CROMATOGRAFIA DE LICHIDE DE

NALT PERFORMAN
PRIN INTRODUCERE N CROMATOGRAFIA DE LICHIDE DE NALT
PERFORMAN
Prin cromatografie se nelege procedeul de separare a dou sau mai
multor substane pe baza afinitilor lor diferite fa de o faz staionar i o faz
mobil care este n micare n raport cu faza staionar. Figura 8.1. ilustreaz
clasica schem a separrii cromatografice a doi solui pe o coloan mpachetat
cu un adsorbent solid, prin care circul un solvent. olutul ! are o afinitate
relativ mai mare fa de materialul fazei staionare dec"t solutul !. #a urmare
solutul $ este eluat din coloan mai ncet dec"t solutul !, rezult"nd separarea
lor.
#romatografia de lichide %&#' este cea mai veche i probabil cea mai
puternic form de cromatografie. #romatografia, ca tehnic de separare, a fost
descoperit i denumit astfel de (s)ett n 1*+, . -e atunci, dezvoltarea tehnicii
cromatografice s.a realizat destul de ncet i numai n ultimii ani a cunoscut o
dezvoltare foarte rapid.
#romatografia de lichide de nalt performan se bazeaz pe dezvoltarea
c"torva domenii din cadrul &#/ aparatura, coloane speciale i materiale de
umplere %suporturi cromatografice', teoria procesului cromatografic, etc. 0n rol
important l.a 1ucat realizarea unor echipamente ce pot realiza presiuni ridicate,
volume.moarte reduse i detectoare foarte sensibile. &a acestea se adaug
realizarea unor suporturi cromatografice speciale, care au permis separri
cromatografice rapide, reproductibile i de mare performan. Putem considera
c nceputurile cromatografiei de lichide moderne au avut loc pe la sf"ritul
anilor 23+, c"nd pac4man, tein i 5oore au introdus analiza automat a
1
amestecurilor de aminoacizi. !ceasta a fost urmat de lucrrile de pionierat ale
lui 6amilton i 7iddings n fundamentarea teoretic a 6P&#, c"t i de lucrrile
6P&# de schimb.ionic ale lui cott i de permeaie n gel ale lui 8.#. 5oore.
-in 1*9* lucrrile publicate referitoare la 6P&# s.au nmulit enorm de mult,
orice cuantificare fiind subevaluat. (ehnica i teoria 6P&# au a1uns astzi la
maturitate, dei e:ist nc multe pori deschise spre perfecionarea lor.
HPLC are foarte multe aplia!ii" #$ %iferite %ome$ii&
;ndustria farmaceutic/ controlul calitii medicamentelor< analize de me.
dicamente i metabolii
#ercetarea medical clinic/ dozare de medicamente i metabolii
;ndustria alimentar/ dozare de aditivi, pesticide i alte substane to:ice con.
taminante
(o:icologie/ dozare de medicamente %droguri' i metabolii
Protecia mediului/ dozare de pesticide, clorofenoli, hidrocarburi aromatice
policiclice c"t i a altor poluani
=
Figura 1.1. Ilustrare a separrii cromatografice: (a) amestecul de solui A i B
sunt adugai la captul superior al coloanei cromatografice ; (b) dup ce faa
mobil (sol!entul) a percolat coloana pentru c"t!a timp# soluii A i B sunt
separai $n coloan; (c) solutul A eluea din coloan; (d) solutul B eluea din
coloan# separarea fiind $nc%eiat cu succes.
$iochimie/ elucidarea structurii proteinelor c"t i a altor substane de interes
biochimic
Petrochimie/ analiza unor compui specifici
;ndustria polimerilor/ analiza monomerilor, aditivilor i a altor compui
specifici.
la care se adaug i domeniul foarte nou al sistematicii biochimice.
#romatografia tradiional pe coloan %fie ea de orice tip . de adsorbie,
partiie sau de schimb ionic', n strat subire i pe h"rtie, i cromatografia de
lichide modern sunt toate forme ale cromatografiei de lichide. -iferenele
dintre toate aceste procedee se refer la detalii de echipament, material
cromatografic, tehnica de lucru, dar cromatografia de lichide modern are c"teva
avanta1e ma1ore fa de celelalte tehnici menionate/ vitez sporit de separare,
posibilitatea de a separa amestecuri comple:e, uurin n e:ecutare, etc. Pentru
a aprecia mai bine avanta1ele cromatografiei de lichide moderne s facem dou
comparaii/ ntre cromatografia de lichide i cea de gaze i ntre cromatografia
de lichide modern i cea tradiional.
