CURS 3 Populaiile limfocitare i markerii lor de suprafa

Populaiile limfocitare i markerii lor de suprafa

din totalul celulelor seriei albe, limfocitele reprezint cam 25-40%, ceea ce corespunde unei valori absolute de 1500-4000 de limfocite pe mm3 din punct de vedere morfologic, se mpart n: 1. Limfocite mici aproximativ 80-85% din totalul limfocitelor periferice diametru 6-9 m raport nucleu/citoplasma supraunitar subvarieti: a. limfocite T b. limfocite B 2. Limfocite mari 10-15% din totalul limfocitelor periferice diametru 10-16m prezint citoplasm foarte abundent ce nconjoar de jur mprejur nucleul n citoplasm sunt prezente din abunden granulaii azurofile uor de evideniat n microscopia optic se numesc LGL (Large Granular Limphocytes) ea include celulele NK implicate n imunitatea natural i RIC 1. Limfocitele mici difereneierea LT/LB NU poate fi fcut niciodat pe baza unor criterii morfologice diferene din punct de vedere electronomicroscopic diferenierea se face rapid i eficient pe baza unui test funcional: testul Rozetrii (foarte vechi, const n punerea n contact a limfocitelor raportate anterior prin tehnici de gradient cu eritrocite de oaie; singurele care angajeaz legturi cu acestea i formeaz conglomerate celulare sunt LT)

LB NU sunt celule rozetante LT prezint pe suprafaa lor un receptor tipic de adeziune intercelular (CD2). El NU exist pe suprafaa LB LT NU reprezint o populaie celular omogen, ci este foarte heterogen din punct de vedere funcional avem 4 subvarieti de LT: a. TH b. TC c. TS d. TCS (contrasupresoare) - diferenierea dintre ele NU poate fi fcut pe baza criteriilor morfologice i nici pe baza testului rozetrii pentru c toate rozeteaz la fel - diferenierea dintre ele se face prin evidenierea markerilor de suprafa Laura & Daniel 1

CURS 3 Populaiile limfocitare i markerii lor de suprafa - pe TH se afl un marker diferit de TC, TS, TCS - se bazeaz pe utilizarea Ac monoclonali (artificiali, cu nalt specificitate, marcai fluorescent i recunosc tipic NUMAI 1 marker) - conteaz de fapt markerii de suprafa, NU forma limfocitelor

Limfocitele T
I. Caractere generale reprezint populaia limfocitar majoritar prezent n sngele periferic (68-80% din totalul limfocitelor periferice) sunt celule cu durat de via lung sau foarte lung (ani, yeci de ani, ct o via de om) celule intens recirculante (ele patruleaz continuu n ntreg organismul n cutarea Ag pentru care sunt programate genetic) II. Receptorii de suprafa ai LT - expun pe suprafaa lor 3 categorii de receptori: 1. Receptori de recunoatere Ag a. Complexul TCR-CD3 - rol n recunoaterea Ag (epitopilor) b. Coreceptori: CD4 sau CD8 (recunoaterea moleculelor prezentatoare ale epitopilor CD4 MHC II CD8 MHC I Din a. i b. => recunosc simultan att Ag prezentat ct i moleculele prezentatoare ale acestora = recunoaterea Ag asociativ (reprezint i principala cale de activare metabolic a LT) 2. Receptori cu rol accesor n activarea LT: o CD28 o CD45 3. Receptori de adeziune intercelular - permite stabilirea de contacte LT alte tipuri de celule o CD2 o LFA1 (CD11A/CD18) - CD = titulatura de catalog a receptorilor prezeni la suprafaa limfocitelor. CD urmat de un numr = un singur receptor prezent la suprafaa LT. s-a recurs la aceast titulatur, pentru a se nlocui titulaturile mai vechi, descriptive. Unele se mai pstreaz (LFA1 antigen asociat funciei leucocitare; VLA antigen cu apariie foarte trzie, el apare dupa ce LT au fost activate, deci apar foarte trziu; ICAM molecule de adeziune intercelulara) - CD = cluster of designation = class du differention = clas de difereniere -

1. Receptori de recunoatere Ag
Caracteristicile recunoaterii Ag realizat de LT i. LT recunosc Ag NUMAI dup structura lor primar (secvena de aa). Recunosc n mod tipic doar Ag hidrofili ii. LT recunosc NUMAI Ag prezentat pe suprafaa APC n complex cu molec MHC (LT, spre deosebire de LB NU recunosc niciodat Ag solubile) iii. Recunoaterea realizat de LT e prin definiie o recunoatere asociativ

a.
-

Complexul TCR-CD3

pe suprafaa LT aflate n repaus exist n jur de 60000 de asemenea complexe TCR (receptorul celulei T pentru Ag) - heterodimer constituit din 2 lanuri transmembranare ( i ) orientate cu capetele N-terminale afar i cele C-terminale n interiorul LT Laura & Daniel 2

CURS 3 Populaiile limfocitare i markerii lor de suprafa - lanurile sunt elaborate dup codul unor gene diferite: Cz 14, Cz 7 - n segmentul extracelular i se asociaz ntre ele prin puni disulfurice

membrana LT strbtut de lanuri separ 3 segmente n cele 2 lanuri

a.
-

segmentul extracelular

lanurile NU sunt liniare, ci adopt o configuraie imunoglobin-like (sunt organizate n bucle sau domenii situate simetric) pe cele 2 lanuri exist cte 2 domenii, fiind de principiu formate din 100-110 aa domeniile N-terminale sunt constituite din secvene de aa variabile/hipervariabile. Ele se noteaz cu V i V V i V se asociaz ntre ele i constituie o cavitate de dimensiuni mici = situs combinativ pentru Ag (SCAg) celelalte 2 domenii sunt constituite din secvene de aa constante ca structur pe majoritatea limfocitelor. Se noteaz cu C i C dintre cele 2 perechi de domenii, cele mai importante din punct de vedere funcional sunt cele variabile. Ele formeaz SCAg i pentru aceasta ele sunt responsabile de recunoaterea Ag dei V i V sunt implicate n recunoaterea Ag, ele NU angajeaz niciodat contacte cu Ag prin ntreaga lor secven de aa, ci realizeaz contacte cu Ag care sunt punctiforme, realizate prin intermediul unor mici secvene de aa (8-15) rezultate n urma plicaturrii V i V. Aceste segmente sunt situate n vrful plicaturilor i protruzioneaz adnc n cavitate, realiznd legturi cu Ag prin potrivire de form sau complementaritate => ele se numesc CDR (regiuni determinante ale complementaritii) 3

Laura & Daniel

CURS 3 Populaiile limfocitare i markerii lor de suprafa domeniile variabile V, V - circular prin plicaturare - plicaturile exist prin intermediul celor 3 puni disulfurice intradomeniu - secvenele din vrful plicaturilor sunt doar ele responsabile de contactul cu Ag (8-15 aa). Ele se numesc CDR - pe fiecare domeniu exist 3 CDR. Ele constituie paratopul - restul secvenelor = zona scheletal (FR framework regions) - recunoaterea Ag se face prin stabilirea de contacte difereniate ntre CDR i complexul MHC epitop - LT recunosc doar Ag care sunt prezentate pe suprafaa APC - APC expun prin moleculele MHC un epitop - CDR1 CDR2 angajeaz legturi NUMAI cu moleculele MHC, recunoscnd din acestea doar domeniile polimorfe (MHC I 1,2, MHC II 1, 1) - CDR3 sunt singurele care asigur legturi cu epitopul prezentat e recunoscut att epitopul, ct i prezentatorul acestuia, deci se realizeaz o recunoatere Ag asociativ intrareceptorial (1 receptor 2 molecule recunoscute) domeniile constante C, C - poriunea din segmentul extracelular al TCR ntre domeniile intern i membranar = zona balama - n aceast poriune (ZB) lanurile i se asociaz ntre ele prin puni disulfurice => heterodimerul - ea e poriunea din TCR dotat cu maximum de flexibilitate. n jurul ZB TCR execut n mod continuu micri de baleiere, care favorizeaz recunoaterea Ag (contactul cu complexul MHC epitop prezentat pe suprafaa APC)

b.
constituit din 22-25 aa

segmentul transmembranar segmentul intracitoplasmatic

c.
-

este extrem de scurt 5-12 aa

Funciile TCR - realizeaz recunoaterea Ag - genereaz semnale activatoare care apar secundar recunoaterii Ag - NU poate realiza transmisia sau transducia semnalelor ctre sistemele enzimatice din profunzime. Ea se realizez prin a doua component a complexului TCR-CD3, adic prin CD3

Laura & Daniel

CURS 3 Populaiile limfocitare i markerii lor de suprafa

CD3 - complex pentameric, format din 5 lanuri: - 3 lanuri scurte i groase care prezint segmente intracitoplasmatice destul de reduse (notate , , ). Au GM de aproximativ 21-25kda i sunt elaborate dup gene prezente pe cromozomul 11 - la cele 3 lanuri scurte i groase se asociaz 2 lanuri foarte lungi i efilate care cel mai frecvent sunt identice ntre ele (notate , au GM de 16kda, fiind elaborate dup codul unor gene aflate pe cromozomul 1) - cele 5 lanuri se asociaz ntre ele prin puni disulfurice i se asociaza la TCR complexul heptameric TCR-CD3 - CD3 trimite semnalele activatoare ctre lanurile , ele avnd acces la sistemele enzimatice de profunzime - CD3 fixeaz localizarea membranar a unor enzime foarte importante pentru activarea metabolic a LT. Ea se face la nivelul unor secvene mici de aa prezente n poriunea intracitoplasmatic a tuturor lanurilor CD3 se numesc ITAM (motive activator imunoregulatoii tirozinice)

b. Coreceptori

CD4 coreceptor de recunoatere Ag GM 60kda elaborat dup codul unor gene prezente pe Cz 12 distribuia: CD4 e distribuit tipic pe suprafaa TH el e considerat marker definitoriu pentru TH TH = LT CD4+ 5

Laura & Daniel

CURS 3 Populaiile limfocitare i markerii lor de suprafa

e o glicoprotein transmembranar orientat cu captul N-terminal afar, C-terminal nuntru exist 3 segmente: a. segmentul extracelular organizat n bucle sau domenii 4 bucle diferite ntre ele (D1 D2 D3 D4) E implicat n recunoaterea moleculelor prezentatoare de Ag Contactele se stabilesc cnd LT coopereaz n vederea recunoaterii Ag cu APC, care expun MHC cu epitop Receptorul recunoate NUMAI moleculele MHC II, contactndu-l prin D1, NUMAI domeniul monomorf al moleculei MHC II 2 b. segmentul transmembranar c. segmentul intracitoplasmatic este foarte lung prin el contribuie esenial la activarea TH CD4 se afl n contact fizic cu o enzim (proteintirozinkinaz PTK1). Varietatea tipic pentru TH e PTK p56lck p56 proteina 56kda lck titulatura protooncogenei responsabil de sinteza acestei proteinkinaze (kinaz caracteristic leucocitelor) CD8 glicoprotein transmembranar heterodimeric: 1 lan i unul orientat cu capetele N-terminale afar i cele C-terminale la interior 6

Laura & Daniel

CURS 3 Populaiile limfocitare i markerii lor de suprafa - elaborat dup codul unor gene de pe Cz 2

particularitate: n segmentul extracelular prezint cte un domeniu domeniile sunt poziionate simetric => conformaie Ig-like segmentele intracitoplasmatice sunt foarte lungi CD8 e prezent pe suprafaa TC i TS (LT CD8+) funcii realizate diferit prin segmentul extracelular i cel intracitoplasmatic segmentul extracelular: cooperarea ntre TC/TS i APC (cooperarea se face cu ocazie prezentrii i recunoaterii Ag. n timpul cooperrii CD8 recunoate specific NUMAI moleculele MHC I, angajnd legturi NUMAI cu domeniul monomorf al MHC I 3). Are rol important n activarea TC/TS. segmentul intracitoplasmatic: se afl n contact cu aceeai PTK p56lck

