TERAPIA FOTODINAMICA IN ENDODONTIE Obiective: Studiul efectului in vitro ale nanoparticulelor incarcate cu fotosensibilizant de tipul albastrului de metil si al luminii

asupra E.faecalis. Materiale si metode: Preluarea si distribuirea nanoparticulelor in E.faecalis in suspensie a fost cercetata cu ajutorul microscopului electronic dupa incubarea complexului PLGE cu particule de aur timp de 2,5- 5 - 10 minute.Speciile de E. faecalis au fost sensibilizate in faza stationara si in canale radiculare infectate ale unor dinti umani extrasi cu nanoparticule incarcate cu albastru de metil timp de 10 minute urmata de expunerea la lumina rosie cu lungime de unda de 665nm. Rezultate: Nanoparticulele s-au observat a fi concentrate mai ales in peretele celular al microorganismelor in toate cele trei perioade. Sinergismul luminii si nanoparticulele incarcate cu albastru de metil au dus la aproximativ 2 si 1 log 10 reducere de formare ale coloniilor in interiorul canalelor radiculare, si in faza planctonica ,in ambele cazuri media nivelelor CPU log 10 au fost semnificativ mai scazute decat controlul nanoparticulelor fara lumina. Concluzia: Utilizarea nanoparticulelor PLGE incarcate cu albastru de metil incapsulate cu medicamente fotoactive ar putea fi un ajutor in tratamentul endodontic antimicrobian.

Scopul tratamentului endodontic este acela de a preveni, si atunci cand este necesar de a elimica infectia endodontica si de a permite vindecarea parodontitei apicale.Desi mare parte din microorganismele implicate in infectie sunt eliminate in timpul debridarii chimice si mecanice, bacteriile reziduale sunt usor detectabile la aproximativ din dinti in timpul obturatii. Complexitatea sistemului de canale radiculare impreuna cu istmurile sale, ramificatiile( canalele accesorii) si canaliculele dentinare face aproape imposibila depbridarea completa de bacterii, chiar si atunci cand metodele conventionale de intrumentare endodontica si de irigare sunt realizate la cele mai inalte standarde tehnice. In plus, la microscopia electronica s-a evidentiat o penetrare bacteriana de 1000 mm in interiorul canaliculelor dentinare. Prezenta DDR-ului in timpul su dupa utilizarea instrumentarului endodontic reduce eficienta irigarii si patrunderii medicamentelor utilizate pentru dezinfectare in interiorul canaliculelor dentinare. Esecul tratamentului endodontic non-chirurgical este asociat deseori cu prezenta in proportii ridicate de bacterii gram negative

