Observatia legata de aparitia apoptozei in tumori nu este recenta. Cu peste 20 de ani in urma, s-a sugerat ca apoptoza este responsabila de o mare parte din pierderile celulare, care apar in tumori, observatii obtinute in studiile cinetice, si nu mai este o noutate extinderea ei si activarea in tumori, ca urmare a aplicarii bine cunoscutelor metode terapeutice: iradierea, chemoterapia citotoxica, ablatia hormonala. Totusi, in ultimii ani, extinderea cunostintelor despre controlul apoptozei la nivel molecular a dus la largirea semnificatiei ei potential oncologice, depasind simpla alimentare a unei explicatii mecaniciste pentru deletia celulelor tumorale. In particular, descoperirea faptului ca apoptoza poate fi reglata de produsii unor anumite protooncogene si de gena supresor tumoral p53, a deschis noi drumuri viitoarelor cercetari. Atunci cand modificarile de la nivelul ADN provoaca acumularea anormala de celule se produce transformarea maligna. Ratele comparative, ale mortii celulare si ale diviziunii celulare, determina viteza de crestere a cancerului. Anumite celule canceroase se divid mult mai incet decat celulele normale, dar cancerul continua sa se extinda, datorita prelungirii timpului de viata al celulei. Multi carcinogeni provoaca rupturi ADN sau interfera cu enzimele necesare p entru replicarea corecta a ADN. Celula poate raspunde la acest tip de alterare in mai multe feluri:

poate intarzia diviziunea celulara pana la repararea leziunii, poate suferi apoptoza sau poate progresa fara intrerupere in ciclul de crestere celulara.. Apoptoza este o metoda eficienta de prevenire a transformarii maligne, deoarece ea indeparteaza celulele care poseda alterari genetice. Apoptoza anormala poate promova dezvoltarea cancerului, atat prin permiterea acumularii de celule in diviziune, cat si prin blocarea indepartarii variantelor genetice cu potential malign ridicat. Inca nu se cunosc factorii, care determina celula sa urmeze una din cele 3 cai: intrarea in apoptoza dupa leziune, repararea deteriorarii sau continuarea ciclului celular. Paradoxal, anumite gene care stimuleaza diviziunea celulara, cum este c-myc, participa la deciderea caii de urmat. Concentratiile de ARN si proteina pentru c-myc cresc timpuriu in apoptoza si supraexprimarea acestor oncogene induce apoptoza in fibroblaste. Oncogena bcl-2 ar putea fi supresorul general al mortii celulare pentru genele care regleaza direct apoptoza. Toate celulele hematopoietice si limfoide, multe celule epiteliale si neuroni contin gena bcl-2, intalnita in special in membrana mitocondriala, nucleu si reticul endoplasmic. Limfoamele foliculare de celule B poseda o concentratie crescuta de proteina Bcl-2, datorita translocatiei it(14:18)s, care plaseaza gena bcl-2 sub controlul unui promotor puternic, cel al genei care codifica pentru lantul greu al imunoglobulinei. Proteinele virusului Epstein-Barr cresc nivelul expresiei genei bcl-2 in celulele limfomului Burkitt. Comparativ cu limfocitele B normale, acelea care exprima bcl-2 supravietuiesc mai mult in cultura, dupa privarea de factori de crestere si sunt rezistente atat la radiatii ionizante, cat si la glucocorticoizi. De asemenea, concentratiile crescute de bcl-2 protejeaza celulele de apoptoza indusa de catre c-myc. Soarecii transgenici, care au fost igienizati, pentru a supraproduce proteina bcl-2, in limfocitele B, deseori dezvolta limfoame imunoblastice cu celule mari si difuze. La jumatate din aceste tumori cu grad avansat de dezvoltare se remarca translocatia genei c-myc. Produsul proteic al genei supresoare tumorale p53 poate intarzia progresia ciclului celular, inaintea initierii sintezei replicative de ADN. Multe cancere umane poseda mutatii sau deletii la nivelul genei p53. Proteinele codificate de virusurile oncogene pot de asemenea lega si inactiva proteina p53. Functionarea defectuoasa a p53 poate promova dezvoltarea cancerului, prin permiterea duplicarii ADN in celulele cu mutatii secundare, inainte de o reparare completa. Totusi, p53 este doar un inhibitor al diviziunii celulare, in alte situatii se comporta ca o apoptogena directa (o gena care provoaca apoptoza). Superproducerea proteinei p53 normale, in linia celulara leucemica mieloida, induce rapid moartea cel lara u prin apoptoza (11) . In multe tipuri celulare, proliferarea necesita cel putin 2 stimuli externi, uneori numiti semnale de competenta si progresie. Semnalele de competenta declanseaza evenimentele metabolice comune atat replicarii, cat si apoptozei; semnalul de progresie abate celula spre replicare, altfel survine apoptoza Apoptoza poate fi considerata o cale alternativa, care distruge celulele incapabile sa strabata punctul de vama inainte de replicarea ADN si se petrece in celulele competente activate, cand un semnal de progresie este absent sau anormal sau cand o celula nu-si repara o leziune intr-o perioada critica.