Cei 4 receptori (TCR, CD3, CD4, CD8) realizeaz recunoaterea Ag asociativ. - recunoaterea e dublu asociativ: o recunoatere Ag asociativ intrareceptorial (realizat de TCR) o recunoatere Ag asociativ interreceptorial (recunosc moleculele prezentatoare) stabilirea unui numr mare de contacte intre moleculele prezentatoare i cele prezentate LT leg. cu MHC (5) prin TCR i CD4/CD8 cu Epi (2) prin TCR DAR ele se realizeaz DOAR cnd e recunoscut epitopul - moleculele MHC de regul sunt molecule prezentate NUMAI pe membranele celulare => LT recunosc NUMAI Ag membranare - Ag membranare pot fi de 3 tipuri: 1) Ag prezentate 2) Ag constitutive 3) Ag ataate

Laura & Daniel

CURS 3 Populaiile limfocitare i markerii lor de suprafa

LT NU recunosc niciodat Ag ataate (Ac) i Ag constitutive (Ac/NK)

LT recunosc DOAR Ag prezentate n complex cu MHC recunoaterea Ag de LT este o recunoatere MHC restrictiv

2. Receptori cu rol accesor n activarea LT

CD28 Laura & Daniel 8

CURS 3 Populaiile limfocitare i markerii lor de suprafa glicoprotein transmembranar homodimeric GM 45kda distribuie: prezent NUMAI pe suprafaa TH/TC i niciodat pe TS segmentul extracelular: cte o bucl pe domeniu segmentul intracitoplasmatic: lung sau foarte lung funcie: favorizeaz net cooperarea dintre TH/TC i APC n timpul cooperrii se stabilesc legturi ntre CD28 i un contraligand (CD80) prezent NUMAI pe suprafaa APC profesionale => semnale activatoare care se trimit ctre profunzime, ele contnd enorm pentru maturarea funcional a TH/TC TH produce diverse tipuri de IL TC produce CK

o CD45 Laura & Daniel

glicoprotein transmembranar GM 100-200kda pe suprafaa tuturor celulelor de origine hematogen (excepie eritrocitele i trombocitele) pe suprafaa LT e extrem de bine reprezentat (ocup 10% din suprafaa lor membranar) NU exist ca receptor izolat El se ataeaz prin puni disulfurice la lanul al CD3 => CD45 e activat ntotdeauna ca urmare a stimulrii Ag Funcie enzimatic, e o fosfataz (PTP) care impreun cu PTK formeaz un cuplu funcional extrem de important 9

CURS 3 Populaiile limfocitare i markerii lor de suprafa

3. Receptorii de adeziune intercelular

- foarte importani printre altele n cooperarea prin contact ntre LT i APC = cooperare cognitiv

o CD2 - receptor panT (pe toate LT) i pe suprafaa celulelor NK - glicoprotein transmembranar - are GM 50kda - segmentul extracelular prezint 2 domenii - segmentul intracitoplasmatic este foarte lung - funcii: segmentul extracelular stabilirea de contacte cu un contraligand prezent pe APC (LFA3[CD58]) contacte prin complementaritate segmentul intracitoplasmatic pregtirea activrii LT, se afl n contact fizic cu o enzim PLC (fosfolipaza C) - cnd se stabilesc contacte CD2-LFA3, CD2 sufer modificri conformaionale ce permit translocarea PLC de la nivelul citoplasmei la nivelul membranei - LT naive = limfocite care n existena lor NU au ntlnit niciodat Ag pentru care au fost programate genetic s l recunoasc - cuplul de adeziune CD2-LFA3 = cuplul de adeziune de linia nti (primele legturi dintre APC i LT se stabilesc prin acest cuplu). Afinitatea reciproc CD2-LFA3 e extrem de mare LFA1 - prezent pe LT, LB, NK Laura & Daniel 1

CURS 3 Populaiile limfocitare i markerii lor de suprafa - 2 lanuri (CD11a) i (CD18) - segmentul extracelular 2 domenii (imagine de Ig-like) - segmentul intracitoplasmatic foarte lung - funcie: segmentul extracelular stabilirea de contacte cu un contraligant prezent pe suprafaa APC (din categoria ICAM) - prezent pe suprafaa LT, n mod particular pe suprafaa LT cu memorie (au ntlnit de nenumrate ori Ag pentru care sunt programate s l recunoasc) - cuplul de adeziune LFA1-ICAM = cuplul de linie a doua (legturile se stabilesc mai trziu i sunt instabile o perioad de timp) Rolul receptorilor - stabilirea de contacte APC-LT pe arii ntinse ale membranelor - aceste cupluri de adeziune favorizeaza net prezentarea i recunoaterea Ag pentru c MHC+Epi i TCR NU sunt poziionate fa n fa. Astfel ele au timp s pluteasc pe membran i s vin n contact unul cu altul

LT TH TC TS

CD3 + + +

CD4 + -

CD8 + +

CD28 + + -

Mecanismele activrii LT
Activarea LT, care reprezint momentul central al majoritii rspunsurilor imune fa de Ag timodependente NU se realizeaz n orice ipostaz, ci doar dac sunt strict ndeplinite anumite condiii ce sunt diferite in vivo/in vitro. Condiii in vivo - LT sunt activate NUMAI de Ag timodependente - Activarea LT se realizeaz strict n organele limfoide secundare (ganglioni, splin), doar n conditiile unei cooperri celulare la care este absolut necesar prezena i activarea APC

Laura & Daniel

CURS 3 Populaiile limfocitare i markerii lor de suprafa - Ag timodependente native NU pot stimula direct LT pentru c LT NU dispun pe membrana lor de receptori de captare Ag. - LT NU expun receptori pentru complement si IgG - Exist alte celule (APC) care prezint pe mebrana lor din abunden receptori de captare Ag. Ele le capteaz, endociteaz, scindeaz => epitopi. Unii sunt ulterior prezentai n complex cu moleculele MHC. Ei sunt apoi recunoscui de LT prin TCR+CD3 - Cooperarea i activarea care rezult pentru a conduce la un rspuns imun eficient trebuie s fie bidirecional (APC i LT trebuie s se stimuleze reciproc una pe cealalt) Distingem n cadrul cooperrii 2 tipuri de activare: activarea anterograd 4) se desfoar dinspre APC spre LT i la finele ei se realizeaz activarea LT. Se numete activare anterograd pentru c ea se exercit n acelai sens cu prezentarea i respectiv recunoaterea antigenic 5) prin transmiterea unor semnale ctre LT pe 2 ci principale: primul semnal e transmis pe calea principal (TCR CD3). El ia natere ca urmare a recunoaterii de LT a epitopului prezentat. El are 2 roluri foarte importante: - conduce la activarea metabolic a LT contribuie la declanarea diviziunii mitotice a LT => crete numrul de limfocite T per clon activat => 2 modificri clonale: activarea clonal i expansiunea clonal cale accesorie: implic activarea receptorului CD28 prezent pe suprafaa LT. El e activat dac angajeaz legturi cu un contraligand prezent pe APC proliferate (CD80). n CD28 => semnale transmise ctre limfocit. Ele: 4. contribuie la activarea diviziunii mitotice a LT 5. contribuie la maturarea funcional a LT 6. contribuie la maturarea funcional a clonei III. clona sufer 3 modificri foarte avantajoase: 1. activare 2. expansiune 3. maturare Cu o asemenea clon => va declana un RI eficient activarea retrograd dinspre LT deja activate ctre APC la finele ei => activarea total, definitiv, maxim a APC ea se exercit n sens opus prezentrii i recunoaterii Ag se realizeaz prin eliberarea de ctre LT activate a unor IL cu rol activator pentru APC (IFN, IL-4). Ele stimuleaz producia i expresia pe membrana APC a moleculelor MHC II (n special) => creterea prezentabilitii Ag => activarea suplimentar a LT LT activate suplimentar activeaz suplimentar APC, etc Ele se activeaz reciproc pn n momentul n care este atins i depit valoarea prag a declanrii RI Valoarea prag a declanrii RI = atingerea i depirea cnd clona sufer cele 3 modificri: e activat, expansionat i maturat Activarea anterograd trece ntotdeauna prin 2 etape: iv. Etapa Ag nespecific a activrii LT Laura & Daniel 1

CURS 3 Populaiile limfocitare i markerii lor de suprafa n cursul ei se realizeaz legtura ntre membranele APC i LT prin cuplurile de adeziune intercelulare primele legturi se realizez pe seama cuplului de adeziune de linia I (CD2 pe LT i LFA-3 CD58 pe APC). Aceste legturi sunt stabile pentru lungi perioade de timp. Numrul lor este imens de la bun nceput (sute de mii de asemenea legturi) apoi se stabilesc legturi de linia a II-a, ntre LFA-1 (pe LT) i ICAM. Ele apar mai trziu datorit faptului c cei 2 liganzi au o afinitate n general mic. Ele sunt instabile i iniial numrul lor este mic.

Funciile acestei etape: Prin formarea cuplurilor de adeziune membranar APC i LT vin n contact intim pe suprafee foarte mari Conteaz pentru pregtirea activrii LT. n momentul n care se stabilesc legturi CD2 LFA-3, PLC, care n cazul LT e poziionat mai interior, vine n contact cu CD2 => migreaz la suprafa, unde poate fi activat ea are loc permanent. Legturile NU au loc NUMAI n situaia n care APC prezint un Ag, dar el NU a fost nc recunoscut. Ea are loc i n situaia n care APC NU expune epitopi (moleculele MHC ale APC sunt goale) faptul c LT stabilesc contacte continue cu APC => LT controleaz permanent APC dac expun sau NU Ag => supraveghere imunologic v. Etapa Ag specific a activrii LT e ocazionat de prezentarea i recunoaterea Ag epitopii sunt recunoscui de TCR la TCR se asociaz laurile CD3 , i i la ele se asocialz cel mai frecvent 2 lanuri lungi, identice ntre ele, lanurile . Apoi se mai asociaz, tot prin puni disulfurice, CD45 2 coreceptori: CD4, dac e TH CD8, dac e TC/TS Laura & Daniel 1

CURS 3 Populaiile limfocitare i markerii lor de suprafa CD4/CD8 se afl n citoplasm n contact cu o enzim, PTK (varietatea p56 LCK). n centrul catalitic exist o timozin, n poziia 505, cu rol reglator pentru PTK Activarea LT e rezultatul declanrii n succesiune a 2 categorii de stimuli: d. Apare pe calea CD4/CD8. El e generat n momentul n care CD4/CD8 angajeaz legturi cu domeniul monomorf al moleculei MHC => stimul ce se transmite prin CD4/CD8, el fiind un stimul inhibitor. El se transmite prin segmentul intracitoplasmatic al CD4/CD8 ctre PTK. Primind stimulul, PTK sufer modificri conformaionale => exteriorizarea Tyr din poziia 505. Exteriorizat, ea se autofosforileaz spontan, ceea ce duce la inhibiia TOTAL a PTK. Inhibiia are rolul unui mecanism de protecie, prin care este mpiedicat activarea LT n situaia n care APC NU prezint nici un epitop (moleculele MHC sunt goale). Dac NU ar exista, LT ar reaciona fa de MHC i ar exista anse ca LT s distrug APC. Dac MHC NU sunt vide, atunci e declanat un al 2-lea semnal e. apare pe calea TCR CD3. El e un semnal activator i se transmite din lan n lan de la TCR prin toate lanurile CD3. atinge lanurile => urmeaz 2 ci: una scurat (a) i una lung (b) 1. de la lanurile ctre CD45. cd 45 se activeaz i ncepe s funcioneze ca o PTP (fosfataz). CD45 preia (P) de pe Tyr din poziia 505 => o defosforilare a PTK p56lck. Acum ea se activeaz. Ea fosforileaz enzime => activarea metabolismului intermediar al LT. n al doilea rnd, ea fosforileaz secvenele ITAM. Fosforilndu-le, ele se activeaz i devin capabile s fosforileze alte enzime (kinaze). Cea mai important e kinaza ZAP-70. ea se fixeaz de lanurile (ZAP = Protein asociat lanurilor , are GM de 70 kda). Stimulii sunt trimii pe calea b. 2. De-a lungul lanurilor i n final au acces la ZAP-70, care tocmai s-a fixat. ZAP-70 se activeaz i fosforileaz prelund fosfatul de pe CD45 i l trimite la PLC, care fiind fosforilat, se activeaz. n mare, activarea declaneaz cascada fosfatidil-inozitolilor. PLC hidrolizeaz PIP2 (fosfatidil inozitol disfosfat) => Inozitol trifosfat (IP3) i diacilglicerol (DAG) IP3 substan hidrosolubil difuzeaz n ntreaga citoplasm, pn ajunge la nivelul REN, care prezint receptori specifici pentru IP3 => activarea REN cu eliberarea masiv n citoplasm a Ca2+ (hipercalciie). Efectul ei foarte important e acela ca Ca2+ activeaz calcinemina (o fosfataz calmodulin dependent). Ea influeneaz indirect anumite funcii nucleare. Ea exercit aceste efecte printr-un factor transcripional = NF-AT (factor nuclear al LT activate). NF-AT e un factor polipeptidic prezent n mod continuu n citoplasma LT, dar atta timp ct LT se afl n repaus NF-AT e inactiv pentru c e fosforilat. Activarea NF-AT se face prin defosforilalrea sa sub aciunea calcineminei. Defosforilat, NF-AT trece n nucleu i aici activeaz marea majoritate a genelor pentru IL => o sintez crescut de IL => naturarea LT DAG substan liposolubil NU difuzeaz n citoplasm, ci rmne la nivelul membranei Aici DAG activeaz o kinaz (PKC). Ea, indirect, poate activa anumite funcii nucleare prin intermediul unui factor transcripional (NF-KB = factorul nuclear pentru lanurile uoare K ale Ig a LB) NF-KB a fost evideniat acum 20 de ani, n cazul LB mielomatoase NF-KB factor polipeptidic prezent n mod continuu n citoplasma LT. Cnd sunt n stare de repaus NF-KB e inactiv, fiind cuplat cu un inhibitor proteic. Activarea se realizeaz sub aciunea PKC, care fosforileaz inhibitorul => desprinderea lui de pe NF-KB. NF-KB devine liber i poate trece n nucleu. Activeaz marea majoritate a genelor pt IL sau CK i n mod cu totul special activeaz foarte intens 2 gene: gena pentru IL-2 ct i gena pentru receptorul IL-2 LT devine productor de IL-2 i are i cu ce s o recepteze => se activeaz cu prpria IL-2 => o activare autocrin cu IL-2 => activarea metabolismului i maturarea LT Stimularea diviziunii mitotice rezultatul transmiterii unor semnale pe 2 ci: TCR-CD3 i calea CD28 factorul cel mai implicat n stimularea mitozelor e MPF (mitosis promoting factor) Laura & Daniel 1

