Genetica bacterian:

studiaz ereditatea i variabilitatea la bacterii; suportul material al ereditii este reprezentat de genomul bacterian, suma genelor unui microorganism; gena constituie unitatea funcional de baz a informaiei genetice;

Genetica bacterian
genomul bacterian este reprezentat de

- ADN cromozomal (include gene eseniale) - ADN plasmidic (conine gene care codific
caractere de tulpin);

genotip = totalitatea informaiei nscris n genomul bacterian; fenotip = suma caracterelor observabile consecutiv interaciunii genotipului cu mediul ambiant.

 De exemplu, cromozomul de Escherichia coli este format dintr-o: molecul circular dublu spiralat de ADN ce
reprezint 80% din greutatea lui;

component proteic: ARN-polimeraza (reprezint

10% din greutatea sa);

ARNm si ARNr n curs de sintetizare (10% din

greutatea sa).

Elemente extracromozomale
Plasmid informaie genetic extracromozomal Episom o form particular de plasmid, care este o unitate de material genetic, neesenial pentru genom, dar care se poate integra singur n genomul ADN al unei bacterii; rmne mult timp stabil, se replic o dat cu cromozomul bacterian i devine o component a acestuia (ex. episom care codific pilii sexuali sau care codific gene de rezisten la A). Bacteriofagi

 Plasmidele pot fi: - conjugative, care se pot transfera singure la alte bacterii, ca de exemplu plasmidele de rezistenta la antibiotice R, - neconjugative, care nu pot prsi ele singure bacteria de origine, ci numai prin intermediul unui alt plasmid conjugativ sau al unui bacteriofag (de exemplu plasmidul care codifica secreia de beta-lactamaz la S.aureus); - episomi, care se pot integra prin recombinare n cromozomul bacterian, pierzndu-i astfel autonomia de replicare (un exemplu de episom este factorul de sex F (plasmidul F) sau factorul de fertilitate).

 Plasmidele de virulen poart determinanii genetici ai unor factori de virulen la bacterii, ca de exemplu: - secreia de enterotoxina (termolabil i termostabil) i factorul de colonizare la Escherichia coli, - hemolizina la Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis i E.coli, - exfoliantina la S. aureus, - gena de invazivitate la Shigella etc.

 Plasmidele R (de rezisten) la chimioterapice (Factorul R) sunt molecule circulare de ADN care constau din doua regiuni genetice distincte: genele care codifica rezistena la antibiotice "R", care pot fi unice sau multiple i genele care confer plasmidului capacitatea de a se transfera "FTRA". Rezistenta la peste 90% din tulpinile de spital este de natura plasmidic.

Fenomenul de variabilitate genotipic - modificare brusc, transmisibil la descendeni a unuia sau a mai multor caractere prin dou mecanisme: mutaia; transferul de ADN de la un donor la un acceptor. Variaia fenotipic: - indus de interaciunea genomului cu factori de mediu; - este reversibil i nu se transmite ereditar; - are la baz controlul transcripiei genelor n ARNm i traducerii n sinteza proteinelor, prin inducia sau represia acestora.

Mutaia:
reprezint o modificare n secvena nucleotidelor ntr-o gen, datorit unei erori n cursul replicrii; eveniment rar, spontan i imprevizibil; mutaiile acumulate de-alungul a miliarde de ani, sub efectul seleciei naturale, explic evoluia speciilor;

Mutaia:
noile gene aprute prin mutaie se numesc alele i ocup acelai locus genetic ca gena de origine; mecanisme moleculare ale mutaiei: - substituia unei perechi de baze printr-o alt pereche, cu nlocuirea unui codon printr-un alt codon; - inseria sau deleia uneia sau a mai multor baze, cu decalarea citirii mesajului genetic.

 Rata mutaiei = probabilitatea de apariie spontan a unei mutaii ntr-o populaie bacterian; rata mutaiei este foarte sczut (10-7 10-9) dar poate crete n prezena unor ageni mutageni (chimici sau fizici). Frecvena mutaiei = proporia unui anumit mutant ntr-o populaie bacterian; frecvena mutantului poate crete ca urmare a seleciei:

- relative (mutantul are un timp de generaie mai scurt) - absolute (prin prezena unui factor de mediu favorabil
mutantului, dar defavorabil restului populaiei).