aerobe si facultative si cu prezenta preponderent a bacteriilor anaerobe implicate in infectiile primare endodontice.Microorganiste de tipul E. Faecalis, care sunt rareori implicate in proportii mari in infectiile primare endodontice, sunt foarte asociate cu esecul tratamentului endodonic, datorita rezistentei pe care acestea o arata la medicatia intracanaliculare. Dezinfectarea sistemului de canale radiculare este critica pentru succesul tratamentului si ea trebuie sa se realizeze in conditii clare si convingatoare. Utilizarea terapiei fotodinamice de inactivare a microorganismelor a fost pentru prima data prezentata cu mai bine de 100 ani in urma, atunci cand Oscar Raab a evidentiat efectul letal al clorhidratului de acridina asupra microorganismelor de tipul Paramecia Caudatum. Terapia fotodinamica(TFD) are la baza conceptul conform caruia fotosensibilizantii non-toxici pot fi localizati preferential in anumite tesuturi si ulterior activati de o lumina cu lungimea de unda necesara generarii de oxigen si radicali liberi care prezinta citotoxicitate pentru celulele din interiorul tesutului tinta.Albastrul de metil este un fotosensibilizant care a fost utilizat in TFD pentru actiunea lui directa asupra diferitelor bacterii gram pozitive sau negative din cavitatea orala, si a fost anterior utilizat pentru studiul efectului TFD in dezinfectarea endodontica.Mai multe studii au aratat o distrugere incompleta a biofilmului cavitatii orale utilizand albastru de metil in TFD. Susceptibilitatea redusa a biofilmelor la TFD a fost atribuita fenomenului de penetrare redusa a fotosensibilizantului.In plus s-a demonstrat ca phenotiazinum fotosensibilizant de baza, impreuna cu albastru de metil si albastru de toluidina sunt substraturi ale rezistentei bacteriene la multiple medicamente, reducand eficacitatea fotosensibilizantului. Prin urmare una din modalitatile de depasire a acestor deficiente este de a dezvolta sisteme de livrare a medicamentelor care sa imbunatateasca semnificativ caracteristile farmacologice ale albastrului de metil. Recent studiile in TFD s-au concentrat pe utilizar de nanoparticule pe baza de polimer ca si modalitate de livrare a fotosensibilizantului. Nanoparticulele ce contin fotosensibilizant prezinta mai multe avantaje fata de moleculele de fotosensibilizant neincapsulate in nanoparticule.Aceste avantaje ar fi: -o masa critica mai mare( fotosensibilizant in concentratie mare ) pentru producerea de oxigen reactiv pentru distrugerea celulelor -limitarea capacitatii celulei tinta de a pompa medicament inapoi, reducand astfel posibilitatea rezistentei la mai multe medicamente -tratamentul selectiv de catre agentii locali de livrare care poate fi

realizat fie prin directionare pasiva sau activa prin energia de suprafata a nanoparticulelor -matricea nanoparticulei este nonimunogena Proiectarea nanoparticulelor polimerice biodegradabile de catre adminstratia Food and Drug ,a fost folosita ulterior ca un sistem de livrare a medicamentelor pentru fotosensibilizanti. Odata incapsulate in PLGA starea de excitabilitate a fotosensibilizantului dispare ceea ce duce la o pierdere a fototoxicitatii.Atunci cand nanoparticulele au fost incubate cu celulele vizate acestea au aratat o pierdere a fotosensibilizantului dependenta de timp, care ulterior si-a recapatat fototoxicitatea si a dus la o activare a TFD nanoagent. Desi incapsulate in PLGA, nanoparticulele incarcate cu diferite componente( antibiotice) au fost folosite pentru directionare bacteriana, utilizarea nanoparticulelor PLGA ca si transportori ai fotosensibilizantilor nu a fost anterior explorata in TFD antimicrobiana. Obiectivul prezentului studiu a fost acela de a utiliza nanoparticule PLGA incarcate cu albastru de metil pentru evaluarea in vitri impotriva E. Faecalis.Un alt obiectiv a fost acela de a studia efectele fotodinamice ale acestor nanoparticule asupra biofolmului de E. Faecalis din interiorul unor canale radiculare infectate ale unui dinte extras. Ipoteza noastra a fost ca incapsulare albastrului de metil in interiorul nanoparticulelor PLGA( diametru 150-200nm) poate oferi un design nou unui nanoplatform pentru distribuirea medicamentului in sistemul canalelor radiculare al dintelui si fotodistrugerea biofilmului prezent in interiorul canalelor radiculare. MATERIALE SI METODE Pregatirea nanotransportorilor PLGA Gradul medical al PLGA a fost obtinut de la Polimeri Birminghan Pluronic F-108, un ABA copolimer triplu blocant al poli( oxid de etilena) si poli( oxid de propilena, ne-au fost furnizate de catre Divizia de Performanta in Produse Chimice ale organizatiei BASF. Atat goale cat si incarcate cu albastru de metil, nanoparticulele PLGA au fost preparate prin amestecarea poliesterului cu copolimerul triplu blocant Pluronic F-108, si fabricand nanoparticulele printr-o procedura de deplasare de catre un solvent asa cum s-a raportat anterior. Pe scurt, o solutie de PLGA(76mg) impreuna cu Pluronic F-108(14 mg) a fost preparata in acetona( 5ml) si incalzita prin amestecare pana cand a devenit limpede Aceasta a fost introdusa intr-o solutie de apa( 50ml) amestecand energic. Rata de adaugare a fazei organice(1ml/min) la faza apoasa, rata de