CURS 3 Populaiile limfocitare i markerii lor de suprafa MPF-ul e un heterodimer format din 2 molecule de ciclin B, asociate la o component kinazic, reprezentat de P34cdc (cell division cycles). Activarea se realizeaz prin cuplarea unor fosforilri i defosforilri Defosforilarea sub aciunea CD45, care defosforileaz ciclinele B => ele se desprind de pe kinaz n paralel kinaza e activat prin defosforilare de o alt PTK, reprezentat de P60src (sarcoma src cells). P60 se fixeaz de lanurile scurte ale CD3 Odat activat MPF sunt activate kinazele ciclin dependente CDK care acioneaz n punctele de restricie ale ciclului mitotic situat ntre faza G2 i faza M => aceste celule au toate ansele sa ptrund n mitoz n faza G2 ajung ca urmare a transmiterii unor semnale pe calea CD28. ele apar cnd CD28 angajeaz legturi cu CD80 => semnale activatoare n CD28 ce se transmit la o kinaz asociat la CD28 i care se numete fosfatidil inozitol 3 kinaza (PI3K). Ea activeaz cascada MAP kinazelor (proteinkinazele asociate mitozelor). MAPK stimuleaz kinazele ciclindependente responsabile de trecerea celulelor din faza G1 i S a diviziunii mitotice (punctul 2 de restricie) => celulele ajung n faza M Consecinele morfofuncionale ale activrii LT Activate, LT i modific att aspectul mologic, ct i funcia LT n stare de repaus Activat antigenic, trece din faza G0 n faza G1, apoi faza S n faza G2 LT din G1-S-G2 se afl n interfaz Ele devin mai mari, cu aspect neregulat i prezint o citoplasm foarte abundent n citoplasm crete numrul de mitocondrii => activarea metabolic a LT; crete RER => produc IL, CK; se modific i expresia fenotipic: expresia de TCR pe suprafaa lor (capacitate mai mare de a recunoate Ag prezentate), crete expresia de LFA-1 (crete capacitatea de aderare a LT la APC) n faza M marea majoritate a limfocitelor rezultate n urma diviziunilor devin LT efectorii (TH, producnd IL sau TC, producnd CK) O mic parte rmn n rezerv = LT cu memorie. Ele NU mai revin niciodat n faza G0 a ciclului mitotic, ci rmn ntr-o etap intermediar, ntre G0 i G1. Ele rmn n stare preactivat. La un nou contact cu Ag, acestea vor rspunde foarte rapid.

Laura & Daniel

CURS 3 Populaiile limfocitare i markerii lor de suprafa

Limfocitele B
Caractere generale aproximativ 15-20% din totalul limfocitelor circulante distribuite primar n ariile bursodependente ale organelor limfoide celule puin recirculante au durat de via n general scurt (luni de zile) Receptori de suprafa 3 categorii: 1. Receptori de recunoatere Ag 2. Receptori cu rol accesor n activare (CD45, CD25 sau IL-2R) 3. Receptori de adeziune intercelular (LFA-1) Receptori de recunoatere Ag 3. recunoaterea Ag se realizeaz printr-un complex receptorial, format din 2 componente: 1. BCR (Ig transmembranare IgM form monomeric, IGD, IgG, IgA, IgE). El e format din asocierea a 2 perechi de lanuri ( 2 grele H orientate cu capetele C-terminale n citoplasm). Prin capetele C-terminale se afl n legtur cu o PTK. Lanurile uoare (L) sunt poziionate extramembranar

Laura & Daniel

CURS 3 Populaiile limfocitare i markerii lor de suprafa

- aceste lanuri la capetele N-terminale se vor asocia ntre ele i formeaz 2 caviti = situsuri combinative pentru Ag (SCAg), prin care pot fi recunoscui determianii Ag conformaionali prezeni la suprafaa Ag nativ. - dei are 2 SCAg, ele sunt identice ntre ele => e recunoscut 1 singur determinant Ag => BCR e receptor monospecific Funciile BCR: 1. recunoaterea Ag 4. recunoate de regul Ag native aflate n stare solubil

5.

n cazul LB NU e necesar niciodat prezentarea Ag. Ele singure pot s-si capteze Ag prin BCR la care se asociaz receptorul de captare CR i FcR 2. generarea unor stimuli activatori 6. acetia NU pot fi trimii de BCR, de aceea se asociaz nc 2 lanuri cu funcie de transducie a semnalului activator (Ig i Ig) 7. De fapt ele sunt lanuri unice care n segmentul extracelular prezint cte un domeniu poziionat excentric

8. 9.

Actualmente Ig = CD79a i Ig = CD79b

Ele se asociaz la BCR prin puni disulfurice, ca i la CD45 1. CR i FcR Activarea LB 10. mult mai complex dect activarea LT

11.

activarea se datoreaz trnsmiterii semnalelor activatoare pe 2 ci: 1. scurt o de la BCR la PTK o activndu-se, PTK preia (P) din citoplasm i l trimite ctre diferite substrate (segmentele intracitoplasmatice ale Ig i Ig, care sufer modificri conformaionale ce permit trecerea unor semnale activatoare pe calea lung 2. lung o la CD45, care se activeaz i preia (P) de pe Ig i Ig i l trimite la PLC => activarea PLC i declanarea cascadei fosfatidil-inoyitolilor Consecinele morfofuncionale ale activrii LB LB se transform i morfologic, dar mai ales funcional LB trec din faza G0 n faza G1, apoi din S n G2 Laura & Daniel 1

CURS 3 Populaiile limfocitare i markerii lor de suprafa Ele trec n interfaz, unde devin nite limfoblati B, care sunt mari i cu aspect neregulat i prezint o citoplasm foarte abundent ce nconjoar nucleul n citoplasm gsim mitocondrii abundente i RER Pe membran crete expresia de LFA-1 i expresia de MHC II!!! Ele devin nite APC!!! n faza M ncep s se divid. Cea mai mare parte devin plasmocite (produc Ac). O mic parte rmne n rezerv sub form de LB cu memorie (rmn ntr-o etap ntre G0 i G1). La un nou contact ele vor aciona mai repede (memorie scurt pentru c LB mor repede)

Organizarea sistemului imun

Distingem 2 componente: - componenta central - componenta periferic

Componenta central
reprezint sectoarele de repartiie primar a tuturor clonelor limfocitare reprezint sectorul tranzitat n mod continuu de APC reprezint sectorul n care poate avea loc cooperarea APC limfocite reprezint sectorul n care limfocitele pot fi i activate 1. Splina 2 zone: pulpa roie (fr funcie imunologic) i pulpa alb (funcie imunologic) Pulpa alb: dispus sub forma a 3 manoane, dispuse n jurul unei arteriole centrale Primul manon (PALS intern) zon timodependent, populat de LT dispuse omogen Al 2-lea manon (PALS extern) zon bursodependent, populat de LB prezente n aglomerri celulare = foliculi limfoizi A 3-a = zona marginata, populat mai ales de Mcf o Funcii Laura & Daniel 1

CURS 3 Populaiile limfocitare i markerii lor de suprafa Genereaz RI fa de Ag circulante, fa de care pot apare RIU, care se desfoar integral n splin, sau RIC, care sunt doar iniiate n splin i se desfoar n esutul Ag Etapele desfurrii RIU intrasplenice - declanate de Ag circulante care pot fi prezente n circulaie ca Ag solubil sau Ag transportat - Ag ajunge sub ambele forme n pulpa alb 1. Ag solubil - mai repede ajunge sub form de Ag solubil i ptrunde n toate cele 3 zone, declannd RI doar n zona bursodependent (Mcf NU au capacitatea de a capta Ag solubile, LT NU pot capta Ag) - Ag e recunoscut de LB, ele se activeaz i se transform n limfoblati B. Dup activare celula ncepe s se ndeprteze de contactul antigenic, rmnnd n PALS extern 2. Ag transportat de CDS - CDS se afl n PALS intern, unde se transform n IDC - prezint Ag LT prezente aici - dac Ag e recunoscut, LT se activeaz i se transform n limfoblati T. Dup un anumit interval de timp, celula se desprindede la locul cooperrii i migreaz, ns migrarea e foarte pronunat i de regul limfoblatii T ajung n PALS extern, unde vin n contact cu limfoblatii B i ncep s coopereze - consecine: activarea complet a limfoblatilor B, care se transform n plasmocite. Dup un interval de timp ele migreaz i la distan mare de cooperare => Ac ce sunt eliberai 2. Ganglionii limfatici 3 zone n parechim: Corticala (Cx) bursodependent LB distribuite n aglomerri celulare = foliculi limfoizi. Care NU sunt stimulate => foliculi lifoizi primari Paracorticala (Pc) LT distribuite omogen Medulara celularitate mixt (LT, LB, Mcf, Plasmocite, etc) o Funcii: Locul generrii unor RI fa de Ag tisulare => 2 rspunsuri: RIU integral n ggl RIC doar iniiat n ggl, n rest se desfoar n esutul Ag Etapele intraganglionare ale RIU: declanat ca urmare a drenrii prin limfaticele aferente a unor Ag tisulare. Ele stimuleaz LB din foliculi, care i modific aspectul, devenind foliculi limfoizi secundari (au dimensiuni mari, enorme i avanseaz ctre Pc). Modificrile se datoreaz faptului c LB stimulate se activeaz i se divid, iar pe de alt parte migreaz. Foliculul are 3 zone: o Subcapsular (cap) format din LB mici (neactivate) o Central, format din puine LB (zona clar). Ele sunt LB mici. Sunt puine pt c LB stimulate au migrat de aici i au trecut n paracortical o Zona dens, format din limfoblati (Pc). Limfoblatii din Pc rmn n contact cu LT de aici i coopereaz => se transform n plasmocite, care migreaz, ajungnd cel mai frecvent n medular, unde elibereaz Ac.