Exemple de mutaii
Mutaiile punctiforme afecteaz un singur nucleotid n cadrul unei gene i sunt reversibile. Consecine: - nlocuirea unui codon cu altul duce la nlocuirea unui aminoacid cu altul n structura unui polipeptid. Aceste mutaii sunt numite mutaii n sens greit; - apariia unui codon nonsens (mutaii nonsens).

Mutaia nonsens mpiedic sinteza n continuare a unui polipeptid, iar daca ea se produce la nceputul genei care codific un polipeptid se numete mutaie polar i acel polipeptid nu se va mai sintetiza deloc.

Mutaii bacteriene observate n laborator:

mutaii privind morfologia coloniei bacteriene (variaia S R); mutaii nutriionale (mutani auxotrofi vezi LP); mutaii care duc la pierderea unor factori de patogenitate (mutani aviruleni la S.pneumoniae care iau pierdut capsula); mutaii care conduc la apariia fenomenului de rezisten la antibiotice (att ADN cromozomic ct i cel plasmidic poate fi sediul unor asemenea mutaii).

Transferul genetic

se realileaz n sens unic, de la o bacterie donor la

una receptor; exogenot = materialul genetic transferat; endogenot = materialul genetic propriu;

Transferul genetic
evoluia exogenotului n celula receptor: - recombinare: alinierea secvenelor cu omologie structural,
urmat de substiutirea uneia sau mai multor gene ntre exo- i endogenot; integrare n genomul bacteriei receptor (transpozoni, fagi); meninerea n poziie extracromozomal dac este un replicon (plasmide, fagi); supus aciunii endonucleazelor de restricie (informaie genetic pierdut).

Replicon: cel mai scurt fragment de ADN sau ARN capabil de replicare independent ntr-o celul.

 Mecanisme de transfer: - transformarea; - transducia: generalizat i specializat; - conjugarea,

Mecanisme de transfer ale exogenotului I. Transformarea

bacteria acceptor este capabil s primeasc ADN exogen provenit din mediu, de la bacterii moarte (stare de competen); exogenotul trebuie s prezinte o structur bicatenar i s reprezinte nu mai mult de 1% din mrimea genomului bacterian; fenomenul a fost descoperit prin experimentri pe oarece cu S.pneumoniae, n 1928 (Griffith), i explicat dup dou decenii mai trziu.

 ADN-ul pneumococilor viruleni, capabili s sintetizeze capsula, s-a transferat la mutante R, nevirulente, acestea din urma dobndind capacitatea de a sintetiza capsula. Transformarea are loc i intre specii diferite. Bacteria care primete materialul genetic trebuie s se afle n stare de competen.

II.Transducia

- transfer de ADN bacterian prin intermediul

bacteriofagilor transductori; exist dou tipuri de transducie: generalizat (transfer aleator al unui fragment din

genomul bacterian); specializat (transfer de gene localizate n cromozomul bacterian n vecintatea locului de integrare a profagului).
Profag: exist ca replicon sau episom

Bacteriofag

Morfologie.
Bacteriofagii sunt formai dintr-un cap hexagonal, un gt i o prelungire numit picior (coad). Capul este alctuit dintr-un nveli proteic (capsid) i adpostete genomul ADN. Coada este un cilindru rigid nvelit ntr-un manon proteic i se termin cu o placa hexagonal care conine o enzim de tipul lizozimului. De placa bazala se aprind 6 fibre cu rol in fixarea bacteriofagului pe suprafaa bacteriei.

 Ataarea bacteriofagului pe suprafaa peretelui bacterian este determinat de existena unor receptori de perete, specifici. Dup ataare are loc contracia manonului proteic i bacteriofagul i injecteaz numai ADN-ul n celula bacterian. Dup ptrunderea genomului fagic n celula bacterian, acesta va determina sinteza de noi bacteriofagi identici cu cel de la care a provenit ADN.

 Dup asamblarea noilor virusuri ele vor prsi celula bacteriana care se lizeaz. Acesta este ciclul litic al bacteriofagilor, iar ei se numesc fagi viruleni.