volum si viteza de amestecare au fost imbunatatile pentru a asigura fidelitatea de la lot la lot. Dupa agitarea peste noapte, nanoparticula a fost centrifugata la 10 000rpm timp de 20min si spalata apoi de 2 ori cu apa si uscata la rece.Pentru prepararea formulelor de nanotransportori , albastru de metil si oleatul de sodiu au fost achizitionate de la Sigma Chemicals. Sarea oleat de albastru de metil a fost dizolvata in solutia de acetona de concentratie 10% a PLGA. Copolimerii triplu blocanti Pluronic F108 au fost adaugati la solutia de polimer in acetona de concentratie 20%. Concentratia si tipul copolimerului Pluronic au fost imbunatatile pentru a se asigura ca nanotransportorii formati au o suprafata stabila hidrofil care rezista la agregare. Caracteristicile nanotransportorilor PLGA Dimensiunea medie a nanotransportorilor PLGA,cu sau fara capsule prezente, a fost determinata cu ajutorul unui sistem ZetaPals de difuzare a luminii laser.Dupa racirea la rece morfologia suprafetei nanotransportorilor a fost vizualizata folosind microscopia electronica de baleiaj. Energia de suprafata a nanotransportorilor in prezenta sau absenta capsulelor a fost determinata prin masuratori de potential zeta. Masuratorile de potential zeta ale nanotransportorilor in suspensii de sol. salina de fosfat tamponata(ph=7,4) au fost efectuate cu instrumente Brookhaven si Zeta-Pals un analizator ultrasenzitiv de potential zeta. Pentru a determina cantitatea de medicament incorporata in nanotransportori la fel ca si procentul de medicament adaugat, o cantitate cunoscuta (10mg) de control si de nanotransportori modificati PEO a fost dizolvata in acetona.Cantitatea de medicament neincapsulat in nanotransportor a fost determinata utilizand spectroscopia UV visibila de absorbtie a albastrului de metil. Energia cinetica eliberata de oleatul de albastru de metil de la nanoparticule a fost determinata in PBS. Tween-80, un agent tensioactiv nonionic de concentratie 1% a fost adaugat in mediu liber pentru a spori solubilitatea complexuluioleatului de albastru de metil si pentru a impiedica aderarea medicamentelor de suprafata interna a continatorului. 100mg din medicamentele continute in nanoparticule au fost incubate cu 10mL in mediu liber intr-o baie de apa agitata la 50rpm.Periodic 5ml din mediu liber a fost indepartat si inlocuit cu 5ml de solutie tamponata pentru a mentine conditiile umede. Albastru de metil eliberat in mediu liber a fost analizat de catre un spectrofotometru UV-VIS Simadzu. Cantitatea totala si concentratia de medicament eliberat au fost