RIU
La baza RIU declanat fa de Ag timodependente st o cooperare celular la care particip de principiu 3 tipuri celulare: 1. APC Laura & Daniel 1

CURS 3 Populaiile limfocitare i markerii lor de suprafa 2. L cu rol imunoreglator ( LTH amplific RI, LTS diminu RI) 3. L cu rol efector (LB) - Ag timodependente sunt preluate de APC, internalizate i scindate cu generarea unui numr de epitopi - Epitopii sunt prezeni pe membrana APC n complex cu diverse molecule de MHC orientate ctre TH, care amplific RI - Alii sunt prezentai ctre TS, care diminu RI - TH ulterior coopereaz cu LB care se activeaz i se transform in plasmocite (produc Ac) - Condiia fundamental a cooperrii: e ntotdeauna bidirecional (se realizeaz 2 tipuri de secvene de cooperare) 1. secvena de activare (efectorie) - corespunde RIU propriu-zis - cuprinde toate influienele activatoare exercitate dinspre APC ctre LB => activarea LB - presupun participarea doar a 3 categorii de celule din cele 4 (APC, TH, LB) - Funciile de principiu: o Selecia clonal a LB/LT (selecia TH se realizeaz de ctre epitopii prezeni pe membrana APC, selecia LB e realizat de Ag timodependent nativ) o Activarea clonal o Expansiunea clonal o E generat o cantitate adecvat de Ac pentru neutralizarea/ndeprtarea/distrugerea Ag declanator 2. secvena de retrocontrol Funcia de principiu: o Limitarea intensitii RIU la un minim necesar unei aprri imune eficiente Are valoarea unui mecanism de protecie prin care sunt evitate 2 efecte defavorabile care ar putea rezulta din orice RIU: Evit expansiunea necontrolat/exagerat a clonelor TH/LB Ag specifice Este evitat generarea unor cantiti exagerate de APC acest control e activat de celule TS. Ele produc i elaboreaz factori inhibitori de natur proteic (TSF factor T supresor). Ei inhib n primul rnd LB, ulterior TH i n cele din urm APC participante la normal ntre 1 i 2 e un echilibru funcional foarte fin care asigur homeostazia RIU

Rspunul imun umoral

Principiul cooperrii celulare care st la baza RIU cele 3 tipuri de celule NU coopereaz niciodat per primam (ele NU au aceeai locaie n organism) APC sunt intratisular TH sunt n ariile timodependente ale organelor limfoide LB sunt n ariile bursodependente ale organelor limfoide Ele coopereaz n etape succesive, ca urmare a migrrii acestor celule, ele trecnd dintr-o arie n alta Ele ncep s migreze cnd se activeaz APC secundar captrii Ag nativ se activeaz i dup un interval de timp trec din esuturi n ariile timo-dependente. Ele transport Ag de la esuturi la TH TH stimulate antigenic se activeaz i dup un interval de timp trec n aria bursodependent nvecinat. Ele cep s oopereze cu LB rezultnd activarea LB care n final produc Ac a. Cooprerarea APC + TH b. Cooperarea TH + LB RIU e declanat ca urmare a ptrunderii intratisulare a diverselor Ag intratisulare (Ag complete) Ag sunt captate de APC. NU toate APC capteaz, ci doar APC non- (orice APC, excepie LB => doar Mcf sau celulele dedritice) 2

Laura & Daniel

CURS 3 Populaiile limfocitare i markerii lor de suprafa - APC se activeaz i apoi ncep migreze, trecnd din esuturi n ariile timodependente ale organelor limfoide, transportnd Ag, urmnd s-l prezinte ctre TH - Prezentarea se face prin intermediul MHC II, Ag fiind prezentat ctre TH, orientat ctre TH prin partea carrier (TH e capabil s recunoasc doar partea carrier a Ag). Recunoaterea se face prin TCR => celulele ncep s coopereze (cooperare cognitiv). Ea e ocazionat de recunoaterea i prezentarea Ag. - Aceast cooperare e completat ntotdeauna de o a doua cooperare, NON-cognitiv. Ea se realizeaz ca urmare a eliberrii de ctre APC a unor IL, cea mai important fiind IL-1. Ea stimuleaz suplimentar TH (NON-cognitiv pentru c se realizeaz prin aceeai IL-1 indiferent de ce tip de Ag e prezentat. - La finele acestei duble cooperri => activarea TH, care e parial - Activate, TH, dup un interval de timp, ncep s se desprind de la contactul cu APC i migreaz din aria timodependent n aria bursodependent nvecinat. Pe msura migrrii se transform morfologic, devenind limfoblast TH - n aria bursodependent ateapt LB - LB sunt activate ntr-o etap ulterioar direct de ctre Ag nativ care e antrenat n circulaia limfatic/sangvin i el ajunge ca substan solubil n ariile bursodependente. Aici e recunoscut de ctre LB prezente obinuit n ariile bursodependente. LB de regul recunosc NUMAI partea haptenic => activarea parial a LB. Dup un interval de timp LB se deprteaz de contactul Ag i ncep s migreze, rmnnd n aria bursodependent respectiv - Pe msur ce migreaz, ea se transform n limfoblast B - Cele 2 categorii de limfoblati vin n contact - Cooperarea e ocazionat iniial de prezena i recunoaterea Ag - Celula care prezint Ag e doar limfoblastul B, care capt funcie de APC (expune pe membranele sale MHC II). El prezint Ag ctre TH (limfoblast), orientnd Ag cu partea carrier ctre limfoblastul TH. Ea e recunoscut de TCR => cooperare cognitiv - Sensul de cooperare e limfoblast B limfoblast TH => activarea total a limfoblastului TH - Devenii total activai, limfoblatii TH produc cantiti mari de IL (IL-4, IL-5, etc) => o cooperare NON-cognitiv. Sensul ei e de la limfoblastul TH ctre limfoblastul B. Rezultatul const n activarea total a limfoblastului B - Rezultatul activrii totale: limfoblastul B se transform n plasmocite, care dup urma formrii ncep s migreze i la distan pun n libertate Ac specifici, capabili s recunoasc Ag (dup partea haptenic) Precizri: - dintre cele 2 categorii de limfocite, primele care particip n RIU sunt doar LT pentru c ele sunt celule intens recirculante LB particip trziu pentru c sunt celule puin recirculante - n cadrul RIU, de-a lungul su, sunt implicate toate categoriile de APC (iniial NON-B, apoi B) - Ag e necunoscut in toto (partea haptenic de LB, iar cea carrier de LT) a. Cooperarea APC NON-B i Limfocitele TH - obligatoriu n ariile timodependente ale oarganelor limfoide - ea trece prin mai multe etape: Cooperarea cognitiv - se stabilesc ntre APC NON-B i LT diverse contacte - iniial contacte Ag nespecifice - contactele sunt realizate prin cuplurile de adeziune intercelulare. Primele prin cuplurile de linia I CD2 prezent pe suprafaa LTH i respectiv LFA-3 (CD58) prezente pe APC. Aceste legturi sunt stabile i extrem de numeroase (cteva sute de mii de asemenea cupluri ntre cele 2 celule) - apoi i prin cuplurile de linia a II-a LFA-1 (pe TH) i ICAM (de pe APC). Acestea apar mai trziu pentru c afinitatea reciproc a acestor receptori deocamdat e mic => legturi puin stabile i puin numeroase - ele sunt importante pentru c favorizeaz constituirea de contacte Ag specifice (ntre complex MHC II Epi TCR CD3)

Laura & Daniel

CURS 3 Populaiile limfocitare i markerii lor de suprafa - prin ancorarea celulelor e posibil ca moleculele MHC II Epi i TCR CD3 s ajung fa n fa prin micarea lor de-a lungul membranei => prezentarea i recunoaterea Ag => declanare de stimuli activatori prin TCR ctre profunzimea LTH => debutul activrii TH - activarea nseamn intensificarea fosforilrilor. Printre substanele fosforilate e i lanul al LFA-1. Fosforilndu-se sufer modificri conformaionale destul de importante, crescnd exploziv afinitatea LFA-1 pentru ICAM => legturi LFA-1 ICAM devin i stabile i foarte numeroase Cooperarea NON-cognitiv - exercitat prin IL-1 eliberat de APC IL-1 - substan polipeptidic cu GM de 17kda - elaborat dup codul unei gene de pe Cz. 2 - tipuri de IL-1: o IL-1 o IL-1 IL-1 - este produs de APC, dar e complet exocitat n mediul extracelular - NU are funcie imunologic, ea e de fapt un mediator proinflamator IL-1 - au funcie imunologic - e produs de APC, dar niciodat exocitat complet, ci expus pe membrana APC - ea se numete IL-1 membranar (mIL-1) - NU e expus la ntmplare, ci tipic e expus NUMAI pe versantul APC de la nivelul fantei dintre 2 celule. Astfel se evit activarea ntmpltoare a altor TH aflate de jur-mprejur (ar exista riscul s fie declanate la ntmplare diverse alte tipuri de RI) - stimuleaz TH pentru c e recunoscut de receptori specifici pentru IL-1 (IL-1 R) => declanarea de stimuli activatori ctre profunzimea citoplasmei TH, care au mai multe efecte: o contribuie esenial la declanarea diviziunii mitotice a TH o stimuleaz 2 gene: gena pentru IL-2 i gena pentru receptorul pentru IL-2 TH capt o dubl proprietate: produce IL-2 i avnd i receptor specific se poate autoactiva n sens autocrin Rezulatele stimulrii: 1. TH se activeaz metabolic foarte intens 2. TH ncep s se divid 3. TH ncep s se matureze funcional (ncep s se transforme n diverse clase de limfocite TH) Clasele de limfocite TH - NU sunt celule preformate, ci ele se formeaz extemporaneu n timpul cooperrii celulare Caracteristici: Morfologice - sunt limfocite mici - au acelai fenotip de suprafa (CD4+, CD28+) - se difereniaz ntre ele n clase doar n funcie de tipurile de IL elaborate 1. THp - limfocite TH imature (naive) - ele conin n genomul lor toate genele necesare sintezei de IL, dar, cu excepia genei pentru IL-2 restul sunt inhibate sau supresate - cnd sunt stimulate Ag ele pot rspunde printr-o producie de IL-2 - THp = helper productoare - Ca urmare a prelungirii n timp a cooperrii celulalre, ncet ele se matureaz suplimentar, devenind TH0 2. TH0 - n urma prelungirii stimulrii Ag Laura & Daniel 2

CURS 3 Populaiile limfocitare i markerii lor de suprafa - desupresia marii majoriti a genelor pentru IL - ncep s produc cantiti foarte mici din toate tipurile de IL (IL-2, IL-3, TNF, IFN- / IL-4, IL-5, IL-6 .... IL-10) - aceste mici cantiti de IL NU folosesc la nimic - din TH0 se constituie ulterior, ca urmare a prelungirii cooperrii celulare, forme finite de TH 3. TH1 - celule foarte mari productoare de IL-2, IL-3, TNF, IFN- - de regul amplific/stimulez RIC 4. TH2 - produc cantiti mari de IL-4, IL-5, IL-6 .... IL-10 - amplific/stimuleaz RIU Transformarea TH0-TH1-TH2 se realizeaz depinznd de condiiile de cooperare celular - prezena/absena de LB: Dac la cooperarea celular n nici o etap NU perticip LB => TH0 se transform obligatoriu NUMAI n TH1 Dac la cooperare sunt prezente LB => TH0 se transform obligatoriu n TH2 - transformarea depinde foarte mult de mecanismul de excludere reciproc. Excluderea reciproc se realizeaz prin IL produse de cele 2 tipuri de celule o TH1 inhib formarea de TH2 mai ales ca urmare a eliberrii de IFN-, care are efect distructiv pentru TH2 o TH2 inhib formarea TH1 n special prin IL-10, care are efect distructiv pe TH1 - la normal rspunsul fa de unul i acelai Ag se realizeaz ori prin RIU ori prin RIC; la normal NU exist rspunsuri mixte - unele IL sunt implicate n controlul RIU IL-2 - surse: THp, TH1, auxiliar TH0 - ele elibereaz IL-2 doar dac sunt complet activate (stimulate i cognitiv i NON-cognitiv) - producia de IL-2 e stimulat de IL-1 i IL-6 - aciune autocrin - aciune paracrin (IL-2 produs de o celul activat activeaz alte celule: LB, NK) - ambele aciuni sunt rezultatul stimulrii de ctre IL-2 a receptorului pentru aceasta (IL-2 R = CD25) CD25 - heterotrimer (, , ) - i au segmente extracelulare foarte lungi - la capetele N-terminal al , se asociaz i constituie situsul de legare al IL-2 - lanul e foarte lung - ca urmare a stimulrii CD25 de IL-2 apar semnale activatoare pe , , transmise ctre prfunzime doar prin lanul - e n contact cu o proteinkinaz care primind semnalelel fosforileaz intens i direct PLC => declanarea fosfatidilinozitolilor (elibernd IP3 i DAG) => stimularea prin IL-2 e o stimulare TCR-like - IL-2 activeaz diverse rspunsuri, n funcie de celula productoare: THp => stimuleaz RIU primare (la primul contact cu Ag) TH1 => stimuleaz RIC IL-4 - stimuleaz RIU secundare (apar la al n-lea contact cu acelai Ag) - surs: TH2 - stimuleaz RIU pentru c are efecte: stimuleaz producerea medular de LB stimuleaz producia i expansiunea pe membranele APC a moleculelor MHC II inhib producia de ctre LB a Ac de tip IgM, favoriznd producerea Ac de tip IgG pentru c ea activeaz un mecanism genetic mecanismul de SWITCH sau mecanismul de comutare izotipic IL-5 - surs: TH2 Laura & Daniel 2