CROMATOGRAFIA DE LICHIDE COMPARAT CU CROMATOGRAFIA DE
GA'E
#apacitatea e:cepional a cromatografiei de gaze %7#' de a separa i
analiza amestecuri foarte comple:e este astzi unanim recunoscut. #omparat
cu metodele cromatografice anterioare, 7# realizeaz separri mult mai rapide
i eficiente. >:ist sisteme cromatografice pentru 7# total automatizate, la
preuri acceptabile, cu performane e:celente. (otui multe amestecuri nu pot fi
rezolvate de 7#, fie din cauz c substanele respective nu sunt volatile, fie c
sunt instabile termic i se descompun n timpul cromatografierii. .a estimat c
,
numai 1+? din compuii organici pot fi separai corespunztor cu a1utorul 7#,
fr modificri chimice prealabile.
#romatografia de lichide, pe de alt parte, nu cunoate limitri datorit
volatilitii sau instabilitii termice a probelor. !stfel, &# este ideal pentru
separri de macromolecule i specii ionice %de interes biomedical', pentru
produi naturali sensibili i pentru o mare varietate de alte substane cu mas
molecular mare, mai puin stabili, cum ar fi/ proteinele, aminoacizii, acizii
nucleici, polizaharidele, pigmenii vegetali, lipidele polare, substanele de interes
farmaceutic %hormoni, vitamine, antibiotice, etc.', coloranii, surfactanii,
medicamentele, pesticidele, etc.
#romatografia de lichide are unele avanta1e fa de 7# i poate rezolva
%de cele mai multe ori' separri mai comple:e deoarece/
@n &# sunt utilizate dou faze %una staionar i alta mobil' cu selectiviti
diferite fa de moleculele supuse separrii, fa de doar una n 7#.
epararea cromatografic este rezultatul unor interacii specifice ntre
moleculele probei cu fazele staionar i mobil. !ceste interaciuni sunt
absente n ce privete faza gazoas mobil a 7#, dar sunt prezente n cazul
&#, furniz"nd astfel o variabil n plus n ce privete controlul i
mbuntirea separrii.
@n &# e:ist %cel puin p"n acum' o mai mare varietate de suporturi
cromatografice<
@n &# se utilizeaz temperaturi sczute %cel mai adesea temperatura
ambiant'.
@n &# se poate utiliza o mare varietate de detectoare/ colorimetre %eventual
combinate cu reactoare unde se desfoar reacii de formare a compuilor
colorai', spectrofotometre n 0A, fluorimetre, detectoare de conductivitate,
de refracie, detectoare polarografice, detectoare radiometrice, etc. @n
B
anumite cazuri de separri cromatografice n &# utilizarea unui detector
corespunztor elimin necesitatea unei separri complete.
0n mare avanta1 al &# fa de 7# este faptul c dup separarea
cromatografic substanele pot fi uor recuperate n eprubete separate, cu
a1utorul colectoarelor de fraciuni. (recerea de la &# analitic la cea
preparativ se face relativ uor, recuperarea componentelor separate fiind
cantitativ. >:ist posibilitatea de recuperare a componentelor i n 7#, dar
procedeul este mult mai complicat i cel mai adesea necantitativ.
@n ciuda avanta1elor menionate ale &# fa de 7#, aceasta din urm este
aplicat cu prioritate dac nu sunt de ateptat probleme speciale n ceea ce
privete separarea componentelor amestecului de analizat. eparrile prin 7#
sunt n general mai rapide i mai sensibile i, cel mai adesea, mai puin
costisitoare.