 Transductia generalizata este mediata de fagi litici, care, dupa ptrunderea n celula bacterian, se multiplic i determina liza celulei gazda. In timpul lizei celulei bacteriene cromozomul acesteia se fragmenteaz. Se poate ntmpla ca unul dintre aceste fragmente, cu o dimensiune apropiat de cea a genomului fagic, s se integreze n capsula bacteriofagului, n locul genomului fagic. Aceti bacteriofagi sunt defectivi i nu se vor mai putea replica, dar pot ptrunde n alte celule bacteriene, injectndu-le ADN-ul, ce provine din cel al celulei donoare. ADN-ul se va integra n cromozomul celulei receptoare prin recombinare, rezultnd caractere noi ca modificri patogenice bacteriene, rezistena la chimioterapice.

 Dar nu ntotdeauna relaiile bacteriofag-bacterie evolueaz n acest fel. Uneori genomul bacteriofagului se va integra in cromozomul bacterian ncadrndu-se i funcional n acesta. In aceasta situaie el nu se mai replica dect n acelai timp cu cromozomul bacterian, deci in timpul diviziunii bacteriene i se numeste profag. Acest ciclu este ciclul lizogen, iar bacteriofagii se numesc fagi temperai.

 Transductie specializat este mediata de fagii temperai. Dup ptrunderea n celula bacteriana a ADN bacteriofagului temperat, ADN sufer un proces de circularizare dup care se insera n cromozom prin recombinare sub forma de profag (pe baza homologiei intre 10
perechi de baze ale ADN fagic si bacterian).

Profagul devine parte integrant a cromozomului bacterian, se va replica odat cu acesta, deoarece este supus unui proces de represie din partea genomului gazda.

Concluzie: Transducia reprezint un transfer de gene cromozomale de la o celula bacterian la alta, mediat de bacteriofagi. Unii bacteriofagi sunt capabili s transfere orice gen bacterian (transducie generalizat) iar alii numai anumite gene (transducia specializat).

Transducia generalizat

Transducia specializat

Conversia lizogen
Conversie lizogen = informaie genetic adiional, de origine fagic, avnd asemnri cu transducia specializat (toxigeneza tulpinilor de Corynebacterium diphtheriae, Streptococcus pyogenes etc).

III. Conjugare

- transfer genetic consecutiv contactului fizic ntre dou bacterii cu polaritate sexual diferit; bacteria donor (sex masculin) posed un plasmid conjugativ (factorul F+) cu gene care codific sinteza de pili sexuali, prin care se ataeaz la receptori specifici de pe suprafaa unei celule receptor ( F-, de sex feminin);

Pil sexual

Pil sexual (E. coli)

Sex pilus

III. Conjugare

- retragerea pililor aduce cele dou celule n

-

contact, prin puntea citoplasmatic care se stabilete, urmnd s fie transferat ADN ul plasmidic; consecutiv acestui tip de conjugare rezult dou celule F(+) ; plasmidul F poate purta gene adiionale (ex. gene de R la antibiotice) care pot fi transferate;

III. Conjugare

- plasmidul F integrat n cromozom poate conduce la transfer de gene cromozomale (ntre o bacterie Hfr high frequency of recombination - i una F(-)); transferul ncepe din vecintatea locului de inserie al plasmidului F, care este ultimul transferat; cel mai frecvent bacteria receptor ramne F(-) deoarece nu se transfer i factorul F; transferul de ADN la bacterii gram-pozitive este controlat de feromoni sexuali (molecule de suprafa prin care celulele bacteriene ader ntre ele).

Elemente genetice transpozabile

reprezint segmente de ADN capabile s se excizeze i apoi s se insere n acelai replicon (cromozom sau plasmid) sau n unul diferit, putnd determina blocarea expresiei unei gene n care se inser (factor mutagen); are loc cu intervenia unei enzime, transpozaza, fr s fie necesar omologia genetic.

 Elementele genetice transpozabile sunt fragmentele de inserie (IS) si transpozonii (Tn).

Elemente genetice transpozabile

Tipuri de elemente transpozabile: secvene de inserie (SI) constituite din gena care codific transpozaza, flancat de repetri inversate, a 20-40 perechi de baze; transpozoni, care posed n regiunea central una sau mai multe gene care codific anumite caractere (ex. rezistena la antibiotice), flancate de SI.

 Transpoziia presupune integrarea ntr-un genom al unui element genetic transpozabil din aceeai molecul de ADN sau din alt molecul prezent n aceeai celul. Inseria oricrei gene ntre doua elemente transpozabile face posibil transferul ei prin recombinare neomolog, n aceeai celul pe o molecula de ADN nenrudit structural. Astfel, prin transpoziie se pot produce deleii, inversii, transpuneri de determinani genetici de pe un plasmid pe altul sau chiar fuzionarea stabil a unor repliconi complei, de pild a doua plasmide.