CURS 3 Populaiile limfocitare i markerii lor de suprafa - stimuleaz de predilecie RIU de la nivelul mucoaselor - Efecte: Stimuleaz producia medular e LB i eozinofile Inhib producia de ctre LB a Ac de tip IgM, favoriznd producia Ac de tip IgA (activeaz mecanismul de SWITCH) b. Cooperarea limfoblati TH limfoblati B - are loc n ariile bursodependente ale organelor limfoide - vin n contact limfoblastul TH cu limfoblastul B i ncep s coopereze, mai nti cognitiv - n cooperarea cognitiv se stabilesc contacte Ag specifice i Ag nespecifice - contactele Ag specifice sunt ocazionate de prezentarea i recunoaterea anitgenic (pezentat NUMAI de limfoblastul B i recunoscut de limfoblastul TH) - limfoblastul B poate produce i expune molecule MHC II, orientnd Ag cu partea carrier ctre limfoblastul TH. Ea e recunoscut de TCR-CD3 => stimuli activatori pe calea TCR ce se soldeaz cu stimularea genelor pentru IL => limfoblastul TH produce i elibereaz diverse IL - contactele Ag nespecifice CD40 (pe limfoblastul B) CD40R (pe limfoblastul TH) => declanarea de stimuli acivatori pe calea CD40 ce conduc la activarea genelor pentru receptorii IL => pe suprafaa limfoblatilor B apar diferite categorii de receptori pentru IL => celulele ncep s coopereze NON-cognitiv - prin cooperarea NON-cognitiv => activarea toatl a limfoblatilor B care se transform n plasmocite (celule productoare de Ac) - se produc Ac diferii, n funcie de tipul de IL stimulatoare, respectiv n funcie de tipul de limfoblast TH - exist 3 situaii: o limfoblastul B stimulat de IL-2 (THp) => Ac de tip IgM o limfoblastul B stimulat de IL-4 (TH2) => Ac de tip IgG o limfoblastul B stimulat de IL-5 (TH2) => Ac de tip IgA

Imunoglobulinele (anticorpii)
Ig sunt glicoproteine prezente n plasm, lichidele extracelulare, i secreii i sunt molecule dotate cu proprieti de Ac, adic au capacitatea de a se combina specific i sunt responsabile de recunoaterea Ag inductor (declanator) al RI. Ac - sunt implicai n finalizarea RIU - sunt implicai n iniierea RIC (funcie de opsonine)

Structura de principiu a Ac - indiferent de clas, Ac sunt constituii din asocierea a 2 perechi de lanuri - forma monomeric e format din asocierea unei perechi de lanuri grele (DH) i una de lanuri uoare (DL) 1. DH - lungi, constituite din numr mare de aa => au greutate molecular foarte mare - se asociaz ntre ele prin puni disulfurice 2. DL - scurte, constituite din numr mic de aa => au greutate molecular mic - ele sunt asociate la lanurile DH prin puni disulfurice Dei sunt diferite ntre ele, cele 2 perechi de lanuri au caracteristici comune: Laura & Daniel 2

CURS 3 Populaiile limfocitare i markerii lor de suprafa - sunt paralele ntre ele (NU e un paralelism liniar, ci unul helicoidal sau spiralar; fiecare lan se nfoar n jurul celui cu care se asociaz prin puni disulfurice. DL execut o hemispir 180 o n jurul DH la care se asociaz; DH se spiraleaz reciproc unul n jurul celuilalt. Aceast asociere face ca ele s aib o configuraie globuloas) - sunt unidirecionate (orientate cu capetele N-terminale n aceeai direcie) - n alctuirea acestor lanuri intr 2 categorii de secvene: a.) secvenele variabile ale lanurilor grele i uoare, constituite din primii 110 aa, la capetele N-terminale (V). Sunt poziionate n oglind => se asociaz ntre ele i constituie cte o mic cavitate ce poart denumirea de situs combinativ pentru Ag (SCAg), n care e recunoscut cte 1 determinant antigenic conformaional, situat la exteriorul Ag nativ. Cele 2 situsuri sunt identice din p.d.v. structural => prin ambele situsuri e recunoscut ntotdeauna un singur Ag conformaional => Ac sunt structuri de recunoatere monospecifice. b.) secvenele constante sunt poziionate ctre captul C-terminale al lanurilor. Ele sunt responsabile de unele efecte biologice ale Ac (activarea cascadei complementului pe calea clasic, fixarea Ac pe suprafaa micro i macrofagelor, pasajul transplacentar al Ac de la mam la ft). Cele ale lanurilor uoare au aproape aceeai structur n cadrul tuturor claselor de Ig = secvene publice. Cele ale lanurilor grele au aceeai structur doar n cadrul unei singure clase (un singur izotip) => 5 clase de Ig. IgG - Ac prototipici Caracteristici generale - se afl n concetraiile cele mai mari n raport cu celelalte clase (variaz ntre 1000-1500 mg/dl). Ei formeaz 75% din totalul Ac din organism - sunt Ac distribuii n cote egale ntre sectorul intravascular i cel extravascular (n lichidele interstiiale, respectiv intratisular) - sunt Ac cu durata de via cea mai mare (variind ntre 3-4 sptmni). Excepie fac IgG 3, care au o durat de via scurt (5-7 zile) Structura - sunt Ac forme monomere - lanurile grele (DH) - sunt formate din aproximativ 450 aa - sunt lungi sau foarte lungi (pn la 130 ) - au GM mare, 45-46 kda - excepie IgG3, care au lanuri grele formate din mult mai muli aa i au GM mai mare - NU sunt lanuri liniare, ci sunt organizate n bucle sau domenii, fiecare domeniu fiind alctuit din aproximativ 110 aa, domenii ce apar ca urmare a existenei unor puni disulfurice intracatenare - pe fiecare lan DH exist 4 domenii cu particulariti structurale i funcionale diferite - primul domeniu e situat mereu pe exterior - apoi domeniul 2 e poziionat spre interior - apoi lanul greu trece de partea opus i avem domeniile 3 i 4 - domeniile N-terminale sunt constituite din secvene de aa variabile sau hipervariabile = VH - celelalte domenii sunt toate constante = CH1, CH2, CH3 - poriunea situat ntre CH1 i CH2 = zon balama. Ea e important pentru c reprezint poriunea din lanurile grele dotat cu cea maximum de flexibilitate, favoriznd net contactul Ac cu determinani Ag conformaionali de la suprafaa Ag nativ. n zona de balama lanurile grele se asociaz ntre eleprin puni disulfurice; n funcie de numrul acestora i repartiia lor distingem 4 subclase sau 4 izotipuri de Ac de tip IgG: IgGI exist 2 puni disulfurice, situate ntre punctul de intersecie i CH2 IgGII exist 4 puni disulfurice, situate 2 cte 2 de o parte i de alta a punctului de intersecie IgGIII exist 15 puni disulfurice, situate ntre punctul de intersecie i CH2 Laura & Daniel 2

CURS 3 Populaiile limfocitare i markerii lor de suprafa IgGIV exist 2 puni disulfurice, situate fiecare de o parte i de alta a punctului de intersecie - n funcie de numrul de puni disulfurice, se condiioneaz, printre altele, i durata de via a acestor Ac. Obinuit, ntre durata de via i numrul de puni disulfurice exist o relaie de invers proporionalitate. Pe msur ce numrul de puni e mai mare pot suferi atacul enzimelor sau radicalilor liberi de O eliberai de factorii proceselor inflamatorii. - lanurile uoare (DL) - alctuite din aproximativ 215 aa - au o lungime de aproximativ 60 de - GM aproximativ 20-22 kda - organizate n bucle sau domenii, 2 pe fiecare lan uor - primul domeniu e situat n interiorul moleculei - cel de-al doilea e orientat spre exterior, lanurile uoare se spiraleaz n jurul celor grele - domeniul N-terminal e constituit din aa variabili i hipervariabili = VL - cellalt domeniu e constant sau aproape constant = CL - se cunosc 2 tipuri de lanuri uoare: K 2/3 din totalul lanurilor uoare 1/3 din totalul lanurilor uoare 2 fragmente: Fab (de legare a Ag) Fc (constant, cristalizabil) Funciile i structura Fab al IgG - rol foarte important n recunoaterea Ag - prin el pot recunoate orice tip de Ag nativ (Ag solubil, jucnd rol important n eliminarea lor sub form de complexe imune de ctre micro sau macrofage) - prin el pot recunoate Ag corpusculare (IgG funcioneaz ca opsonine i favorizeaz endocitarea Ag de ctre macrofage) - recunoaterea antigenic e realizat prin situsul combinativ pt Ag (SCAg) Structura i funcia SCAg o cavitate de dimensiuni reduse (30-10-6 ) rezultat n urma plicaturrii VH-VL, care permite att acomodarea Ag, ct i angajarea de legturi cu acesta prin potrivire de form sau complementaritate plicaturarea ce st la baza SCAg e rezultatul existenei unor puni disulfurice intradomeniu n cadrul fiecrui domeniu exist 3 puni ce creeaz 3 plicaturi n cadrul SCAg distingem 2 categorii de secvene: secvenele de aa ce particip la realizarea recunoaterii Ag (ele sunt constituite din 8-15 aa i sunt situate la nivelul vrfului intern al plicaturii. Ele realizeaz contactul cu Ag prin potrivire de form (complementaritate) = regiuni determinante ale complementaritii CDR adic CDR1, CDR2, CDR3) secvenele Fr (framework region) nu sunt implicate direct n stabilirea contactului cu Ag, ele sunt pereii cavitii cele mai importante in funcia Ac sunt regiunile CDR cele 6 CDR formeaz paratopul (substructura din SCAg care este direct responsabil de angajarea unor legturi specifice cu Ag inductor) caracteristica fundamental a paratopului e specificitatea legturii Ag-Ac. Ea ine de: natura aa care intr n constituia CDR, numrul aa prezeni n CDR i poziionarea n spaiu a plicaturilor (a celor 6 CDR), dependent de zona Fr plicaturarea VH, VL poate avea 2 efecte distincte: - favorizeaz net recunoaterea Ag - poate n unele situaii s transforme SCAg n determinani Ag conformaionali, pentru c prin asocierea CDR se pot constitui secvene de aa ce pot fi ori rar ntlnite n Laura & Daniel 2