determinate prin curbele de calibrare ale agentilor respectivi . Culturile bacteriene E. faecalis a fost utilizat in acest studiu.Culturile au fost intretinute de subculturi saptamanale pe placute de agar-agar tripticaz cu sange de oaie 5%. In scop experimental, microorganismul a fost cultivat in plus de 80%N2, 10% H2, 10%CO2 la 350 C intr-o camera anaeroba timp de 72 de ore.Recoltate pe placute si introduse pe mediu de cultura bulion.Celulele au fost dispersate prin amestecare si treceri repetate prin pipete Pasteur.Numarul de celule a fost masurat cu un spectrofotometru in cuva de 1 ml. Asimilarea bacteriana de catre nanoparticule Asimilarea si distributia in cazul E.faecalis a fost investigata prin microscopie lectronica de transmisie folosind complexul PLGA cu particule de aur coloidal. Nanoparticulele de aur coloidal au fost pregatite printr-o reducere de acid clorhidric cu citrat de sodiu. Intr-un balon ce contine 85ml de lichid cu punct de fierbere de inalta performanta a fost adaugata o solutie de 10 ml de apa si acid cloroauric si solutia a putut sa se intoarca la punctul de fierbere. O solutie proaspat preparata de citrat de sodiu( 5ml, 0.003mol / L) a fost adaugata in balon.Dupca cateva minute solutia a devenit din incolora colorata in rosu ca vinul. Incalzirea s-a oprit in acest punct si solutia rezultata a fost lasata sa se raceasca peste noapte.Nanoparticulele au fost centrifugate la 30.000 de rpm timp de 10 min si supernatantul a fost eliminat. Restul de capsula a fost redispersata in apa distilata pentru o utilizare ulterioara. Proprietatile fizice ale nanoparticulelor cu potentialul zeta au fost comparate cu cele ale nanoparticulelor descarcate si nu s-au gasit diferentesemnificative. Bacteriile au fost incubate prin suspendare in nanoparticulele PLGAAu-Pluronic(100mg/ml) timp de 2,5; 5; 10 minute centrifugate si spalate de doua ori cu PBS.Apoi microorganismele au fost fixate in solutie de glutaraldeida de concentratie 2,5%la temperatura camerei timp de 1 ora , spalate apoi cu apa distilata si fixate ulterior in tetraoxid de ostium si acetat de uranil.Celulele au fost deshidratte cu etanol si incorporate in Embed 812. Sectiuni subtiri de esantioane au fost preparate si examinate cu ajutorul unui microscop electronic cu transmisie. Tratamentul fotodinamic al suspensiilor bacteriene Pentru tratamentul fotodinamic al microorganismelor, au

fost introduse alicote de suspenstii bacteriene(108/ml) in interiorul un tuburile sterile introduse ulterior la microcentrifuga si centrifugate (7000rpm timp de 4 minute).Supernatantii au fost aspirati si 1ml de BHI- bulion cu nanoparticule PLGA incarcate cu albastru de metil au fost adaugate ulterior( concentratia finala 6,25mg/ml echivalent albastru de metil).Culturile au fost iar suspendate cu nanoparticule si plasate in placute cu cate 24 de godeuri timp de 10 minute inainte sa fie expuse luminii.Toate godeurile au fost iradiate cu lumina rosie de la o dioda laser cu o putere de iesire de 1 W si lungime de unda de 665nm timp de 10 minute la intuneric la temperatura camerei.Sistemul a fost cuplat la o fibra optica cu diametrul de 1mm care emite lumina intr-un obiectiv(lentila) Acesta a format o pata circulara cu diametrul de 2cm la baza placutei cu cele 24 de godeuri. Laserul poseda oo stabilitate spectrala de 2nm cu o putere de iesire stabilita la 10 mW. Masuratorile de putere au fost cuantificate cu un contor de putere. Ajustarea distantei dintre lentila si placutele de iluminat , a creat campuri de iradiere cu dimensiuni si putere cu densitate corespunzatoare. Expunerea la lumina a fost de sus cu o iradiere de 100 mW/cm2 si o energie de 60 J/cm2.Toate placutele au fost acoperite pe durata iluminarii in scopul mentinerii sterilitatii culturii.Dupa iluminarea godeurilor , suspensia bacteriana a suferit diferite dilutii in bulion BHI si 100ml alicote au fost plasate pe placute de agar-sange pentru incubati anaeroba timp de 7 zile. Urmatoarele grupuri experimentale au fost utilizate: -fara lumina/fara nanoparticule incarcate cu albastru de metil -tratate doar nanoparticule incarcate cu albastru de metil -tratate cu nanoparticule incarcate cu albastru de metil si lumina Trei experimente separate au fos efectuate cu 4 culturi bacteriene pentru fiecare grup si pentru fiecare experiment in parte. Obictivul principal de evaluat a fost numarul mediu de unitati formatoare de colonii pentru fiecare grup. Prepararea dintilor pentru experiment Au fost extrasi 32 de dinti monoradiculari umani si depozitati in solutie de NaOCl de concentratie 0,5%(hipoclorit de sodiu) timp de 2 saptamani. Dintilor le-au fost indepartata coroana pana la o lungime la radacinii de 12mm cu o freaza diamantata la o viteza de turatie de 20.000rpm sub racire cu apa. Permeabilitatea foramenului apical a fost realizata introducand un ac KERR de dimensiune 15. A fost facuta o masuratoare in punctul in care acul KERR-15 a devenit vizibil la nivelul foramenului apica si s-au scazut 0.5mm pentru a se stabili lungimea de lucru.