CROMATOGRAFIA DE LICHIDE MODERN COMPARAT CU CEA
TRADIIONAL
considerm acum diferenele dintre sistemul cromatografic tradiional
i cel modern/
@n &# clasic, o coloan este, n general, utilizat o dat %n cel mai bun
caz de c"teva zeci de ori' dup care este golit i reumplut %eventual materialul
de umplere este regenerat'. !ceasta reprezint o mare cheltuial at"t de
manoper c"t i de material. !plicarea probei, pentru a se face corect, necesit o
mare pricepere din partea operatorului. #urgerea solventului %eluentului' prin
coloan se realizeaz prin cdere liber %pe baza acceleraiei gravitaionale', sau
cu a1utorul unor pompe peristaltice. eparrile cromatografice dureaz, n
varianta clasic, c"teva ore %uneori c"teva zile', fiind prin urmare procedee mari
consumatoare de timp i de efort uman.
3
Aariantele &# pe h"rtie %paper chromatographC D P#', aprut prin ani
2B+ i a cromatografiei n strat subire %thin.laCer chromatographC D (&#' din
anii 23+ a simplificat ntr.o oarecare msur multe din operaiile necesare
e:ecutrii cromatografiei. !stfel, realizarea stratului %patului' cromatografic n
(&# sau P# s.a simplificat mult i a devenit mult mai ieftin. 6"rtia
cromatografic sau plcile gata turnate pentru (&# pot fi astzi cumprate la
preuri acceptabile. !plicarea probelor n aceste tehnici este mai puin
pretenioas, e:ist"nd de altfel i dispozitive care a1ut la realizarea acestei
operaii. #urgerea solventului se realizeaz, cel mai adesea prin capilaritate,
h"rtia sau placa cromatografic fiind introdus ntr.un tanc cromatografic nchis,
ce conine o mic cantitate din solventul eluant. @n acest fel, singura intervenie a
operatorului const n urmrirea frontului de solvent pentru a opri procesul
cromatografic la timpul dorit. -etectarea i cuantificarea substanelor separate se
realizeaz prin stropirea h"rtiei sau plcii uscate cu reactivi cromogenici
corespunztori, pentru a se crea spoturi colorate pentru fiecare component
separat.
(ehnica P# i (&# a simplificat mult procesul cromatografic i a redus
timpul de separare, care, n special n cazul (&# este de ordinul minutelor %,+.
9+ min.'. (otui, anumite limitri, caracteristice metodelor cromatografice Epat.
deschisE %open.bed' s.au pstrat i la aceste tehnici/
reproductibilitate redus<
dificultate n realizarea determinrilor cantitative<
timpi de separare mai lungi i rezoluii mai sczute dec"t n cazul 7#<
capacitate limitat de realizare a separrilor preparative automatizare dificil.
#romatografia de lichide modern utilizeaz coloane nchise, care pot fi
refolosite de sute sau chiar de mii de ori, fr a periclita performanele
separrilor. #u toate c aceste coloane sunt foarte scumpe %de la B++ -5 n sus',
9
in"nd cont de faptul c perioada de via este foarte lung, practic utilizarea lor
este mai economic dec"t cea a coloanelor deschise. #u toate c i coloanele
6P&# se pot ncrca individual de fiecare operator, cel mai adesea, acestea se
cumpr gata umplute, astfel c se poate elimina aceast operaie mare
consumatoare de timp i care necesit o mare pricepere din partea operatorului.
;n1ectarea probelor se realizeaz cu a1utorul unor dispozitive speciale .valve de
in1ecie, bucle de in1ecie . care fac ca operaia s fie rapid i foarte uor de
e:ecutat. #urgerea solvenului prin coloan se realizeaz cu a1utorul unor pompe
de mare presiune, motiv pentru care tehnica se mai numete cromatografie de
mare presiune %6igh Presure &iFuid #hromatographC D 6P&#'. @n funcie de
presiunea cu care este mpins faza mobil n coloan, metodele cromatografice
pot fi clasificate n cromatografie la presiune redus %sub 3 bari', la presiune
moderat sau medie %3.3+ bari' i la presiune nalt %peste 3+ bari'. #urgerea
solventului sub presiune are o serie de avanta1e/ viteza de curgere este rapid i
%aproape' perfect controlat, ceea ce duce la reducerea dispersiei moleculare i
la o %aproape' perfect reproductibilitate a separrilor cromatografice.
-etectarea i cuantificarea substanelor separate se realizeaz n mod
continuu cu a1utorul detectoarelor de diferite tipuri i a integratoarelor.
nregistratoare ce fac parte component din sistemele cromatografice 6P&#.