CURS 3 Populaiile limfocitare i markerii lor de suprafa organism, ori chiar unice, nemaintlnite n organism. Ele se pot comporta ca structuri antigenice = idiotopi = componenta Ag a oricrui SCAg idiotopii pot fi interni, externi sau micti totalitatea idiotopilor = idiotip (specificitatea Ag a oricrui SCAg) => SCAg poate avea 2 caliti aparent contrarii - el e o structur de recunoatere Ag - poate fi o structur Ag n sine. Idiotopii sunt structuri intens imunogene => RI fa de un Ag NU e unic, ci un rspuns repetitiv, ntreinut de cateva ori. Rspunsul se repet pn cnd se formeaz Ac antiidiotip, numii copia intern a Ag. Copia intern a antigenului - RIU are ca rezultat Ac care prezint SCAg complementare Ag inductor - e posibil ca aceti Ac s prezinte n SCAg idiotopi. Ei se vor comporta ca noi structuri Ag rezultnd declanarea unui alt RIU specific, caracterizat prin generarea de Ac specifici, ce prezint un SCAg complementar al generaiai anterioare. Ac nou formai sunt Ac antiidiotip. SCAg al Ac antiidiotip seamn conformaional cu conformaia spaial a Ag inductor = imaginea intern a Ag (ea limiteaz RIU) Funciile i structura Fc al IgG CH2 - rol n declanarea cascadei complementului pe calea clasic - realizeaz funcia printr-o secven de aproximativ 600 aa capabili s angajeze legturi cu o component a complementului (C1q) => se declaneaz cale clasic. Nu are loc spontan, ci doar dup ce Ag a fost recunoscut ca Ag specific - ca urmare a recunoaterii Ag apar modificri conformaionale n lanul H, care se transmit din aproape n aproape n sens ortodromic (N-C) care contribuie la exteriorizarea secvenei de aa capabil s lege componenta C1q a complementului CH3 - rol n fixarea Ac de membrana macro i microfagelor
- Ac sunt importani n medierea fagocitrii (sunt Ag corpusculare) - fixarea IgG pe micro i macrofage se face NU prin contact direct, ci prin receptori: FcR - exist 3 categorii de receptori FcRI CD 64 FcRII CD 32 FcRIII CD 16 FcR1 - receptori de nalt afinitate pt IgG (fixeaz cu aviditate IgG, dar selectiv. Ei fixeaz n special IgG1 i IgG3, mai

puin IgG2 i deloc IgG4 - distribuii pe membrana macrofagelor, suprafaa neutrofilelor i pe celulele K (Killer) - 2 componente: una receptorial (glicoprotein transmembranar ce prezint n segmentul extracelular 2 bucle, segment intracitoplasmatic foarte scurt) i o component de transducie a semnalului activator (2 lanuri identice ntre ele cu lanuri receptoriale foarte lungi = lanuri (segmente intracitoplasmatice foarte lungi)
- el e capabil s fixeze Ag corpusculare opsonizate prin IgG. Fixarea se face prin legturi din domeniul N-terminal al componentei receptoriale i domeniul CH3 al IgG => semnale activatoare ce se transmit ctre poriunea intracitoplasmatic NUMAI prin lanurile - funcia lui:

Macrofage fagocitare/endocitare a Ag corpusculare opsonizate prin IgG NK captarea Ag corpusculare opsonizate prin IgG. Endocitarea nu e posibil de obicei (diametrul redus al celulelor NK) rezultnd activarea lor i n final eliberarea unor mediatori distructivi: enzime, radicali liberi de O, perforine. Distrug Ag corpusculare extracelular i fragmentele pot fi endocitate (procesul = ADCC citotoxicitate celular anticorp dependent)

FcR2 - joas afinitate pentru IgG, neselectiv - pe suprafaa monocitelor, macrofagelor, pe membrana granulocitelor i la nivelul sinciiotrofoblastului

- o singur component care ndeplinete funcia de receptor i transductor - glicoprotein transmembranar care n poriunea extracelular prezint 2 bucle (domenii) i dispune de un segment intracitoplasmatic foarte lung Laura & Daniel 2

CURS 3 Populaiile limfocitare i markerii lor de suprafa - funcie: pe macrofage endocitarea Ag corpusculare opsonizate prin IgG pe granulocite mediaz ADCC n sinciiotrofoblast joac rol important n pasajul transmembranar al IgG de la mam la ft
FcR3 - joas afinitate pentru IgG - NUMAI pe suprafaa celulelor K i NK

- receptor definitoriu: celulele k i NK = celule CD16+ - 2 componente distincte: receptor (structur Ig like), transductor - receptorul are cte 2 domenii extracitoplasmatice i un segment intracitoplasmatic foarte lung - transductor: lanuri lungi
- funcie:

mediaz ADCC Particulariti funcionale ale subclaselor de IgG IgG1 - subclas major, 900mg/dl - sunt buni activatori de complement - sunt Ac responsabili de imunizarea pasiv a nou-nscutului (trec uor prin placent) IgG2 - clas minoritar, 30mg/dl - sunt slabi activatori de complement IgG3 - concentraie de 100mg/dl - sunt mai buni activatori de complement dect IgG2 IgG4 - concentraii mici, 50mg/dl - NU sunt activatori de complement Ac de tip IgG sunt caracteristici pentru RIU secundare (apar dup cel de-al doilea contact cu acelai antigen) IgM Caractere generale - concentraii de 120-130mg/dl - durat de via scurt (7-10 zile) - sunt forme pentamerice, formai din 5 monomeri asociai printr-o pies de jonciune cu GM de 900 kda. Lanurile grele de IgM sunt mai lungi. Ele conin 5 domenii (1 variabil i 4 constante) Funcii - o prim linie de aprare antibacterian i antiviral - acioneaz ca Ac aglutinani - dintre toate categoriile de Ac sunt cei mai activatori de complement pentru c dispun de 2 domenii activatoare de complement (CH2 i CH3) i sunt forme pentamerice, nu monomerice ca IgG (dispun de 20 de situsuri activatoare de complement i NU doar de 2) - sunt caracteristice pentru RIU primare

Clasificarea RIU
1. Primare 2. Secundare 1. Primare Laura & Daniel 2

CURS 3 Populaiile limfocitare i markerii lor de suprafa se formeaz Ac NUMAI IgM pentru c la primul contact cu Ag la cooperarea cu APC particip doar LTHp, care produc i elibereaz IL-2 care NU activeaz mecanismul de SWITCH (comutare izotipic) concentraia de IgM e moderat crescut pentru c la primul contact cu Ag particip clone limfocitare TH i B neexpansionate durata hiper IgM e limitat n timp pentru c Ac IgM au durat scurt de via (conin un numr mare de puni disulfurice) i pentru c la primul contact cu Ag NU exist nc clone T/B cu memorie 2. Secundare se formeaz Ac NUMAI IgG pentru c la al n-lea contact (contacte repetitive) cu acelai Ag la cooperarea cu APC particip LTH2 care produc IL-4 care e capabil s activeze mecanismul de SWITCH, producia de IgM fiind inhibat concentraiile de IgG sunt mari sau foarte mari pentru c la contacte repetitive cu acelai Ag particip clone T sau B deja expansionate ca urmare a contactelor Ag precedente durata hiper IgG e prelungit n timp (3 4 sptmni) pentru c IgG au o durat de via lung i pentru c particip clone T/B cu memorie imunologoic

Retrocontrol RIU
Definiie: Cuprinde totalitatea influienelor inhibitorii rezultate n urma stimulrii/aciunii limfocitelor TS ce au drept scop inhibiia cooperrii dintre limfoblatii B i limfoblatii TH Ag specifici i limitarea sau frnarea RIU n curs de desfurare. - retrocontrolul RIU se bazeaz pe aciunea TS

Limfocitele Ts - NU se cunosc foarte bine toate categoriile TS (5 6 clase)

a) b) TS Ag specifice din punct de vedere fenotipic sunt celule CD8+ i CD28recunosc NUMAI Ag expuse pe membrane APC n complex cu moleculele MHC I elaboreaz anumii factori inhibitori a cror prezen e dovedit,dar NU se tie structura lor au o funcie inhibitorie mai general (pot inhiba fie RIU, fie RIC) TS idiotip specifice fenotipic sunt celule foarte heterogene: aproximativ 35 40% din ele sunt celule CD4+, 60-65% sunt celule CD8+ se numesc idiotip specifice pentru c ele recunosc prin receptorul lor de suprafa partea Ag a unor receptori Ag (idiotip) - elaboreaz anumii factori inhibitori, numii TSF, ce rezult din solubilizarea/eliberarea receptorilor lor Ag de supraf Structura receptorului Ag de suprafa a TS idiotip specifice - receptorul Ag are structur total difeit de TCR - e un complex format din 3 piese distincte: 1. Receptorul Ag prpriu-zis - are structur Ig-like - NU e un receptor transmembranar 2. E ataat prin puni disulfurice la o molecul MHC II (varietatea E). i ea e plasat n afara membranei celulare 3. Molecula MHC II E e ataat indirect la membran printr-o pies de jonciune (glicoprotein transmembranar) - cnd e stimulat Ag receptorul se activeaz (NU se tie cum) i n urma activrii => eliberarea componentei extramembranare (MHC II E i receptorul Ag, care devine un receptor liber. n aceast calitate el e receptor Ag n continuare i are funcie inhibitorie de TSF => inhib RIU) Laura & Daniel 2

CURS 3 Populaiile limfocitare i markerii lor de suprafa Clasificarea TS idiotip specifice - 3 categorii de limfocite: 1. TS inductorii - CD4+ - Funcie de a inhiba LB Ag specifice 2. TS transductorii - CD8+ - Funcie de a inhiba cele 2 categorii de limfoblati ce particip la RIU (limfoblast B i TH Ag specific) 3. TS efectorii - CD8+ - Funcie de a inhiba LB Ag specifice Caractere commune: - NU acioneaz NICIODAT independent unele de altele - Ele se stimuleaz reciproc n etape successive: a. primele stimulate sunt TSi b. TSi activate stimuleaz TSt c. TSt activate stimulez TSe ele formeaz cascada T supresoare - ele sunt activate de structuri Ag diferite: TSi sunt activate de partea haptenic a Ag, concurnd cu LB TSt i TSe sunt activate de idiotopii unor TSF => ele sunt singurele idiotop specifice - cascada T supresoare se activeaz n general trziu, mult dup apariia primelor cantiti de Ac - funcia general a cascade T supresoare const n inhibiia secvenei de activare a RIU Cooperarea APC-NON B i LTH (n ariile timodependente) - APC expun pe suprafaa lor n complex cu MHC II (varietatea A) Ag inductor (format dintr-o parte haptenic i una carrier) - Carrierul e recunoscut de TCR de pe TH => cooperarea cognitiv - Rezultat: activarea TH i migrarea lor, trecnd din aria timodependent n aria bursodependent, unde se transform n limfoblati TH - Aici ei ateapt limfoblatii B cu care ar urma s coopereze - Cascada T supresoare e activat ca urmare a elaborrii de ctre aceleai APC de molecule de MHC II E. prin intermediul lor acelai Ag e prezentat ctre limfocitele TS, prin partea sa haptenic. Partea haptenic e recunoscut de TSi. Ca urmare a recunoaterii, se activeaz TSi i pune n libertate recptorul Ag de suprafa (TSF1) TSF1 - aciune inhibitorie: TSF1 difuzeaz larg n ntreg organismul, pn cnd ajunge la focarul Ag. Aici TSF1 recunoate partea haptenic a Ag. n urma recunoaterii se constituie n focarul Ag complexe TSF1 Ag. Constituirea lor echivaleaz cu blocarea Ag = diminuarea cantitii de Ag liber disponibil pentru stimularea LB => de butul inhibiiei RIU - aciune activatoare: TSF1 n SCAg prezint idiotopi, mai ales idiotopi interni => el se comport ca o nou structur Ag care va activa morfologic TS din cascad. Activarea TSt care prezint pe suprafaa lor receptori complementari pentru TSF1. Rezultat: activarea TSt ce pune n libertate receptorii de suprafa (TSF). TSF2 din punct de vedere structural e identic cu partea haptenic a Ag inductor, ns difer n restul moleculei (are alt parte carrier). TSF2 exercit 2 efecte contrare: TSF 2 - aciune inhibitoare: difuzeaz larg n tot organismul, pn ajunge n ariile bursodependente. Aici TSF2 e recunoscut de ctre LB n calitate de Ag (confund Ag cu TSF2). LB preia TSF2 i se activeaz i se transform n limfoblast B. n acest stadiu, prin intermediul MHC II expune TSF2 ctre limfoblatii TH, prezentnd TSF2 prin partea carrier. De data aceasta limfoblastului TH i este prezentat o alt parte carrier dect cea pe care o recunoate => cele 2 categorii de limfoblati NU pot coopera => n final limfoblastul B NU se mai activeaz TOTAL => limfoblastul B NU se mai poate transforma n plasmocit => e sistat complet producerea de Ac Laura & Daniel 3