Diametrul foramenului apical a fost stabilit in final cu un ac KERR -25 in scopul de a permite o deschidere apicala adecvata pentru spalarea agregatelor microbiene. RC a fost utilizat ca si lubrifiant si canalele radiculare au fost spalate cu hipoclorit de sodiu de concentratie 6% pe intreaga secventa de utilizare a instrumentarului.Spalarea finala a canalului s-a realizat utilizand 1ml solutie EDTA de concentratie 17% timp de 3 minute, pentru indepartarea DDR-ului care a fost dezactivat cu 1 ml solutie hipoclorit de sodiu de concentratie 6%. Fiecare proba a fost plasata ulterior intrun tub cu 500ml PBS intr-o microcentrifuga. Dintii au fost ulterior introdusi la autoclav la 1210C timp de 20 de minute.Dupa sterilizarea la autoclav a fost aspirat PBS din tuburile din microcentrifuga in conditii sterile.Suprafata radiculara a fost acoperita cu Performix pentru a evita o eventuala contaminare ulterioara. Infectarea canalelor radiculare 26 de exemplare radiculare au fost transferat in conditii sterile in interiorul unor tuburi introduse la microcentrifuga. 1ml de bulion BHI continand 109 microorganisme din clasa E.faecalis a fost introdus in interiorul fiecarui canala radicular utilizand un ac de irigare tip PRORISE-30G.Dupa injectare, fiecare radacina in parte a fost introdusa in totalitate in bulionBHI, apoi tuburile au incubate in mediu anaerob 3 zile.Dupa incubare mediul de cultura a fost aspirat aseptic din interiorul tuburilor.Trei radacini fost utilizate pentru studii si scanate cu ajutorul unui microscop electronic si 23 de probe au fost utilizate pentru studiile TFD.

SEM Un total de 9 dinti monoradiculari umani extrasi au fost selectati in mod aleatoriu pentru SEM. Trei probe au fost utilizate la demonstratia de indepartare a DDR-ului si si permeabilitatea tubulilor dentinari si 3 probe pentru demonstratia infectarii cu E. Faecalis. Radacinile a 3 dinti neinfectati au fost incubate cu 1ml PBS continand nanoparticule incarcate cu albastru de metil (concentratia finala 50g/ml echivalent de albastru de metil) timp de 15 minute pentru a evidentia transportul nanoparticulelor in interiorul canalelor radiculare. Canalele longitudinale au fost sectionate cu o freaza diamantata pe ambele suprafete ale radacinii( palatinallingual). Fiecare mostra a fost taiata pe jumatate cu o dalta din otel.Jumatatea de mostra cu partea de apex cea mai vizibila a fost

fixata in glutaraldeida de concentratie 3,7% in solutie tamponata de sodiu <<< cacodylete>> 0,2mol/l la 40C timp de 24 ore.Dupa deshidratare intr-o serie gradata de solutie de etanol, mostrele au fost uscate cu aer si montate pe suporturi SEM pentru stropirea cu aur >>>> si observarea cu ajutorul unui microscop electronic JOEL-JSM 6400.Imaginile SEM au fost obtinute la o marime standard de 1500.