!ceste sisteme sunt %sau pot fi' complet automatizate/ probele pot fi in1ectate
automat cu a1utorul in1ectoarelor automate, operaiile e:ecutate de sistemul de
pompe, detectoare i integratoare pot fi de asemenea controlate de ctre un
calculator, iar regsirea substanelor separate se poate realiza cantitativ cu
a1utorul colectoarelor de fraciuni. ;ntervenia manual a operatorului este
minim, n cel mai ru caz, reduc"ndu.se la efectuarea in1ectrii probei n
coloan, el put"nd face alte operaii n timp ce sistemul cromatografic lucreaz.
Gperaiile fiind automatizate, performanele cromatografice sunt e:cepional de
ridicate, dac le comparm cu metodele de #& clasice, motiv pentru care metoda
se mai numete cromatografie de nalt performan %6igh Performance &iFuid
H
#hromatographC D 6P&#'. @n plus, ridicarea la scar, adic trecerea de la
cromatografia analitic la cea semi.preparativ i preparativ se realizeaz foarte
uor. -atorit curgerii solventului sub presiune, cu vitez mare, prin stratul
cromatografic, timpul de cromatografiere a fost mult redus, marea ma1oritate a
separrilor realiz"ndu.se n mai puin de =+ minute. Pentru realizarea diferitelor
separri cromatografice, e:ist o multitudine de suporturi cromatografice, care
fac posibile separri de mare finee . cum ar fi izomerii optici. 5arele
Edezavanta1E al &# moderne %pe care de acum ncolo o vom numi simplu 6P&#'
const n preurile foarte ridicate ale aparaturii care trebuie s fie de cea mai
mare precizie, al materialului cromatografic care trebuie s fie de cea mai bun
calitate, al solvenilor de eluie care trebuie s fie ce cea mai mare puritate,
motiv pentru care iniialele 6P&# pot s nsemne i 6igh Price &iFuid
#hromatographC.
;at rezumativ c"teva caracteristici tipice ale cromatografiei clasice %de
1oas presiune' i ale cromatografiei moderne %6P&#'
(abel H.1. #aracteristici generale ale cromatografiei de lichide clasic i ale
6P&#
#aracteristici &# clasic 6P&#
8
-imensiunea particulelor
Aiteza de curgere
Presiunea de operare
(impul de separare
Aolumul probei
Iezoluia
Jea1unsuri
1++.,++ Km
1+.,+ ml cm
.=
h
.1
L3 bar
=B h, sau chiar mai
mult
Aariabil %ml.litri'
$un
(imp de procesare lung
,.1+ Km
1++.,++ ml cm
.=
h
.1
M3+ bar
+.1., h
5ic %Kl.ml'
Poate fi e:celent
#ost ridicat al aparaturii
ECHIPAMENTUL FOLO(IT N CROMATOGRAFIA DE LICHIDE
>chipamentul necesar pentru &# poate fi asamblat din componente care pot
proveni de la diferii fabricani sau %cel mai bine' poate fi un sistem cromatografic
complet asamblat provenit de la un singur productor. >:ist enorm de multe firme
productoare de sisteme cromatografice. e poate pune ntrebarea/ #are este cel mai
bun sistem cromatografic N Ispunsul, fr a fi evaziv, este c nu e:ist un echipament
Ecel mai bunE deoarece cerinele pentru un anume aparat depind de problemele
specifice pe care acesta este chemat s le rezolve. (abelul 1.=. prezint sumar unele
dintre acestea.
(abelul 1.=. #riterii pentru echipamentele 6P&#
Performan
e
#erine
#aracteristici ale
sistemului
#erine ale echipamentului
!daptabilit
ate
0tilizabil pentru probe din
diferite clase i tipuri de
substane
5ateriale cu mare rezisten
chimic
-iferite tipuri de detectoare
*
Performan
e
#erine
#aracteristici ale
sistemului
#erine ale echipamentului
Aitez #oloane selective, cu
eficien mare
Aitez volumetric sporit
a fazei mobile
Aitez mare de ieire a da.
telor
Pompe de mare presiune
-etectoare i tuburi de conec.