 Evolutia rezistenei la antibiotice a bacteriilor nu poate fi conceputa astzi fr fenomenul de transpoziie. Mecanismele transpoziiei sunt responsabile de formarea plasmidelor cu multirezisten, prin inserarea succesiv pe un plasmid a determinanilor genetici de rezisten situai ntre doua elemente transpozabile de pe alte plasmide.

 26

Patogenitatea bacteriilor
Patogenitate = ansamblul proprietilor biologice ale unui microorganism care i permit s determine mbolnvirea gazdei. Clasificarea bacteriilor n raport de patogenitate - nepatogene (prezena lor nu determin mbolnviri); - nalt patogene sau patogene primare (determin
cel mai frecvent mbolnviri la gazda normoreactiv dar lipsit de aprare specific); pe suprafeele de nveli, pot determina mbolnviri cnd:
apar disfuncii ale barierelor de aprare antimicrobian variaia genetic le confer factori de patogenitate).

- condiionat patogene sau oportuniste (prezente

Atributele majore ale unei bacterii patogene

transmisibilitatea = posibilitatea de a trece de la o gazd la alta; infectivitatea = abilitatea de a ptrunde, de a persista prin depirea sau neutralizarea barierelor i mecanismelor antimicrobiene, de a se multiplica i de a invada organismul gazdei; virulena = capacitatea microorganismului de a vtma gazda.

I. Transmisibilitatea conferit de:

- prezena endosporilor care asigur indefinit -

supravieuirea n condiii nefavorabile (specii Bacillus i Clostridium); rezistena la condiii de desicaie/uscciune (Mycobacterium tuberculosis, Staphylococcus aureus, Corynebacterium diphtheriae etc);

I. Transmisibilitatea conferit de:

supravieuirea i chiar multiplicarea n medii umede, minimale nutritiv (specii din familia Enterobacteriaceae sau Pseudomonas aeruginosa); adaptarea la transmiterea direct (ex. transmitere sexual) sau prin vectori biologici (artropode hematofage) n cazul speciilor extrem de fragile n mediul extern (Neisseria gonorrhoeae, Treponema pallidum, respectiv specii Rickettsia, Borrelia).

II. Infectivitatea
1. Depirea barierelor externe de aprare - discontinuiti ale tegumentului; - discontinuiti ale stratului de mucus (plcile Peyer); - producere de neuraminidaz (hidroliza stratului de mucus); - forma spiralat i mobilitatea (Vibrio cholerae, Helicobacter pylori, Campylobacter jejuni); - producere de ureaz (neutralizeaz bariera acid gastric , ex. Helicobacter pylori, H. heilmannii); - sinteza de bacteriocine (afecteaz bariera biologic a suprafeelor).

2. Meninerea prin aderare la suprafeele de nveli

necesit participarea a doi factori: adezin sau ligant componente macromoleculare pe suprafaa celulei bacteriene, receptori celulari prezeni pe suprafaa celulelor gazdei; adezinele i receptorii interacioneaz n manier complementar i specific; confer rezisten la splarea mecanic (prin secreii sau excrete) sau prin micri peristaltice; structuri de suprafa cu rol de liganzi: fimbrii, glicocalix, proteine de suprafa (proteina M, proteina F), acizi teichoici i lipoteichoici.

Adhesion
BACTERIUM

adhesin

receptor

EPITHELIUM

S. pyogenes
F-protein lipoteichoic acid

fibronectin

Tulpini uropatogene (E. coli - prezint pili)

Absena pililor

3. Invazia
majoritatea bacteriilor i exercit efectul patogen prin invazia esuturilor, precedat de aderarea la suprafaa mucoaselor; invazia poate fi din: - aproape n aproape, - pe cale limfatic sau - hematogen; bacteriile invazive sunt capabile s penetreze n celulele nefagocitare prin endocitoz, graie unor proteine de suprafa invazine;

3. Invazia
unele bacterii posed: factori de difuziune (hialuronidaz, colagenaz, fibrinolizine), exoenzime care degradeaz esutul conjuctiv care se opune invaziei (ciment intercelular, membran bazal, depozite de fibrin, fascii).