FDT la canalele radiculare cu biofilm prezent 23 de canale radiculare au fost preparate si infectate asa cum s-a descris anterior si au fost expuse FDT folosind nanoparticule incarcate cu albastru de metil in BHI bulion Mostrele au fost aleatoriu impartite in 3 grupuri: -fara lumina/ fara nanoparticule incarcate cu albastru de metil -tratate doar cu nanoparticule incarcate cu albastru de metil -cu lumina si cu nanoparticule incarcate cu albastru de metil Doua experimente separate au fost realizate cu 4 probe pentru fiecare grup al fiecarui eperiment, exceptie a facut grupul cu tratament doar cu nanoparticule incarcate cu albastru de metil la care 4 sau 3 probe au fost folosite. Toate probele individuale au fost introduse in tuburi de 1,5 ml in microcentrifuga in conditii sterile si apoi doar canalele tratate cu nanoparticule incarcate cu albastru de metil si probele FDT au fost umplute pana la nivelul de acces al cavitatii cu solutie de nanoparticule, utilizand un ac de irigare PRORISE-30G. Dupa injectare, intreaga proba a fost scufundata in totalitate in solutie 15 minute ca sistemul de canale radiculare sa fie expus continuu la medicament. Intr-un cadru clinic medicamentul va fi aplicat in canalul radicular si preluat de bacteriile reziduale din canalul radicular principal, istmuri, canalele laterale si tubuli dentinari. Pentru a minimaliza impactul in vitro al medicamentului eliberat la nivelul apexului am incercat sa imitam continuu prezenta clinica in vivo a medicamentului pe tot parcursul tratamentului endodontic nonchirurgical prin scufundarea radacinii in solutie de medicament, in scopul de a asigura prezenta continua a albastrului de metil in interiorul canalului radicular.In plus invelisul cu Performix a eliminat orice posibilitate de infiltrate a albastrului de metil in afara canalului radicular.Exemplarele in grupul de control au fost injectate si scufundate in totalitate in bulion stelir BHI .Dupa incubare solutia de medicament in exces a fost aspirata si exemplarele de radacina au fost scoase din tuburi.Lumina a fost apoi aplicata iin interiorul canalelor radiculare ale exemplarelor timp de 5 minute.Sursa de iradiere a fost dioda unui laser cu o putere de iesire de 1 W si o

lungime de unda de 665nm.Sistemul a fost cuplat la o fibra optica cu diamentrul de 250nm care a fost taiate la intervale de 1mm pe o distanta de 1 cm.Fibra a fost capabila sa distribuie lumina la 3600.Puterea a avut o densitate de 100mW/cm2. si energia totala dozata a fost de 30 J/cm2.Dupa toate tratamentele aplicate, fiecare proba a fost in contitii aseptice montata pe un baraj de cauciuc prin utilizarea unui material plastic montat pe un cadru in forma de U atasat la un raft Fiecare proba a fost montata cu 4mm deasupra barajului de cauciuc. Continutul canalelor radiculare a fost aspirata in esantion prin aplicarea de 1 ml BHI cu un ac de irigare PRORISE-30G.Suspensia bacteriana a fost colectata intr-un tub de microcentrifuga de 1,5ml, pozitionat sub foramenul apical, si incarcatura bacteriana a fost masurata pentru fiecare mostra cu un spectrofotometru.Dupa vortexare timp de 20 sec au fost preparate dilutii si 100ml de alicote au fost inoculate pe mediul agar-sange si intubate timp de 7 zile. Analiza datelor In 3 experimente FDT de suspensii bacteriene, 2 tratamente(nanoparticule incarcate cu albastru de metil singure si lumina plus nanoparticule incarcate cu albastru de metil) si un control au fost evaluate. Patru observatii au fost obtinute pentru fiaccre grup supus tratamentelor in fiecare din cele 3 experimente un total de 12 observatii/ tratament si 36 observatii globale( pe deasupra).Valorile datelor au fost log 10 transformate pentru a reduce variatia heterogenitatii.Efectele tratamentului asupra nivelurilor log10 au fost evaluate in 2 moduri de analiza a variatiilor cu scopul de a controla in timp orice variatie straina de la experiment la experiment, in timp ce se obtine rezumatul comparatiilor al efectelor tratamentului. Comparatii ale nivelurilor medii de tratament au fost efectuate de procedura Tukey, multiple comparatii cu un alfa total de 0,01.In cazul datelor despre canalul radicular, o analiza similara a fost efectuata de valorile log10CFU, in cazul cu doua experimente si iar cu 4 observatii pentru fiecare grup supus tratamentului, un total de 8 observatii / tratament si 24 de observatii in total. Dupa analiza variatiilor , comapratiile efectelor in urma tratamentului au fost realizate de procedura Tukey cu un alfa total de 0,01. REZULTATE Caracterizarea nanoparticulelor Diametrul nanoparticulelor PEO-PLGA s-a situat intre 100250nm.Marimea particulei a ramsa aceeasi cu adaugarea albastrului