Majoritatea medicamentelor anticancerigene: inhibitori ai topoizomerazei, agenti alchilanti, antimetaboliti si hormoni antagonisti, produc apoptoza in celulele sensibile. In urma acestor observatii, este subinteles faptul ca eficienta lor nu depinde totdeauna doar de interactia cu o tinta biochimic specifica; un efect asupra evenimentelor metabolice conducand la apoptoza poate, de asemenea, influenta raspunsul la chemoterapie. S-a descoperit faptul ca, in diferite cancere umane, concentratia endonucleazelor calciu- dependente, care degradeaza ADN pe parcursul apoptozei, variaza enorm. Tendinta unei celule cancerigene de a suferi apoptoza poate fi importanta, in special pentru terapia tumorilor maligne cu o rata scazuta de crestere, care sunt de obicei rezistente la agenti citostatici. APARITIA SPONTANA A APOPTOZEI IN TUMORI Apoptoza poate fi gasita in toate tumorile virtuale, netratate. Desi s-au efectuat putine studii cantitative precise , evaluarile histologice indica faptul ca extinderea apoptozei in anumite tumori umane se apropie de ceea ce s-a observat in tesuturile cu involutie rapida evidentiind semnificatia ei cinetica, uneori considerabila. Factorii responsabili pentru aparitia spontana a apoptozei in tumori sunt, indubitabil, diversi. Apoptoza, deseori este proeminenta mai ales la locusul de confluenta cu necroza, unde se presupune ca ischemia moderata este implicata in initierea ei, aceasta fiind o cauza cunoscuta a activarii apoptozei in tesuturile non-neoplazice. S-a aratat ca, TNFa (factorul de necroza tumoral) induce apoptoza in liniile de celule tumorale in vitro, astfel, o serie de fenomene apoptotice observate in vivo in tumori ar putea fi atribuite eliberarii acestei citokine de catre macrofagele infiltrante. In alte cazuri, apoptoza poate fi rezultatul atacului tumorii de catre limfocitele T citotoxice. Totusi, un nivel ridicat al apoptozei este observat si in locusurile preneoplazice si in nodulii care se dezvolta in ficat, dupa administrarea de carcinogeni chimici, este improbabil ca factorii mentionati ar putea fi operativi in aceste circumstante. Este posibil ca prezumtivele mecanisme reglatoare ale populatiilor celulare, descrise mai sus, actioneaza intr-o etapa timpurie a procesului de carcinogeneza, cu o apoptoza crescuta, care echilibreaza temporar cresterea proliferarii celulare. In sfarsit, nivelurile crescute de apoptoza in tumori pot fi rezultatul unui proces intrinsec al acestor celule. Ratele de apoptoza gasite in tumori similare difera, fiind rezultatul expresiei diferitelor oncogene.