4. Supravieuirea n organismul gazdei

- protecia fa de fagocite i complement prin:

inhibarea chemotaxiei fagocitelor i uneori a producerii i eliberrii lor din mduva hematogen; sinteza de polizaharide capsulare; supravieuirea i multiplicarea n celulele fagocitare; liza celulelor fagocitare (prin leucocidine);

eludarea supravegherii imune:

variaia antigenic; identitatea antigenic cu celulele gazdei; diversitatea antigenic; localizarea n situs-uri privilegiate anatomic sau celular; supresia rspunsului imun.

5. Achiziia de nutrieni

- necesarul de Fe n medii feriprive este asigurat prin:

sinteza de siderofori (enterochelin, aerobactin); legarea transferinei sau lactoferinei la receptori de pe suprafa bacteriei; reducerea Fe feric n Fe feros.

III. Virulena

- reprezint capacitatea microorganismelor de a

-

vtma gazda; este un atribut de tulpin cuantificabil (DLM; DL50); condiii majore pentru recunoaterea unui constituient celular ca factor de virulen (postulatele
moleculare Koch)

- genele de virulen sunt cel mai frecvent prezente pe

elemente genetice mobile (plasmide, fagi, transpozoni).

Postulatele moleculare Koch:

factorul de virulen este prezent numai la tulpinile virulente; inactivarea prin mutaie a genei care-l codific duce la pierderea virulenei; reversia la gena slbatic restaureaz virulena; produsul genei induce, de regul, un rspuns imun protector;

Mecanisme de lezare a gazdei

- mecanisme directe
exotoxine, produse de metabolism bacterian de natur proteic, eliberate n mediul extracelular att de bacterii gram-pozitive ct i gram-negative; endotoxine, prezente numai la bacterii gramnegative, eliberate numai n momentul lizei celulei bacteriene; agresine, exoenzime capabile s determine alterri tisulare. mecanisme indirecte reacii de sensibilizare de tip II, III sau IV (Coombs i Gell) vezi Imunologia

Proprieti comparative exotoxine - n general termolabile

- intens antigenice - pot fi transformate n anatoxine

endotoxine
- termostabile

- slab antigenice - nu pot fi transformate - DLM ng/Kg corp - DLM g/Kg corp - aciune specific (enterotoxine, - aciune nespecific neurotoxine, citotoxine) (febr, leucopenie urmat de leucocitoz, CID, oc endotoxinic)

Clasificarea exotoxinelor

citolitice atac fosfolipide din membrana citoplasmatic (fosfolipaze); creaz pori prin membrana celular (hemolizine, leucocidine). bipartite, constituite din dou subuniti subunitaea B permite legarea toxinei la un receptor celular subunitatea A, cu proprieti enzimatice, ptrunde n celul acionnd asupra unor inte moleculare. superantigene activeaz limfocitele T prin legare simultan la receptori de pe suprafaa acestora i la CMH clas II de pe suprafaa macrofagelor este stimulat eliberarea unor mari cantiti de limfokine, mediatorii fenomenelor morbide.

Membrane damaging exotoxins

Proteases Phospholipases Detergent-like action

A-B toxins
Cell surface
Active
Binding

Inhib acidul -aminobutiric (influxul nervos nu mai este blocat neuronii motori sunt stimulai n exces contracturi spastice ale musculaturii striate)

Toxina tetatnic tip AB

Superantigene
activeaz limfocitele T prin legare simultan la

receptori de pe suprafaa acestora i la CMH clas II de pe suprafaa macrofagelor este stimulat eliberarea unor mari cantiti de limfokine, mediatorii fenomenelor morbide.

Efecte biologice ale endotoxinelor

activarea complementului pe cale alternativ cu stimularea procesului inflamator; fixarea pe suprafaa macrofagelor, cu eliberare de de citokine (IL-1, IL-6, IL-8, FNT etc), mediatori ai inflamaiei i ocului endotoxic; activarea unor factori ai coagulrii, care conduce la CID; activarea plasminei, cu apariia de hemoragii; fixarea pe celule endoteliale cu, creterea permeabilitii vasculare. n infecii cu bacterii gram-pozitive sau a.a.r., peptidoglicanul, acizii teichoici i respectiv arabinogalactanul pot determina efecte endotoxin-like.