de metil.Energia de suprafata a nanoparticulelor in prezenta sau absenta capsulelor, a fost determinat de catre masuratorile de potential zeta si s-a gasit a fi 24,48 respectiv 31,87mV. Aceste valori estimative au fost obtinute dde la 6 loturi de nanoparticule si nu au fost semnificative din punct de vedere statistic. Dupa uscarea la rece morfologia de suprafata a nanoparticulelor a fost vizualizat de SEM. Nanoparticulele PLGA aveau forma sferica si o suprafata neteda. Spectroscopul UV a verificat capacitatea si eficienta albastrului de metil neincapsulat. Studiile TEM Absorbtia si distrubutia nanoparticulelor in cazul E. Faecalis a fost investigata de catre TEM folosind complex PLGA cu particule coloidale aurii, in scopul de a obtine un contrast mai inalt.Dupa incubarea microorganismelor cu o suspensie(100 g/ml)de PLGA-Au-Pluronic nanoparticule timp de mai bine de 10 minute, TEM a descoperit acumulari substantiale de nanoparticule pe peretii bacteriei.Proprietatile de suprafata( marime si energie) ale nanoparticulelor au fost aceleasi atat pentru aur cat si pentru albastru de metil.

Rezultatele experimentelor pentru canalele radiculare au urmat acelasi model ca acelea vazute in experimentele planctonice. Principalele efecte de tratament n cadrul celor doua modalitati de analiza a variatie au fost extrem de semnificative. Discutie Nanoparticulele pe baza de polimer au fost recent utilizati pentru livrarea de fotosensibilizanti si sisteme de eliberare, la acelea din TFD. Matricea nanoparticulei PLGA este un poliester copolimer al acidului polilactic si al acidului poliglicolic care a primit aprobarea de la Adminstratia Food and Drug datorita biocompatibilitatii sale si abilitatii sale de a se degrada in organism prin mecanisme naturale. Albastrul de metil a fost anterior incapsulat in interiorul unei poliacrilamide, sol gelica dioxid de siliciu si nanoparticule silicat modificate organic pentru actiunea foto asupra celulelor tumorale in vitro.Recent nanoparticulele cu albastru de metil cntinand silicat legat magnetic>>>> au fost propuse ca si posibili transportori pentru TFD. Susceptibilitatea speciilor de tipul E. Faecalis la TFD mediata de catre