tare cu volume moarte foarte
reduse
@nregistratoare i sisteme rapide
de prelucrare a datelor
Ieproducti
bilitate
#ontrolul operaional al
parametrilor
#ontrolul precis al/
. temperaturii coloanei
. temperaturii detectorului
. compoziiei fazei mobile
%gradient'
. vitezei fazei mobile
. rspunsului detectorului
enzitivitat
e
-etectoare cu rspuns
foarte rapid
$enzi nguste
-esign atent al detectorului
Iaport semnalOzgomot redus
#oloane eficiente
!a cum s.a mai menionat, iniiale 6P&# pot s semnifice i high price
liFuid chromatographC deoarece echimapentele 6P&# sunt foarte scumpe. 0n
sistem cu configuraie de baz, cost n 1ur de =++++ -5, coloanele cost de la
B++ -5 n sus i e:emplele ar putea continua. -eoarece n acest caz preul este
un factor limitativ, este important de tiut care sunt cerinele unui bun sistem
6P&#, cci dei este recomandabil achiziionarea unui sistem 6P&# integrat,
1+
rezultate similare se pot obine i prin asamblarea de componente provenind de
la firme diferite i care ar putea fi mai ieftine.
PARAMETRI CE AFECTEA' RETENIA CROMATOGRAFIC
5odificatorii organici. >luia in IP.6P&# este efectuat datorit
prezenei sau creterii gradate a concentraiei unui solvent organic n eluent.
olventul se numete, n acest caz, modificator organic. ;mportana teoriei
solvofobice const n faptul c permite prezicerea caracteristicilor de retenie a
soluilor. !ceasta poate fi clar demonstrat prin efectele modificatorilor organici
introdui n faza mobil asupra reteniei soluilor.
Temperatura. Gdat cu creterea temperaturii scad timpii de retenie i
deci se mrete viteza de cromatografiere. #a regul general, o cretere cu 1+P#
duce la o reducere a factorului de capacitate de dou ori. Prin creterea
temperaturii se scade viscozitatea solvenilor organici i deci se poate mri
viteza de eluare.
A%)u*area %e +)ruri #$ fa,a mo-il) duce la modificarea factorului de
capacitate. Pentru un solut neutru, logaritmul factorului de capacitate va crete
linear cu concentraia srurilor. !ceasta este o consecin a creterii lineare a
tensiuni de suprafa.
pH.ul/ Pentru compuii care ionizeaz c"nd p6.ul fazei mobile se apropie
de pQ
a
.ul solutului se observ schimbri ma1ore n ce privete factorul de
capacitate i selectivitatea.
Tampoa$ele/ !a cum s.a amintit de1a, supresia ionic este o tehnic
util pentru creterea factorilor de capacitate a soluilor. 7radul de ionizare al
soluilor poate varia cu concentraia solutului n absena unui tampon, pe msur
ce un solut elueaz din coloan, concentraia sa n band variaz i la fel i
gradul de ionizare. !stfel de schimbri n ionizare pot duce la apariia cozilor
11
sau a eluiilor nt"rziate %cozi inversate'. !stfel de probleme pot fi corectate prin
tamponarea corect a fazelor mobile.
Pe l"ng faptul c menine constat p6.ul fazei mobile, tamponul mai
trebuie s ndeplineasc anumite cerine cromatografice/
fie transparent optic, pentru a permite utilizarea detectoarelor 0A.A;. -e
e:emplu, acetatul, n comun cu ali acizi carbo:ilici, nu poate fi folosit sub
=,3 nm, unde ncepe s devin opac optic<
#omponentele tamponului nu trebuie s precipite n prezena modificatorilor
organici<
Lu$*imea la$!urilor li*a$,ilor 0i%rofo-i. #u toate c e:ist suporturi
cromatografice cu liganzi hidrocarbonai imobilizai a cror lungime variaz de
la = la 18 atomi de carbon, totui cel mai comod este a se modifica compoziia
fazei mobile, care de altfel constituie i factorul dominant n determinarea
rezoluiei. @n ce privete efectul lungimii lanului hidrocarbonat utilizat ca ligand
hidrofob, pe msur ce numrul atomilor de carbon crete i retenia soluilor.
Ietenia depinde i de densitatea acestor liganzi, astfel c putem spune c
retenia soluilor pe astfel de suporturi cromatografice crete odat cu coninutul
de carbon al fazei staionare.
1=