CURS 3 Populaiile limfocitare i markerii lor de suprafa - aciune activatoare: ca nou structur Ag activeaz o nou categorie de TS din cascad: TSe, care prezint i ele receptori complementari pentru TSF2. Rezultat: elibereaz recptorul de suprafa TSF3 TSF3 - identic cu TSF1 la partea receptorial (Situsul de recunoatere pentru Ag), ns difer n rest (partea carrier). Difuzeaz i el larg i ajunge n focarul Ag, unde ca i TSF1 blocheaz Ag => LB NU mai pot fi activate Particulariti funcionale ale celor 2 secvene ale RIU 1) cele 2 secvene sunt mult decalate n timp (NICIODAT NU se desfoar simultan). Decalarea ine de faptul c APC NON-B elaboreaz n 2 etape diferite cele 2 categorii de molecule MHC II: prima e MHC II A => RIU, iar dup un interval de timp ndelungat MHC II E => Retrocontruol RIU 2) cele 2 secvene sunt echilibrate funcional: - sunt activate de ctre una i aceeai APC NON-B, care ns prezint cantiti echivalente de Ag n cele 2 secvene - la stimularea realizat de APC NON-B rspunde un numr echivalent de TH i de TSi (ambele sunt CD4+) - ntre cantitatea de Ag utilizat n declanarea RIU i cantitatea de TSF2 rezultat din retrocontrolul RIU exist un raport de echivalen. TSF2 e identic cu Ag inductor la partea haptenic, diferind de Ag la partea carrier => TSF2 = copia intern a Ag cu efect frenator Ag n cadrul RIU e utilizat n 2 ipostaze: 1. original = declanarea RIU 2. copie = frenarea RIU (retrocintrolul RIU)

Sistemul complement
= un sistem multienzimatic format din 25-30 de componente care n cadrul RIU joac rolul unui mecanism efector auxiliar ce ndeplinete 2 funcii majore: a. definitivarea aciunii Ac pe Ag b. realizarea unei recunoateri imunologice nespecifice a structurilor non-self care de regul sunt Ag - cele 2 funcii pot fi exercitate separat sau simultan A. Definitivarea aciunii Ac pe Ag - unica funcie a Ac const n recunoaterea Ag, fr ns ca acetia s aib efect decisiv asupra Ag - prin efect decisiv nelegem: distrugerea Ag (mecanism obligator necesar pentru Ag corpusculate: bacterii, virusuri, parazii) i ndeprtarea Ag (mecanism eficient n cazul Ag solubile: proteine, glicoproteine, oligozaharide) 1) Distrugerea Ag corpusculate - bacteria prezint pe suprafaa ei determinai Ag conformaionali - ea e recunoscut de ctre Ig prezente n lichidele interstiiale (IgG) - Ac recunosc determinanii de suprafa i se depun pe suprafaa bacteriilor, realiznd opsonizarea acestora - bacteria poate tri foarte bine cu orice cantitate de Ac pe ea - efect decisiv = aciunea complementului. Ac recunosc determinanii Ag de supraf prin catul lor Fab => apar modificri conformaionale n lanurile H de IgG ce conduc la exetriorizarea situsului activator de complement plasat la nivelul domeniului CH2. prin aciunea lui => exetriorizarea unei secvene de aa capabil s activeze subunitatea C1q a complementului. Odat activat, C1q => declanarea cascadei complementului pe calea clasic i n final => formarea MAC (complex de atac al membranelor). Acesta se organizeaz sub forma unor structuri tubuliforme ce se inser multiplu n membrana bacterian i creeaz largi comunicri ntre mediul intracelular i extracelular. Rezultat: alterarea grav, ireversibil a gradientelor ionice de o parte i de alta a membranei bacteriei => hidratarea supracaut a acestei particule => se rupe mebrana cu liza osmotic a acestei particule 2. Ideprtarea Ag - Ag solubile declaneaz RIU traduse prin formarea de Ac Laura & Daniel 3

CURS 3 Populaiile limfocitare i markerii lor de suprafa - Ac difuzeaz larg n ntreg organismul pn cnd ajung i n focarul Ag. Aici are loc recunoaterea Ag, iar rezultatul recunoaterii e formarea de complexe imune Ag-Ac - La normal acestea au ca particularitate faptul c se organizeaz sub form de reele - Ele se ncarc rapid cu diveri factori solubili, mai ales C3b a complementului. Aceasta provine din funcionarea permanent a cii alterne. Dup activare cu C3b, complexele imune pot fi ndeprtate (endocitate de Mcf rezidente n esuturi ele prezint CR pe suprafa i pot angaja legturi cu C3b). complexele imune sunt n final distruse intramacrofagic, odat cu acestea fiind distruse i Ag prinse n ele. Dac complexele imune se formeaz intracirculator, dup ce au fost saturate cu C3b sunt ataate pe suprafaa eritrocitelor, care i ele prezint receptori pentru complement. Apoi sunt transporatte de acestea pn la SRE (sistemul reticulo-endotelial). Aici complexele imune sunt preluate de Mcf rezidente obinuit aici => endocitarea i distrugerea complexelor imune, inclusiv Ag din structura lor B. Recunoaterea imunologic nespecific a structurilor non-self - in de proprietatea C3b a complementului de a se depozita obligatoriu pe membranele celulare - C3b odat generat NU rmne NICIODAT n faz fluid, ci se depoziteaz pe membranele celulalre, dac acestea sunt acceptoare de complement - NU accept depozitarea complementului membranele self pentru c sunt protejate anticomplement - Membranele non-self NU sunt protejate, ele permind depozitarea C3b - Ca urmae a funciei permanente a cii alterne => continuu cantiti mici de C3b - C3b NU rmne n faz fluid, ci se depoziteaz pe mebranele celulalre - Membranele self NU accept complement (au receptori ce mpiedic ataarea C3b) - Membranele non-self accept C3b ( NU au recptori ce mpiedic ataarea C3b) => un strat de molecule de C3b (opsonizarea prin C3b a membranelor non-self) - Structura non-self = structur Ag => recunoatere imunologic nespecific (depozitarea se realizeaz pe orice membran, indiferent de specificitatea Ag propriu-zis) A i B pot fi coroborate - n cadrul aceluiai RIU - complementul intervine n etapa de iniiere i finalizare a RIU - NICIODAT NU particip n etapa de desfurare a. n etapa de iniiere - prin opsonizare favorizeaz net captarea de ctre APC a Ag corpusculare. Odat captate => activarea APC, cooperarea cu TH, cooperarea cu LB, etc. la finele cooperrii => formarea de Ag specifici care recunosc Ag corpusculate dup determinatul Ag de suprafa. n acest moment final intervine din nou complementul b. Ax activeaz C1q => declanarea cascadei complementului pe calea clasic, cu formarea MAC => liza osmotic a bacteriilor Caracterele funcionale ale sistemului complement 1. Funcioneaz pe principiul cascadei - majoritatea factorilor complementului sunt prezeni n circulaie sub form de zimogeni (enzime inactive) - dca un zimogen e activat => generarea enzimei, care la rndul ei activeaz alt zimogen, etc 2. Activarea zimogenului n enzim - activarea se realizeaz prin proteoliz limitat, n urma ei => 2 fragmente cu structur i funcie diferite - zimogenul X e activat => 2 fragmente: unul mic, Xa i unul mare Xb - Xa rmne n faz fluid, n lichidul interstiial. Unde exercit efecte proinflamatorii - De cele mai multe ori, Xb sunt fragmente enzimatice. Ele NU rmn NICIODAT n faz fluid, ci se depun pe mebranele celulare acceptoare de complement (non-self) 3. Reaciile enzimatice ale complementului se desfoar NUMAI pe mebranele celulare i ca urmare a parcurgerii mai multor etape se constiutie n final complexe enzimatice multifactoriale - Xb activeaz pe zimogenul Y, pe care l cliveaz => Ya i Yb care se depune pe membranele celulare (NU la tmplare, ci n contact cu perecedentul) => un complex bimolecular pe membrana celular (XbYb) Laura & Daniel 3

CURS 3 Populaiile limfocitare i markerii lor de suprafa 4. Continuitatea reaciilor pe suprafaa membranelor celulare e asigurat i de comutarea specificitii de substrat a unora din enzimele depoziate - n contact cu fragmentele depozitate (Yb), enzima Xb sufer modificri conformaionale care conduc la modificarea specificitii de substrat => Xb NU mai acionez asupra zimogenului Y, ci pe unul nou (Z), pe care l cliveaz n 2 fragmente: Za i Zb care se ataeaz la complex => complexe trimoleculare (XbYbZb) - o enzim si poate modifica specificitatea de substrat o singur dat Organizarea de ansamblu a sistemului complement - asemntoare cu sistemul coagulrii (2 ci cu o parte comun) A. Partea comun - evenimentul central e reprezentat de conversia C3 n C3b - conversia se face sub aciunea C3 converatzelor (4) - C3 convertazele rezult din activarea unor ci diferite: 1. calea clasic a complementului - declanat n urma recunoaterii imunologice specifice - structurile Ag sunt recunoscute prin Ac => activarea C3 convertazei 2. calea altern a complementului - funcionez permanent la un nivel de intensitate sczut - ea se poate amplifica ca urmare a opsonizrii membranelor non-self (nvelirea prin C3b) => o serie de etape ce duc la activarea C3 convertazei => activarea C3 n C3b, care la rdul sa activeaz factorii din faza terminal (C5, C6, C7, C8, C9) => MAC => liza osmotic a membranelor non-self Calea clasic a complementului - implic participarea unor factori notai cu C C1 - complex trimolecular: a. C1q - unitate de recunoatere a complexelor imune (Ag-Ac) - se afl n concentraii mici (70g la ml) - structur: 6 subuniti identice ntre ele, asociate 2 cte 2, cu formarea a 3 uniti tot identice ntre ele Fiecare subunitate are o parte lung i une globuloas Cele 2 subuniti sun asociate ntre ele prin puni disulfurice Fiecare subunitate e format din asamblarea a 3 lanuri: A, B, C Lanurile A, B, C n poriunea N-terminal (liniar) adopt o conformaie colagen-like (formeaz un triplu helix), iar ctre captul C-terminal ele adopt o conformaie globuloas Funcii: Poriunea globuloas e direct rspunztoare de recunoaterea complexelor imune membranare. Recunoaterea se face ca urmare a exteriorizrii secvenelor activatoare de complement (60aa) prezente n structura Ig. Aceste secvene sunt situate la nivelul CH2 (IgG) sau CH2+CH3 (IgM). Ea e exteriorizat dup ce Ig a recunoscut Ag i atunci apar modificri conformaionale n lanurile H ce se transmit pn la domeniile respective i contribuie la exteriorizarea secvenei activatoare de complement. Secvena e recunoscut prin complementaritate de o secven prezent n poriunea globuloas a C1q => legturi complexe imune C1q. C1q sufer i el modificri conformaionale n fiecare subunitate ce se transmit antidromic (C-terminal N-terminal). Rezultatul modificrilor: exetriorizarea unor secvene de aa prezente n poriunea liniar a fiecrei subuniti de C1q. Ea poate ataa C1r, care se activeaz i fixeaz C1s, care se activeaz => s-a constituit complexul trimolecular C1qC1rC1s b. C1r c. C1s Laura & Daniel 3

CURS 3 Populaiile limfocitare i markerii lor de suprafa - cliveaz n 2 etape succesive faciunile C4 i C2 => cascada complementului pe calea clasic.