nanoparticule PLGA cu albastru de metil a fost cercetata in faza planctonica. Sensibilizarea speciilor E.faecalis cu nanoparticule(6,25g/ml echivalent la albastru de metil)si lumina(30J/cm 2) expuse aproximativ 1 log10 omorand biofilmul de E.faecalis in canalele radiculare infectate ale unor dinti umani extrasi. In ambele planctonica si canale radiculare experimentale, nanoparticulele incarcate cu albastru de metil singure au expus aproximativ 44% si 58% reducerea viabilitatii bacteriene.In prezentul studiu, doar efectul luminii in interiorul canalelor radiculare nu a fost cercetata.Un studiu anterior condus de grupul nostru nu a aratat uun efect semnificativ al luminii asupra viabilitatii bacteriene comparativ controalelor( fara lumina/ fara medicament). Desi comparatii directe intre rezultatele obtinute de la plactonic si de la experimentele pe canale radiculare nu pot si facute, ambele conditii experimentale arata clar susceptibilitatea bacteriana la TFD indusa de nanoparticulele incarcate cu albastru de metil. O evaluare completa a efectelor fotodinamice a nanoparticulelor incarcate cu albastru de metil pe biofilmele de la nivelul canalelor radiculare ar cere de asemenea cunostinte despre parametrii optimi de tratament. Asta include concentratia de albastru de metil neincapsulat in nanoparticule, perioada de incubare a nanoparticulelor cu microorganismele, densitatea puterii, si energia luminii.TEM a aratat ca nanoparticulele erau adesea concentrate pe peretii celulei bacteriene.Asta ar fi putut face peretele celulei bacteriene permeabila pentru albastrul de metil eliberat de nanoparticule.In acest caz, localizarea intracelulara si imprejurimile albastrului de metil influenteaza fototoxicitatea. Sensibilizarea albastrului de metil cu lumina duce spre producerea doar a oxigenului care poate migra aproximativ 0,02m dupa formarea lui, tintind componentele intracelulare.Exista si o alta posibilitate, conform careia fotodistrugerea are loc in interiorul peretelui celular. In acest caz continutul intracelular ar fi putut fi deja extravazat.Oricum, faptul ca nanoparticulele incarcate cu albastru de metil singure expun o toxicitate de la 34% la 58.5% sugereaza faptul ca albastrul de metil a penetrat peretele celular. Efectele fotodinamine ale nanoparticulelo PLGA incarcate cu albastru de metil pe E.faecalis au fost probabil afectate de existenta proteinelor serice din BHI-bulion.Rezultatele preliminare obtinute in laboratorul nostru de la studiile TFD utilizand nanoparticule PLGA incarcate cu albastru de metil pentru tintitea E. Faecalis in vitro au aratat distrugeri bacteriene excelente atunci cand nanoparticulele sunt dizolvate in PBS.Recent, s-a descoperit ca albastrul de metil dizolvat intr-o mixtura de:glicerol, etanol, apala fel ca si o formula de albastru de metil continand o emulsie de oxidant: transportorul de oxigen a consolidat efectele fotodinamice ale albastrului de metil in vitro.O limitare a prezentului studiu se refera la

metoda cu mostre folosite pentru colectarea biofilmului de specii din interiorul canalelor radiculare. duce la o detasare a speciilor din biofilm mai ales de pe suprafata canalului radicular si de la nivelul deschiderii canaliculelor dentinare. In studiile preliminare am folosit documente dar prea putine bacterii au fost obtinute comparativ cu . De asemenea am strivit radacinile ( probe) prin criopulverizare pentru a testa fragmentele.Datele obtinute nu au fost convingatoare. Metoda a fost preferata in fise ca sa evitam distrugerea bacteriana indusa de aceasta din urma. Utilizarea unui polimer biodegradabil pentru a sintetiza nanoparticulele face ca produsul final sa fie mai atractiv pentru utilizarea clinica. Studiile viitoare ar trebui sa defineasca parametrii de tratament pentru o dezinfectare endodontica optima si o fereastra terapeutica in care microorganismele ar putea si omorate de catre nanoparticulele incarcate cu albastru de metil in timp ce nu afecteaza celulele normale.Rolul energiei de suprafata al nanoparticulelor in efectele TFD antimicrobiene ar trebui de asemenea evaluate. Intr-o etapa ulterioara , o comparatie intre efectele fotodinamice ale nanoparticulelor incarcate cu albastru de metil si albastru de metil liber ar fi nesesara.