C3 - considerat a fi componenta central a complementului pentru c: 1. scioneaz pe 2 ci 2. n raprt de ali factori, se afl n concetraiile cele mai mari (0,5 1,5 mg/ml) Structura i funcia C3 - heterodimer cu GM = 280kDa - 2 lanuri: a. (mai mare, GM 110kDa) b. (mai mic, GM 70kDa) - ele sunt asociate prin puni disulfurice => heterodimeri - sunt lanuri bidirecionale (N-terminal, C-terminal n direcii opuse = antiparalele) a. lanul -prezint ctre captul C-teerminal un buzunar hidrofob care realizeaz o internalizare relativ a unei grupri tiolesterice (relativ internalizat pentru dechiderea acestui buzunar e destul de larg) b. lanul - la lanul se asociaz prin puni disulfurice la captul N-terminal - el prezint la captul lui N-terminal o secven de aa capabil s ataeze C5 Mecanismele activrii C3 - pe 2 ci distincte: 1. enzimatic permite funcia C3 n ambele ci 2. non-enzimatic funcia C3 strict din calea altern a complementului 1. Enzimatic - se realizeaz prin clivarea C3 sub aciunea unor enzime nuite C3 convertaze. Ele pot fi generate att pe calea clasic, ct i pe calea altern. Ele cliveaz doar lanul C3 undev ctre captul N-terminal, n afara punii disulfurice, care e mereu conservat - ca urmare a lizrii => eliberarea captului N-terminal al lanului , acest mic fragment rezultat = C3a - C3a: Rmne NUMAI n faz fluid Local C3a exercit efecte de anafilotoxin n sensul c are aciune proinflamatorie sau proflogistic (vasodilataie local, creterea permeabilitii capilare, efect clonotacic pentru leucocite) - retul de factor = C3b C3b: fragment mare NU rmne NICIODAT n faz fluid, ci se depoziteaz pe suprafaa membranelor non-self Depozitarea C3b pe membranele non-self se realizeaz prin intermediul punii tiol-esterice, efect al unei succesiuni de evenimente: Ca urmare a secretrii , sufer modificri conformaionale ce se transmit din aproape n aproape n direcie ortodromic n final ajung la buzunarul hidrofob, pe care l relaxeaz n urma relaxrii => aducerea la suprafa a gruprii tiol-esterice Gruparea tiol-esteric e o grupare electronofil (e acceptoare de electroni) => ea poate angaja legturi cu unele grupri nucleofile (donare de electroni) prezente n structura membranelor (gruparea OH din structura glucidelor sau NH2 din structura proteinelor membranare) => depozitarea C3b pe membranele non-self Laura & Daniel 3

CURS 3 Populaiile limfocitare i markerii lor de suprafa Depozitarea C3b se soldeaz cu opsonizarea celulei non-self i recunoaterea imunologic nespecific a structurii non-self Rezultatul de ansamblu al depozitrii sunt modificri conformaionale de ansamblu n C3b => modificri ce se transmit de la la i n final ele contribuie la exteriorizarea secvenei de aa capabil s fixeze/ataeze componenta C5 a complementului => C3b are funcie de cofactor 2. Non-enzimatic - ine de particularitatea buzunarului hidrofob ce prezint o deschidere larg care permite ptrunderea lent, n cantiti mici i n permanen a moleculelor de ap - ptrunderea moleculelor de ap se soldeaz cu ruperea legturii tiol-esterice cu formarea de grupri COOH i SH => ruperea non-enzimatic a gruprii tiol-esterice => modificri conformaionale n ce se transmit n direcie antidromic - rezultatul modificrilor conformaionale: exteriorizarea unei secvene de aa capabil s fixeze componenta B a complementului (factor alctivator al cii alterne a complementului) => acum se declaneaz cascada complementului pe calea altern, ce funcioneaz permanent, cu o intensitate mic C4 - activeaz strict pe calea clasic a complementului - se afl n concentraii medii (400 500 g/ml) - e un heterotrimer (GM = 200kDa) Structur: a. (GM 90kDa) b. (GM 80kDa) c. (GM 30kDa) - cele 3 lanuri sunt ancorate ntre ele prin puni disulfurice i toate sunt unidirecionate a. - seamn foarte mult cu al C3 - prezint ctre captul C-terminal un buzunar hidrofob care realizeaz o internalizare strict a unei legturi tiolesterice - e strict internalizat pentru c deschiderea buzunarului e foarte mic => moleculele de ap NU au acces n buzunarul hidrofob (factorul C4 NU acioneaz pe calea altern) - la se asociaz prin puni disulfurice b. - blocant structural al C4 - e un fel de ax n jurul cruia se nfoar celelalte 2 c. - se asociaz la prin puni disulfurice - prezint ctre captul C-terminal o secven de aa capabil s fixeze componenta C2 a complementului Activarea C4 - NUMAI enzimatic - Enzima activatoare e subcomponent a complexului C1 (C1s) - C1s cliveaz DOAR lanul , undeva foarte aproape de captul N-terminal, cu ruperea punii disulfurice -

Hipersensibilitatea III
-este in RIU secundar, anormal / patologic caracterizat prin generarea unor cantitati excesive de complexe imune (CI) libere care activand intens cascada complementului pe calea clasica duc la generarea unor leziuni tisulare inflamatorii Acestea sunt de 2 tipuri - localizate,daca Ag declansator patrunde direct intratisular si CI se formeaza local Laura & Daniel 3

CURS 3 Populaiile limfocitare i markerii lor de suprafa - multifocale, daca Ag patrunde direct in circulatie si CI se formeaza intravascular si doar ulterior acestea se depoziteaza in diverse tesuturi si organe HS. III cuprinde 2 etape - generarea CI libere - generarea leziunilor tisulare inflamatorii acute 1.Generarea CI - HS III e o boala prin CI pentru ca generarea de CI e tipica pt. HS III HSIII = CI; reciproca e falsa Formarea de CI nu reprezinta un element patologic in sine intrucat generarea acestora insoteste in realitate evolutia oricarui RIU, indiferent daca acesta este normal sau patologic RIU normal - se formeaza cantitati mici de CI - CI sunt de dimensiuni mari - au intotdeauna efect protector, contribuie la indepartarea Ag RIU patologic - se formeaza cantitati mari de CI - CI sunt de dimensiuni reduse - sunt lipsite de efect de protectie, au efect patogen (induc leziuni tisulare) Generarea CI la normal - la normal formarea de CI reprezinta o etapa intermediara si obligatorie a oricarui RIU in cadrul careia CI nou formate marcheaza aparitia primelor cantitati de Ac si contribuie la epurarea/indepartarea Ag declansatoare - aceasta etapa apare in derularea oricarui RIU normal si reprezinta momentul central al dinamicii Ag si Ac in organism = totalitatea modificarilor cantitative si calitative suferite in timp (pe masura ce RI se desfasoara) de catre Ag care reprezinta elementul declansator al RIU si respectiv Ac care reprezinta elementul rezultant al RIU

- in prima etapa a curbei disparitiei Ag scaderea concentratiei se datoreaza captarii Ag de catre APC care preiau acest Ag si intr-o a-II-a etapa si datorita transportului Ag de catre APC catre ganglionii locoregionali unde il prezinta catre LTH care coopereaza cu LB - in ganglioni in final LB se activeaza si produc Ac care sunt lansati in circulatie si ajung si in tesutul antigenic -> debutul RIU - primele cantitati de Ac apar intr-un moment in care Ag e prezent din abundenta in organism; concentratia Ac creste progresiv pana ajunge la o valoare maxima - Ac formeaza cu Ag compexe imune; CI se formeaza in timpul hasurat pe desen - CI nu raman ca atare, ele sunt ulterior captate de macrofagele din sistemul reticuloendotelial (din ganglioni,splina etc.) -> internalizarea CI si in final CI sunt distruse mai ales in compartimentul lizozomal; prin distrugerea CI rezulta si distrugerea Ag si asa se ajunge la momentul Ag = 0 CI - formarea lor atesta realizarea recunoasterii imunologic specifice a Ag inductor Laura & Daniel 3

CURS 3 Populaiile limfocitare i markerii lor de suprafa - joaca rol important in epurarea Ag inductor - atesta eficienta RI - in timp, Ag si Ac se afla sub 2 forme distincte- Ag initial se afla in organism ca substanta iar ulterior sub forma de CI; Ac exista si ei sub 2 forme - initial - CI - ulterior - Ac ca atare Exista un interval de timp in care nici Ag, nici Ac nu exista ca atare, ci doar sub forma de CI. Acest interval in care nici Ag, nici Ac nu sunt dozabili = hiatus imunologic ce corespunde cu momentul formarii CI. Hiatusul imunologic exista si la normal si in conditii patologice: - la normal - are durata scurta - evolueaza cu generarea unor cantitati mici de CI - nu evolueaza cu un consum de complement - dozarea C3 e normala - patologic - durata lunga - evolueaza cu generarea unor cantitati mari de CI - concentratia factorului C3 e scazuta pt. ca se realizeaza un consum de complement Factorii de care depinde formarea CI: 6) aparitia primelor cantitati de Ac poate fi marcata prin intervalul Agi Aci (initierea raspunsului prin Ac) 7) timpul de contact Ac-Ag ce corespunde intervalului Aci Ag 0 Agi > Aci Aci > Ag 0 _________________(+) Agi -------------> Ag 0 => formarea de CI atat calitativ cat si cantitativ depinde de cantitatea si calitatea stimularii Ag Fazele curbei disparitiei Ag din organism: - scaderea concentratiei Ag din organism trece prin 3 faze distincte:

faza de difuziune respectiv de diluie a Ag - consta intr-o scadere pronunat a cantitii de Ag - dureaz puin (minute), echivalent timpului de recirculare a sangelui n organism - scade pt ca Ag administrat intravenos difuzeaza extravascular si in lichidul interstitial se dilueaza in intreg LEC Laura & Daniel 3

CURS 3 Populaiile limfocitare i markerii lor de suprafa - faza 1 nu are functie imunologica faza de clearance macrofagic a Ag - scadere putin pronuntata a concentratiei de Ag - dureaza 12 14 zile - se numeste asa pt. ca Ag e preluat de diversele macrofage - capacitatea de preluare a Ag de macrofage are 2 caracteristici: e mica/f. mica si e constanta in timp - unghiul (format din panta fazei 2 si orizontala) are cel mult 3 grade = gradul stimularii antigenice Macrofagele prezinta Ag catre TH ce vor coopera cu LB.In partea a-II-a a fazei 2 debuteaza RIU. Din acest moment incepe sa creasca concentratia Ac care are 2 caracteristici - e mare/f.mare - e aproximativ constanta de la moment la moment Producerea Ac poate fi cuantificata prin valoarea unghiului (45 60 grade). - corespunde cu gradul raspunsului prin Ac - e >> => la normal raspunsul prin Ac e excesiv,in raport de gradul stimularii Ag; la normal se elaboreaza o cantitate de Ac cu mult mai mare decat ar fi strict necesar pt. simpla recunoastere a Ag aceasta se datoreaza pt. ca in cadrul cooperarii LB incep sa se multiplice-> cresterea nr. LB per clona activata -> expansiune clonala -> producere excesiva de Ac Ac care se produc recunosc Ag -> formarea de CI la care participa un exces de Ac -> se organizeaza sub forma de retele si pot fixa f. usor C3b generata continuu pe calea alterna. CI se formeaza intravascular -> CI pot fi f. usor fixate pe suprafata eritrocitelor pt. ca prezinta receptori CR care angajeaza legaturi cu C3b. CI adsorbite pe eritrocite sunt ulterior transportate catre SRE (sist. reticulo-endotelial) in special din splina unde sunt endocitate de macrofage -> CI sunt distruse intramacrofagic ->se formeaza a-III-a faza faza de clearance imun a Ag (se numeste asa pt. ca Ag nu e indepartat ca atare, ci sub forma de CI) - scadere abrupta a concentratiei Ag - dureaza putin si ajunge la momentul Ag 0 La normal se formeaza doar cantitati f. mici de CI pt ca: - la normal RIU e declansat obisnuit de cantitati reduse de Ag - la normal timpul de contact e foarte redus prin productia excesiva de Ac care fixeaza f. rapid intreaga cantitate de Ag; => la normal CI are 4 caracteristici: - cantitati scazute de CI - CI nu sunt niciodata libere, sunt adsorbite pe suprafata unor celule - au efect protector, contribuie esential la epurarea Ag din organism - nu au efecte defavorabile pt. ca nu sunt libere In conditii patologice CI - se formeaza in cantitati excesive - sunt libere - sunt lipsite de efect de protectie - se insotesc de aparitia unor leziuni tisulare inflamatorii acute ce pot fi de 2 tipuri localizate,daca Ag patrund direct intratisular in organisme hiperimunizate, cu generarea unor cantitati mari de CI ce depasesc capacitatea macrofagelor locale de a le indeparta; ex: reactia Arthus - multifocale daca Ag patrunde direct in circulatia sistemica cu generarea de CI in cantitati excesive ce depasesc capacitatea macrofagelor din SRE de a le indeparta, ele depozitande-se ulterior in diverse tesuturi si organe; ex: RAA, boli autoimune

Laura & Daniel

CURS 3 Populaiile limfocitare i markerii lor de suprafa

Laura & Daniel